專利名稱：穩(wěn)定的單一液態(tài)酶比色試劑及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種分析試劑及其應(yīng)用，特別是一種穩(wěn)定的單一液態(tài)酶比色試劑及其應(yīng)用。
以往的酶比色法測(cè)定試劑以干粉試劑測(cè)定試劑為主。干粉試劑的不足之處是，使用時(shí)需要復(fù)溶，復(fù)溶時(shí)間長(zhǎng)且對(duì)復(fù)溶水質(zhì)要求高，不同的使用者復(fù)溶后試劑瓶間差異大，質(zhì)量得不到保證，易造成試劑浪費(fèi)，而且干粉單試劑其包裝不能適各類自動(dòng)分析儀，需復(fù)溶后再轉(zhuǎn)分析儀的專用瓶，操作麻煩，易受污染且過(guò)程試劑浪費(fèi)大。近幾年為了使用方便，逐漸演變?yōu)橐后w試劑為主。由于各種成分穩(wěn)定性不一，難以制成穩(wěn)定的單一液體試劑，通常的解決方法是采用雙液體試劑，即將不同穩(wěn)定條件的酶及試劑組分拆分成兩組試劑形式保存來(lái)延長(zhǎng)使用期限。但由于現(xiàn)今臨床檢測(cè)項(xiàng)目的增加使得分析儀器的試劑倉(cāng)位變得擁擠，由于檢測(cè)的標(biāo)本量趨向增大，試劑更換頻率高，易出差錯(cuò)，雙試劑分兩步測(cè)定，花費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)，由于每個(gè)測(cè)定項(xiàng)目分兩種試劑在裝試劑時(shí)易造成混淆，引起測(cè)定結(jié)果出亂、浪費(fèi)試劑、影響工作質(zhì)量，一些使用中小型儀器的用戶其試劑倉(cāng)位不夠用更為嚴(yán)重。
為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明穩(wěn)定的單一液態(tài)酶比色試劑，它基本構(gòu)成包括緩沖液、顯色劑、4-氨基安替比林、過(guò)氧化物酶， 其特征是它還包括可與被檢測(cè)物質(zhì)作用而產(chǎn)生比色反應(yīng)所需的過(guò)氧化氫的氧化酶和用量為0.01～500g/L的酶穩(wěn)定劑組分。所述的氧化酶可以是甘油磷酸氧化酶、膽固醇氧化酶、尿酸氧化酶、葡萄糖氧化酶、山梨醇氧化酶、肌氨酸氧化酶、酮胺氧化酶、黃嘌呤氧化酶、氨基酸氧化酶、膽堿氧化酶、丙酮酸氧化酶、乳酸氧化酶、果糖氨基酸氧化酶、1，5-脫水山梨醇氧化酶。
為了進(jìn)一步提高單一液態(tài)酶比色試劑的穩(wěn)定性，所述的緩沖液可以是生物緩沖液，生物緩沖液的pH5.0-9.0，緩沖濃度為10～500mMol/L。生物緩沖液可以是ADA、ACES、BES、MES、Bis-Tris、PIPES、MOPS、MOPSO、HEPES、TES、DIPSO、TAPSO等Good′S生物緩沖液(該英文的生物緩沖液皆為商品名)pH5.0-9.0，緩沖濃度為10～500mMol/L。所述的顯色劑可以選用水溶性顯色劑，如TOPS、TOOS、TODB、ADPS、DBHS、TBHBA(該英文的水溶性顯色劑皆為商品名)等，用量為0.1～50mmol/L，也可以是上述水溶性顯色劑的組合。水溶性顯色劑也可以和以往的苯酚、對(duì)羥基苯甲酸、4-氯酚、2，4-二氯酚等適量組合使用。所述試劑也可以含有表面活性劑組分，可以選用非離子表面活性劑、兩性表面活性劑、聚醚單獨(dú)使用或組合使用，用量為0.05～100g/L。所述試劑也可以包含酶穩(wěn)定劑組分。
