專利名稱：貝類遺傳圖譜的快速構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬海洋生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及到貝類遺傳圖譜的快速構(gòu)建方法。
本發(fā)明的目的在于利用貝類的擔(dān)輪幼蟲為遺傳作圖材料，并采取擬測交策略來快速構(gòu)建貝類的遺傳圖譜，為貝類的遺傳圖譜構(gòu)建工作提供新的思路和方法。
將貝類分別排放精卵后進(jìn)行單對交配，并單獨培育至擔(dān)輪幼蟲，然后取擔(dān)輪幼蟲置于保存液中，該保存液的成分包括20％二甲基亞楓(DMSO)，0.3M乙二胺四乙酸二納(EDTA)，飽和NaCl。此保存液可長時間(大于1年)保存完好的幼蟲形態(tài)及其內(nèi)的DNA.。
2.單個擔(dān)輪幼蟲的分離因擔(dān)輪幼蟲很小，需借助于一定的手段進(jìn)行分離，目前對微小幼蟲的分離中用的方法為液滴法(Huvet，Mar.Biotechnol.，3448)，此法只是假設(shè)每液滴中有一個幼蟲，不準(zhǔn)確。本發(fā)明通過顯微操作來準(zhǔn)確地分離單個幼蟲。具體操作為取上述保存液中的幼蟲用TE緩沖液(10Mm Tris-Cl，1mMEDTA)清洗幾遍以除去保存液后，再取幾十個于載玻片上，并將載波片置于顯微操作儀上，用事先拉制好的玻璃針在顯微鏡下吸取單個幼蟲，并輕輕吹入用作聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的小離心管(簡稱PCR管)內(nèi)。在進(jìn)行操作時應(yīng)注意觀察幼蟲的形狀，挑選個體完整且處于擔(dān)輪幼蟲期的幼蟲，以及玻璃針的口徑應(yīng)與擔(dān)輪幼蟲大小相適應(yīng)為宜。
3.單個擔(dān)輪幼蟲DNA的提取將以上得到的各含有1個幼蟲的PCR管內(nèi)各加入15ul的裂解液于55℃恒溫裂解3h，升溫到85℃保持15min以滅活蛋白酶K，這樣所得的含有已被釋放和提取DNA的裂解液即可保存于4℃待用。
考慮到單個幼蟲DNA含量很小，其裂解液若進(jìn)行常規(guī)酚-氯仿抽提要損失部分DNA。本發(fā)明所采用的裂解液不含有抑制擴(kuò)增的物質(zhì)，可直接用于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(簡稱PCR反應(yīng))。裂解液配方有兩種，一種成分包括10mM Tris-Cl，10mM的氯化鈣(CaCl2)，0.3mg/ml蛋白酶K(PrK)，簡稱為配方A。另一種成分包括10mM Tris-Cl，50mM氯化鈉(KCl)，0.5％吐溫20(Tween-20)，0.3mg/ml PrK，簡稱為配方B，這兩種裂解液的PH值皆為8.0。
4)單個擔(dān)輪幼蟲DNA拷貝數(shù)增加圖譜構(gòu)建中需對單個幼蟲進(jìn)行多次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(簡稱PCR)以獲得足夠量的標(biāo)記位點，而單個幼蟲可提供的DNA量很少，不足以用于多位點分析。本發(fā)明應(yīng)用已有的兼并引物隨機(jī)擴(kuò)增法(簡稱PEP法)來增加單個幼蟲DNA拷貝數(shù)，以獲得PCR擴(kuò)增所需的足夠量的模板DNA。
作為例子具體可取上述所得的3ul的幼蟲裂解液作為模板，加入20ul的PCR反應(yīng)體系中，包括0.5uM的引物，0.2uM的dNTP，1.5U的Taq DNA聚合酶，2.0ul的10×PCR緩沖液，上述引物序列為5’-d(NNNNNNNNNNNNNNN)-3’，其PCR反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5min后進(jìn)行40～50個循環(huán)94℃ 1min，37℃ 2min，10s/℃升溫到55℃，延伸4min，最后72℃保溫5min。即可得到足夠量的單個擔(dān)輪幼蟲的模板DNA。
5)應(yīng)用擬測交策略進(jìn)行圖譜構(gòu)建通過以上預(yù)擴(kuò)增得到足夠量的單個擔(dān)輪幼蟲的DNA模板后，即可應(yīng)用擬測交策略及可用于回交模型分析的遺傳圖譜構(gòu)建軟件如JoinMap、Mapdisto等進(jìn)行圖譜構(gòu)建。具體步驟為首先選擇各種遺傳標(biāo)記方法如微衛(wèi)星(簡稱ISSR)，隨機(jī)擴(kuò)增的多態(tài)性DNA(簡稱RAPD)和擴(kuò)增片段長度多態(tài)性(簡稱AFLP)等對單個幼蟲個體進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物在3.5％-4.5％的變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳后，進(jìn)行銀染顯帶。并應(yīng)用Crosscheck軟件將擴(kuò)增帶轉(zhuǎn)化成1-0矩陣。然后選擇在雙親中表現(xiàn)多態(tài)，且在幼蟲中發(fā)生1∶1的測交分離方式位點進(jìn)行連鎖分析，最后將以上得到的連鎖位點輸入能處理回交模型的遺傳圖譜軟件中即可得到所需的遺傳圖譜。
