專利名稱：L－氨基酸的生產(chǎn)方法
背景技術(shù)：
發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及發(fā)酵工業(yè)。更特別的是，本發(fā)明涉及一種具有生產(chǎn)L-氨基酸能力的細(xì)菌，以及使用該菌生產(chǎn)L-氨基酸的方法。
相關(guān)技術(shù)的描述目前，廣泛認(rèn)為ppGpp(鳥苷-3’-二磷酸-5’-二磷酸)和pppGpp(鳥苷-3’-三磷酸-5’-二磷酸)在微生物細(xì)胞中作為信號(hào)物質(zhì)發(fā)揮著重要的作用。已知ppGpp是一種基本的物質(zhì)，當(dāng)微生物增殖所必須的細(xì)胞內(nèi)氨基酸和糖都被耗盡時(shí)，該物質(zhì)能夠誘導(dǎo)微生物體內(nèi)的適應(yīng)機(jī)制，從而使其在此條件下得以存活。
據(jù)報(bào)道，ppGpp分別由RelA蛋白和SpoT蛋白產(chǎn)生，兩者又分別是大腸桿菌體內(nèi)的relA基因和spoT基因的編碼產(chǎn)物。此外，這些基因和蛋白的核苷酸序列和氨基酸序列也都被報(bào)道過(GenBank accession J04039，Metzger，S.et al.，J.Biol.Chem.，1988，263(30)，15699-15704，GenBank accession AE000442U00096)。
RelA蛋白在細(xì)菌細(xì)胞中以與核糖體結(jié)合的形式存在，當(dāng)它接受氨基酸損耗(depletion)的信號(hào)時(shí)，就將一個(gè)非氨?；膖RNA結(jié)合到核糖體上，然后利用GTP和GDP來生產(chǎn)pppGpp。另一方面，已知SpoT蛋白是一種酶，該酶能夠催化三種反應(yīng)，如從pppGpp到ppGpp的反應(yīng)，從GTP到ppGpp的反應(yīng)和從ppGpp到GTP的反應(yīng)。在下文中ppGpp和pppGpp均稱為是“ppGpp”，因?yàn)樗鼈儽徽J(rèn)為在細(xì)胞中的生理學(xué)功能上是相同的。
已知當(dāng)培養(yǎng)基內(nèi)和細(xì)胞中的氨基酸突然損耗時(shí)，ppGpp就會(huì)通過RelA蛋白在細(xì)胞內(nèi)積累，這些細(xì)胞通常表現(xiàn)出一系列的反應(yīng)，包括核糖體合成的終止，核糖體蛋白的降解，不同氨基酸生物合成途徑中的基因表達(dá)的增強(qiáng)等等。這些通常被認(rèn)為是應(yīng)急反應(yīng)(stringent responses)，并且這些應(yīng)急反應(yīng)已被廣泛認(rèn)為對(duì)于細(xì)胞在由于氨基酸耗盡而導(dǎo)致的饑餓狀態(tài)下的存活是必要的反應(yīng)(Cashel，M，Gentry，D.R.，Hernadez，V J.，and Vinella，D.，The stringent response，InNeidhardt，F(xiàn).C.et al.(ed)Escherichia coli and Salmonella；Cellar and Molecular Biology，2ndedition，1458-1469(ASM Press，Washington d.c.，1996)。
到目前為止，分析實(shí)例將注意力放在ppGpp引起的物質(zhì)的產(chǎn)生上，包括使用消除了產(chǎn)生ppGpp活性的重組大腸桿菌以提高蛋白的產(chǎn)量(Dedhia，N.et al.，Biotechnol.Bioeng.，1997，Vol.53，379-386)，通過修飾放線菌體內(nèi)的核糖體蛋白和RNA聚合酶的ppGpp-結(jié)合位點(diǎn)來提高抗生素的生產(chǎn)能力(Hu，H.，and Ochi，K.，Appl.Environ.Microbiol.，2001，Vol.67，1885-18921，Hu，H.，Zhang，Q.，and Ochi，K.，J.Bacteriol.，2002，Vol.184，3984-3991)等等。