酶穩(wěn)定組分可以選用多元醇、白蛋白、氨基酸、蛋白酶抑制劑、單、二糖、螯合劑、抗氧化劑，可以是單獨(dú)使用，也可以是組合使用。多元醇可以是甘油、乙二醇、丙二醇、甘露醇、二甘醇等，用量為1～500g/L。白蛋白可以是牛血清白蛋白、人血清白蛋白、卵清蛋白等，用量為1～500g/L。氨基酸可以是賴氨酸、天門冬氨酸、谷氨酸、丙氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、精氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、酪氨酸等及其鹽，用量為0.1～500g/L。蛋白酶抑制劑有植酸、糖蛋白烏司他丁、硼酸鹽、4-FPBA、蛋白酶抑制劑PMSF、抑肽酶(蛋白酶抑制劑Aprotinin)、S-亞硝基谷胱苷肽、膽酸鈉等，用量為0.01～300g/L。螯合劑有乙二胺四乙酸(EDTA)、亞氨基二乙酸、氮三乙酸和二乙基三胺五乙酸、2-環(huán)己二胺四乙酸、乙二醇雙(α-氨基乙酸)醚四乙酸、HEDTA等及其鹽類，用量為0.05～100g/L。PROCLIN系列防腐劑、迭氮鈉、慶大霉素、氯霉素、酚類、對(duì)羥基苯甲酸甲酯、脫氧乙酸及其鹽、陽(yáng)離子表面活性劑等，用量為0.05～200g/L。發(fā)明方法中如牛血清白蛋白、硼酸、EDTA、表面活性劑、谷胱甘肽、巰基乙醇等還原劑都有穩(wěn)定作用，例如表面活性劑聚乙烯吡咯烷酮(PVP)中的CO-N＝基都能結(jié)合酚，形成穩(wěn)定的復(fù)合物，硼酸也可以與酚類化合物依靠氫鍵形成復(fù)合物，延緩酚的氧化，達(dá)到穩(wěn)定的效果。適量的金屬離子可以是鎂、鈣、錳、鈉、銨、鉀、銅離子等，用量為0.01～100g/L。
本發(fā)明提供的一種穩(wěn)定的單一液態(tài)酶比色試劑，使試劑在單一液體狀態(tài)能保持長(zhǎng)期穩(wěn)定，性能超過(guò)干粉單試劑要求，具有使用方便、在儀器上編程簡(jiǎn)單，易識(shí)別不易出差錯(cuò)，效率高(通常5分鐘可以完成測(cè)定)，符合臨床使用要求，同時(shí)也適用于雙試劑使用要求的場(chǎng)合。
為了更好地理解本發(fā)明的實(shí)質(zhì)，以下通過(guò)對(duì)照實(shí)驗(yàn)對(duì)本發(fā)明的用途和效果加以闡述。對(duì)照例參照中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部醫(yī)政司編的《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》第二版。
經(jīng)過(guò)發(fā)明人的研究，發(fā)現(xiàn)造成這系列試劑的不穩(wěn)定因素是有很多因素造成的，特別是甘油三酯測(cè)定試劑其組分較復(fù)雜，因此需要一種或一種以上的穩(wěn)定方法進(jìn)行作用，在大多數(shù)情況下這些穩(wěn)定方法可以在各種Trinder試劑中使用，下面將通過(guò)實(shí)施來(lái)說(shuō)明
本實(shí)施例提供的是在總膽固醇測(cè)定試劑中采用生物緩沖液及水溶性顯色劑

