專利名稱：人sel－10多肽及編碼其的多核苷酸的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供了包含編碼人sel-10的兩個(gè)可選擇剪接變異體中的任何一個(gè)的多核苷酸的分離的核酸分子，這兩個(gè)變異體中的一個(gè)在海馬細(xì)胞中表達(dá)，另一個(gè)在乳腺細(xì)胞中表達(dá)。本發(fā)明也提供了分離的sel-10多肽。
背景技術(shù)：
早老性癡呆(AD)是在中老年階段引起進(jìn)行性記憶和識(shí)別衰退的中樞神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病。此病伴隨廣泛的神經(jīng)病理學(xué)特征，包括細(xì)胞外淀粉樣空斑和神經(jīng)元內(nèi)神經(jīng)纖維纏結(jié)(Sherrington，R.，等；自然(Nature)375754-60(1995))。盡管并不完全了解導(dǎo)致AD的致病途徑，但已知幾個(gè)遺傳位點(diǎn)與此病的發(fā)展有關(guān)。
通過使用在早期發(fā)病的AD家族中的圖譜研究，已鑒定了與早期發(fā)病的早老性癡呆(AD)有關(guān)的基因。這些研究表明，在染色體1和14上的遺傳位點(diǎn)可能與AD有關(guān)。染色體14位點(diǎn)的定位克隆鑒定了編碼8跨膜結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)的一種新的突變基因，此基因后來被命名為早老素(presenilin)-1(PS-1)(Sherrington，R.等，自然375754-60(1995))。人EST數(shù)據(jù)庫(kù)的blast搜尋揭示了與PS-1顯示同源性的單個(gè)EST，稱之為早老素-2(PS-2)，經(jīng)證明其是染色體1上與AD有關(guān)的基因。(Levy-Lahad，E.等，科學(xué)(Science)269937-977(1995)；Rogaev，E.I.，等，自然376775-8(1995)；Li，J.等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)9212180-12184(1995))。
在PS-1和PS-2上與早老性癡呆有關(guān)的突變主要是錯(cuò)義突變。PS-1和PS-2都經(jīng)歷了蛋白酶解加工，其能通過在家族性早老性癡呆中發(fā)現(xiàn)的點(diǎn)突變而被改變[Perez-Tur，J.等，神經(jīng)報(bào)告(Neuroreport)7297-301(1995)；Mercken，M.等，F(xiàn)EBS Lett.389297-303(1996)]。PS-1基因表達(dá)廣泛分布在組織中，而在胰和骨骼肌中發(fā)現(xiàn)PS-2 mRNA的水平最高。(Li，J.等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)9212180-12184(1995)；Jinhe Li，私人通信)。然而，在腦中發(fā)現(xiàn)了PS-2蛋白質(zhì)的水平最高(Jinhe Li，私人通信)。PS-1和PS-2蛋白質(zhì)都局限于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體和核膜。(Jinhe Li，私人通信；Kovacs，D.M.等，自然雜志醫(yī)藥分冊(cè)(Nat.Med.)2224-229(1996)；Doan，A.等，神經(jīng)元(Neuron)171023-1030(1996))。在PS-1基因或PS-2基因任一個(gè)中的突變改變了淀粉樣蛋白質(zhì)前體(APP)的加工，以至增加了Aβ1-42相應(yīng)于Aβ1-40的比例(Scheuner，D，等，自然雜志醫(yī)藥分冊(cè)2864-870(1996))。當(dāng)在轉(zhuǎn)基因小鼠中與人APP協(xié)同表達(dá)，相對(duì)于Aβ1-40觀察到Aβ1-42比例的類似增加(Borchelt，D.R.等，神經(jīng)元171005-1013(1996)；Citron，M.等，自然雜志醫(yī)藥分冊(cè)367-72(1997)；Duff，K.等，自然383710-713(1996))，以及在淀粉樣斑中Aβ沉淀的加速(Borchelt等，神經(jīng)元19939(1997))。
盡管有關(guān)于在AD中PS-1和PS-2所扮演的角色的上述資料，仍不知道它們的生物學(xué)功能，它們與大量人類疾病基因一樣也具有未知的生物學(xué)功能。在對(duì)于基因或其產(chǎn)物的功能未知的情況下，模式生物體中的遺傳分析可能用于把這些基因置于已知的生化或遺傳途徑中。通過篩選抑制或增強(qiáng)所分析基因中的突變效應(yīng)的外源突變可以達(dá)此目的。例如，在疾病基因中，喪失功能型突變的基因外抑制基因可以打開受影響突變基因下游的遺傳或生化途徑，而獲得功能型突變的抑制基因可能關(guān)閉此途徑。
可以用于闡明早老素基因功能的模式生物體是秀麗新桿線蟲(C.elegans)，其包含與PS-1和PS-2具有同源性的三個(gè)基因，其中sel-12與編碼人早老素的基因具有最高程度的同源性。在篩選激活的缺刻受體lin-12(d)的遺傳抑制基因的過程中發(fā)現(xiàn)了sel-12(Levitan，D.等，自然377351-354(1995))。lin-12在模式細(xì)胞譜系的發(fā)展中起作用。增加lin-12活性的超效等位基因突變，例如lin-12(d)，引起“多陰門”表型，而降低活性的減效基因突變引起外陰外翻，以及在另外幾個(gè)細(xì)胞譜系中的同源異型改變(Greenwald，I.等，自然346197-199(1990)；Sundram，M.等，遺傳學(xué)(Genetics)135755-763(1993))。sel-12突變抑制超效等位基因的lin-12(d)突變，但僅在lin-12(d)突變通過完整的lin-12(d)受體激活信號(hào)傳遞時(shí)起作用(Levitan，D.等，自然377351-354(1995))。切斷受體胞漿結(jié)構(gòu)域的lin-12突變也激活信號(hào)傳遞(Greenwald，I.，等，自然346197-199(1990))，但不被sel-12突變所抑制(Levitan，D.等，自然377351-354(1995))。這提示sel-12突變可能通過降低出現(xiàn)在質(zhì)膜上的功能性lin-12受體數(shù)目，在lin-12信號(hào)傳遞途徑上游區(qū)起作用。除了抑制一些lin-12超效等位基因突變外，sel-12突變還引起產(chǎn)卵功能喪失，并因此導(dǎo)致卵的體內(nèi)蓄積，盡管此變異體在其他方面看起來是解剖學(xué)正常的(Levitan，D.等，自然377351-354(1995))。sel-12突變體能被人PS-1或PS-2之一營(yíng)救，表明sel-12、PS-1和PS-2是功能上的同系物(Levitan，D.等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)9314940-14944(1996))。
在lin-12減效基因突變之抑制基因的獨(dú)立遺傳篩選中已鑒定了另一種基因，sel-10。在sel-10中的喪失功能型突變通過lin-12減效基因突變體恢復(fù)信號(hào)傳遞。由于sel-10活性的降低提高了lin-12活性，可以推斷sel-10充當(dāng)lin-12信號(hào)傳遞的負(fù)調(diào)節(jié)基因。sel-10也可充當(dāng)秀麗新桿線蟲早老素同系物sel-12的負(fù)調(diào)節(jié)基因(Levy-Lahad，E.等，科學(xué)269937-977(1995))。sel-10活性的喪失抑制了與sel-12中的減效基因突變有關(guān)的產(chǎn)卵缺陷(Iva Greenwald，私人通信)。sel-10的喪失功能型突變對(duì)lin-12突變和sel-12突變的作用表明，sel-10充當(dāng)lin-12/缺刻和早老素活性的負(fù)調(diào)節(jié)基因。因此，可以預(yù)期秀麗新桿線蟲sel-10的人同系物以與早老性癡呆發(fā)病機(jī)理有關(guān)的方式，可以同人早老素基因發(fā)生遺傳學(xué)和/或生理學(xué)相互作用。
綜上所述，顯然始終需要鑒定與AD有關(guān)的基因，以及需要發(fā)展鑒定能干擾導(dǎo)致AD的生物學(xué)途徑的因子的測(cè)定法。
信息公開Hubbard EJA，Wu G，Kitajewski J和Greenwald I(1997)秀麗新桿線蟲(Caenorhabditis elegans)中l(wèi)in-12活性的一種負(fù)調(diào)節(jié)基因Sel-10，其編碼蛋白質(zhì)CDC4家族的成員?；蚝桶l(fā)育(Genes & Dev)113182-3193。
Greenwald-I；Seydoux-G(1990)秀麗新桿線蟲的lin-12基因的獲得功能型突變的分析。自然。346197-9。
Kim T-W，Pettingell WH，Hallmark OG，Moir RD，Wasco W，Tanzi R(1997)在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中早老素2的內(nèi)切蛋白酶解切割和蛋白酶體降解。生物化學(xué)雜志(J Biol Chem)27211006-11010。Levitan-D；Greenwald-I(1995)通過sel-12(秀麗新桿線蟲S182早老性癡呆基因)促進(jìn)lin-12介導(dǎo)的信號(hào)傳遞。自然。377351-4。Levitan-D；Doyle-TG；Brousseau-D；Le-MK；Thinakaran-G；Slunt-HH；Sisodia-SS；Greenwald-I(1996)在秀麗新桿線蟲中正常的和突變的人早老素功能的評(píng)定。美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)9314940-4。Sundaram-M；Greenwald-I(1993)lin-12減效基因的抑制基因限定與秀麗新桿線蟲中l(wèi)in-12和glp-1兩者都相互作用的基因。遺傳學(xué)。135765-83。
Sundaram-M；Greenwald-I(1993)在秀麗新桿線蟲中減效基因lin-12突變體的遺傳和表型研究。遺傳學(xué)。135755-63。
F55B12.3 GenPep報(bào)告(WMBL位點(diǎn)CEF55B12，載入號(hào)z79757)。WO 97/11956發(fā)明概述本發(fā)明提供了包含編碼在海馬區(qū)和乳腺細(xì)胞中表達(dá)的人sel-10的多核苷酸之分離的核酸分子。除非另外特別提到，任何此處提及的sel-10應(yīng)理解為指人sel-10，并且既包括海馬區(qū)sel-10，也包括乳腺sel-10。也提供了海馬區(qū)(hippocampal)sel-10和乳腺sel-10的片段。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種分離的核酸分子，其包含的多核苷酸序列與選自以下序列的序列有至少95％的相同(a)編碼人sel-10多肽的核苷酸序列，sel-10多肽具有選自SEQ ID NO3、SEQ ID NO4、SEQ ID NO5、SEQ ID NO6和SEQ IDNO7的或由包含在ATCC保藏物第98978號(hào)中的cDNA克隆編碼的完整氨基酸序列；(b)編碼人sel-10多肽的核苷酸序列，sel-10多肽具有選自SEQ ID NO8、SEQ ID NO9和SEQ ID NO10的或由包含在ATCC保藏物第98979號(hào)中的cDNA克隆編碼的完整氨基酸序列；和(c)與(a)或(b)的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列。
另一方面，本發(fā)明提供了包含在嚴(yán)格條件下可與編碼sel-10的多核苷酸或其片段雜交的多核苷酸之分離的核酸分子。
本發(fā)明也提供了包含本發(fā)明分離的核酸分子的載體、導(dǎo)入了此類載體的宿主細(xì)胞和獲得sel-10多肽的重組方法，其包括培養(yǎng)所述的宿主細(xì)胞和分離sel-10多肽。
另一方面，本發(fā)明提供了分離的sel-10多肽及其片段。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，sel-10多肽具有選自SEQ ID NO3、4、5、6、7、8、9及10的氨基酸序列。也提供了可特異性結(jié)合sel-10多肽的分離的抗體，包括多克隆抗體和單克隆抗體。
附圖簡(jiǎn)述