然而，至今仍沒有有關(guān)氨基酸生物合成系統(tǒng)與ppGpp生產(chǎn)能力之間關(guān)系的研究報(bào)道，其中所述生物合成系統(tǒng)被公認(rèn)為由ppGpp直接作用。
發(fā)明概述本發(fā)明的一個(gè)目的是提高細(xì)菌生產(chǎn)L-氨基酸的能力，以及具有生產(chǎn)L-氨基酸能力被提高的細(xì)菌。
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種生產(chǎn)L-氨基酸的方法，該方法包括在培養(yǎng)基上培養(yǎng)具有生產(chǎn)L-氨基酸能力的細(xì)菌，使L-氨基酸在培養(yǎng)物中積累，然后從培養(yǎng)物中收集L-氨基酸，其中所述的細(xì)菌被修飾過，從而使提高了合成ppGpp的活性。
本發(fā)明的進(jìn)一步的目的是提供上面所述的方法，其中所述的細(xì)菌經(jīng)過修飾從而合成ppGpp的酶的活性被提高了。
本發(fā)明的進(jìn)一步的目的是提供上面所述的方法，其中所述的酶是RelA蛋白，或者是該蛋白的催化結(jié)構(gòu)域。
本發(fā)明的進(jìn)一步的目的是提供上面所述的方法，其中所述的RelA蛋白的活性通過提高relA基因的拷貝數(shù)或者是提高編碼RelA蛋白催化結(jié)構(gòu)域的relA基因的部分區(qū)域的拷貝數(shù)而被增強(qiáng)；或者通過修飾relA基因的表達(dá)調(diào)控序列，從而使細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)relA基因的表達(dá)或編碼RelA蛋白催化結(jié)構(gòu)域的relA基因的部分區(qū)域的表達(dá)得以增強(qiáng)。進(jìn)一步目的是提供上面所述的方法，其中所述的RelA蛋白被定義為如下的(A)或(B)(A) 一種具有SEQ ID NO20所示氨基酸序列的蛋白。
(B) 一種具有SEQ ID NO20的包括其替換，缺失，插入，增加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的氨基酸序列的蛋白，且所述的蛋白具有合成ppGpp的活性。并且所述蛋白質(zhì)具有合成ppGpp的活性。
本發(fā)明的進(jìn)一步的目的是提供一種上述的方法，其中所述的RelA蛋白是由如下(a)或(b)編碼的(a)具有SEQ ID NO19所示核苷酸序列的DNA。
(b)具有在嚴(yán)謹(jǐn)條件下能與SEQ ID NO.19核苷酸序列雜交的DNA，且所述的DNA編碼具有合成ppGpp活性的蛋白。
本發(fā)明的進(jìn)一步的目的是提供一種上面所述的方法，其中所述的L-氨基酸選自L-谷氨酸，L-蘇氨酸，L-異亮氨酸，L-賴氨酸，L-組氨酸，L-纈氨酸，L-精氨酸，L-亮氨酸，L-苯丙氨酸和L-色氨酸。
本發(fā)明的進(jìn)一步的目的是提供一種上面所述的方法，其中所述的L-氨基酸選自L-谷氨酸，L-蘇氨酸，L-異亮氨酸和L-賴氨酸。
本發(fā)明的進(jìn)一步的目的是提供一種上面所述的方法，其中所述的細(xì)菌屬于埃希氏菌屬。
本發(fā)明的更進(jìn)一步的目的是提供一種具有生產(chǎn)L-氨基酸能力的和經(jīng)過修飾，并增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)RelA蛋白的活性的細(xì)菌。
根據(jù)本發(fā)明，細(xì)菌生產(chǎn)L-氨基酸的能力能被提高。
附圖簡(jiǎn)要說明