標(biāo)本膽固醇含量為352mg/dL在37℃反應(yīng)5分鐘

試驗(yàn)結(jié)果表明本發(fā)明用新型水溶性顯色劑與以往的氯酚相比能大大降低對(duì)酶活力的損傷。而且新的顯色劑有較高的靈敏度，可以降低標(biāo)本用量能降低血清中膽紅素、抗壞血酸、血紅蛋白、脂濁等對(duì)測(cè)定的干擾，提高了檢測(cè)結(jié)果的可靠性。實(shí)施例3應(yīng)用不同的表面活性劑促進(jìn)標(biāo)本中蛋白質(zhì)溶解釋放出被檢測(cè)物質(zhì)，并減少標(biāo)本高脂引起的干擾，可以是非離子表面活性劑、兩性表面活性劑、聚醚單獨(dú)使用或組合使用，用量為0.05～100g/L本實(shí)施例提供的是與實(shí)施例2相比，在總膽固醇測(cè)定試劑中單獨(dú)使用非離子表面活性劑替代膽酸鈉

標(biāo)本膽固醇含量為352mg/dL在37℃反應(yīng)5分鐘

試驗(yàn)結(jié)果表明本發(fā)明實(shí)施例3不使用膽酸鈉，單獨(dú)使用非離子表面活性劑同樣具有高穩(wěn)定性，其優(yōu)點(diǎn)對(duì)照例2、實(shí)施例2試劑含有膽酸鈉易干擾其它臨床測(cè)定項(xiàng)目如膽汁酸、高、低密度膽固醇直接法測(cè)定，而實(shí)施例3則無(wú)此弊端。實(shí)施例4本實(shí)施例提供的是在酶比色試劑中如何提高酶穩(wěn)定性。
通常酶在液體狀態(tài)都不太穩(wěn)定，容易造成酶失活，蛋白質(zhì)析出，試劑空白上升，而多元醇、白蛋白、氨基酸、單、二糖、螯合劑、抗氧化劑、防腐劑、蛋白酶抑制劑都能增強(qiáng)其穩(wěn)定性作用，可以是單獨(dú)使用，也可以是組合使用。
六碳以下的多元醇不僅有穩(wěn)定作用且有防凍作用(高溫和冷凍都能損傷酶活力)常見(jiàn)的有甘油、乙二醇、丙二醇、甘露醇、二甘醇等，用量為1～500g/L。
蛋白質(zhì)可以和酶分子作用，防止離解為亞基或變性失活傾向牛血清白蛋白(具有一定的抗氧化性)、人血清白蛋白、卵清蛋白等，用量為1～500g/L氨基酸是構(gòu)成蛋白質(zhì)的基本單位，在酶液中添加氨基酸可增強(qiáng)酶的穩(wěn)定性賴氨酸、天門冬氨酸、谷氨酸、丙氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、精氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、酪氨酸等及其鹽，用量為0.1～500g/L。
由于一些酶、蛋白中蛋白酶含量較高，會(huì)分解蛋白質(zhì)，由于酶也是蛋白質(zhì)，因此蛋白酶會(huì)分解反應(yīng)所需的工具酶，引起試劑不穩(wěn)定，因此添加適量的蛋白酶抑制劑以及白蛋白能提高酶的穩(wěn)定性，常見(jiàn)的蛋白酶抑制劑有植酸、糖蛋白烏司他丁、硼酸鹽、4-FPBA、蛋白酶抑制劑PMSF(對(duì)甲基磺酰氟)、抑肽酶(蛋白酶抑制劑Aprotinin)、S-亞硝基谷胱苷肽、膽酸鈉等，用量為0.01～300g/L這些酶比色法試劑除了酶以外，還有緩沖液等一些化學(xué)試劑組分組成，這些試劑中可能含有一定量的重金屬，重金屬會(huì)促成酶分子半胱氨酸的氧化而使酶失活，加入適量螯合劑可有效防止酶失活，而且象EDTA類螯合劑具有一定的抗氧化作用乙二胺四乙酸(EDTA)、亞氨基二乙酸、氮三乙酸和二乙基三胺五乙酸、2-環(huán)己二胺四乙酸、乙二醇雙(α-氨基乙酸)醚四乙酸、HEDTA等及其鹽類，用量為0.05～100g/L。
由于試劑中含有一定量的蛋白質(zhì)、糖、氨基酸等容易長(zhǎng)菌變質(zhì)，添加適量的防腐殺菌劑有穩(wěn)定作用PROCLIN系列防腐劑、迭氮鈉、慶大霉素、氯霉素、酚類、對(duì)羥基苯甲酸甲酯、脫氧乙酸及其鹽、陽(yáng)離子表面活性劑等，用量為0.05～200g/L
Trinder試劑需酚或酚的衍生物參與顯色反應(yīng)，由于酚很容易被氧化，容易造成試劑變色空白上升，造成測(cè)定影響，加入合適的抗氧化劑能明顯降低空白發(fā)明方法中如牛血清白蛋白、硼酸、EDTA、表面活性劑、谷胱甘肽、巰基乙醇等還原劑都有穩(wěn)定作用，例如表面活性劑聚乙烯吡咯烷酮(PVP)中的CO-N＝基都能結(jié)合酚，形成穩(wěn)定的復(fù)合物，硼酸也可以與酚類化合物依靠氫鍵形成復(fù)合物，延緩酚的氧化，達(dá)到穩(wěn)定的效果。
適量的金屬離子對(duì)酶有一定的激活或穩(wěn)定作用，其可以是可以是鎂、鈣、錳、鈉、銨、鉀、銅離子等，用量為0.01～100g/L。
本實(shí)施例提供在甘油三酯測(cè)定試劑中應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)