圖1A和1B圖1A和1B是Western印跡，顯示了在用PS1-C-FLAG、6-myc-N-sel-10和APP695NL-KK cDNA轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞中的蛋白質(zhì)表達(dá)。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供了包含編碼人sel-10的多核苷酸之分離的核酸分子。在SEQ ID NO1中給出的人海馬區(qū)sel-10(hhsel-10)的核苷酸序列編碼5種hhsel-10多肽(hhsel-10-(1)、hhsel-10(2)、hhsel-10(3)、hhsel-10(4)和hhsel-10(5)，此處共同稱作hhsel-10)。在SEQ IDNO2中給出的人乳腺sel-10(hmsel-10)的核苷酸序列編碼3種hmsel-10多肽(hmsel-10-(1)、hmsel-10(2)及hmsel-10(3)，此處共同稱作hmsel-10)。hhsel-10多肽的核苷酸序列在SEQ ID NO1中給出，其中SEQ ID NO1的核苷酸殘基45-1928相當(dāng)于hhsel-10-(1)，SEQ ID NO1的核苷酸殘基150-1928相當(dāng)于hhsel-10-(2)，SEQ ID NO1的核苷酸殘基267-1928相當(dāng)于hhsel-10-(3)，SEQ IDNO1的核酸殘基苷291-1928相當(dāng)于hhsel-10-(4)，以及SEQ ID NO1的核苷酸殘基306-1928相當(dāng)于hhsel-10-(5)。hmsel-10多肽的核苷酸序列在SEQ ID NO2中給出，其中SEQ ID NO2的核苷酸殘基180-1949相當(dāng)于hmsel-10-(1)，SEQ ID NO2的核苷酸殘基270-1949相當(dāng)于hmsel-10-(2)，以及SEQ ID NO2的核苷酸殘基327-1949相當(dāng)于hmsel-10-(3)。由hhsel-10和hmsel-10核酸分子編碼的多肽的氨基酸序列如下SEQ ID NO3、4、5、6和7分別相應(yīng)于hhsel-10-(1)、hhsel-10(2)、hhsel-10(3)、hhsel-10(4)和hhsel-10(5)多肽，而SEQ ID NO8、9和10分別相應(yīng)于hmsel-10-(1)、hmsel-10(2)和hmsel-10(3)。除非另外特殊提到，任何此處提及的sel-10應(yīng)理解為指人sel-10，并且包括所有海馬區(qū)和乳腺sel-10核酸分子(就涉及sel-10核酸、多核苷酸、DNA、RNA或基因而言)或多肽(就涉及sel-10蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸序列而言)。也提供了海馬區(qū)sel-10及乳腺sel-10的核酸分子和多肽的片段。
如實(shí)施例1所述獲得了SEQ ID NO1的核苷酸序列，且其包含在cDNA克隆PNV 102-1中，后者于1998年11月9日保藏在美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，10801University Blvd，Manassas，VA201 10中，保藏號(hào)為98978。如實(shí)施例2所述獲得了SEQ ID NO2的核苷酸序列，且其包含在cDNA克隆PNV 108-2中，后者于1998年11月9日保藏在美國(guó)典型培養(yǎng)保藏中心，10801 University Blvd，Manassas，VA201 10中，保藏號(hào)為98979。
本發(fā)明的人sel-10多肽同秀麗新桿線蟲sel-10以及同包括酵母CDC4和人LIS-1在內(nèi)的β-轉(zhuǎn)導(dǎo)素蛋白質(zhì)家族的成員具有同源性。此家族以存在F-盒和多重WD-40重復(fù)體為特征(Li，J.，等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)9212180-12184(1995))。此重復(fù)體長(zhǎng)度為20至40個(gè)氨基酸，并同甘氨酸-組氨酸(GH)和色氨酸-天冬氨酸(WD)殘基結(jié)合。β-轉(zhuǎn)導(dǎo)素的三維結(jié)構(gòu)表明，WD40重復(fù)體組成七葉螺旋槳樣結(jié)構(gòu)的臂(Sondek，J.，等.自然379369-374(1996))。每一葉由具有一對(duì)在蛋白質(zhì)基元中形成一個(gè)內(nèi)部β鏈界限的保守天冬氨酸殘基的β-片層四個(gè)交替的折疊構(gòu)成。在代表多樣化功能類別的27種以上不同的蛋白質(zhì)中發(fā)現(xiàn)了WD40重復(fù)體(Neer，E.J.，等，自然371297-300(1994))。這些重復(fù)體調(diào)節(jié)包括細(xì)胞分裂、細(xì)胞命運(yùn)決定、基因轉(zhuǎn)錄、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白質(zhì)降解、mRNA修飾和囊泡融合在內(nèi)的細(xì)胞功能。在功能上的多樣性得出了如下假設(shè)β-轉(zhuǎn)導(dǎo)素家族成員提供能在其上裝配多蛋白質(zhì)復(fù)合體的共同支架。
SEQ ID NO1中給出的核苷酸序列相當(dāng)于編碼hhsel-10的核苷酸序列，而SEQ ID NO2中給出的核苷酸序列相當(dāng)于編碼hmsel-10的核苷酸序列。編碼sel-10的DNA的分離和測(cè)序在以下的實(shí)施例1和2中有所描述。
如實(shí)施例1和2所述，應(yīng)用自動(dòng)測(cè)序方法獲得sel-10的核苷酸序列。獲得了本發(fā)明sel-10核苷酸序列的兩條DNA鏈，且據(jù)信為100％精確。然而，眾所周知，通過此類自動(dòng)化方法獲得的核苷酸序列可能包含一些錯(cuò)誤。通過自動(dòng)化確定的核苷酸序列一般至少大約90％，至少大約95％至99.9％與給定核酸分子的實(shí)際核苷酸序列相同。實(shí)際的序列可以應(yīng)用本領(lǐng)域眾所周知的手工測(cè)序方法更精確地測(cè)定。導(dǎo)致一個(gè)或更多的核苷酸插入或缺失的序列中的錯(cuò)誤可能導(dǎo)致翻譯中的讀框移位，使得推定的氨基酸序列自突變點(diǎn)開始不同于由核酸分子的實(shí)際核苷酸序列推定的核苷酸序列。本發(fā)明的sel-10 DNA包括cDNA、化學(xué)合成DNA、通過PCR分離的DNA、基因組DNA及其組合。應(yīng)用本領(lǐng)域眾所周知的方法，通過篩選具有此處所述的sel-10 cDNA的基因組文庫(kù)，可以獲得基因組sel-10 DNA。由sel-10 DNA轉(zhuǎn)錄的RNA也包括在本發(fā)明中。
由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性，兩個(gè)DNA序列可以不同但編碼相同的氨基酸序列。本發(fā)明因此提供了具有編碼任一本發(fā)明sel-10多肽的多核苷酸序列之分離的核酸分子，其中所述的多核苷酸序列編碼具有SEQID NO3-10的完整氨基酸序列的sel-10多肽或其片段。
此處也提供了純化的sel-10多肽，包括重組的及非重組的。保留任何sel-10生物學(xué)活性的天然sel-10蛋白質(zhì)的變異體和衍生物也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。如上所述，本發(fā)明的sel-10多肽同酵母CDC4有同源性。由于已知CDC4催化特定細(xì)胞蛋白質(zhì)的遍在蛋白化作用(Feldman等，細(xì)胞(Cell)91221(1997))，可以推斷sel-10也具有此活性。證明此類生物活性的測(cè)定方法是眾所周知的，包括應(yīng)用純化人sel-10蛋白質(zhì)連同酵母蛋白質(zhì)Cdc4p、Cdc53p和Skp1p(或它們的人類直向同源基因)和E1酶、E2酶Cdc34p(或它們的人類直向同源基因)、遍在蛋白、一種靶蛋白質(zhì)以及一種ATP再生系統(tǒng)重構(gòu)遍在蛋白化系統(tǒng)(Feldman等，1997)。Skplp通過一個(gè)稱作F-盒的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域同Cdc4p結(jié)合(Bai等，細(xì)胞86263(1996))。在酵母CDC4、秀麗新桿線蟲sel-10、小鼠sel-10及人sel-10中發(fā)現(xiàn)了F-盒蛋白質(zhì)基元?？梢杂媒湍赋煞值男沱愋聴U線蟲對(duì)應(yīng)物，如代替Cdc53p的cul-1(也稱作lin-19)蛋白質(zhì)(Kipreos等，細(xì)胞85829(1996))和代替Skp1p的蛋白質(zhì)F46A9，或用它們的哺乳動(dòng)物對(duì)應(yīng)物，如代替Cdc53p的cul-2蛋白質(zhì)(Kipreos等，1996)和代替酵母Skp1p的哺乳動(dòng)物Skp1p重構(gòu)sel-10遍在蛋白化系統(tǒng)。由蛋白激酶提供的磷酸化系統(tǒng)也包括在由Feldman等于1997年創(chuàng)立的測(cè)定系統(tǒng)中。
例如，可以通過天然sel-10編碼核苷酸序列的突變獲得sel-10變異體。此處所述sel-10變異體是同天然sel-10基本同源的多肽，但由于在其氨基酸序列中一個(gè)或更多的缺失、插入或替換，其具有不同于天然sel-10的氨基酸序列。變異體的氨基酸或核苷酸序列與天然sel-10序列優(yōu)選至少大約80％相同，更優(yōu)選地至少大約90％相同，而最優(yōu)選地至少大約95％相同。因此，例如同天然sel-10基因相比，每一百個(gè)核苷酸含有5個(gè)點(diǎn)突變的變異核苷酸序列與天然蛋白質(zhì)95％相同。在天然和變異的sel-10序列之間的序列相同性的百分比，也稱為同源性，其可以例如通過應(yīng)用任一常用于此目的的計(jì)算機(jī)程序比較兩個(gè)序列而確定，諸如此類的程序有應(yīng)用Smith和Waterman算法(應(yīng)用數(shù)學(xué)進(jìn)展(Adv.Appl.Math.)2482-489(1981))的Gap程序(Wisconsin序列分析包(Wisconsin Sequence Analysis Package)，Unix第8版，遺傳學(xué)計(jì)算機(jī)組，大學(xué)科研園，Madison Wisconsin)。
可以通過大量已知技術(shù)中的任一種完成天然氨基酸序列的改變。例如，通過熟練技術(shù)人員所周知的方法，如由Walder等(基因(Gene)42133(1986))；Bauer等(基因3773(1985))；Craik(生物技術(shù)(BioTechniques)，1985年1月，第12-19頁(yè))；Smith等(遺傳工程原理和方法，Plenum出版社(1981))；和美國(guó)專利第4,518,584和4,737,462所描述的寡核苷酸介導(dǎo)的誘變，可以在特定位點(diǎn)引入突變。
在本發(fā)明范圍內(nèi)sel-10變異體可以包括保守替換的序列，意思是sel-10多肽的一個(gè)或多個(gè)氨基酸可被不同的殘基替換，而這種替換不改變sel-10多肽的二級(jí)和/或三級(jí)結(jié)構(gòu)。此類替換可以包括一個(gè)氨基酸被具有相似物理化學(xué)性質(zhì)的殘基置換，例如替換一個(gè)脂肪族殘基(異亮氨酸、纈氨酸、亮氨酸或丙氨酸)為另一個(gè)脂肪族殘基，或在堿性殘基賴氨酸和精氨酸之間、酸性殘基谷氨酸和天冬氨酸之間、酰胺殘基谷氨酰胺和天冬酰胺之間、羥基殘基絲氨酸和酪氨酸之間或芳香族殘基苯丙氨酸和酪氨酸之間替換。關(guān)于進(jìn)行表型沉默的氨基酸交換的進(jìn)一步資料可以在Bowie等，科學(xué)2471306-1310(1990)中發(fā)現(xiàn)。其它可能基本保留sel-10生物學(xué)活性的sel-10變異體是那些在蛋白質(zhì)的功能區(qū)域以外的區(qū)域進(jìn)行氨基酸替換的變異體。
另一方面，本發(fā)明提供了包含在嚴(yán)格條件下可與上述核酸分子的一部分雜交的多核苷酸之分離的核酸分子，例如，可與前述的核酸分子之一的至少大約15個(gè)核苷酸，優(yōu)選至少大約20個(gè)核苷酸，更優(yōu)選至少大約30個(gè)核苷酸，而最優(yōu)選至少大約從30個(gè)到至少大約100個(gè)核苷酸雜交。具有上述長(zhǎng)度的核酸分子的該部分涉及，例如，對(duì)照核酸分子的至少大約15個(gè)連續(xù)的核苷酸。嚴(yán)格雜交條件，預(yù)期是在6XSSC/0.1％SDS中在大約42/C過夜孵育大約2.5小時(shí)，接著在65/C1.0XSSC、0.1％SDS中洗滌濾膜。
在此所述的sel-10編碼核酸分子的片段以及能同該核酸分子雜交的多核苷酸可以在聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)中用作探針或引物。該探針可以用于，例如，在體外測(cè)定以及Southern和Northern印跡中檢測(cè)sel-10核酸的存在與否。通過此類探針的使用，也可以鑒定表達(dá)sel-10的細(xì)胞類型。該方法是眾所周知的，且熟練的技術(shù)人員將能選擇一個(gè)長(zhǎng)度適于具體應(yīng)用的探針。對(duì)于PCR，應(yīng)用對(duì)應(yīng)于期望的sel-10核酸分子末端的5′和3′引物應(yīng)用常規(guī)技術(shù)以分離和擴(kuò)增該序列。
sel-10核酸分子的其他有用的片段是包含能同目標(biāo)sel-10 mRMA(使用有義鏈)或sel-10 DNA(使用反義鏈)序列結(jié)合的單鏈核酸序列的反義或有義寡核苷酸。
另一方面，本發(fā)明包括具有或不具有相關(guān)天然模式糖基化的sel-10多肽。在酵母或哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的sel-10(下面討論)可以在分子量和糖基化模式上與天然sel-10多肽相似或明顯不同。在細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)中sel-10的表達(dá)將提供非糖基化的sel-10。
本發(fā)明的多肽優(yōu)選以分離的形式提供，并優(yōu)選為基本上純的。通過眾所周知的方法，包括硫酸銨或乙醇沉淀反應(yīng)、陰離子或陽離子交換層析法、磷酸纖維素層析法、疏水相互作用層析法、親和層析法、羥基磷灰石層析法及植物凝集素層析法可以從重組細(xì)胞培養(yǎng)物中回收和純化sel-10多肽。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，應(yīng)用高效液相層析法(HPLC)純化。
