堿性磷酸酶(nap)染色液(化學染色法)的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術領域，具體的說是涉及堿性磷酸酶（NAP)染色液（化學染色 法），即一種中性粒細胞堿性磷酸酶染色試劑盒以及染色方法。
【背景技術】
[0002] 堿性磷酸酶（NAP)主要存在于成熟中性粒細胞，是一種胞內非特異性水解酶，在 堿性條件下能水解多種磷酸酯。隨著細胞的成熟，NAP的活性也逐漸增強。在病理情況下， 不同疾病及疾病的不同階段均可引起NAP成分與含量的變化，因此，作為快速測定堿性磷 酸酶活性的化學染色法經(jīng)常被用作各種疾病的臨床輔助診斷指標。NAP活性變化對某些疾 病的鑒別與診斷具有重要的臨床價值：當患有慢性粒細胞白血病時（無繼發(fā)感染時），其活 性顯著減低，緩解期可恢復至正常范圍，加速期和急變期時，NAP活性可不同程度增高，該檢 測可作為觀察慢粒白血病療效和預后的一項指標，也是與類白血病反應鑒別的重要檢測項 目。急性粒細胞白血病，NAP活性降低，并發(fā)感染時可稍增高。NAP活性減低還常見于病毒 感染或寄生蟲、立克次體感染，惡性組織細胞增生癥和淋巴瘤等。至于中性粒細胞堿性磷酸 酶活性增高的情況則比較多見，如妊娠16W~20W孕婦，NAP水平顯著增高，其他如細菌性 炎癥、類白血病反應、再生障礙性貧血、特發(fā)性血小板減少性紫癜、多發(fā)性骨髓瘤、真性紅細 胞增多癥、急性淋巴細胞白血病等也伴隨有NAP積分增高現(xiàn)象。
[0003] 堿性磷酸酶的染色方法主要有金屬鹽沉淀法和偶氮偶聯(lián)法。
[0004] 金屬鹽沉淀法中最經(jīng)典的是Gomori的鈣鈷法，其原理是以β -甘油磷酸為底物， 在ρΗ9. 3的堿性條件下水解為磷酸鈉和甘油，磷酸鈉與鈣離子作用生成磷酸鈣，再與鈷離 子作用生成磷酸鈷，后者與硫化銨作用生成不溶性硫化鈷沉淀。由于鈣鈷法存在操作繁瑣、 費時、有特殊不良氣味、硫化銨污染等缺點，目前醫(yī)療臨床上已經(jīng)很少應用。
[0005] 1955年kaplow LS提出了用偶氮偶聯(lián)法對細胞中的堿性磷酸酶進行染色，其原理 是利用堿性磷酸酶在PH9. 2-9. 8的堿性環(huán)境下，水解α -磷酸萘酚鈉，產(chǎn)生α -萘酚，后者 與重氮劑偶聯(lián)成有色沉淀物的原理進行染色。但是，α-萘酚為未取代萘酚，與偶氮的有效 偶聯(lián)需要加入過量的重氮鹽，對酶活性可能造成阻抑作用，其分解產(chǎn)物對細胞具有非特殊 性染色作用，且每次試驗需要臨時配制孵育液。后期有許多學者找到了 α-磷酸萘酚鈉鹽 的替代品，如萘酚AS-BI磷酸鈉鹽、萘酚AS-MX磷酸鈉鹽，應用該方法染色具有快速、簡便、 容易重復等優(yōu)點，但始終存在陽性染色不明顯、顯色靈敏度偏低等問題。

【發(fā)明內容】

[0006] 有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供堿性磷酸酶（NAP)染色液（化學染色法），即一 種中性粒細胞堿性磷酸酶染色試劑盒以及染色方法，使所述試劑盒以及染色方法應用于血 細胞內堿性磷酸酶檢測時能夠提高陽性染色效果。
[0007] 本發(fā)明的另一個目的在于提供一種中性粒細胞堿性磷酸酶染色試劑盒以及染色 方法，使所述試劑盒以及染色方法應用于血細胞內堿性磷酸酶檢測時能夠提高顯色靈敏 度。
[0008] 為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術方案：
[0009] -種中性粒細胞堿性磷酸酶染色試劑盒，包括pH值為9. 2-9. 8的堿性磷酸酶底物 溶液，所述堿性磷酸酶底物為N-(2-甲基-5-甲氧基-4-聯(lián)苯基）-3-磷酸氧基-2-萘甲酰 胺。
[0010] 作為優(yōu)選，所述N-(2-甲基-5-甲氧基-4-聯(lián)苯基）-3-磷酸氧基-2-萘甲酰胺濃 度為0· 125mg/ml~lmg/ml，更優(yōu)選0· 25mg/ml~0· 5mg/ml，其分子結構如下：