實(shí)施例5本實(shí)施例提供的是在酶比色試劑中進(jìn)一步提高酶穩(wěn)定性。

實(shí)施例6為了說(shuō)明本發(fā)明也可以運(yùn)用在雙試劑上。本實(shí)施例如用二步法進(jìn)行測(cè)定能有效消除游離甘油(1000mg/dL)干擾，以提高試劑穩(wěn)定性。

標(biāo)本為1000mg/dL甘油三酯，在37℃反應(yīng)5分鐘后進(jìn)行測(cè)定

上表對(duì)照結(jié)果，對(duì)照例經(jīng)過(guò)高溫后明顯失活，而實(shí)施例仍保持穩(wěn)定狀態(tài)。實(shí)施例7本實(shí)施例提供的是本發(fā)明技術(shù)在尿酸測(cè)定試劑中的應(yīng)用舉例以下實(shí)施例通過(guò)多種穩(wěn)定技術(shù)使尿酸試劑達(dá)到長(zhǎng)時(shí)間穩(wěn)定，試劑空白低，由于NaN3對(duì)大腸桿菌的尿酸酶有抑制作用，使用陽(yáng)離子表面活性劑替代NaN3同樣能獲得高穩(wěn)定性，當(dāng)然也可以用其它防腐殺菌劑。