本發(fā)明也涉及包含本發(fā)明的多核苷酸分子的載體，以及用此載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。任一本發(fā)明的多核苷酸分子可與一種載體連接，其通常包括一種可選擇標(biāo)志和一個(gè)用于在宿主中繁殖的復(fù)制起點(diǎn)。因?yàn)楸景l(fā)明也提供由上述多核苷酸分子表達(dá)的sel-10多肽，所以優(yōu)選用于sel-10表達(dá)的載體。此類載體包括編碼任一上述或下面描述的sel-10多肽的DNA，該DNA有效連接到合適的轉(zhuǎn)錄或翻譯調(diào)節(jié)序列，諸如源自哺乳動(dòng)物、微生物、病毒或昆蟲基因的調(diào)節(jié)序列。調(diào)節(jié)序列的實(shí)例包括轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子、操縱基因或增強(qiáng)子、mRNA核糖體結(jié)合位點(diǎn)以及控制轉(zhuǎn)錄和翻譯的合適序列。當(dāng)調(diào)節(jié)序列在功能上與編碼sel-10的DNA相關(guān)時(shí)，核苷酸序列為有效連接。因此，如果啟動(dòng)子核苷酸序列指導(dǎo)sel-10序列的轉(zhuǎn)錄，則啟動(dòng)子核苷酸序列為有效連接到sel-10 DNA上。
用于克隆編碼sel-10的多核苷酸分子或用于表達(dá)sel-10多肽的適合載體的選擇當(dāng)然取決于載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞以及待表達(dá)sel-10多肽的宿主細(xì)胞。用于表達(dá)sel-10多肽的合適的宿主細(xì)胞包括原核生物、酵母及高等真核生物細(xì)胞，其中的每一個(gè)都將在以下討論。
在此類宿主細(xì)胞中表達(dá)的sel-10多肽也可以是包含來自異源蛋白質(zhì)區(qū)域的融合蛋白質(zhì)。可包括此類區(qū)域以使，例如，多肽的分泌、穩(wěn)定性改善或促進(jìn)多肽純化。例如，編碼適當(dāng)?shù)男盘?hào)肽序列能整合入表達(dá)載體。用作信號(hào)肽(分泌性前導(dǎo)物)的DNA序列可以符合讀框地融合到sel-10序列中，以使sel-10以包含信號(hào)肽的融合蛋白質(zhì)形式得到翻譯。在預(yù)期的宿主細(xì)胞中起作用的信號(hào)肽促進(jìn)了sel-10多肽的細(xì)胞外分泌。優(yōu)選sel-10一旦從細(xì)胞分泌，則由sel-10多肽上切除信號(hào)序列。能用于實(shí)施本發(fā)明的信號(hào)序列的非限制性實(shí)例包括酵母I-因子和在sf9昆蟲細(xì)胞中的蜜蜂melatin前導(dǎo)區(qū)。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，sel-10多肽是包括用于促進(jìn)多肽純化的異源區(qū)域的融合蛋白質(zhì)。很多可得到的用于此功能的多肽允許融合蛋白質(zhì)同結(jié)合配體的選擇性結(jié)合。例如，sel-10多肽可以被修飾為包含一種肽，從而形成可同結(jié)合配體或肽標(biāo)記物特異性結(jié)合的融合蛋白質(zhì)。此類肽標(biāo)記物的非限制性實(shí)例包括6-組氨酸標(biāo)記物、硫氧還蛋白標(biāo)記物、FLAG標(biāo)記物、血凝素標(biāo)記物、GST標(biāo)記物以及OmpA信號(hào)序列標(biāo)記物。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員理解的那樣，可識(shí)別并同肽結(jié)合的結(jié)合配體可以是如下任何分子或化合物，包括金屬離子(例如金屬親和柱)、抗體或其片段及可同肽結(jié)合的任何蛋白質(zhì)或肽在內(nèi)?？梢酝ㄟ^可同每種類型標(biāo)記物特異性反應(yīng)的熒光素或若丹明標(biāo)記的抗體識(shí)別這些標(biāo)記物。
用于表達(dá)sel-10多肽的適合的宿主細(xì)胞包括原核生物、酵母及高等真核生物細(xì)胞。用于表達(dá)sel-10的適合的原核生物宿主包括埃希桿菌屬(Escherichia)、芽孢桿菌屬(Bacillus)和沙門菌屬(Salmonella)的細(xì)菌以及假單孢菌屬(Pseudomonas)、鏈霉菌屬(Streptomyces)和葡萄球菌屬(Staphylococcus)的成員。對(duì)于在例如大腸桿菌中的表達(dá)，sel-10多肽可以包括一個(gè)N-端蛋氨酸殘基以促進(jìn)原核生物宿主中重組多肽的表達(dá)。之后，可以任選地從表達(dá)的sel-10多肽上切除N-端蛋氨酸。
用在原核生物宿主中的表達(dá)載體通常包括一個(gè)或更多的表型可選擇性標(biāo)志基因。此類基因通常編碼，例如賦予抗生素抗性或供給營(yíng)養(yǎng)缺陷需要的蛋白質(zhì)。廣泛種類的此類載體易于由商業(yè)來源得到。實(shí)例包括pSPORT載體、pGEM載體(Promega公司)、pPROEX載體(LTI，Bethesda，MD)、Bluescript載體(Stratagene)及pQE載體(Qiagen公司)。
sel-10也可表達(dá)在來自包括酵母屬(Saccharomyces)、畢赤酵母母屬(Pichia)和克魯維酵母屬(Kluveromyces)在內(nèi)的屬的酵母宿主細(xì)胞內(nèi)。優(yōu)選的酵母宿主是啤酒酵母(S.cerevisiae)和巴斯德畢赤酵母(P.pastoris)。酵母載體常包括來自2T酵母質(zhì)粒的復(fù)制序列起點(diǎn)、自主性復(fù)制序列(ARS)、啟動(dòng)子區(qū)域、用于多腺苷酸化的序列、用于轉(zhuǎn)錄終止的序列及可選擇的標(biāo)志基因。
也可以應(yīng)用既可在酵母也可在大腸桿菌中復(fù)制的載體(稱為穿梭載體)。除了上面提到的酵母載體的特征，穿梭載體還包括用于在大腸桿菌中復(fù)制和篩選的序列。在酵母宿主中表達(dá)的sel-10多肽的直接分泌，可以通過在sel-10編碼核苷酸序列5′端插入編碼酵母I-因子前導(dǎo)區(qū)序列來完成。
昆蟲宿主細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)也可以用于Sel-10多肽的表達(dá)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，應(yīng)用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)本發(fā)明的sel-10多肽。關(guān)于用于昆蟲細(xì)胞中異源蛋白質(zhì)表達(dá)的桿狀病毒系統(tǒng)的用途之進(jìn)一步資料由Luckow和Summers，生物工藝學(xué)(Bio/Techndogy)647(1998)綜述。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，sel-10多肽在哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中表達(dá)。適合的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系的非限制性實(shí)例包括猴腎細(xì)胞的COS-7系(Gluzman等，細(xì)胞23175(1981)和中華倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞。
用于表達(dá)本發(fā)明sel-10多肽的合適表達(dá)載體的選擇，當(dāng)然取決于應(yīng)用的特定哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞，且應(yīng)在普遍技術(shù)人員的技能范圍內(nèi)。合適的表達(dá)載體的實(shí)例包括pcDNA3(Invitrogen公司)和pSVL(Parmacia Biotech公司)。用在哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中的表達(dá)載體包括源自病毒基因組的轉(zhuǎn)錄和翻譯控制序列?？梢杂迷诒景l(fā)明中的常用啟動(dòng)子序列和增強(qiáng)子序列包括但不限于，源自人巨細(xì)胞病毒(CMV)、腺病毒2、多瘤病毒及猿猴病毒40(SV40)的那些序列。例如在OKayama和Berg(分子細(xì)胞生物學(xué)(Mol.Cell.Biol)3280(1983))；Cosman等(分子免疫學(xué)(Mol Immunol)23935(1986)；Cosman等(自然312768(1984))；EP-A-O367566和WO91/18982中公開了用于構(gòu)建哺乳動(dòng)物表達(dá)載體的方法。
本發(fā)明的多肽也可以來培養(yǎng)多克隆和單克隆抗體，其可用于檢測(cè)sel-10多肽表達(dá)的診斷測(cè)定。此類抗體可以通過常規(guī)方法制備。參見，例如，抗體實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，Harlow和Land(編)，Cold Spring Harbor實(shí)驗(yàn)室出版社，Cold Spring Harbor，紐約(1988)；單克隆抗體，雜交瘤在生物學(xué)分析中的新領(lǐng)域，Kennet等(編)，Plenum出版社，紐約(1980)。
由于其能同人類染色體上的特定位點(diǎn)雜交，本發(fā)明的sel-10核酸分子對(duì)染色體鑒定也是有價(jià)值的。由于目前幾乎沒有可得的基于實(shí)際序列資料(重復(fù)多態(tài)性)的染色體標(biāo)記試劑用于標(biāo)記染色體位點(diǎn)，因此需要鑒定染色體上的特定部位。一旦把一個(gè)序列繪圖定位在精確的染色體位置上，此序列在染色體上的物理位置可同遺傳圖譜資料相互關(guān)聯(lián)。可通過連鎖分析鑒定在基因和已被繪圖定位到同一染色體區(qū)域的疾病之間的關(guān)系，其中確定了物理上相鄰的基因的共同遺傳。能通過比較患病的和未患病的個(gè)體之間的核酸序列，來確定看起來與特定疾病有關(guān)的基因?qū)嶋H上是否為疾病的病因。
本發(fā)明的sel-10多肽及編碼它們的DNA，也可以用于進(jìn)一步闡明AD的生物學(xué)機(jī)制，并可最終導(dǎo)致能用于改變?cè)摍C(jī)制的化合物的鑒定。本發(fā)明的sel-10多肽與秀麗新桿線蟲sel-10有47.6％相同和56.7％相似。如上所述，已知秀麗新桿線蟲sel-10的突變抑制了導(dǎo)致sel-12的產(chǎn)卵功能喪失型突變，并也抑制lin-12的某些減效基因突變。也能通過人類早老性癡呆連鎖基因PS-1(與sel-12有42.7％相同)或者PS-2(與sel-12有43.4％相同)挽救秀麗新桿線蟲sel-12的突變。然而，具有家族性AD-連鎖突變體的人PS-1挽救sel-12突變體的能力降低(Levitan，D.等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)9314940-14944(1996))。
這表明，人類和秀麗新桿線蟲基因在缺刻信號(hào)傳遞途徑的互換性使之可以合理地預(yù)言人sel-10突變將抑制導(dǎo)致AD的PS-1或PS-2突變，尤其是根據(jù)sel-10的推定結(jié)構(gòu)。如上所述，導(dǎo)致早老性癡呆的PS-1和PS-2突變是干擾PS-1或PS-2的蛋白分解加工的突變。本發(fā)明的sel-10多肽是β-轉(zhuǎn)導(dǎo)素蛋白質(zhì)家族的成員，該家族中包括酵母CDC4，后者是能在遍在蛋白依賴性蛋白質(zhì)降解途徑起作用的一種酶的成分。因此，人sel-10可以通過遍在蛋白-蛋白酶體途徑調(diào)節(jié)早老素降解。替代地或另外，人sel-10可以改變?cè)缋纤氐墓δ?，方法是通過靶定經(jīng)過遍在蛋白質(zhì)化作用降解一種早老素活性的抑制劑，如負(fù)調(diào)控子。因此，sel-10突變可以逆轉(zhuǎn)作為PS-1或PS-2突變的結(jié)果而造成的PS-1或PS-2錯(cuò)誤的蛋白酶解加工，或者增加早老素功能。由于相同的原因，sel-10活性的抑制也可以起逆轉(zhuǎn)PS-1或PS-2突變的作用。因此，可以假定，抑制本發(fā)明的人sel-10多肽表達(dá)或活性的化合物可以逆轉(zhuǎn)PS-1或PS-2突變作用，因此對(duì)于AD的預(yù)防或治療有作用。
因此，秀麗新桿線蟲可用作鑒定能抑制本發(fā)明的人sel-10多肽活性或表達(dá)的因子之遺傳系統(tǒng)。用在此類測(cè)定中的合適的秀麗新桿線蟲種系缺乏編碼活性秀麗新桿線蟲sel-10的基因，并顯示了由于sel-10基因失活而產(chǎn)生的產(chǎn)卵功能喪失。sel-12序列(Genebank保藏號(hào)U35660)和導(dǎo)致產(chǎn)卵功能喪失的sel-12突變都是已知的(參見Levitan等，自然377351-354(1995)，其描述了秀麗新桿線蟲sel-12(ar171)的構(gòu)建)，因此，由于sel-10突變而喪失產(chǎn)卵功能的秀麗新桿線蟲種系的構(gòu)建可以應(yīng)用常規(guī)方法完成。如何制備這樣一個(gè)種系的實(shí)例由Levitan等給出(自然377351-354(1995))。在秀麗新桿線蟲sel-12(ar171)中的野生型秀麗新桿線蟲sel-10也用常規(guī)方法誘變，例如在Levitan等，出處同上中用于sel-12誘變的技術(shù)。
