專利名稱：梅花遺傳圖譜構建方法
技術領域：
本發(fā)明屬于植物基因工程領域，具體涉及一種梅花遺傳圖譜構建方法。
背景技術：
梅花(Prunus mume Sieb.et Zucc.)是中國目前唯一獲得國際品種登錄權的植物，雖然近幾十年對梅花的研究成績斐然，在種質資源(包滿珠，1993 ;劉青林，1996 ;康素紅和劉曉祥，1997 ;張永春 和劉小祥，1999)、繁殖生理(胡金良和徐漢卿，1994 ;徐漢卿和王慶亞，1995 ;趙守邊和劉小祥，1999)等研究領域取得相當?shù)倪M展，但是在分子育種方面比
較滯后。遺傳圖譜的構建具有重要的應用價值。分離群體是構建遺傳圖譜使用的遺傳材料，群體親本的選擇直接影響到構建遺傳圖譜的難易程度及圖譜的應用范圍。由于農作物育種歷史悠久，生長周期短，構建近交系、純系群體相當容易，但是果樹類、林木類等多年生木本植物生長周期長，高度雜合等特點，目前在樹木中多利用擬測交策略構建遺傳圖譜(ffeeden et al.1994 ；Yamamoto et al.2002)。由于梅花分布廣、資源變異豐富，不同生態(tài)區(qū)域的梅花，其遺傳基礎相差較大，加上梅花起源復雜、有性生殖困難等特性，目前還沒有獲得一張梅花的遺傳圖譜，嚴重限制了梅花的分子育種工作的開展。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一種梅花遺傳圖譜構建方法。本發(fā)明提供的梅花遺傳圖譜構建方法，其包括如下步驟:I)構建梅花F1代擬測交群體；2)提取父母本及其子代基因組DNA ；3)利用限制性內切位點相關的DNA測序方法對父母本及其子代基因組進行重測序，獲得符合孟德爾遺傳規(guī)律的單核苷酸多態(tài)性標記；4)根據(jù)所獲得的單核苷酸多態(tài)性標記，應用擬測交策略構建梅花遺傳圖譜。本發(fā)明中，根據(jù)作圖親本選配原則，選擇結實率高，子房飽滿的梅花品種為母本，選擇花藥飽滿，散粉量大，花粉生活力高的梅花品種為父本，在保留母本花萼的情況下，用鑷子去雄，采取一次授粉的方法，進行人工雜交選育，用收獲的子代構建F1代擬測交群體。其中父本花藥在溫度20 25°C，濕度10 40%下，散粉15 20小時，收集花粉。收集的花粉可立即授粉，也可以在干燥條件下4°C冷藏備用。優(yōu)選的，以‘粉瓣’為母本，以‘扣子玉蝶’為父本進行雜交，構建F1代擬測交群體。本發(fā)明的一個實施方案中，利用限制性內切酶對父母本及其子代基因組DNA進行酶切，利用Solexa方法對純化的父母本及其子代的酶切片段進行單末端測序，使用SOAPsnp軟件獲得符合孟德爾遺傳規(guī)律的單核苷酸多態(tài)性標記。在獲得符合孟德爾遺傳規(guī)律的單核苷酸標記后，根據(jù)卡平方檢驗作圖群體中符合孟德爾期望分離比為1: 2:1或1:1的標記，P <0.01，過濾掉SNP分子標記中偏分離的標記，利用JoinMap3.0的軟件，設置LOD彡3，構建梅花高密度遺傳圖譜。本發(fā)明在克服梅花品種結實率低、育種周期長，構建F1群體困難的基礎上，利用二代測序技術對父母本及其子代進行重測序，通過RAD的方法和擬測交策略相結合快速構建梅花的遺傳圖譜，該方法為快速構建木本植物高密度圖譜提供新的思路和方法，促進其遺傳圖譜構建進程。


圖1A為梅花遺傳圖譜I 4連鎖群。圖1B為梅花遺傳圖譜5 8連鎖群。
具體實施例方式以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。實施例1構建擬測交群體本實施例選擇梅花品種‘粉瓣’為母本，主要性狀為:花芽1-2朵著生，主要分布在短花枝和中花枝，花極繁密，花徑2.99cm(2.75-3.31cm)，花蕾粉色，頂端有復色，花瓣為5-8枚,單瓣淺碗型,粉色，有色暈，子房飽滿，柱頭發(fā)育良好，結實率聞；‘扣子玉蝶’為父本，主要性狀:花芽1-2朵著生，主要分布在短花枝和束花枝，花較繁密，花徑