圖1顯示質(zhì)粒pM14和pM15的構(gòu)建。
圖2顯示質(zhì)粒pMD4041-cat-2Tfd的構(gòu)建。
圖3顯示質(zhì)粒pSTVrelA和pSTVrelA*的構(gòu)建。
優(yōu)選實(shí)施例的描述本發(fā)明的發(fā)明人為了實(shí)現(xiàn)前述發(fā)明目的，進(jìn)行了刻苦的研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)通過提高ppGpp的生產(chǎn)能力，特別是通過增強(qiáng)RelA蛋白合成ppGpp的活性，能夠提高L-氨基酸的生產(chǎn)能力。因此，完成本發(fā)明。
接下來，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述。
本發(fā)明中所使用的細(xì)菌本發(fā)明中的細(xì)菌具有生產(chǎn)L-氨基酸的能力，并且經(jīng)過修飾使其在細(xì)胞內(nèi)合成ppGpp的能力增強(qiáng)。
本發(fā)明中的細(xì)菌沒有特別的限制，只要通過增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)合成ppGpp的活性，其生產(chǎn)L-氨基酸的能力可被增強(qiáng)。細(xì)菌的實(shí)例，包括但不局限于，屬于埃希氏菌屬(Escherichia)的細(xì)菌如大腸桿菌(Escherichia coli)，棒狀桿菌如乳酸發(fā)酵短桿菌(Brevibacterium lactofermentum)，屬于沙雷氏菌屬(Serratia)的細(xì)菌如粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratia marcescens)，屬于桿狀菌屬(Bacillus)的細(xì)菌如枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)等等。
本發(fā)明中所使用的術(shù)語(yǔ)“生產(chǎn)L-氨基酸的能力”是指，當(dāng)本發(fā)明的細(xì)菌在培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，能夠促使L-氨基酸在培養(yǎng)基中積累的一種能力。這種生產(chǎn)L-氨基酸的能力可以是野生型細(xì)菌菌株內(nèi)在固有的一種性質(zhì)，也可以是通過繁殖(breeding)而賦予的或者增強(qiáng)的一種性質(zhì)。
L-氨基酸的實(shí)例包括L-谷氨酸、L-蘇氨酸、L-異亮氨酸、L-賴氨酸、L-組氨酸、L-纈氨酸、L-精氨酸、L-亮氨酸、L-苯丙氨酸和L-色氨酸等等。在這些L-氨基酸中，L-谷氨酸、L-蘇氨酸、L-異亮氨酸和L-賴氨酸是優(yōu)選的。
具有生產(chǎn)L-氨基酸能力的細(xì)菌的特殊的例子，包括但不局限于，下述的以L-谷氨酸作為目的氨基酸的大腸桿菌MG1655ΔsucA(見實(shí)施例部分)，大腸桿菌AJ12624(FERM BP-3853，見FR2680178)，大腸桿菌的L-纈氨酸抗性菌株例如大腸桿菌B11、大腸桿菌K-12(ATCC10798)、大腸桿菌B(ATCC11303)和大腸桿菌W(ATCC9637)，乳酸發(fā)酵短桿菌AJ12475(FERM BP-2922，見US5272067)等等；以L-蘇氨酸作為目的氨基酸的大腸桿菌VKPM B-3996(見US5175107)，大腸桿菌MG442菌株(VKPM B-1628，見Gusyatiner et al.