為鑒定抑制人sel-10活性的化合物，將包含編碼任一本發(fā)明野生型人sel-10蛋白質(zhì)的人sel-10基因之DNA載體引入上述秀麗新桿線蟲種系。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，將異源人sel-10基因整合入秀麗新桿線蟲基因組。之后用Levitan等(美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)9314940-14944(1996))所述的方法表達(dá)此基因。然后把試驗(yàn)化合物施予此種系，以便確定一個(gè)給定的因子能否抑制sel-10活性，從而抑制導(dǎo)致產(chǎn)卵缺陷的sel-12或lin-12突變。之后，例如通過Levitan等(美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)9314940-14944(1996))描述的測(cè)定法，確定的此種系中的產(chǎn)卵功能。為進(jìn)一步證實(shí)此化合物對(duì)于產(chǎn)卵功能的作用是由于sel-10活性的抑制，可以在已知被sel-10中的喪失功能型突變影響的第二生化或遺傳途徑中檢驗(yàn)此化合物的作用(例如，在lin-12(d)減效基因種系中l(wèi)in-12活性的進(jìn)一步提高)?？梢匀鏢undarem和Greenwald(遺傳學(xué)135765-783(1993))所述施行該測(cè)定法。
另外，檢測(cè)了化合物抑制E3遍在蛋白質(zhì)連接酶的能力。證明該活性的測(cè)定方法是眾所周知的，包括應(yīng)用純化的人sel-10蛋白質(zhì)連同酵母蛋白質(zhì)Cdc4p、Cdc53p及Skp1p和一種E1酶、E2酶Cdc34p、遍在蛋白質(zhì)、一種目標(biāo)蛋白質(zhì)及一種ATP再生系統(tǒng)重構(gòu)遍在蛋白化系統(tǒng)(Feldman等，1997)。sel-10遍在蛋白化系統(tǒng)也可以用酵母元件的秀麗新桿線蟲對(duì)應(yīng)物重構(gòu)，例如，用cul-1(也稱為lin-19)蛋白質(zhì)替換Cdc 53p(Kipreos等，細(xì)胞85829(1996))及蛋白質(zhì)F46A9替換Skp1p，或它們的哺乳動(dòng)物對(duì)應(yīng)物重構(gòu)，例如，用Cul-2蛋白質(zhì)替換Cdc53p(Kipreos等，出處同上)及哺乳動(dòng)物Skp1p替換酵母Skp1p。由蛋白質(zhì)激酶提供的磷酸化系統(tǒng)也包括在如Feldman等，1997所述的測(cè)定系統(tǒng)中。
另外，由于用人sel-10 cDNA轉(zhuǎn)化而表達(dá)人sel-10，并因此具有APP加工增加和Aβ1-40或Aβ1-42形成的細(xì)胞系，也可以用于如實(shí)施例3描述的此類測(cè)定法中?？梢詸z測(cè)化合物是否具有對(duì)于降低見于sel-10轉(zhuǎn)化細(xì)胞系中的Aβ加工增加的能力。
然后，篩選挽救產(chǎn)卵缺陷或抑制E3遍在蛋白質(zhì)連接酶的化合物是否有引起人細(xì)胞系中Aβ1-40或Aβ1-42的產(chǎn)生減低的能力。用試驗(yàn)化合物接觸已知產(chǎn)生Aβ1-40或Aβ1-42的IMR-32或其它人細(xì)胞系(Asami-okada等，生物化學(xué)(Biochemistry 3410272-10278(1995))，或接觸經(jīng)工程化以高水平表達(dá)人APP的人細(xì)胞系。在這些測(cè)定法中，通過本領(lǐng)域已知的ELISA或其他測(cè)定法測(cè)定細(xì)胞提取物中(或在釋放入培養(yǎng)基后)的Aβ1-40或Aβ1-42(Borchelt等，神經(jīng)元171005-1013(1996)；Citron等，自然雜志醫(yī)藥分冊(cè)367-72(1997))。
全面描述了本發(fā)明后，參考以下的實(shí)施例將更容易理解之，但這些實(shí)施例只供例證，并不意在限制。
實(shí)施例實(shí)施例1秀麗新桿線蟲sel-10的人同系物的鑒定結(jié)果ACEDB中sel-10的鑒定Sel-10圖上位于克隆的多態(tài)性arP3和緊鄰him-5左側(cè)的TCRARI之間[ACEDB登記wm95p536]?？缭介g隔對(duì)三個(gè)噬菌體λ克隆F35C11、F09F3和F55B12測(cè)序。據(jù)報(bào)道sel-10與酵母cdc4有同源性[ACEDB登記wm97Aβ259]。Blast探查揭示了，單個(gè)ORF在由arP3和相應(yīng)于GenPep登記號(hào)F55B12.3的TCPARI所限定的間隔之內(nèi)與酵母cdc4(CC4 YST)具有同源性。如酵母cdc4一樣，F(xiàn)55B12.3是β-轉(zhuǎn)導(dǎo)素蛋白質(zhì)家族的成員。該家族以存在多倍的WD40重復(fù)體為特征[Neer，E.J.等，自然(Nature)371297-300(1994)]。人sel-10同系物Incyte028971的鑒定應(yīng)用tblastn將GenPep登記號(hào)F55B12.3用于探查L(zhǎng)ifeSeq、LifeSeq FL和EMBL數(shù)據(jù)庫(kù)。該探查揭示了與包括LIS-1(S36113和P43035)、與Miller-Dieker無腦回畸形有關(guān)的基因、爪蟾基因、TRCPXEN(U63921)和LifeSeq FL中的人重疊群028971在內(nèi)的β-轉(zhuǎn)導(dǎo)素家族成員的多種同系物。既然在秀麗新桿線蟲基因組中也有多重β-轉(zhuǎn)導(dǎo)素家族成員，用復(fù)合blast探查采集這些成員，然后與sel-10侯選基因成簇。用使用Clustal方法的DNAStar程序Megalign進(jìn)行多重序列對(duì)比。這揭示了LIS-1與T03F6.F(一種不同的β-轉(zhuǎn)導(dǎo)素家族成員)成簇，并因此將其排除作為侯選的sel-10同系物。TRCPXEN與K10B2.1(也與F55B12.3和CC4YST成簇的一種基因)成簇，而Incyte 028971與sel-10成簇。因此，Incyte 028971看來編碼秀麗新桿線蟲sel-10的人同系物。在包含WD40基元的7個(gè)重復(fù)體的蛋白質(zhì)區(qū)域中，在sel-10和028971之間的序列同源性是最強(qiáng)的。Incyte 028971重疊群包含來自于包括胰腺、肺、T-淋巴細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、乳腺、海馬區(qū)、心肌、結(jié)腸及其它組織在內(nèi)的多重文庫(kù)的44個(gè)EST。
公共EST針對(duì)TREMBLP數(shù)據(jù)組，用DNA序列028971以Blastx探查鑒定了來自于IMAGE文庫(kù)Soares小鼠胚胎NbME13.5-14.5的單個(gè)同源性小鼠EST(W85144)。應(yīng)用W85144，然后應(yīng)用F55B12.3的028971的blastx序列對(duì)比法，揭示028971中閱讀框架的改變，其可能是由于測(cè)序錯(cuò)誤。
用028971 DNA序列對(duì)EMBL EST數(shù)據(jù)庫(kù)的Blastn探查揭示了，除了W85144，與028971的編碼序列匹配的3個(gè)人EST及與028971序列的3′未翻譯區(qū)匹配的六個(gè)EST。
蛋白質(zhì)基元在酵母cdc4、小鼠W85144和人028971共有的F55B12.3中，兩個(gè)蛋白質(zhì)基元得到鑒別。這些基元在N-端結(jié)構(gòu)域有一個(gè)F-盒，在C-端結(jié)構(gòu)域有7個(gè)β-轉(zhuǎn)導(dǎo)素重復(fù)體。
討論sel-10基因編碼β-轉(zhuǎn)導(dǎo)素蛋白質(zhì)家族成員，其以多重WD40重復(fù)體的存在為特征[Neer，E.J.等，自然371297-300(1994)]。該重復(fù)體長(zhǎng)度為20-40個(gè)氨基酸，并同甘氨酸-組氨酸(GH)和色氨酸-天冬氨酸(WD)殘基結(jié)合。β-轉(zhuǎn)導(dǎo)素的三維結(jié)構(gòu)溶液顯示W(wǎng)D40重復(fù)體形成七葉螺旋漿樣結(jié)構(gòu)的臂(Sondek，J，自然379369-374(1996)。在形成一個(gè)內(nèi)部β鏈界限的蛋白質(zhì)基元中，每一個(gè)葉片由具有一對(duì)保守天冬氨酸殘基的β片層的四個(gè)交替的折疊形成。WD40重復(fù)體見于代表多樣化功能類別的超過27種不同的蛋白質(zhì)中[Near，E，J等，自然371297-300(1994)]，這些重復(fù)體調(diào)控包括細(xì)胞分裂、細(xì)胞命運(yùn)決定、基因轉(zhuǎn)錄、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白質(zhì)降解、mRNA修改和囊泡融合在內(nèi)的細(xì)胞功能。這種功能上的多樣性導(dǎo)致了β-轉(zhuǎn)導(dǎo)素家族成員提供了多蛋白質(zhì)復(fù)合體能在其上裝配的共同支架的假設(shè)。
sel-10，28971和W85144與酵母cdc4基因的同源性提示了，在用于細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)降解的遍在蛋白-蛋白酶體途徑中起作用的一個(gè)角色。通過阻斷Sic1(S期細(xì)胞周期蛋白/cdk復(fù)合物的抑制劑)的降解，酵母cdc4的突變導(dǎo)致細(xì)胞周期的停滯[King，R.W.等，科學(xué)2741652-9(1996)]。Sci1的磷酸化作用以通過遍在蛋白-蛋白酶體途徑破壞為目標(biāo)。該途徑包括三個(gè)由多蛋白復(fù)合物催化的連接酶反應(yīng)[Ciechanover，A.，細(xì)胞7913-21(1994)；Ciechanover，A.和A.L.Schwartz，F(xiàn)ASEB J.，8182-91(1994)]。最初，遍在蛋白的C-端甘氨酸被ATP激活，以在由遍在蛋白激活酶，E1催化的反應(yīng)中形成高能硫基酯中間物。激活后，E2酶(遍在蛋白偶聯(lián)酶)將遍在蛋白從E1轉(zhuǎn)移到蛋白質(zhì)目標(biāo)。在某些情況下，E2單獨(dú)起作用。在其它情況下，它與結(jié)合蛋白質(zhì)底物的E3遍在蛋白連接酶一同起作用，重新招募E2以催化遍在蛋白化作用。E2遍在蛋白偶聯(lián)酶包括一個(gè)相當(dāng)保守的基因家族，而E3酶在序列上是多種多樣的[Ciechanover，A.，細(xì)胞7913-21(1994)；Ciechanover，A.和A.L.Schwartz，F(xiàn)ASEBJ，8182-91(1994)]。
在酵母中，E2遍在蛋白偶聯(lián)酶cdc34的突變，通過不能降解S-期細(xì)胞周期蛋白/cdk復(fù)合物的Sic1抑制劑，而導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯[King，R.W.等，科學(xué)2741652-9(1996)]。Sic1通常在細(xì)胞進(jìn)入G1-S期過渡時(shí)期降解，但在cdc34缺乏的情況下，Sic1避免了降解，且它的蓄積導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯。除了cdc34，cdc4是G1-S期過渡所需的另外三個(gè)蛋白質(zhì)之一。另外兩個(gè)是cdc53和Skp1。如上所述，cdc4含有兩個(gè)結(jié)構(gòu)基元、7個(gè)WD40重復(fù)體(這提示著該蛋白質(zhì)形成β-螺旋)和一個(gè)與作為SKP1相互作用結(jié)構(gòu)域的細(xì)胞周期蛋白F共有的結(jié)構(gòu)基元。[Bai，C.等，細(xì)胞86263-74(1996)]。包括cdc53、cdc4和Skp1(還有遍在蛋白、cdc34和E1)在內(nèi)的昆蟲細(xì)胞裂解產(chǎn)物能夠?qū)⒈樵诘鞍邹D(zhuǎn)移到Sic1，這提示這些成分中的一種或多種作為E3遍在蛋白連接酶起作用[King，R.W.等，科學(xué)2741652-9(1996)]。不論cdc4還是Skp1的表達(dá)增加都部分補(bǔ)償了另外一個(gè)的損失。
在秀麗新桿線蟲中，sel-10的突變沒有可見的表型，這說明sel-10在細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)中不起作用。一個(gè)密切相關(guān)的秀麗新桿線蟲及β-轉(zhuǎn)導(dǎo)素家族成員K10B2.6可具有這種作用，這是因?yàn)樗膳c來自爪蟾的基因TRCP_XEN成簇，該基因可拯救由于不能降解細(xì)胞周期蛋白B而在分裂后期階段停滯的酵母細(xì)胞周期突變體。如果sel-10確實(shí)編碼E3-遍在蛋白連接酶的一種成分，它怎樣能抑制sel-12而增強(qiáng)lin12突變呢？。
簡(jiǎn)單的假設(shè)是sel-10通過遍在蛋白-蛋白酶體途徑調(diào)控這兩種蛋白質(zhì)的降解。sel-12和lin-12都是跨膜蛋白質(zhì)。sel-12跨膜8次，以至于它的N-端和C-端都面向細(xì)胞溶膠[kim，T.W.等，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem)27211006-10(1997)]，而lin-12是I型跨膜蛋白質(zhì)(Greenwald，I.和G.Seydoux，自然346197-9(1990))。兩者都是遍在蛋白化的，并且就人類PS2來說，在用蛋白酶體抑制劑N-乙酰-L-亮氨酸-L-正亮氨酸和乳胱氨酸處理過的細(xì)胞中穩(wěn)態(tài)水平增高(Li，X.和I.Greenwald，神經(jīng)元171015-21(1996))?；蛘?，sel-10可能以早老素功能的負(fù)調(diào)節(jié)物的降解為目標(biāo)。
遺傳分析和由與cdc4的同源性提示的蛋白質(zhì)功能暗示，人sel-10的藥物抑制劑可能提高人早老素的穩(wěn)態(tài)水平。這能增強(qiáng)早老素途徑的潛在活性，并提供了一種治療性干預(yù)早老性癡呆的方法。
實(shí)施例2編碼秀麗新桿線蟲中早老素突變的外源基因抑制基因sel-10的人cDNA的5′RACE克隆材料和方法基于F55B12.3序列，制備用于從來源于秀麗新桿線蟲cDNA的sel-10編碼序列之?dāng)U增的寡核苷酸引物，該F55B12.3序列在實(shí)施例2中鑒定為秀麗新桿線蟲sel-10的編碼序列。