標(biāo)本為20mg/dL尿酸在37℃反應(yīng)5分鐘，測(cè)定結(jié)果

從以上種種實(shí)施例結(jié)果表明，本發(fā)明運(yùn)用多種穩(wěn)定技術(shù)進(jìn)行組合，使Trinder試劑能在液體單試劑(或雙試劑)狀態(tài)下保持長(zhǎng)期穩(wěn)定，實(shí)施例中的穩(wěn)定技術(shù)不局限于實(shí)施例，也可以應(yīng)用到其它Trinder試劑中；本發(fā)明的穩(wěn)定技術(shù)組合不局限于實(shí)施例中組合，可以多種穩(wěn)定方法根據(jù)需要任意進(jìn)行組合。
權(quán)利要求
1.一種穩(wěn)定的單一液體酶比色試劑，它基本構(gòu)成包括緩沖液、顯色劑、4-氨基安替比林、過(guò)氧化物酶， 其特征是它還包括可與被檢測(cè)物質(zhì)作用而產(chǎn)生比色反應(yīng)所需的過(guò)氧化氫的氧化酶和用量為0.01～500g/L的酶穩(wěn)定劑組分。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的穩(wěn)定的單一液體酶比色試劑，其特征是所述的緩沖液是生物緩沖液，緩沖液pH5.0-9.0，緩沖濃度為10～500mMol/L。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的穩(wěn)定的單一液體酶比色試劑，其特征是所述的顯色劑是水溶性顯色劑，用量為0.1～50mmol/L。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的穩(wěn)定的單一液體酶比色試劑，其特征是所述的酶比色試劑含有表面活性劑組分，用量為0.05～100g/L。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的穩(wěn)定的單一液體酶比色試劑，其特征是所述的酶比色試劑含有表面活性劑組分，用量為0.05～100g/L。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的穩(wěn)定的單一液體酶比色試劑，其特征是所述的氧化酶可以是甘油磷酸氧化酶、膽固醇氧化酶、尿酸氧化酶、葡萄糖氧化酶、山梨醇氧化酶、肌氨酸氧化酶、酮胺氧化酶、黃嘌呤氧化酶、氨基酸氧化酶、膽堿氧化酶、丙酮酸氧化酶、乳酸氧化酶、果糖氨基酸氧化酶、1，5-脫水山梨醇氧化酶。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的穩(wěn)定的單一液體酶比色試劑，其特征是所述的氧化酶可以是甘油磷酸氧化酶、膽固醇氧化酶、尿酸氧化酶、葡萄糖氧化酶、山梨醇氧化酶、肌氨酸氧化酶、酮胺氧化酶、黃嘌呤氧化酶、氨基酸氧化酶、膽堿氧化酶、丙酮酸氧化酶、乳酸氧化酶、果糖氨基酸氧化酶、1，5-脫水山梨醇氧化酶。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的穩(wěn)定的單一液體酶比色試劑，其特征是所述的氧化酶可以是甘油磷酸氧化酶、膽固醇氧化酶、尿酸氧化酶、葡萄糖氧化酶、山梨醇氧化酶、肌氨酸氧化酶、酮胺氧化酶、黃嘌呤氧化酶、氨基酸氧化酶、膽堿氧化酶、丙酮酸氧化酶、乳酸氧化酶、果糖氨基酸氧化酶、1，5-脫水山梨醇氧化酶。
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的穩(wěn)定的單一液體酶比色試劑，其特征是所述的氧化酶可以是甘油磷酸氧化酶、膽固醇氧化酶、尿酸氧化酶、葡萄糖氧化酶、山梨醇氧化酶、肌氨酸氧化酶、酮胺氧化酶、黃嘌呤氧化酶、氨基酸氧化酶、膽堿氧化酶、丙酮酸氧化酶、乳酸氧化酶、果糖氨基酸氧化酶、1，5-脫水山梨醇氧化酶。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種穩(wěn)定的單一液態(tài)酶比色試劑，它基本構(gòu)成包括緩沖液、顯色劑、4－氨基安替比林、過(guò)氧化物酶，它還包括可與被檢測(cè)物質(zhì)作用而產(chǎn)生比色反應(yīng)所需的過(guò)氧化氫的氧化酶和用量為0.01～500g/L的酶穩(wěn)定劑組分。所述的緩沖液可以是生物緩沖液，生物緩沖液的pH5.0－9.0，緩沖濃度為10～500mMol/L。所述的顯色劑是水溶性顯色劑，用量為0.1～50mmol/L。這種穩(wěn)定的單一液態(tài)酶比色試劑，使試劑在單一液體狀態(tài)能保持長(zhǎng)期穩(wěn)定，性能超過(guò)干粉單試劑要求，具有使用方便、在儀器上編程簡(jiǎn)單，易識(shí)別不易出差錯(cuò)，效率高(通常5分鐘可以完成測(cè)定)，符合臨床使用要求，同時(shí)也適用于雙試劑使用要求的場(chǎng)合。
文檔編號(hào)C12Q1/54GK1446925SQ0311596
公開日2003年10月8日 申請(qǐng)日期2003年3月24日 優(yōu)先權(quán)日2003年3月24日
發(fā)明者肖洪武 申請(qǐng)人:肖洪武