一種超靈敏堿性磷酸酶檢測的新方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種超靈敏堿性磷酸酶檢測的新方法，待測樣品中的堿性磷酸酶水解5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸，生成5-溴-4-氯-3-吲哚和無機磷酸鹽，5-溴-4-氯-3-吲哚還原尼羅藍A，降低尼羅藍A的SERS強度，間接檢測堿性磷酸酶。本發(fā)明與光密度檢測或光強度檢測的ALP活性檢測方法相比，本發(fā)明基于SERS的超靈敏檢測能夠在更低濃度的水平上檢測堿性磷酸酶；與現(xiàn)有的堿性磷酸酶SERS檢測方法相比，本發(fā)明檢測的是尼羅藍A分子(NBA)分子的SERS信號，尼羅藍A分子的內在拉曼活性比有的堿性磷酸酶SERS檢測方法中BCIP產物的高，有利于進一步提高分析靈敏度。
【專利說明】一種超靈敏堿性磷酸酶檢測的新方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種酶活性檢測的【技術領域】，更具體地，涉及一種基于表面增強拉曼檢測技術建立的超靈敏堿性磷酸酶檢測的新方法。
【背景技術】
[0002]堿性磷酸酶(ALP)是一種水解酶，從生物分子除去磷酸基團發(fā)揮生物效應，參與能量代謝、信號轉導等生命活動，在其活性或含量的變化將指示生理和病理演變等生化反應。因此，檢測體液中ALP可以診斷多種疾病。此外，ALP也用作標記試劑為生物學研究。當它是作為酶免疫標記試劑，相較于辣根過氧化物酶，ALP具有高穩(wěn)定性，高靈敏度的優(yōu)點。它也被用來作為基因表達研究一個量化指標。發(fā)展一種超靈敏的ALP活性的檢測方法對于上述的研究是十分重要的。目前，堿性磷酸酶(ALP)的活性通過測定有色產物的光密度或產品的發(fā)出的熒光或化學發(fā)光強度來檢測。方法的檢出限分別為500 μ U/L和20 μ U/L。
[0003]表面增強拉曼散射(SERS)技術是超靈敏的檢測的有力工具。在實際應用中，強SERS信號總是從對SERS材料具有高親和力和高的內在拉曼活性的分子獲得。許多策略已經被開發(fā)用于那些對SERS材料親和力低或拉曼活性低的分子。在SERS檢測酶的活性研究中，當酶的底物和產物不能提供強的SERS信號時，合成帶有染料的替代底物是一種有效的方法。
[0004]5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸(BCIP)是檢測ALP活性中常用的商品化顯色底物，并將其轉化為5-溴-4-氯-3-吲哚(BCI)和無機磷酸鹽。在免疫印跡法、原位雜交和免疫組織化學研究中，產生的BCI可以還原氮藍四唑(NBT)，以形成不溶性有色沉淀物，以指示ALP的存在。雖然ALP的SERS檢測方法已開發(fā)通過收集BCI 二聚體的SERS信號，但本發(fā)明中，尼羅藍A(NBA)是一種具有較強的內在拉曼活性的分子，可建立ALP的超靈敏SERS檢測方法。

【發(fā)明內容】

[0005]發(fā)明目的:本發(fā)明的目的是提供一種基于表面增強拉曼檢測技術建立的超靈敏堿性磷酸酶檢測的新方法，具有操作簡便的特點。
[0006]技術方案:為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明通過下述技術方案實現(xiàn):一種超靈敏堿性磷酸酶檢測的新方法，待測樣品中的堿性磷酸酶水解5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸，生成5-溴-4-氯-3-吲哚和無機磷酸鹽，5-溴-4-氯-3-吲哚還原尼羅藍Α，降低尼羅藍A的SERS強度，間接檢測堿性磷酸酶。
[0007]本發(fā)明將尼羅藍A分子(NBA)和5-溴_4_氯_3_吲哚磷酸作為ALP的底物，通過檢測反應體系中尼羅藍A分子(NBA)的SERS光譜的一種超靈敏堿性磷酸酶檢測的新方法。
[0008]具體包括以下步驟:
[0009]I)將含有堿性磷酸酶的待測樣品用含MgCl2和NaCl的ρΗ9.5的tris-HCl緩沖溶液稀釋1-10000倍得到溶液；[0010]2)將5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸水溶液和尼羅藍A分子水溶液加入步驟I)溶液中，再在37 V溫育30分鐘，所述5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸水溶液在溶液中的初始濃度為I X 10—3-1 X 10_6mOl/L，所述的尼羅藍A分子水溶液在溶液中的初始濃度為lXl(T4-lXl(T9mol/L ；
[0011]3)將SERS活性材料加入步驟2)得到的溶液中，5分鐘后測定SERS信號。