制備的引物是5′-CGGGATCCACCATGGATGATGGATCGATGACACC-3′(SEQ ID NO11)和5′-GGAATTCCTTAAGGGTATACAGCATCAAAGTCG-3′(SEQ ID NO12)。用BALSuperscriptII預(yù)擴(kuò)增試劑盒將秀麗新桿線蟲mRNA轉(zhuǎn)變?yōu)閏DNA。用限制酶BamHI和EcoRI(LTI，Gaithersberg，MD)消化pCR產(chǎn)物，并將其克隆入pcDNA3.1(Invitrogen)。將兩個(gè)分離物測(cè)序(ABI，Perkin-Elmer Corp)。
用Incyte克隆028971的序列(編碼秀麗新桿線蟲sel-10的人同系物的部分)設(shè)計(jì)四種反義寡核苷酸引物5′-TCACTTCATGTCCACATCAAAGTCC-3′(SEQ ID NO13)、5′-GGTAATTACAAGTTCTTGTTGAACTG-3′(SEQ ID NO14)、5′-CCCTGCAACGTGTGTAGACAGG-3′(SEQ ID NO15)和5′-CCAGTCTCTGCATTCCAC-ACTTTG-3′(SEQ IDNO16)，以擴(kuò)增人sel-10缺失的5′端。用Incyte LifeSeq“ElectronicNorthern”分析法鑒別在其中表達(dá)sel-10的組織。選擇這其中的兩個(gè)，海馬區(qū)和乳腺，用于應(yīng)用CloneTech Marathon試劑盒的5′RACE克隆形成，并從海馬區(qū)和乳腺制備Marathon-ready的cDNA。將PCR產(chǎn)物克隆入TA載體pCR3.1(Invitrogen公司)，并且將分離物測(cè)序。在具有基于不同于海馬區(qū)sel-10序列5′-CTCAGACAGGTCAGGACATTTGG-3′(SEQ ID NO17)的5′端的Incyte克隆，也設(shè)計(jì)出另外的5′寡核苷酸引物。
用Blastn探查Incyte數(shù)據(jù)庫(kù)LifeSeq和LifeSeqFL。用GCG程序進(jìn)行序列比較排列和翻譯(Wisconsin序列分析包，Unix第8版，遺傳學(xué)和計(jì)算機(jī)組，大學(xué)研究所公園，Madison Wisconsin)。
結(jié)果秀麗新桿線蟲sel-10的編碼序列秀麗新桿線蟲Sel-10預(yù)期的編碼序列，F(xiàn)55B12.3最先在圣路易斯華盛頓大學(xué)的基因組測(cè)序中心得到確定，其是通過應(yīng)用計(jì)算機(jī)程序GeneFinder，預(yù)測(cè)基因組粘粒F55B12中的內(nèi)含子和外顯子。通過擴(kuò)增來自秀麗新桿線蟲cDNA的該區(qū)域，并將其克隆、測(cè)序，進(jìn)一步證實(shí)了假設(shè)的cDNA序列。
人sel-10基因同系物的編碼序列所有的028971反義寡核苷酸擴(kuò)增了來源于人海馬區(qū)和乳腺cDNA的5′RACE產(chǎn)物?？寺〔y(cè)序來自于海馬區(qū)反應(yīng)物的最長(zhǎng)的PCR產(chǎn)物。設(shè)計(jì)該P(yáng)CR反應(yīng)以產(chǎn)生在預(yù)期的終止密碼子上截止的產(chǎn)物。兩分離物包含完全相同的序列，其開始于028971序始起始處之前的880堿基。通過與跨越Incyte cDNA克隆的比較進(jìn)一步證實(shí)了該序列。沒有將跨越人sel-10同系物的5′端的Incyte克隆命名為F55B12.3，因?yàn)樵谌撕托沱愋聴U線蟲基因之間該區(qū)域中的同源性低，且因?yàn)檫@些基因與命名的克隆之間的重疊對(duì)它們來講恰巧非常小，以至于Incyte數(shù)據(jù)庫(kù)中不能成簇，或被我們用028971序列Blast探查Incyte數(shù)據(jù)庫(kù)所揭露。
人sel-10的預(yù)期蛋白質(zhì)序列與秀麗新桿線蟲sel-10有47.6％相同和56.7％相似。人sel-10序列的N-端以4個(gè)符合讀框的甲硫氨酸起始。除了上述的WD40重復(fù)體，人序列也包括與用于結(jié)合Skp1(預(yù)期為sel-10同系物)的CDC4F-盒同源的區(qū)域。
在乳腺和海馬區(qū)組織中表達(dá)的不同人sel-10mRNA不同于海馬區(qū)序列的另外幾種人sel-10EST得到鑒定。存在精確的匹配，說明另外可選擇的轉(zhuǎn)錄本可能是真實(shí)的。這些序列與人海馬區(qū)sel-10序列的比較顯示了在第4個(gè)符合讀框的蛋氨酸之前的差異，從那之后顯示出精確的序列匹配。發(fā)現(xiàn)了對(duì)該選擇性轉(zhuǎn)錄本的5′端有特異性的寡核苷酸引物，以擴(kuò)增來源于乳腺而不是海馬區(qū)cDNA的產(chǎn)物。這說明了人sel-10轉(zhuǎn)錄以組織特異性方式經(jīng)歷了不同的剪接，或說明基因包含多種組織特異性的啟動(dòng)子。
討論用5′RACE和PCR擴(kuò)增克隆編碼秀麗新桿線蟲基因sel-10之人同系物的全長(zhǎng)cDNA。序列分析進(jìn)一步證實(shí)了先前的預(yù)想，即sel-10是包含F(xiàn)-盒和WD40重復(fù)體結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)CDC4家族的成員。人sel-10 cDNA的兩種變異體從海馬區(qū)和乳腺得到克隆，它們?cè)诜g起始位置的表觀位點(diǎn)之前的5′序列上不同。這提示該基因也許有兩個(gè)或更多的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，其為組織特異性的，或外顯子剪接模式為組織特異性的。
實(shí)施例3人細(xì)胞中抗原決定簇標(biāo)記的sel-10的表達(dá)，和由人sel-10產(chǎn)生的淀粉樣β肽加工紊亂材料和方法抗原決定簇標(biāo)記的sel-10的構(gòu)建亞克隆、細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)染應(yīng)用經(jīng)寡核苷酸237(5′-GGAATTCCATGAAAAGATTGGACCATGGTTCTG-3′)(SEQ ID NO18)和206(5′-GGAATTCCTCACTTCATGTCACATCAAAGTCCAG-3′)(SEQID NO19)引發(fā)的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，將EcoR1位點(diǎn)符合讀框地引入人sel-10 cDNA。將產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物克隆入載體pCS2+MT的EcoR1位點(diǎn)。這將5′6-myc抗原決定簇標(biāo)記符合讀框地融合入海馬區(qū)sel-10 cDNA的第5蛋氨酸，即，SEQ ID NO1中所示序列的核苷酸306的上游區(qū)。該構(gòu)建體的核苷酸序列命名為6-myc-N-sel-10，示于SEQ ID NO20中，而其編碼的多肽的氨基酸序列示于SEQ ID NO21中。海馬區(qū)和乳腺sel-10 cDNA在該蛋氨酸上游區(qū)不同。將具有3′-FLAG標(biāo)記的PS1cDNA(PS1-C-FLAG)亞克隆入pcDNA3.1載體。將包含瑞典NL突變的APP cDNA以及含有APP695 C-端的雙賴氨?；郊游?APP695NL-KK)之稀釋的ER保留序列亞克隆入載體pIRES-EGFP(Mullan等，自然遺傳學(xué)(NatGenet)1992年8月；1(5)345-7)。HEK293和IMR32細(xì)胞在帶10％FBS的DMEM中生長(zhǎng)為80％鋪滿，并用上述的cDNA轉(zhuǎn)染。10mg總DNA/6×106細(xì)胞總數(shù)用于由單一質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。為了多種質(zhì)粒的共轉(zhuǎn)染，每種質(zhì)粒采用均等數(shù)量，利用LipofectAmine(BKL)，總量為10mg DNA。
為了構(gòu)建C-端V5組氨酸標(biāo)記的sel-10和C-端mychis標(biāo)記的sel-10，用5′引物5′-GGGTACCCCTCATTATTCCCTCGAGTTCTTC-3′(SEQ ID NO22)上包含有KPNI限制位點(diǎn)和3′引物5′-GGAATTCCTTCATGTCCACATCAAAGTCC-3′(SEQ IDNO23)上包含有EcoRI位點(diǎn)的寡核苷酸作引物，用最初的人sel-10RACE PCR產(chǎn)物作模板，擴(kuò)增人海馬區(qū)sel-10的編碼序列。產(chǎn)物用KpnI和EcoRI兩者消化，并克隆入載體pcDNA6/V5-His A或pcDNA3.1/myc-His(+)A(Invitrogen公司)。通過雙脫氧測(cè)序法進(jìn)一步證實(shí)了獨(dú)立的分離物的核苷酸序列。C-端V5組氨酸標(biāo)記的sel-10的核苷酸序列示于SEQ ID NO24中，而其編碼的多肽的氨基酸序列示于SEQ ID NO25中。通過雙脫氧測(cè)序法進(jìn)一步證實(shí)獨(dú)立的分離物的核苷酸序列。C-端mychis組氨酸標(biāo)記的sel-10的核苷酸序列示于SEQ ID NO26中，而其編碼的多肽的氨基酸序列示于SEQID NO27中。
經(jīng)FACS對(duì)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞的克隆選擇在裝備有由空氣冷卻的氬激光提供的488nm激發(fā)線的EPICSElite ESP流式細(xì)胞計(jì)數(shù)器(Coulter，Hialeah，F(xiàn)L)上分析細(xì)胞樣本。通過525nm譜帶透過濾片測(cè)量EGFP發(fā)射，并在由前方和右側(cè)角光散射決定的存活細(xì)胞上選通后，在4-decade對(duì)數(shù)坐標(biāo)上顯示熒光強(qiáng)度。單個(gè)的綠色細(xì)胞經(jīng)分離進(jìn)入96孔平板的任一個(gè)孔中，其中包含不帶G481的生長(zhǎng)培養(yǎng)基。四天的恢復(fù)期后，將G418加入該培養(yǎng)基中至最終濃度為400mg/ml。具有克隆的孔從96孔平板擴(kuò)展至24孔平板上生長(zhǎng)，然后擴(kuò)展到6孔平板上生長(zhǎng)，其中在每一個(gè)階段選擇生長(zhǎng)最快的克隆用于擴(kuò)增。
免疫熒光在冰上用溶于PBS中的4％甲醛和0.1％TritonX-100轉(zhuǎn)染30分鐘后，在載玻片上固定細(xì)胞48小時(shí)，并用溶于PBS中的10％山羊血清(封閉液)室溫下(即25℃)封閉1小時(shí)，接著用小鼠anti-myc(10mg/ml)或兔抗FLAG(0.5mg/ml)抗體在4℃條件下培育過夜，然后在封閉液中用熒光素標(biāo)記的山羊抗-小鼠或抗-兔抗體(5mg/ml)，在25℃條件下封閉1小時(shí)。
Western印跡法在冰上用100ml TENT(50mM Tris-HClpH8.0、2mM EDTA、150mM NaCl、1％Triton X-100、1x蛋白酶抑制劑混合物)孵育105個(gè)細(xì)胞10分鐘，接著以14000g離心，轉(zhuǎn)染后48小時(shí)制備細(xì)胞裂解產(chǎn)物。將上清液置于4-12％NuPage凝膠(50mg蛋白質(zhì)/泳道)上電泳，并用X室II微室系統(tǒng)(Novex)進(jìn)行轉(zhuǎn)移。用在PBS中的5％牛奶在室溫下封閉此斑點(diǎn)印跡1小時(shí)，并在4℃條件下用anti-myc或抗FLAG抗體(如上面的“免疫熒光”所述)培育過夜，然后，在室溫下用綿羊抗小鼠或抗兔抗體-HRP(0.1mg/ml)培育1小時(shí)，接著用Supersignal(Pierce)檢測(cè)。
酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)在下述的能夠探查培養(yǎng)物上清液中的Aβ1-40和Aβ1-42肽水平的雙抗體夾心ELISA中，分析細(xì)胞培養(yǎng)物上清液或細(xì)胞裂解產(chǎn)物(100ml甲酸/106個(gè)細(xì)胞)。
在雙抗體夾心ELISA中，用單克隆抗體(mAb)6E10(Senetek，st.Louis，MO)和生物素化的兔抗血清162或164(NYS基礎(chǔ)研究院，Staten島，紐約)測(cè)量人Aβ1-40和Aβ1-42。捕獲抗體6E10對(duì)存在于人Aβ的N-端氨基酸殘基1-16的抗原決定簇是特異的。偶聯(lián)的探測(cè)抗體162和164分別對(duì)hAβ1-40和1-42是特異的。根據(jù)Pirttila等的方法實(shí)施夾心ELISA(衰老的神經(jīng)生物學(xué)(Neurobiology ofAging)18121-7(1997))。簡(jiǎn)而言之，將Nunc Maxisorp 96孔免疫平板用稀釋于0.1M碳酸鹽-磷酸氫鹽緩沖液、pH 9.6的mAb 6E10(5μg/ml)覆蓋(100μl/孔)，并在4℃條件下培育過夜。用含有0.05％吐溫-20的0.01M DPBS(Pierce，Rockford，II生產(chǎn)的ModifiedDulbecco′s磷酸緩沖鹽液(0.008M磷酸鈉、0.002M磷酸鉀、0.14M氯化鈉、0.01M氯化鉀、pH7.4))(DPBST)沖洗該板3次，用溶于0.01M DPBS的10％標(biāo)準(zhǔn)綿羊血清(Sigma公司)200微升封閉該板60分鐘，以避免非特異性結(jié)合。從1mg/mlDMSO貯存溶液中以非轉(zhuǎn)染條件的細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋人Aβ1-40或Aβ1-42標(biāo)準(zhǔn)(Bachem，Torrance，CA)，洗滌平板后加入上述標(biāo)準(zhǔn)100μl/孔以及100μl/孔樣品，即轉(zhuǎn)染細(xì)胞的經(jīng)過濾的條件培養(yǎng)基。該平板在室溫下培養(yǎng)2小時(shí)，并在4℃培養(yǎng)過夜。第二天，清洗該平板后，加入稀釋于DPBST+0.5％BSA的100μl/孔生物素化的免抗血清162(1∶400)或164((1∶50)，并在室溫孵育的1小時(shí)15分鐘。清洗后，加入在DPBST中以1∶10000稀釋的100μl/孔neutravidin-辣根過氧化酶(Pierce，Rockford，II)，并在室溫下孵育1小時(shí)。在最后一次清洗后，加入溶于50mM枸櫞酸/100mM磷酸鈉緩沖液(Sigma Chemicals，st.louis，MO)，pH5.0的鄰-苯二胺二鹽酸鹽100μl/孔(Sigma Chemicals，st.louis，MO)作為底物，并用Soft max Pro軟件在動(dòng)力學(xué)微孔板讀數(shù)儀中于450nm處監(jiān)控顏色發(fā)生20分鐘。