，Genetika(in Russian)，14，pp.947-956，1978，US4278765)，嗜乙酰乙酸短桿菌(Corynebacteriumacetoacidophilum)AJ12318(FERM BP-1172，見US5188949)等等；以L-異亮氨酸作為目的氨基酸的大腸桿菌KX141(VKPM B-4781，見EP519113)，黃色短桿菌(Brevibacterium flavum)AJ12149(FERM BP-759，見US4656135)等等；以L-賴氨酸作為目的氨基酸的大腸桿菌AJ11442(NRRL B-12185，F(xiàn)ERMBP-1543，見US4346170)，大腸桿菌WC196菌株(FERM BP-5252，WO96/17930)，乳酸發(fā)酵短桿菌AJ3990(ATCC31269，見US4066501)等等；以L-苯丙氨酸作為目的氨基酸的大腸桿菌AJ12604(FERM BP-3579，見EP488424)，乳酸發(fā)酵短桿菌AJ12637(FERM BP-4160，見FR2686898)等等；以L-亮氨酸作為目的氨基酸的，具有β-2-噻吩丙氨酸抗性的菌株，具有β-2-噻吩丙氨酸抗性和β-羥基亮氨酸抗性的菌株(見JP62-34397，其針對(duì)前面兩者)，具有4-氮亮氨酸(4-azaleucine)或者是5，5，5-三氟亮氨酸抗性的菌株(見JP8-70897)，大腸桿菌AJ11478(FERM P-5274，見JP62-34397)，乳酸發(fā)酵短桿菌AJ3718(FERM P-2516，見US3970519)等等。
以L-纈氨酸作為目的氨基酸的大腸桿菌VL1970(VKPM B-4411，見EP519113)，乳酸發(fā)酵短桿菌AJ12341(FERM BP-1763，見US5188948)等等，和以L-高絲氨酸作為目的氨基酸的NZ10菌株，該菌株是一個(gè)大腸桿菌C600的Leu+回復(fù)突變型菌株(見Appleyard R.K.，Genetics，39，pp.440-452，1954)。
在上面所述的菌株中，大腸桿菌MG1655ΔsucA菌株是通過破壞MG1655菌株(得自大腸桿菌遺傳繁殖中心(Yale University，Dept.Biology，OsbornMemorial Labs.，06511-7444 New Haven，Connecticut，U.S.A.，P.O.Box 6666)中編碼aKGDH(a-酮戊二酸脫氫酶)E1亞基的一個(gè)基因(sucA)而獲得的(見實(shí)施例部分)。因此核苷酸序列和編碼的氨基酸序列是已知的(見，例如，GenBank收錄號(hào)X00661)。此外，對(duì)于大腸桿菌染色體sucA基因的破壞也是已知的(見EP0670370B1)。
另外，大腸桿菌B-3996菌株缺乏thrC基因，利用蔗糖，并且在ilvA基因處有一個(gè)滲漏突變。此菌株在與對(duì)蘇氨酸和高絲氨酸具有高耐受性有關(guān)的rht基因處有一個(gè)突變(FR2804971)。B-3996菌株含有pVIC40質(zhì)粒，該質(zhì)粒的獲得是通過將一個(gè)thrA*BC操縱子插入到來自于RSF1010的載體上，其中的操縱子含有一個(gè)突變的、編碼天冬氨酸激酶-高絲氨酸脫氫酶I的thrA基因，對(duì)于蘇氨酸的反饋抑制是極不敏感的。B-3996菌株已于1987年4月7日保藏于俄羅斯國(guó)際工業(yè)微生物保藏中心(VKPM)(地址Dorozhny proezd.1，Moscow113545，Russian Federation)，其保藏編號(hào)為B-3996。
菌株B-3996/pMWD5(JP08-047397，US5998178)的獲得是通過將質(zhì)粒pMWD5導(dǎo)入到菌株B-3996中，其中所述質(zhì)粒含有ilvGMEDA操縱子，該操縱子中除去了弱化作用(attenuation)所必需的區(qū)域(JP08-047397，WO96/26289)。