[0012]其中，上述MgCl2在tris-HCl緩沖溶液中的濃度為0.l-50mmol/L，所述NaCl在tris-HCl緩沖溶液中的濃度為I O-1 OOOmmo I/L。
[0013]其中，上述tris-HCl緩沖溶液的濃度為l-lOOOmmol/L。
[0014]其中，上述SERS活性材料為金納米粒子懸浮液、銀納米粒子懸浮液、金銀復合的納米粒子懸浮液、金銀與無機或有機材料復合的納米粒子懸浮液或集成在固相基底上形成的納米材料中的一種。
[0015]其中，上述的金銀與無機材料復合的納米粒子懸浮液是硅或二氧化硅為核的金殼或銀殼懸浮液；所述的金銀與有機材料復合的納米粒子懸浮液是聚苯乙烯為核的金殼或銀殼懸浮液；所述的集成在固相基底納米材料是上述任意一種或幾種納米粒子懸浮液吸附到載玻片或針灸針上形成的固相基底納米材料。
[0016]有益效果:與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點:
[0017](I)本發(fā)明與光密度檢測或光強度檢測的ALP活性檢測方法相比，本發(fā)明基于SERS的超靈敏檢測能夠在更低濃度的水平上檢測堿性磷酸酶。
[0018](2)與現(xiàn)有的堿性磷酸酶SERS檢測方法相比，本發(fā)明檢測的是尼羅藍A分子(NBA)分子的SERS信號，尼羅藍A分子的內在拉曼活性比有的堿性磷酸酶SERS檢測方法中BCIP產物的高，有利于進一步提高分析靈敏度。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0019]圖1是本發(fā)明檢測的原理示意圖。
[0020]圖2是基于一種固相SERS基底檢測堿性磷酸酶的標準曲線。
【具體實施方式】
[0021 ] 下述非限制性實施例可以使本領域的普通技術人員更全面地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。
[0022]實施例1純堿性磷酸酶的SERS檢測
[0023]純酶用含5mmol/L 的 MgCl2 和 100mmol/L 的 NaCl 的 tris-HCl 緩沖溶液(ρΗ9.5)稀釋至l、10、100、1000、10000mU/L ;BCIP水溶液和尼羅藍A分子(NBA)水溶液加入上述溶液中，再在37°C溫育30分鐘后，其中tris-HCl緩沖溶液(pH9.5)的濃度為lmmol/L ；BCIP水溶液在溶液中的初始濃度為4.5X10_4mOl/L，尼羅藍A分子(NBA)水溶液在溶液中的初始濃度為4X 10_6mol/L ;將集成SERS活性材料的載玻片浸入上述溶液，5分鐘后測定SERS信號，根據(jù)592CHT1處的SERS強度和對應的堿性磷酸酶的量繪制標準曲線(見圖2)。得到線性方程:Y = 11.6397Χ+33413.429。SERS活性材料為金銀復合的納米粒子懸浮液。
[0024]實施例2:血液中堿性磷酸酶的SERS檢測
[0025]將血液用含5mmol/L的MgCl2和100mmol/L的含NaCl的tris-HCl緩沖溶液(pH9.5)稀釋至1、10、100、1000、10000倍；其中tris-HCl緩沖溶液(ρΗ9.5)的濃度為IOmmoI/L ;BCIP水溶液和尼羅藍A分子(NBA)水溶液加入上述溶液中，再在37°C溫育30分鐘后，其中，所述的BCIP水溶液在溶液中的初始濃度為4.5X10_4mol/L，所述的尼羅藍A分子(NBA)水溶液在溶液中的初始濃度為4X 10_6mOl/L ;將集成SERS活性材料的載玻片浸入上述溶液，5分鐘后測定SERS信號，SERS活性材料為金銀與二氧化硅復合的，以二氧化硅為核的納米粒子懸浮液。其中稀釋10倍的SERS強度是1.03X 105?？筛鶕?jù)實施例1的標準曲線計算具體的酶含量約為119.98U/L。
[0026]實施例3:血液中磷酸酶的SERS檢測
[0027]將血液用含0.lmmol/L 的 MgCl2 和 10mmol/L 含 NaCl 的 ρΗ9.5 的 tris-HCl 緩沖溶液稀釋至1、10、100、1000、10000倍得到溶液；其中tris-HCl緩沖溶液(pH9.5)的濃度為20mmol/L ;將5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸水溶液和尼羅藍A分子水溶液加入上述溶液中，再在37°C溫育30分鐘，所述5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸水溶液在溶液中的初始濃度為I X 10_3mol/L，所述的尼羅藍A分子水溶液在溶液中的初始濃度為I X 10_4mol/L ;將SERS活性材料加入得到的溶液中，5分鐘后測定SERS信號。SERS活性材料為聚苯乙烯為核的金殼納米粒子懸浮液。其中稀釋10倍的SERS強度8.2X 104?？筛鶕?jù)實施例1的標準曲線計算具體的酶含量約為 493.45U/L。