結(jié)果HEK293細(xì)胞的轉(zhuǎn)染通過應(yīng)用表達(dá)綠色熒光蛋白質(zhì)(GFP)或者通過用抗原決定簇標(biāo)記的sel-10或PS1免疫熒光探測(cè)檢驗(yàn)轉(zhuǎn)染效率。N-端6-myc抗原決定簇用于標(biāo)記人sel-10(6 myc-N-sel-10)，而PS1用C-端FLAG抗原決定簇(PS1-C-FLAG)標(biāo)記。通過包含提高Aβ加工能力的瑞典NL突變以及包含帶有C-端雙賴氨酸基元(APP695NL-KK)的稀釋的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)保留信號(hào)，修飾APP695。該雙賴氨酸基元提高了Aβ加工能力約2倍。將APP695NL-KK構(gòu)建體插入包括GFP的雙順反子載體(pIRES-EGFP，Invitrogen)的第一個(gè)順反子，以允許我們監(jiān)測(cè)轉(zhuǎn)染效率。對(duì)于用單種質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)染，HEK293細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染效率約為50％。對(duì)于用兩種質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，當(dāng)用雙免疫熒光檢測(cè)時(shí)，約30-40％的細(xì)胞表達(dá)兩種蛋白質(zhì)。
通過用于閘明PS-1-C-FLAG和6myc-N-sel-10(圖1A)的Western印跡法，證實(shí)了在轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞中重組蛋白質(zhì)的表達(dá)。在三種質(zhì)粒(PS1-C-FLAG+6 myc-N-sel-10+APP)共同轉(zhuǎn)染的情況中，應(yīng)用合適的抗體通過Western印跡法在同一細(xì)胞溶裂產(chǎn)物中探測(cè)到全部的三種蛋白質(zhì)。
6myc-N-sel-10和PS1-C-FLAG對(duì)Aβ加工的作用用6myc-N-sel-10或PS1-C-FLAG與APP695NL-KK共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，與僅用APP695NL-KK的轉(zhuǎn)染相比，增加了2到3倍釋放入培養(yǎng)物上清液中的Aβ1-40和Aβ1-42肽(表1)。用6myc-N-sel-10和PS1-C-FLAG兩者共轉(zhuǎn)染APP695NL-KK又進(jìn)一步增加了Aβ的釋放(即，增加4-6倍)。相反，釋放入上清液的Aβ1-42/(Aβ1-40+Aβ1-42)的比例降低了約50％。Aβ1-42/(Aβ1-40+Aβ1-42)比例的微妙降低，反映了Aβ1-40相對(duì)于Aβ1-42增加得更大。6myc-N-sel-10和PS1-C-FLAG都不影響HEK293細(xì)胞中的內(nèi)源性Aβ的生成。在IMR32細(xì)胞中也獲得了相似的觀察結(jié)果(表2)。然而，IMR32細(xì)胞的轉(zhuǎn)染不如HEK293細(xì)胞，所以通過與6myc-N-sel-10或PS1-C-FLAG共轉(zhuǎn)染對(duì)APP695NL-KK加工的刺激作用較低。
在用APP695NL-KK轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞中表達(dá)的Aβ1-40的水平足夠在培養(yǎng)物上清液和細(xì)胞沉淀中都測(cè)量到Aβ肽。僅用APP695NL-KK轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中，HEK293細(xì)胞沉淀中檢測(cè)到的Aβ1-40比上清液中多得多。用6myc-N-sel-10或PS1-C-FLAG共轉(zhuǎn)染成比例地降低在細(xì)胞沉淀的Aβ1-40，并增加培養(yǎng)物上清液中Aβ。這提示了6myc-N-sel-10和PS1-C-FLAG改變了APP的加工或運(yùn)輸，以至更多的Aβ成比例地從細(xì)胞釋放。6mycN-sel-10和PS1-C-FLAG表達(dá)對(duì)內(nèi)源性Aβ加工作用6myc-N-sel-10對(duì)人細(xì)胞中的內(nèi)源性Aβ的加工作用，通過創(chuàng)建表達(dá)這些蛋白的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的HEK293細(xì)胞系評(píng)估。產(chǎn)生了兩種表達(dá)6myc-N-sel-10細(xì)胞系(sel-10/2和sel-10/6)及用pcDAN3.1載體DNA轉(zhuǎn)化的控制細(xì)胞系。如由Western印跡分析法顯示兩種6myc-N-sel-10細(xì)胞系都表達(dá)該蛋白質(zhì)。在兩個(gè)6myc-N-sel-10細(xì)胞系中Aβ1-40內(nèi)源性產(chǎn)物同載體DNA轉(zhuǎn)化的細(xì)胞相比都有增加(表3)。此外，在用APP695NL-KK質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染后，6myc-N-sel-10的穩(wěn)定表達(dá)大大增加了Aβ產(chǎn)生。表達(dá)PS1-C-FLAG的6個(gè)穩(wěn)定的細(xì)胞系獲得了相似的結(jié)果。在用APP695NL-KK轉(zhuǎn)染后，6個(gè)細(xì)胞系全部顯示了內(nèi)源性Aβ加工能力顯著提高，還全部顯示了Aβ加工能力的增強(qiáng)(表3)。另外，見于利用6myc-N-sel-10轉(zhuǎn)染的Aβ加工的增高也見于C-端用mychis或V5組氨酸標(biāo)記的sel-10(見圖4)。C-端和N-端標(biāo)記都導(dǎo)致Aβ加工能力的增高。
討論這些資料表明，當(dāng)過度表達(dá)時(shí)，6myc-N-sel-10以及PS1-C-FLAG在短暫的和穩(wěn)定的表達(dá)系統(tǒng)中都改變了Aβ加工能力，在這些實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用6-myc抗原決定簇標(biāo)記，以允許用Western印跡分析法探測(cè)sel-10蛋白質(zhì)的表達(dá)。如果象它的酵母CDC4的序列同系物提示的那樣，sel-10是E2-E3遍在蛋白連接酶，應(yīng)該可能鑒定以遍在蛋白化為目標(biāo)的蛋白質(zhì)。由于早老素經(jīng)遍在蛋白-蛋白酶體路徑降解，PS1和PS2是sel-10催化的遍在蛋白化作用的符合邏輯的目標(biāo)[Kim等，生物化學(xué)雜志27211006-11010(1997)]。在此處sel-10如何影響Aβ加工仍不清楚。今后，需要確定sel-10和PS1是否通過改變APP產(chǎn)生、加工、轉(zhuǎn)運(yùn)或轉(zhuǎn)化數(shù)提高Aβ加工能力，以及PS1的作用是否由sel-10介導(dǎo)或調(diào)控。
這些實(shí)驗(yàn)表明，sel-10是AD治療中以降低Aβ水平為目標(biāo)的潛在藥物。它們還顯示秀麗新桿線蟲是于其中調(diào)查AD中早老素生物學(xué)的完美模式系統(tǒng)。因此，如由共轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)顯示以及在穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化物中所示，6myc-N-sel-10或PS1-C-FLAG的表達(dá)提高了Aβ加工能力。用APP695NL-KK與6myc-N-sel-10或PS1-C-FLAG共轉(zhuǎn)染后，在HEK293細(xì)胞和IMR32細(xì)胞中都可見Aβ加工能力的提高。在表達(dá)6myc-sel-10或PS1-C-FLAG的HEK293細(xì)胞的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化物中，觀察到內(nèi)源性Aβ加工能力的提高，以及用APP695NL-KK轉(zhuǎn)染后的Aβ加工能力的提高。這表明sel-10和/或PS1的抑制劑可以降低Aβ加工能力，并可能具有早老性癡呆的治療潛力。
顯而易見，本發(fā)明也許會(huì)用不同于上述的敘述和實(shí)施例中所述的方式實(shí)施。
參照上述教導(dǎo)，本發(fā)明的大量修飾和變體是有可能的，因此，它們落入本發(fā)明的范圍內(nèi)。
在此處引用的所有出版物的全部?jī)?nèi)容在此處引入作為參考。
表1.6myc-N-sel-10和PS1-C-FLAG瞬時(shí)轉(zhuǎn)染對(duì)HEK293細(xì)胞上清液中的Ab水平的影響轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒 Ab1-42 Ab1-40 Ab1-42/總Abng/ml ng/ml ng/mlpcDNA3 81±20 231±500.26±0.056myc-N-sel-10 67±7 246±340.21±0.03PS1-C-FLAG 75±18 227±450.25±0.03PS1-C-FLAG+6myc-N-sel-1077±21 220±260.25±0.03APP695NL-KK 141±27 896±103 0.14±0.02APP695NL-KK+6myc-N-sel-10 308±17 2576±190 0.11±0.00APP695NL-KK+PS1-C-FLAG 364±39 3334±337 0.09±0.00APP695NL-KK+PS1-C-FLAG+6myc-N-sel-10550±20 5897±388 0.09±0.00
表2.6myc-N-sel-10和PS1-C-FLAG瞬時(shí)轉(zhuǎn)染對(duì)IMR32細(xì)胞上清液中的Ab水平的影響轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒 Ab1-42 Ab1-40 Ab1-42/總Abng/mlng/mlng/mlpcDNA3 65±3319±146 0.19±0.066myc-N-sel-1063±0246±53 0.21±0.04PS1-C-FLAG 67±6307±79 0.18±0.04PS1-C-FLAG+6myc-N-sel-10 67±6302±94 0.20±0 08APP695NL-KK 66±5348±110 0.17±0.05APP695NL-KK+6myc-N-sel-1075±18 448±141 0.15±0.03APP695NL-KK+PS1-C-FLAG 63±26 466±72 0.12±0.02APP695NL-KK+PS1-C-FLAG+6myc-N-sel-10 81±26 565±179 0.12±0.01表3.來源于HEK293細(xì)胞的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化物的上清液中的內(nèi)源和外源Ab1-40和Ab1-42穩(wěn)定的細(xì)胞系 GFP轉(zhuǎn)染APP695NL-KK轉(zhuǎn)染Ab1-40 Ab1-42 Ab1-40 Ab1-42ng/ml ng/ml ng/mlng/ml6myc-N-sel10/2297±29109±17 4877±547750±326myc-N-sel10/6168±1885±11 8310±3081391±19PS1-C-FLAG/2 97±6 68±8 3348±68 493±21PS1-C-FLAG/8 118±1185±17 3516±364515±36PS1-C-FLAG/9 83±20 67±16 2369±73 350±12PS1-C-FLAG/11 152±1768±13 4771±325599±25PS1-C-FLAG/12 141±1250±10 4095±210449±21PS1-C-FLAG/13 270±139 61±28 6983±304745±41pcDNA3/1 43±13 75±15 1960±23461±6表4.在N-端或C-端具有抗原決定簇標(biāo)記的sel-10構(gòu)建體提高了Aβ1-40和Aβ1-42構(gòu)建體Aβ1-40％增加P-值 Aβ1-42％增加P-值pcDNA 4240±102 614±106myc-N-sel-10 7631±465 80％ 3.7×10-61136±73 46％ 7.9×10-6sel-10-C-mychis 5485±329 29％ 1.8×10-4795±5029％ 4.0×10-4sel-10-C-V5his6210±498 46％ 1.2×10-4906±7348％ 2.1×10-6
SEQUENCE LISTING<110>Gurney，Mark E.
Li，JinhePauley，Adele M.