本發(fā)明中的細(xì)菌可通過修飾具有生產(chǎn)上面提及的L-氨基酸能力的細(xì)菌而獲得，從而使細(xì)菌合成ppGpp的活性得以增強(qiáng)。本發(fā)明中的細(xì)菌也可通過給予被修飾的細(xì)菌生產(chǎn)L-氨基酸的能力，從而使細(xì)菌合成ppGpp的活性增強(qiáng)，或者是增強(qiáng)這種細(xì)菌生產(chǎn)L-氨基酸的能力。
“被修飾從而使合成ppGpp的活性得以增強(qiáng)”是指與未經(jīng)修飾的菌株，例如野生型菌株相比，經(jīng)修飾菌株的每個(gè)細(xì)胞合成ppGpp的活性被增強(qiáng)。這種野生型菌株的例子包括，但不局限于大腸桿菌中的大腸桿菌MG1655。
細(xì)菌合成ppGpp的活性可以通過修飾細(xì)菌被增強(qiáng)，從而合成ppGpp的酶的活性被增強(qiáng)。ppGpp合成酶的例子包括RelA蛋白和SpoT蛋白。其中RelA蛋白是優(yōu)選的。此外，細(xì)菌也可以被修飾使RelA蛋白和SpoT蛋白的活性都被增強(qiáng)。
前面提及的細(xì)菌蛋白的活性可通過例如，提高編碼RelA的基因(relA)和編碼SpoT的基因(spoT)的表達(dá)而被增強(qiáng)。這些基因表達(dá)水平的提高可通過增加relA和spoT的拷貝數(shù)。例如，將含有relA或者spoT的基因片段連接到細(xì)菌中可發(fā)揮功能的載體上，優(yōu)選的是多拷貝型載體，來制備重組DNA并將其用于細(xì)菌的轉(zhuǎn)化。
relA基因和spoT基因的來源并沒有被特別地限制，只要這些基因能在導(dǎo)入它們的寄主細(xì)菌中發(fā)揮功能。然而，來源于與寄主同種或者類似種的基因是優(yōu)選的。
大腸桿菌relA基因和spoT基因核苷酸序列是已知的(relAGenBank收錄號(hào)AE000362，核苷酸片段1667-3901，spoT.GenBank收錄號(hào)為AE000442U00096，核苷酸片段3791-5899)。這些基因可通過PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，見White，T.J.et al.，Trends Genet.5，185(1989))獲得，其PCR過程中所使用的引物是在屬于埃希氏菌屬的細(xì)菌的已知核苷酸序列和染色體DNA的基礎(chǔ)上制備而成的。其它微生物中relA和spoT的同族物(homologues)也可通過類似的方法制備。
大腸桿菌relA基因的核苷酸序列和RelA蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NOS19和20所示。大腸桿菌spoT基因的核苷酸序列和SpoT蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NOS21和22所示本發(fā)明中所使用的relA和spoT可編碼RelA或者SpoT，包括其經(jīng)過替換、缺失、插入、增加或者倒置一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基，只要編碼的RelA蛋白和SpoT蛋白合成ppGpp的活性沒有被大幅降低就可。此處“幾個(gè)”氨基酸殘基的數(shù)目根據(jù)蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)或者氨基酸殘基的類型而有所不同，它可以是2-500個(gè)，優(yōu)選的是2-100個(gè)，更優(yōu)選的是2-20個(gè)。