[0012] 與傳統(tǒng)較常用的底物萘酚AS-BI磷酸鈉鹽、萘酚AS-MX磷酸鈉鹽相比，本發(fā)明試劑 采用的底物在原有發(fā)色基團萘甲酰的N位上引入了另一發(fā)色基團聯(lián)苯基，且在聯(lián)苯基的2 位和5位分別用助色基團甲基和甲氧基取代，可以增強堿性磷酸酶水解底物產(chǎn)生的萘酚與 偶氮鹽反應的顯色強度，從而大大提高了堿性磷酸酶的顯色靈敏度。
[0013] 所述堿性磷酸酶底物N-(2-甲基-5-甲氧基-4-聯(lián)苯基）-3-磷酸氧基-2-萘甲 酰胺的合成方法為：以2-羥基-3-萘甲酸（化合物1)和5-甲基-4-苯基鄰茴香胺（化合 物2)為原料，三氯化磷為羧基和氨基的縮合劑，獲得3-羥基-N- (2-甲基-5-甲氧基-4-聯(lián) 苯基）-2_萘甲酰胺（化合物3);再通過五氯化磷磷酸化，最終獲得N-(2-甲基-5-甲氧 基-4-聯(lián)苯基）-3-磷酸氧基-2-萘甲酰胺（化合物4)。
[0014] 合成路線如下：
[0015] CN 105181423 A W 切卞 3/7 頁
[0016] 作為優(yōu)選，所述堿性磷酸酶底物溶液中還包括基質緩沖液、穩(wěn)定劑、防腐劑和無機 鹽。
[0017] 其中，所述基質緩沖液優(yōu)選自Tris-HCl緩沖液、2-氨基-2-甲基-1，3丙二醇緩沖 液、巴比妥緩沖液、碳酸鹽緩沖液、甘氨酸緩沖液中的一種；
[0018] 所述基質緩沖液濃度優(yōu)選為0· IM ;
[0019] 所述無機鹽優(yōu)選為氯化鈉或氯化鎂；
[0020] 所述無機鹽濃度優(yōu)選為0· 1M。
[0021 ] 所述穩(wěn)定劑優(yōu)選為甘油、PVP或TWEEN20,防腐劑優(yōu)選為NaN3。
[0022] 作為優(yōu)選，本發(fā)明所述試劑盒還包括常規(guī)NAP染色一般都會具備的固定液、重氮 鹽和蘇木素復染液。
[0023] 其中，所述固定液選自1%~30% (v/v)甲醛甲醇、30%~80% (v/v)丙酮-枸 緣酸溶液、70%~95% (v/v)甲醇中的一種，更優(yōu)選1%~30% (v/v)甲醛甲醇，尤其優(yōu)選 10%~20% (v/v)甲酸甲醇；
[0024] 所述重氮鹽選自固紅TR鹽、固黑K鹽、固藍BB鹽、固紅GBC鹽、耐曬猩紅R鹽、固 紅紫LB鹽、固紫B鹽、固暗藍R鹽、固藍B鹽、新品紅溶液中的一種，更優(yōu)選固紅TR鹽、固紫 B鹽、耐曬猩紅R鹽。
[0025] 蘇木素復染液可按照本領域常規(guī)方法用蘇木精配制，或直接市售購買。本發(fā)明所 述蘇木素復染液優(yōu)選含有如下試劑：0.05%~1 % (w/v)蘇木精，10%~50% (v/v)無水乙 醇，0· 01%~0· 1% (w/v)碘酸鈉，10%~50% (v/v)甘油，0· 5%~5% (w/v)硫酸錯鉀， 0. 5%~10% (w/v)枸緣酸，其余為蒸餾水。復染液pH范圍為1. 8~2. 9。
[0026] 上述蘇木素復染液中蘇木精與碘酸鈉的比例可以為1:0. 05-1: 1，優(yōu)選 1:0. 1-1:0. 5,尤其優(yōu)選 1:0. 1-1:0. 2。
[0027] 根據(jù)本發(fā)明提供的適用于血細胞堿性磷酸酶染色的試劑盒產(chǎn)品，本發(fā)明還提供一 種中性粒細胞堿性磷酸酶染色方法，包括：
[0028] 步驟1、向新鮮待測血液涂片滴加固定液固定，固定后水洗待干；
[0029] 步驟2、將重氮鹽置入pH值為9. 2-9. 8的堿性磷酸酶底物溶液中完全溶解，混合成 為染色工作液，將固定后血液涂片置入染色工作液中孵育，之后流水沖洗，取出待干；
[0030] 步驟3、向血液涂片中滴加蘇木素復染液復染，水洗待干，鏡檢；
[0031] 其中，所述堿性磷酸酶底物為N-(2-甲基-5-甲氧基-4-聯(lián)苯基）-3_磷酸氧 基-2-萘甲酰胺。