Pharmacia & Upjohn 公司<120>人Sel-10多肽及編碼其的多核苷酸<130>6142<140>6142<141>1997-12-19<160>27<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>3550<212>DNA<213>人<400>1ctcattattc cctcgagttc ttctcagtca agctgcatgt atgtatgtgt gtcccgagaa 60gcggtttgat actgagctgc atttgccttt actgtggagt tttgttgccg gttctgctcc 120ctaatcttcc ttttctgacg tgcctgagca tgtccacatt agaatctgtg acatacctac 180ctgaaaaagg tttatattgt cagagactgc caagcagccg gacacacggg ggcacagaat 240cactgaaggg gaaaaataca gaaaatatgg gtttctacgg cacattaaaa atgatttttt 300acaaaatgaa aagaaagttg gaccatggtt ctgaggtccg ctctttttct ttgggaaaga 360aaccatgcaa agtctcagaa tatacaagta ccactgggct tgtaccatgt tcagcaacac 420caacaacttt tggggacctc agagcagcca atggccaagg gcaacaacga cgccgaatta 480catctgtcca gccacctaca ggcctccagg aatggctaaa aatgtttcag agctggagtg 540gaccagagaa attgcttgct ttagatgaac tcattgatag ttgtgaacca acacaagtaa 600aacatatgat gcaagtgata gaaccccagt ttcaacgaga cttcatttca ttgctcccta 660
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<213>人<400>10Met Lys Arg Lys Leu Asp His Gly Ser Glu Val Arg Ser Phe Ser Leu1 5 10 15Gly Lys Lys Pro Cys Lys Val Ser Glu Tyr Thr Ser Thr Thr Gly Leu20 25 30Val Pro Cys Ser Ala Thr Pro Thr Thr Phe Gly Asp Leu Arg Ala Ala35 40 45Asn Gly Gln Gly Gln Gln Arg Arg Arg Ile Thr Ser Val Gln Pro Pro50 55 60Thr Gly Leu Gln Glu Trp Leu Lys Met Phe Gln Ser Trp Ser Gly Pro65 70 75 80Glu Lys Leu Leu Ala Leu Asp Glu Leu Ile Asp Ser Cys Glu Pro Thr85 90 95Gln Val Lys His Met Met Gln Val Ile Glu Pro Gln Phe Gln Arg Asp100 105 110Phe Ile Ser Leu Leu Pro Lys Glu Leu Ala Leu Tyr Val Leu Ser Phe115 120 125Leu Glu pro Lys Asp Leu Leu Gln Ala Ala Gln Thr Cys Arg Tyr Trp130 135 140Arg Ile Leu Ala Glu Asp Asn Leu Leu Trp Arg Glu Lys Cys Lys Glu145 150 155 160Glu Gly Ile Asp Glu Pro Leu His Ile Lys Arg Arg Lys Val Ile Lys165 170 175
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<210>11<211>34<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述寡核苷酸引物<400>11cgggatccac catggatgat ggatcgatga cacc34<210>12<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述寡核苷酸引物<400>12ggaattcctt aagggtatac agcatcaaag tcg 33<210>13<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述寡核苷酸引物
<400>13tcacttcatg tccacatcaa agtcc 25<210>14<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述寡核苷酸引物<400>14ggtaattaca agttcttgtt gaactg 26<210>15<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述寡核苷酸引物<400>15ccctgcaacg tgtgtagaca gg 22<210>16<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述
寡核苷酸引物<400>16ccagtctctg cattccacac tttg 24<210>17<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述寡核苷酸引物<400>17ctcagacagg tcaggacatt tgg23<210>18<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述寡核苷酸引物<400>18ggaattccat gaaaagattg gaccatggtt ctg 33<210>19<211>34<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述寡核苷酸引物<400>19ggaattcctc acttcatgtc acatcaaagt ccag 34<210>20<211>1881<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述6myc標(biāo)記的人<400>20atggagcaaa agctcatttc tgaagaggac ttgaatgaaa tggagcaaaa gctcatttct 60gaagaggact tgaatgaaat ggagcaaaag ctcatttctg aagaggactt gaatgaaatg 120gagcaaaagc tcatttctga agaggacttg aatgaaatgg agcaaaagct catttctgaa 180gaggacttga atgaaatgga gagcttgggc gacctcacca tggagcaaaa gctcatttct 240gaagaggact tgaattccat gaaaagaaag ttggaccatg gttctgaggt ccgctctttt 300tctttgggaa agaaaccatg caaagtctca gaatatacaa gtaccactgg gcttgtacca 360tgttcagcaa caccaacaac ttttggggac ctcagagcag ccaatggcca agggcaacaa 420cgacgccgaa ttacatctgt ccagccacct acaggcctcc aggaatggct aaaaatgttt 480cagagctgga gtggaccaga gaaattgctt gctttagatg aactcattga tagttgtgaa 540ccaacacaag taaaacatat gatgcaagtg atagaacccc agtttcaacg agacttcatt 600tcattgctcc ctaaagagtt ggcactctat gtgctttcat tcctggaacc caaagacctg 660ctacaagcag ctcagacatg tcgctactgg agaattttgg ctgaagacaa ccttctctgg 720agagagaaat gcaaagaaga ggggattgat gaaccattgc acatcaagag aagaaaagta 780ataaaaccag gtttcataca cagtccatgg aaaagtgcat acatcagaca gcacagaatt 840gatactaact ggaggcgagg agaactcaaa tctcctaagg tgctgaaagg acatgatgat 900catgtgatca catgcttaca gttttgtggt aaccgaatag ttagtggttc tgatgacaac 960actttaaaag tttggtcagc agtcacaggc aaatgtctga gaacattagt gggacataca 1020ggtggagtat ggtcatcaca aatgagggac aacatcatca ttagtggatc tacagatcgg 1080
acactcaaag tgtggaatgc agagactgga gaatgtatac acaccttata tgggcatact 1140tccactgtgc gttgtatgca tcttcatgaa aaaagagttg ttagcggttc tcgagatgcc 1200actcttaggg tttgggatat tgagacaggc cagtgtttac atgttttgat gggtcatgtt 1260gcagcagtcc gctgtgttca atatgatggc aggagggttg ttagtggagc atatgatttt 1320atggtaaagg tgtgggatcc agagactgaa acctgtctac acacgttgca ggggcatact 1380aatagagtct attcattaca gtttgatggt atccatgtgg tgagtggatc tcttgataca 1440tccatccgtg tttgggatgt ggagacaggg aattgcattc acacgttaac agggcaccag 1500tcgttaacaa gtggaatgga actcaaagac aatattcttg tctctgggaa tgcagattct 1560acagttaaaa tctgggatat caaaacagga cagtgtttac aaacattgca aggtcccaac 1620aagcatcaga gtgctgtgac ctgtttacag ttcaacaaga actttgtaat taccagctca 1680gatgatggaa ctgtaaaact atgggacttg aaaacgggtg aatttattcg aaacctagtc 1740acattggaga gtggggggag tgggggagtt gtgtggcgga tcagagcctc aaacacaaag 1800ctggtgtgtg cagttgggag tcggaatggg actgaagaaa ccaagctgct ggtgctggac 1860tttgatgtgg acatgaagtg a1881<210>21<211>626<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述6myc標(biāo)記的人<400>21Met Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Glu Met Glu Gln1 5 10 15Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Glu Met Glu Gln Lys Leu Ile20 25 30Ser Glu Glu Asp Leu Asn Glu Met Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu35 40 45
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<223>人工序列描述寡核苷酸引物<400>22gggtacccct cattattccc tcgagttctt c 31<210>23<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述寡核苷酸引物<400>23ggaattcctt catgtccaca tcaaagtcc 29<210>24<211>2010
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述V5HIS標(biāo)記的人<400>24atgtgtgtcc cgagaagcgg tttgatactg agctgcattt gcctttactg tggagttttg 60ttgccggttc tgctccctaa tcttcctttt ctgacgtgcc tgagcatgtc cacattagaa 120tctgtgacat acctacctga aaaaggttta tattgtcaga gactgccaag cagccggaca 180cacgggggca cagaatcact gaaggggaaa aatacagaaa atatgggttt ctacggcaca 240ttaaaaatga ttttttacaa aatgaaaaga aagttggacc atggttctga ggtccgctct 300ttttctttgg gaaagaaacc atgcaaagtc tcagaatata caagtaccac tgggcttgta 360ccatgttcag caacaccaac aacttttggg gacctcagag cagccaatgg ccaagggcaa 420caacgacgcc gaattacatc tgtccagcca cctacaggcc tccaggaatg gctaaaaatg 480tttcagagct ggagtggacc agagaaattg cttgctttag atgaactcat tgatagttgt 540gaaccaacac aagtaaaaca tatgatgcaa gtgatagaac cccagtttca acgagacttc 600atttcattgc tccctaaaga gttggcactc tatgtgcttt cattcctgga acccaaagac 660ctgctacaag cagctcagac atgtcgctac tggagaattt tggctgaaga caaccttctc 720tggagagaga aatgcaaaga agaggggatt gatgaaccat tgcacatcaa gagaagaaaa 780gtaataaaac caggtttcat acacagtcca tggaaaagtg catacatcag acagcacaga 840attgatacta actggaggcg aggagaactc aaatctccta aggtgctgaa aggacatgat 900gatcatgtga tcacatgctt acagttttgt ggtaaccgaa tagttagtgg ttctgatgac 960aacactttaa aagtttggtc agcagtcaca ggcaaatgtc tgagaacatt agtgggacat 1020acaggtggag tatggtcatc acaaatgaga gacaacatca tcattagtgg atctacagat 1080cggacactca aagtgtggaa tgcagagact ggagaatgta tacacacctt atatgggcat 1140acttccactg tgcgttgtat gcatcttcat gaaaaaagag ttgttagcgg ttctcgagat 1200gccactctta gggtttggga tattgagaca ggccagtgtt tacatgtttt gatgggtcat 1260gttgcagcag tccgctgtgt tcaatatgat ggcaggaggg ttgttagtgg agcatatgat 1320tttatggtaa aggtgtggga tccagagact gaaacctgtc tacacacgtt gcaggggcat 1380actaatagag tctattcatt acagtttgat ggtatccatg tggtgagtgg atctcttgat 1440acatcaatcc gtgtttggga tgtggagaca gggaattgca ttcacacgtt aacagggcac 1500cagtcgttaa caagtggaat ggaactcaaa gacaatattc ttgtctctgg gaatgcagat 1560tctacagtta aaatctggga tatcaaaaca ggacagtgtt tacaaacatt gcaaggtccc 1620
aacaagcatc agagtgctgt gacctgttta cagttcaaca agaactttgt aattaccagc 1680tcagatgatg gaactgtaaa actatgggac ttgaaaacgg gtgaatttat tcgaaaccta 1740gtcacattgg agagtggggg gagtggggga gttgtgtggc ggatcagagc ctcaaacaca 1800aagctggtgt gtgcagttgg gagtcggaat gggactgaag aaaccaagct gctggtgctg 1860gactttgatg tggacatgaa ggaattctgc agatatccag cacagtggcg gccgctcgag 1920tctagagggc ccttcgaagg taagcctatc cctaaccctc tcctcggtct cgattctacg 1980cgtaccggtc atcatcacca tcaccattga 2010<210>25<211>669<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述V5HIS標(biāo)記的人<400>25Met Cys Val Pro Arg Ser Gly Leu Ile Leu Ser Cys Ile Cys Leu Tyr1 5 10 15Cys Gly Val Leu Leu Pro Val Leu Leu Pro Asn Leu Pro Phe Leu Thr20 25 30Cys Leu Ser Met Ser Thr Leu Glu Ser Val Thr Tyr Leu Pro Glu Lys35 40 45Gly Leu Tyr Cys Gln Arg Leu Pre Ser Ser Arg Thr His Gly Gly Thr50 55 60Glu Ser Leu Lys Gly Lys Asn Thr Glu Asn Met Gly Phe Tyr Gly Thr65 70 75 80Leu Lys Met Ile Phe Tyr Lys Met Lys Arg Lys Leu Asp His Gly Ser
85 90 95Glu Val Arg Ser Phe Ser Leu Gly Lys Lys Pro Cys Lys Val Ser Glu100 105 110Tyr Thr Ser Thr Thr Gly Leu Val Pro Cys Ser Ala Thr Pro Thr Thr115 120 125Phe Gly Asp Leu Arg Ala Ala Asn Gly Gln Gly Gln Gln Arg Arg Arg130 135 140Ile Thr Ser Val Gln Pro Pro Thr Gly Leu Gln Glu Trp Leu Lys Met145 150 155 160Phe Gln Ser Trp Ser Gly Pro Glu Lys Leu Leu Ala Leu Asp Glu Leu165 170 175Ile Asp Ser Cys Glu Pro Thr Gln Val Lys His Met Met Gln Val Ile180 185 190Glu Pro Gln Phe Gln Arg Asp Phe Ile Ser Leu Leu Pro Lys Glu Leu195 200 205Ala Leu Tyr Val Leu Ser Phe Leu Glu Pro Lys Asp Leu Leu Gln Ala210 215 220Ala Gln Thr Cys Arg Tyr Trp Arg Ile Leu Ala Glu Asp Asn Leu Leu225 230 235 240Trp Arg Glu Lys Cys Lys Glu Glu Gly Ile Asp Glu Pro Leu His Ile245 250 255Lys Arg Arg Lys Val Ile Lys Pro Gly Phe Ile His Ser Pro Trp Lys260 265 270