因此，如上面所描述的RelA或者SpoT的變化都是典型的保守性的變化，從而能夠保持RelA或者SpoT的活性。替換變化，包括那些氨基酸序列中至少一個(gè)殘基被去掉，又有不同的殘基被插入到它的位置上。在RelA或者SpoT蛋白中，原始氨基酸可被替換，且又被認(rèn)為是保守性替換的氨基酸的例子包括Ser或Thr替換Ala；Gln、His或Lys替換Arg；Glu、Gln、Lys、His、Asp替換Asn；Asn、Glu或Gln替換Asp；Ser或Ala替換Cys；Asn、Glu、Lys、His、Asp或Arg替換Gln；Asn、Gln、Lys或Asp替換Glu；Pro替換Gly；Asn、Lys、Gln、Arg、Tyr替換His；Leu、Met、Val、Phe替換Ile；Ile、Met、Val、Phe替換Leu；Asn、Glu、Gln、His、Arg替換Lys；Ile、Leu、Val、Phe替換Met；Trp、Tyr、Met、Ile或Leu替換Phe；Thr、Ala替換Ser；Ser或Ala替換Thr；Phe、Tyr替換Trp；His、Phe、Trp替換Tyr；Met、Ile、Leu替換Val。
RelA蛋白由催化結(jié)構(gòu)域和核糖體結(jié)合結(jié)構(gòu)域組成。在本發(fā)明中RelA蛋白的核糖體結(jié)合結(jié)構(gòu)域可被去除。在SEQ ID NO20所示的RelA蛋白的氨基酸序列中，催化結(jié)構(gòu)域?qū)?yīng)的是氨基酸1-464。這樣一種僅由催化結(jié)構(gòu)域組成的RelA蛋白也落入本發(fā)明所指的RelA蛋白范圍之內(nèi)。在本發(fā)明說明書中，只編碼僅由催化結(jié)構(gòu)域組成的RelA蛋白的基因，也可被描述為“relA*”。
編碼與RelA或SpoT基本一致的蛋白的DNA可通過修飾relA或spoT的核苷酸序列獲得。例如，可使用定點(diǎn)誘變以在RelA或RpoT的特異性位點(diǎn)上替換、缺失、插入、添加或倒置氨基酸殘基。此外，上面所描述的DNA修飾也可通過傳統(tǒng)的已知的誘變處理來獲得。這種誘變處理包括一種在體外誘變處理之前，使用羥胺或者其類似物處理DNA的方法，和一種在誘變處理之前，使用紫外輻射或者通常處理使用的誘變劑，如N-甲基-N’-硝基-亞硝基胍(NTG)和亞硝酸對(duì)微生物，如含有DNA的埃希氏菌細(xì)菌，進(jìn)行的處理的方法。
可在適當(dāng)?shù)募?xì)胞內(nèi)表達(dá)上述突變的DNA，通過檢測(cè)表達(dá)產(chǎn)物的活性來獲得編碼與RelA或SpoT基本一致的蛋白的DNA。編碼含有突變的RelA或SpoT的DNA也可通過如下方式獲得分離能在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與探針雜交的DNA，該探針包含如，核苷酸序列SEQ ID NO19或21的核苷酸序列或者它們的一部分，并且所述DNA編碼具有從含有編碼帶有突變的RelA或SpoT的DNA的細(xì)胞中合成ppGpp活性的蛋白?！皣?yán)謹(jǐn)條件”在此指的是，包括那些可形成所謂特異性雜交，而不能形成非特異性雜交的條件。很難使用任何數(shù)值對(duì)該條件作出清楚的表達(dá)。然而，例如，嚴(yán)謹(jǐn)條件包括在此條件下DNA具有高度同源性，如至少50％同源性的DNA之間可彼此雜交，而低于此同源性的DNA之間則不能雜交。另外，嚴(yán)謹(jǐn)條件也體現(xiàn)為DNA彼此雜交的鹽濃度條件，該鹽濃度對(duì)應(yīng)于Southern雜交的普通洗滌條件。例如，1×SSC，0.1％SDS，優(yōu)選0.1×SSC，0.1％SDS，60℃。
SEQ ID NO19或21的部分核苷酸序列也可被用來作為探針。探針的生成是使用寡核苷酸通過PCR合成的，其中的寡核苷酸是在以SEQ ID NO19或20的核苷酸序列為引物，以含有SEQ ID NO19或21的核苷酸序列的DNA片段作為模板的基礎(chǔ)上生成的。當(dāng)使用長(zhǎng)度大約為300bp的DNA片段為探針時(shí)，雜交的洗滌條件可以是，例如50℃，2×SSC和0.1％SDS。