[0028]實施例4血液中磷酸酶的SERS檢測
[0029]I)將血液用含 25mmol/L 的 MgCl2 和 500mmol/L 的 NaCl 的 ρΗ9.5 的 tris-HCl 緩沖溶液稀釋至1、10、100、1000、10000倍得到溶液；其中tris-HCl緩沖溶液(pH9.5)的濃度為500mmol/L ；2)將5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸水溶液和尼羅藍A分子水溶液加入步驟I)溶液中，再在37°C溫育30分鐘，5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸水溶液在溶液中的初始濃度為
0.5X10_3mol/L，尼羅藍A分子水溶液在溶液中的初始濃度為0.5X10_4mol/L ；3)將SERS活性材料加入步驟2)得到的溶液中，5分鐘后測定SERS信號。SERS活性材料為銀納米粒子懸浮液吸附到載玻片上形成的固相基底納米材料。其中稀釋10倍的SERS強度4.5X 104?？筛鶕?jù)實施例1的標準曲線計算具體的酶含量約為31.65U/L。
[0030]實施例5血液中磷酸酶的SERS檢測
[0031]I)將血液用含 50mmol/L 的 MgCl2 和 1000mmol/L 的 NaCl 的 pH9.5 的 tris-HCl 緩沖溶液稀釋至1、10、100、1000、10000倍得到溶液；其中tris-HCl緩沖溶液(ρΗ9.5)的濃度為lOOOmmol/L ；2)將5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸水溶液和尼羅藍A分子水溶液加入步驟I)溶液中，再在37°C溫育30分鐘，5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸水溶液在溶液中的初始濃度為1父10_611101/1，尼羅藍六分子水溶液在溶液中的初始濃度為1\10_911101/1 ；3)將SERS活性材料加入步驟2)得到的溶液中，5分鐘后測定SERS信號。SERS活性材料為金銀與二氧化硅復合的，以二氧化硅為核的納米粒子懸浮液吸附到針灸針上形成的固相基底納米材料。其中稀釋10倍的SERS強度是8.6X 104?？筛鶕?jù)實施例1的標準曲線計算具體的酶含量約為498.8U/L。
【權利要求】
1.一種超靈敏堿性磷酸酶檢測的新方法，其特征在于，待測樣品中的堿性磷酸酶水解5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸，生成5-溴-4-氯-3-吲哚和無機磷酸鹽，5-溴-4-氯-3-吲哚還原尼羅藍A，降低尼羅藍A的SERS強度，間接檢測堿性磷酸酶。
2.根據(jù)權利要求1所述的一種超靈敏堿性磷酸酶檢測的新方法，其特征在于，具體包括以下步驟: 1)將含有堿性磷酸酶的待測樣品用含MgCl2和NaCl的pH9.5的tris_HCl緩沖溶液稀釋1-10000倍得到溶液； 2)將5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸水溶液和尼羅藍A分子水溶液加入步驟I)溶液中，再在37 °C溫育30分鐘，所述5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸水溶液在溶液中的初始濃度為I X 10—3-1 X 10_6mOl/L，所述的尼羅藍A分子水溶液在溶液中的初始濃度為lXl(T4-lXl(T9mol/L ； 3)將SERS活性材料加入步驟2)得到的溶液中，5分鐘后測定SERS信號。
3.根據(jù)權利要求2所述的一種超靈敏堿性磷酸酶檢測的新方法，其特征在于，所述MgCl2在tris-HCl緩沖溶液中的濃度為0.l-50mmol/L，所述NaCl在tris_HCl緩沖溶液中的濃度為 10-1000mmol/L。
4.根據(jù)權利要求2所述的一種超靈敏堿性磷酸酶檢測的新方法，其特征在于，所述tris-HCl緩沖溶液的濃度為l-1000mmol/L。
5.根據(jù)權利要求2所述的一種超靈敏堿性磷酸酶檢測的新方法，其特征在于，所述SERS活性材料為金納米粒子懸浮液、銀納米粒子懸浮液、金銀復合的納米粒子懸浮液、金銀與無機或有機材料復合的納米粒子懸浮液或集成在固相基底上形成的納米材料中的一種。
【文檔編號】G01N1/38GK103969436SQ201410194039
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2014年5月8日 優(yōu)先權日:2014年5月8日
【發(fā)明者】董健, 李媛, 張明月, 郝振宇, 朱珠, 張里, 錢衛(wèi)平 申請人:東南大學