Ser Ala Tyr Ile Arg Gln His Arg Ile Asp Thr Asn Trp Arg Arg Gly275 280 285Glu Leu Lys Ser Pro Lys Val Leu Lys Gly His Asp Asp His Val Ile290 295 300Thr Cys Leu Gln Phe Cys Gly Asn Arg Ile Val Ser Gly Ser Asp Asp305 310 315 320Asn Thr Leu Lys Val Trp Ser Ala Val Thr Gly Lys Cys Leu Arg Thr325 330 335Leu Val Gly His Thr Gly Gly Val Trp Ser Ser Gln Met Arg Asp Asn340 345 350Ile Ile Ile Ser Gly Ser Thr Asp Arg Thr Leu Lys Val Trp Asn Ala355 360 365Glu Thr Gly Glu Cys Ile His Thr Leu Tyr Gly His Thr Ser Thr Val370 375 380Arg Cys Met His Leu His Glu Lys Arg Val Val Ser Gly Ser Arg Asp385 390 395 400Ala Thr Leu Arg Val Trp Asp Ile Glu Thr Gly Gln Cys Leu His Val405 410 415Leu Met Gly His Val Ala Ala Val Arg Cys Val Gln Tyr Asp Gly Arg420 425 430Arg Val Val Ser Gly Ala Tyr Asp Phe Met Val Lys Val Trp Asp Pro435 440 445Glu Thr Glu Thr Cys Leu His Thr Leu Gln Gly His Thr Asn Arg Val
450 455 460Tyr Ser Leu Gln Phe Asp Gly Ile His Val Val Ser Gly Ser Leu Asp465 470 475 480Thr Ser Ile Arg Val Trp Asp Val Glu Thr Gly Asn Cys Ile His Thr485 490 495Leu Thr Gly His Gln Ser Leu Thr Ser Gly Met Glu Leu Lys Asp Asn500 505 510Ile Leu Val Ser Gly Asn Ala Asp Ser Thr Val Lys Ile Trp Asp Ile515 520 525Lys Thr Gly Gln Cys Leu Gln Thr Leu Gln Gly Pro Asn Lys His Gln530 535 540Ser Ala Val Thr Cys Leu Gln Phe Asn Lys Asn Phe Val Ile Thr Ser545 550 555 560Ser Asp Asp Gly Thr Val Lys Leu Trp Asp Leu Lys Thr Gly Glu Phe565 570 575Ile Arg Asn Leu Val Thr Leu Glu Ser Gly Gly Ser Gly Gly Val Val580 585 590Trp Arg Ile Arg Ala Ser Asn Thr Lys Leu Val Cys Ala Val Gly Ser595 600 605Arg Asn Gly Thr Glu Glu Thr Lys Leu Leu Val Leu Asp Phe Asp Val610 615 620Asp Met Lys Glu Phe Cys Arg Tyr Pro Ala Gln Trp Arg Pro Leu Glu625 630 635 640
Ser Arg Gly Pro Phe Glu Gly Lys Pro Ile Pro Asn Pro Leu Leu Gly645 650 655Leu Asp Ser Thr Arg Thr Gly His His His His His His660 665<210>26<211>2001<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述MYCHIS標(biāo)記的人<400>26atgtgtgtcc cgagaagcgg tttgatactg agctgcattt gcctttactg tggagttttg 60ttgccggttc tgctccctaa tcttcctttt ctgacgtgcc tgagcatgtc cacattagaa 120tctgtgacat acctacctga aaaaggttta tattgtcaga gactgccaag cagccggaca 180cacgggggca cagaatcact gaaggggaaa aatacagaaa atatgggttt ctacggcaca 240ttaaaaatga ttttttacaa aatgaaaaga aagttggacc atggttctga ggtccgctct 300ttttctttgg gaaagaaacc atgcaaagtc tcagaatata caagtaccac tgggcttgta 360ccatgttcag caacaccaac aacttttggg gacctcagag cagccaatgg ccaagggcaa 420caacgacgcc gaattacatc tgtccagcca cctacaggcc tccaggaatg gctaaaaatg 480tttcagagct ggagtggacc agagaaattg cttgctttag atgaactcat tgatagttgt 540gaaccaacac aagtaaaaca tatgatgcaa gtgatagaac cccagtttca acgagacttc 600atttcattgc tccctaaaga gttggcactc tatgtgcttt cattcctgga acccaaagac 660ctgctacaag cagctcagac atgtcgctac tggagaattt tggctgaaga caaccttctc 720tggagagaga aatgcaaaga agaggggatt gatgaaccat tgcacatcaa gagaagaaaa 780gtaataaaac caggtttcat acacagtcca tggaaaagtg catacatcag acagcacaga 840attgatacta actggaggcg aggagaactc aaatctccta aggtgctgaa aggacatgat 900gatcatgtga tcacatgctt acagttttgt ggtaaccgaa tagttagtgg ttctgatgac 960aacactttaa aagtttggtc agcagtcaca ggcaaatgtc tgagaacatt agtgggacat 1020
acaggtggag tatggtcatc acaaatgaga gacaacatca tcattagtgg atctacagat 1080cggacactca aagtgtggaa tgcagagact ggagaatgta tacacacctt atatgggcat 1140acttccactg tgcgttgtat gcatcttcat gaaaaaagag ttgttagcgg ttctcgagat 1200gccactctta gggtttggga tattgagaca ggccagtgtt tacatgtttt gatgggtcat 1260gttgcagcag tccgctgtgt tcaatatgat ggcaggaggg ttgttagtgg agcatatgat 1320tttatggtaa aggtgtggga tccagagact gaaacctgtc tacacacgtt gcaggggcat 1380actaatagag tctattcatt acagtttgat ggtatccatg tggtgagtgg atctcttgat 1440acatcaatcc gtgtttggga tgtggagaca gggaattgca ttcacacgtt aacagggcac 1500cagtcgttaa caagtggaat ggaactcaaa gacaatattc ttgtctctgg gaatgcagat 1560tctacagtta aaatctggga tatcaaaaca ggacagtgtt tacaaacatt gcaaggtccc 1620aacaagcatc agagtgctgt gacctgttta cagttcaaca agaactttgt aattaccagc 1680tcagatgatg gaactgtaaa actatgggac ttgaaaacgg gtgaatttat tcgaaaccta 1740gtcacattgg agagtggggg gagtggggga gttgtgtggc ggatcagagc ctcaaacaca 1800aagctggtgt gtgcagttgg gagtcggaat gggactgaag aaaccaagct gctggtgctg 1860gactttgatg tggacatgaa ggaattctgc agatatccag cacagtggcg gccgctcgag 1920tctagagggc ccttcgaaca aaaactcatc tcagaagagg atctgaatat gcataccggt 1980catcatcacc atcaccattg a2001<210>27<211>666<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述MYCHIS標(biāo)記的人<400>27Met Cys Val Pro Arg Ser Gly Leu Ile Leu Ser Cys Ile Cys Leu Tyr1 5 10 15Cys Gly Val Leu Leu Pro Val Leu Leu Pro Asn Leu Pro Phe Leu Thr20 25 30Cys Leu Ser Met Ser Thr Leu Glu Ser Val Thr Tyr Leu Pro Glu Lys
35 40 45Gly Leu Tyr Cys Gln Arg Leu Pro Ser Ser Arg Thr His Gly Gly Thr50 55 60Glu Ser Leu Lys Gly Lys Asn Thr Glu Asn Met Gly Phe Tyr Gly Thr65 70 75 80Leu Lys Met Ile Phe Tyr Lys Met Lys Arg Lys Leu Asp His Gly Ser85 90 95Glu Val Arg Ser Phe Ser Leu Gly Lys Lys Pro Cys Lys Val Ser Glu100 105 110Tyr Thr Ser Thr Thr Gly Leu Val Pro Cys Ser Ala Thr Pro Thr Thr115 120 125Phe Gly Asp Leu Arg Ala Ala Asn Gly Gln Gly Gln Gln Arg Arg Arg130 135 140Ile Thr Ser Val Gln Pro Pro Thr Gly Leu Gln Glu Trp Leu Lys Met145 150 155 160Phe Gln Ser Trp Ser Gly Pro Glu Lys Leu Leu Ala Leu Asp Glu Leu165 170 175Ile Asp Ser Cys Glu Pro Thr Gln Val Lys His Met Met Gln Val Ile180 185 190Glu Pro Gln Phe Gln Arg Asp Phe Ile Ser Leu Leu Pro Lys Glu Leu195 200 205Ala Leu Tyr Val Leu Ser Phe Leu Glu Pro Lys Asp Leu Leu Gln Ala210 215 220
Ala Gln Thr Cys Arg Tyr Trp Arg Ile Leu Ala Glu Asp Asn Leu Leu225 230 235 240Trp Arg Glu Lys Cys Lys Glu Glu Gly Ile Asp Glu Pro Leu His Ile245 250 255Lys Arg Arg Lys Val Ile Lys Pro Gly Phe Ile His Ser Pro Trp Lys260 265 270Ser Ala Tyr Ile Arg Gln His Arg Ile Asp Thr Asn Trp Arg Arg Gly275 280 285Glu Leu Lys Ser Pro Lys Val Leu Lys Gly His Asp Asp His Val Ile290 295 300Thr Cys Leu Gln Phe Cys Gly Asn Arg Ile Val Ser Gly Ser Asp Asp305 310 315 320Asn Thr Leu Lys Val Trp Ser Ala Val Thr Gly Lys Cys Leu Arg Thr325 330 335Leu Val Gly His Thr Gly Gly Val Trp Ser Ser Gln Met Arg Asp Asn340 345 350Ile Ile Ile Ser Gly Ser Thr Asp Arg Thr Leu Lys Val Trp Asn Ala355 360 365Glu Thr Gly Glu Cys Ile His Thr Leu Tyr Gly His Thr Ser Thr Val370 375 380Arg Cys Met His Leu His Glu Lys Arg Val Val Ser Gly Ser Arg Asp385 390 395 400Ala Thr Leu Arg Val Trp Asp Ile Glu Thr Gly Gln Cys Leu His Val
405 410 415Leu Met Gly His Val Ala Ala Val Arg Cys Val Gln Tyr Asp Gly Arg420 425 430Arg Val Val Ser Gly Ala Tyr Asp Phe Met Val Lys Val Trp Asp Pro435 440 445Glu Thr Glu Thr Cys Leu His Thr Leu Gln Gly His Thr Asn Arg Val450 455 460Tyr Ser Leu Gln Phe Asp Gly Ile His Val Val Ser Gly Ser Leu Asp465 470 475 480Thr Ser Ile Arg Val Trp Asp Val Glu Thr Gly Asn Cys Ile His Thr485 490 495Leu Thr Gly His Gln Ser Leu Thr Ser Gly Met Glu Leu Lys Asp Asn500 505 510Ile Leu Val Ser Gly Asn Ala Asp Ser Thr Val Lys Ile Trp Asp Ile515 520 525Lys Thr Gly Gln Cys Leu Gln Thr Leu Gln Gly Pro Asn Lys His Gln530 535 540Ser Ala Val Thr Cys Leu Gln Phe Asn Lys Asn Phe Val Ile Thr Ser545 550 555 560Ser Asp Asp Gly Thr Val Lys Leu Trp Asp Leu Lys Thr Gly Glu Phe565 570 575Ile Arg Asn Leu Val Thr Leu Glu Ser Gly Gly Ser Gly Gly Val Val580 585 590
Trp Arg Ile Arg Ala Ser Asn Thr Lys Leu Val Cys Ala Val Gly Ser595 600 605Arg Asn Gly Thr Glu Glu Thr Lys Leu Leu Val Leu Asp Phe Asp Val610 615 620Asp Met Lys Glu Phe Cys Arg Tyr Pro Ala Gln Trp Arg Pro Leu Glu625 630 635 640Ser Arg Gly Pro Phe Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn645 650 655Met His Thr Gly His His His His His His660 66權(quán)利要求
1.一種用于鑒定能改變?nèi)缦率黾?xì)胞系中產(chǎn)生的Aβ1-40/Aβ1-40+Aβ1-42比例的試劑的方法，其包括以下步驟(a)獲得所述細(xì)胞系的測(cè)試培養(yǎng)物和對(duì)照培養(yǎng)物；(b)將所述的測(cè)試培養(yǎng)物與測(cè)試試劑接觸；(c)測(cè)定步驟(b)所述測(cè)試培養(yǎng)物和所述對(duì)照培養(yǎng)物產(chǎn)生的Aβ1 -40和Aβ1-42的水平；(d)從步驟(c)中測(cè)量的Aβ1-40和Aβ1-42水平，計(jì)算出對(duì)于所述測(cè)試培養(yǎng)物和所述對(duì)照培養(yǎng)物之Aβ1-40/Aβ1-40+Aβ1-42的比例；和(e)比較步驟(d)中測(cè)量的對(duì)于所述測(cè)試培養(yǎng)物和所述對(duì)照培養(yǎng)物之Aβ1-40/Aβ1-40+Aβ1-42的比例；由此，確定所述測(cè)試培養(yǎng)物的Aβ1-40/Aβ1-40+Aβ1-42的比例高于或低于所述對(duì)照培養(yǎng)物的Aβ1-40/Aβ1-40+Aβ1-42的比例，提示所述的測(cè)試試劑改變了Aβ1-40/Aβ1-40+Aβ1-42的比例，其中所述細(xì)胞系具有改變了的Aβ加工，且表達(dá)sel-10核酸分子，所述sel-10核酸分子，其包含的多核苷酸具有與選自下列各組的序列至少有95％相同的序列(a)編碼具有sel-10生物活性的多肽的核苷酸序列，其中所述多肽具有選自SEQ ID NO3、SEQ ID NO4、SEQ ID NO5、SEQID NO6及SEQ ID NO7的完整氨基酸序列；(b)編碼具有sel-10生物活性的多肽的核苷酸序列，其中所述多肽具有選自SEQ ID NO8和SEQ ID NO9的完整氨基酸序列；和(c)與(a)或(b)中的全長(zhǎng)核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列；或者其包含在嚴(yán)格的條件下可同具有上述(a)、(b)或(c)中所述的核苷酸序列的多核苷酸雜交的多核苷酸，其中所述嚴(yán)格雜交條件包括在6×SSC/0.1％SDS中在42℃下過夜孵育2.5小時(shí)，然后在1×SSC和0.1％SDS中65℃下洗滌；其中所述分離的核酸分子編碼具有sel-10生物活性的多肽，或者是編碼具有sel-10生物活性的多肽之分離的核酸之互補(bǔ)物。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述的Aβ1-40/Aβ1-40+Aβ1-42的比例被所述的測(cè)試試劑增大。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述的Aβ1-40/Aβ1-40+Aβ1-42的比例被所述的測(cè)試試劑減小。
全文摘要
本發(fā)明提供了包含編碼人sel－10的兩種可選擇剪接變異體中任意一個(gè)的多核苷酸之分離的核酸分子，這兩種變異體中的一個(gè)在海馬區(qū)中表達(dá)，一個(gè)在乳腺細(xì)胞中表達(dá)。本發(fā)明還提供了分離的sel－10多肽和其中Aβ加工被改變的表達(dá)所述多肽的細(xì)胞系。
文檔編號(hào)C12N5/02GK1597988SQ20041006379
公開日2005年3月23日 申請(qǐng)日期1998年12月17日 優(yōu)先權(quán)日1997年12月19日
發(fā)明者M·E·古尼, 李金河, A·M·保利 申請(qǐng)人:法瑪西雅厄普約翰美國(guó)公司