編碼與RelA基本一致蛋白的DNA，其特殊實(shí)例包括編碼相對(duì)于SEQ IDNO20所示的氨基酸序列，優(yōu)選與其有70％同源性或更多，更優(yōu)選為80％同源性或更多，更優(yōu)選為90％同源性或更多，特別優(yōu)選為95％同源性或更多，具有與RelA相似活性的蛋白的DNA。當(dāng)RelA蛋白僅由催化結(jié)構(gòu)域組成時(shí)，那么優(yōu)選該催化結(jié)構(gòu)域也應(yīng)該具有前面所述程度的同源性。編碼與SpoT基本一致蛋白的DNA，其特殊實(shí)例包括相對(duì)于SEQ ID NO22所示的氨基酸序列，優(yōu)選與其有70％同源性或更多，更優(yōu)選為80％同源性或更多，更優(yōu)選為90％同源性或更多，特別優(yōu)選為95％同源性或更多，且具有與SpoT相似活性的蛋白的DNA。
作為分離RelA或SpoT的材料的染色體DNA可通過，例如Saito和Miura方法(見H.Saito and K.Miura，Biochem.Biophys.Acta，72，619(1963)，Text forBioengineering Experiments，Edited by the Society for Bioscience and Bioengineering，Japan，pp.97-98，Baifukan，1992)或者類似方法從細(xì)菌中制備，該細(xì)菌是染色體DNA的提供者。
用于relA擴(kuò)增的引物的實(shí)例包括表格1中描述的relA5和relA6，用于relA*擴(kuò)增的引物的實(shí)例包括relA5和relA7。此外，用于spoT擴(kuò)增的引物的實(shí)例包括spoT1和spoT4。
若將PCR擴(kuò)增的含有relA和spoT的DNA片段與可在大腸桿菌或類似細(xì)胞中自主復(fù)制的載體DNA相連接，那么后續(xù)的程序就變得更容易。在大腸桿菌細(xì)胞中能夠自主復(fù)制的載體包括pUC19、pUC18、pHSG299、pHSG399、pHSG398、RSF1010、pBR322、pACYC184、pMW219、pSTV29等等。
為了將relA和spoT連接到載體上，以制備重組DNA，需要使用與基因末端相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶來消化該載體，并使用T4 DNA連接酶來連接。
為了將上述制備好的重組DNA導(dǎo)入到棒狀桿菌中，可采用任何迄今已報(bào)道過的已知的轉(zhuǎn)化方法。例如，這些方法包括用氯化鈣處理受體細(xì)胞來增強(qiáng)DNA的滲透性，此法被報(bào)道用于大腸桿菌K-12，(Mandel，M And Higa，A.，J.Mol.Biol.53，159(1970))，以及一種從生長(zhǎng)期的細(xì)胞中制備感受態(tài)細(xì)胞，然后將DNA導(dǎo)入其中的方法，此法被報(bào)道用于枯草芽孢桿菌(Duncan，C.H.，Wilson，G.A.and Young，F(xiàn).E.，Gene，1，153(1977))。此外，此種轉(zhuǎn)化方法還包括將DNA受體細(xì)胞制備成很容易吸收重組DNA的原生質(zhì)體或去壁細(xì)菌細(xì)胞，隨后將重組DNA導(dǎo)入到細(xì)胞中，已知此法在枯草芽孢桿菌，放射菌類和酵母上是可行的(Chang，S.And Choen，S.N.，Molec.Gen.Genet.，168，111(1979)；Bibb，M.J.，Ward，J.M.and Hopwood，O.A.，Nature，274，398(1978)；Hinnen，A.，Hicks，J.B.and Fink，G.R.，Proc.Natl.Sci，USA，75，1929(1978))。轉(zhuǎn)化也可以通過電脈沖的方法來完成(日本專利，
發(fā)明者今泉明, R·S·沙庫(kù)羅夫, A·L·布芮克哈諾夫 申請(qǐng)人:味之素株式會(huì)社