[0032] 作為優(yōu)選，上述染色方法還可以進一步為
[0033] 步驟1、向新鮮待測血液涂片滴加4°C預冷的固定液固定30秒，固定后水洗待干；
[0034] 步驟2、將重氮鹽置入pH值為9. 2-9. 8的堿性磷酸酶底物溶液中完全溶解，混合成 為染色工作液，將固定后血液涂片置入染色工作液中37°C孵育30分鐘，之后連缸流水沖洗 1-5分鐘，取出待干；
[0035] 步驟3、向血液涂片中滴加蘇木素復染液，室溫復染1-2分鐘，水洗待干，鏡檢。
[0036] 作為優(yōu)選，重氮鹽與N-(2-甲基-5-甲氧基-4-聯(lián)苯基）-3-磷酸氧基-2-萘甲 酰胺的摩爾濃度比為2:1~8:1，在本發(fā)明的一些實施例中，重氮鹽與N-(2-甲基-5-甲氧 基-4-聯(lián)苯基）-3-磷酸氧基-2-萘甲酰胺的摩爾濃度比為3. 58:1。
[0037] 作為優(yōu)選，所述堿性磷酸酶底物溶液中還包括基質緩沖液、穩(wěn)定劑、防腐劑和無機 鹽。
[0038] 其中，所述基質緩沖液、穩(wěn)定劑、防腐劑、無機鹽、固定液、重氮鹽和蘇木素復染液 可參照試劑盒中優(yōu)選的技術方案。
[0039] 在和現(xiàn)有的NAP染色方法的對比試驗中，本發(fā)明染色效果為細胞核為藍色，胞漿 中出現(xiàn)紅色沉淀，胞核和胞漿染色顏色鮮艷、對比清晰、鮮明。而對比的現(xiàn)有方法胞漿中出 現(xiàn)紅色沉淀顏色較淡，與細胞核的顏色對比并不鮮明。
[0040] 同時，在檢測急性淋巴細胞白血病、細菌性感染、再生障礙性貧血、多發(fā)性骨髓瘤、 陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿病、慢性粒細胞性白血病和惡性組織細胞病共169例患者的NAP 活性試驗中，本發(fā)明能夠顯著增加患者NAP染色陽性率結果，表明本發(fā)明試劑盒和染色方 法靈敏度更高，增加陽性染色。
[0041] 由以上結果可知，本發(fā)明以堿性磷酸酶底物替代現(xiàn)有萘酚AS-BI磷酸鈉鹽、萘酚 AS-MX磷酸鈉鹽等進行NAP染色，該底物化學結構中通過引入發(fā)色基團聯(lián)苯基，增強堿性磷 酸酶水解底物產(chǎn)生的萘酚與偶氮鹽反應的顯色強度，從而大大提高了堿性磷酸酶的顯色靈 敏度和陽性染色。
【附圖說明】
[0042] 圖1所示以本發(fā)明NAP染色方法的正常人外周血細胞涂片的鏡檢結果；
[0043] 圖2所示以本發(fā)明NAP染色方法的妊娠17周孕婦外周血細胞涂片的鏡檢結果；
[0044] 圖3所示以現(xiàn)有NAP染色方法的正常人外周血細胞涂片的鏡檢結果；
[0045] 圖4所示以現(xiàn)有NAP染色方法的妊娠17周孕婦外周血細胞涂片的鏡檢結果。
【具體實施方式】
[0046] 本發(fā)明實施例公開了一種中性粒細胞堿性磷酸酶染色試劑盒以及染色方法。本領 域技術人員可以借鑒本文內容，適當改進工藝參數(shù)實現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替 換和改動對本領域技術人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的產(chǎn) 品和方法已經(jīng)通過較佳實施例進行了描述，相關人員明顯能在不脫離本
【發(fā)明內容】
、精神和 范圍內對本文所述的產(chǎn)品及方法進行改動或適當變更與組合，來實現(xiàn)和應用本發(fā)明技術。
[0047] 為了進一步理解本發(fā)明，下面結合實施例對本發(fā)明提供的一種中性粒細胞堿性磷 酸酶染色試劑盒以及染色方法進行詳細說明。
[0048] 實施例1 :N-(2-甲基-5-甲氧基-4-聯(lián)苯基）-3-磷酸氧基-2-萘甲酰胺的合成
[0049] 將 54g(0. 29mol)2-羥基-3-萘甲酸、60