為了進(jìn)一步說明以上方法，作為實施例以貝類中廣泛養(yǎng)殖的具有很高經(jīng)濟(jì)價值的扇貝為例進(jìn)行圖譜構(gòu)建首先取性腺飽滿櫛孔扇貝一對進(jìn)行單對交配，并單獨培育至擔(dān)輪幼蟲后，取擔(dān)輪幼蟲保存于上述步驟1的保存液中。
然后取保存液中的幼蟲用TE清洗4遍后，取幾十個于載玻片上，并將載玻片置于顯微操作儀上，用口徑大小與扇貝幼蟲相對應(yīng)的玻璃針在顯微鏡下吸取單個幼蟲，并輕輕吹入小PCR管內(nèi)。
在以上得到的各含有1個幼蟲的PCR管內(nèi)各加入15ul的裂解液于55℃恒溫裂解3h，升溫到85℃保持15min，最后裂解液即可保存于4℃待用。裂解液選用上述步驟3中的裂解液配方中的任一種。
對以上所得的單個幼蟲DNA的裂解液應(yīng)用上述的PEP法來增加其拷貝數(shù)，以獲得足夠量的單個擔(dān)輪幼蟲的模板DNA。
取3ul以上所得的模板DNA應(yīng)用上述的ISSR標(biāo)記技術(shù)對其進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物在3.5％的變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳后，進(jìn)行銀染顯帶，并應(yīng)用Crosscheck軟件獲得1，0數(shù)據(jù)。
最后應(yīng)用擬測交策略進(jìn)行圖譜構(gòu)建選擇在雙親中表現(xiàn)多態(tài)，且在幼蟲中發(fā)生1∶1擬測交分離方式位點進(jìn)行連鎖分析，最后將以上得到的連鎖位點輸入作圖軟件“JoinMap”進(jìn)行了圖譜構(gòu)建。共獲得了17個扇貝連鎖群，包括52個ISSR標(biāo)記位點，總圖距為820.6cM。
作為另一實施例再選擇貝類中另一種經(jīng)濟(jì)價值更高的鮑進(jìn)行遺傳圖譜構(gòu)建取性腺飽滿的皺紋盤鮑雌和日本盤鮑雄各一只進(jìn)行單對交配，并單獨培育至擔(dān)輪幼蟲，取上浮的幼蟲于保存液中保存。
然后按上述步驟中的2、3和4的方法進(jìn)行幼蟲的分離、單個幼蟲DNA提取以及拷貝數(shù)增加。
取3ul以上所得的模板DNA應(yīng)用上述的ISSR標(biāo)記技術(shù)對其進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物在3.5％的變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳后，進(jìn)行銀染顯帶，并應(yīng)用Crosscheck軟件獲得1，0數(shù)據(jù)。
最后應(yīng)用擬測交策略進(jìn)行圖譜構(gòu)建選擇在雙親中表現(xiàn)多態(tài)，且在幼蟲中發(fā)生1∶1擬測交分離方式位點進(jìn)行連鎖分析，最后將以上得到的連鎖位點輸入作圖軟件“Mapdisto”進(jìn)行了圖譜構(gòu)建。共獲得12個皺紋盤鮑的連鎖群，包括35個AFLP標(biāo)記位點，總圖距為366cM。
本發(fā)明的優(yōu)點在于采用了貝類的擔(dān)輪幼蟲和擬測交策略相結(jié)合的方法進(jìn)行了貝類的遺傳圖譜構(gòu)建，該方法不僅省去了成體培養(yǎng)所需的時間和財力，而且可以保證材料的準(zhǔn)確可靠，同時為應(yīng)用現(xiàn)有材料進(jìn)行貝類圖譜構(gòu)建提供了新的思路和方法，加速了貝類遺傳圖譜構(gòu)建進(jìn)程。發(fā)明中所采用的保存液可長時間保持形態(tài)完好且DNA沒被降解的貝類擔(dān)輪幼蟲；用顯微操作來分離單個幼蟲非常的準(zhǔn)確快速；所用裂解液可有效的提取DNA，并且其不需抽提可直接用于PCR擴(kuò)增；采用隨機(jī)兼并引物擴(kuò)增法可有效的增加微量DNA的拷貝數(shù)；通過以上方法得到足夠量的單個幼蟲的DNA，并結(jié)合擬測交策略即可得到貝類的遺傳圖譜。
權(quán)利要求
1.一種貝類遺傳圖譜的快速構(gòu)建方法，其先后步驟包括貝類擔(dān)輪幼蟲的培育與保存、單個擔(dān)輪幼蟲的分離、單個擔(dān)輪幼蟲DNA的提取、及其微量DNA拷貝數(shù)增加，最后應(yīng)用擬測交策略及可用于回交模型分析的遺傳圖譜構(gòu)建軟件即可獲得貝類的遺傳圖譜。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的貝類遺傳圖譜的快速構(gòu)建方法，其特征在于上述貝類擔(dān)輪幼蟲的培育與保存是將貝類分別排放精卵后進(jìn)行單對交配，并單獨培育至擔(dān)輪幼蟲，然后取擔(dān)輪幼蟲置于保存液中保存。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的貝類遺傳圖譜的快速構(gòu)建方法，其特征在于上述單個擔(dān)輪幼蟲的分離是取上述保存液中的幼蟲用TE緩沖液清洗幾遍以除去保存液后，再取幾十個于載玻片上，并將載玻片置于顯微操作儀上，用事先拉制好的口徑與擔(dān)輪幼蟲大小相適應(yīng)的玻璃針在顯微鏡下吸取單個擔(dān)輪幼蟲，并輕輕吹入小PCR管內(nèi)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的貝類遺傳圖譜的快速構(gòu)建方法，其特征在于上述單個擔(dān)輪幼蟲DNA的提取是將以上得到的各含有1個幼蟲的PCR管內(nèi)各加入15ul的裂解液于55℃恒溫裂解3h，升溫到85℃保持15min，這樣所得的含有已被釋放和提取DNA的裂解液即可保存于4℃待用。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的貝類遺傳圖譜的快速構(gòu)建方法，其特征在于上述單個擔(dān)輪幼蟲的微量DNA拷貝數(shù)增加是以兼并引物隨機(jī)擴(kuò)增法來增加單個幼蟲DNA拷貝數(shù)，以獲得PCR擴(kuò)增所需的足夠量的單個擔(dān)輪幼蟲的模板DNA。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的貝類遺傳圖譜的快速構(gòu)建方法，其特征在于上述應(yīng)用擬測交策略來獲得貝類的遺傳圖譜的具體步驟是選擇各種遺傳標(biāo)記方法對單個擔(dān)輪幼蟲的模板DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物在3.5-4.5％的變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳后，進(jìn)行銀染顯帶，并應(yīng)用Crosscheck軟件將擴(kuò)增帶轉(zhuǎn)化成1-0矩陣，然后選擇在雙親中表現(xiàn)多態(tài)，且在幼蟲中發(fā)生1∶1的測交分離方式位點進(jìn)行連鎖分析，最后將以上得到的連鎖位點輸入遺傳圖譜構(gòu)建軟件即可得到所需的遺傳圖譜。
7.根據(jù)權(quán)利根據(jù)權(quán)利要求2所述的貝類遺傳圖譜的快速構(gòu)建方法，其特征在于上述保存液的成分是包括20％二甲基亞楓，0.3M乙二胺四乙酸二納，飽和NaCl。
8.根據(jù)權(quán)利根據(jù)權(quán)利要求4所述的貝類遺傳圖譜的快速構(gòu)建方法，其特征在于上述裂解液的配方可分別選用配方A10mMTris-Cl，10mM的氯化鈣，0.3mg/ml蛋白酶K，PH值為8.0或配方B10mM Tris-Cl，50mM氯化鈉，0.5％吐溫20，0.3mg/ml蛋白酶K，PH值為8.0。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種貝類遺傳圖譜的快速構(gòu)建方法，其先后步驟包括貝類擔(dān)輪幼蟲的培育與保存、單個擔(dān)輪幼蟲的分離、DNA的提取、及其DNA拷貝數(shù)的增加，最后應(yīng)用擬測交策略及可用于回交模型分析的遺傳圖譜構(gòu)建軟件即可獲得貝類的遺傳圖譜。本發(fā)明的優(yōu)點在于采用了貝類的擔(dān)輪幼蟲和擬測交策略相結(jié)合的方法進(jìn)行遺傳圖譜構(gòu)建，該方法不僅省去了成體培養(yǎng)所需的時間和財力，而且可以保證材料的準(zhǔn)確可靠，同時為應(yīng)用現(xiàn)有材料進(jìn)行貝類圖譜構(gòu)建提供了新的思路和方法，加速了貝類遺傳圖譜構(gòu)建進(jìn)程。
文檔編號C12Q1/68GK1448516SQ0311233
公開日2003年10月15日 申請日期2003年4月19日 優(yōu)先權(quán)日2003年4月19日
發(fā)明者萬俊芬, 包振民, 潘潔, 陳剛, 劉廣緒, 王師 申請人:中國海洋大學(xué)