2.32cm(1.6-2.68cm)，花蕾頂端有復色，花瓣為14-16枚，重瓣淺碗型，白色，花藥飽滿，散粉量大，花粉的生活力高。在父本初花期與盛花期時，選取中等長勢的枝條上且無病蟲害及生理缺陷的枝條上大蕾與中蕾期的花蕾， 用消毒后的醫(yī)用鑷子剝離花藥平鋪在硫酸紙上，室溫(20-25°C )濕度(40%以下)，自然散粉15-20小時，4°C保存?zhèn)溆?。在母本初花期，選擇生長健壯的中短花枝，適當修剪，先去除已開的花朵和過小花蕾，在保留花萼的情況下，用醫(yī)用鑷子小心地將梅花的花瓣，雄蕊去除，去雄完成后，在10-16時，柱頭上具有發(fā)亮的粘液時，用毛筆蘸取花粉，輕輕的涂于柱頭，完成授粉，計數(shù)并掛牌，用硫酸紙做成紙袋，馬上套袋，僅進行一次授粉，一次套袋，共雜交2120朵花。授粉完成后7天，待柱頭干燥變黑，子房膨大，去掉紙袋；在雜交果實發(fā)育85天時，為防止采前落果，進行收前套網；果實發(fā)育115天時，人工采收，共采收561粒雜交種子，采收后通風陰涼處，放置15-20天，讓雜交種子在果實中充分成熟。將收獲的果實去除果肉后，將種子取出，洗凈，晾干，置于4°C冷庫中砂藏催芽；待種子剛露白，可進行播種。種子催芽后，在溫室中將露白的342粒種子，播種于直徑為12cmX12cm的花盆中，待其生長到20-30cm時將310棵雜種苗移栽到大田中，每周灌水一次，注意期間的病蟲害防護。根據(jù)作圖親本選配原則，選擇具有優(yōu)良性狀、生長健壯的品種為雜交親本，選擇結實率高，子房飽滿，柱頭發(fā)育良好的梅花品種為母本，花藥飽滿，散粉量大，花粉的生活力高的梅花品種為父本，采用保留梅花花萼的情況下，用鑷子去雄，僅進行一次授粉的方法，進行人工雜交選育，與傳統(tǒng)方法相比，改進之處見表I。表1:本發(fā)明與傳統(tǒng)雜交相比創(chuàng)新之處
權利要求
1.一種梅花遺傳圖譜構建方法，其包括如下步驟: 1)構建梅花F1代擬測交群體； 2)提取父母本及其子代基因組DNA； 3)利用限制性內切位點相關的DNA測序方法對父母本及其子代基因組進行重測序，獲得符合孟德爾遺傳規(guī)律的單核苷酸多態(tài)性標記； 4)根據(jù)所獲得的單核苷酸多態(tài)性標記，應用擬測交策略構建梅花遺傳圖譜。
2.根據(jù)權利要求1所述的構建方法，其特征在于，根據(jù)作圖親本選配原則，選擇結實率高，子房飽滿的梅花品種為母本，選擇花藥飽滿，散粉量大，花粉生活力高的梅花品種為父本，在保留母本花萼的情況下，用鑷子去雄，采取一次授粉的方法，進行人工雜交選育，用收獲的子代構建F1代擬測交群體。
3.根據(jù)權利要求1所述的構建方法，其特征在于，其中父本花藥在溫度20 25°C，濕度10 40%下，散粉15 20小時，收集花粉。
4.根據(jù)權利要求2或3所述的構建方法，其特征在于，以‘粉瓣’為母本，以‘扣子玉蝶’為父本進行雜交，構建F1代擬測交群體。
5.根據(jù)權利要求1所述的構建方法，其特征在于，利用限制性內切酶對父母本及其子代基因組DNA進行酶切，利用Solexa方法對純化的父母本及其子代的酶切片段進行單末端測序，使用SOAPsnp軟件獲得符合孟德爾遺傳規(guī)律的單核苷酸多態(tài)性標記。
6.根據(jù)權利要求1所述的構建方法，其特征在于，利用卡平方檢驗作圖群體是否符合孟德爾期望分離比為1: 2:1或1:1的標記，P < 0.01，過濾掉SNP分子標記中偏分離的標記，利用JoinMap3.0的軟件，設置LOD值> 3，構建梅花高密度遺傳圖譜。
全文摘要
本發(fā)明提供一種梅花遺傳圖譜構建方法，其包括如下步驟1)構建梅花F1代擬測交群體；2)提取父母本及其子代基因組DNA；3)利用限制性內切位點相關的DNA測序方法對父母本及其子代基因組進行重測序，獲得符合孟德爾遺傳規(guī)律的單核苷酸多態(tài)性標記；4)根據(jù)所獲得的單核苷酸多態(tài)性標記，應用擬測交策略構建梅花遺傳圖譜。本發(fā)明在克服梅花品種雜交結實率低、育種周期長，構建F1群體困難的基礎上，利用RAD的方法和擬測交策略相結合的方法快速構建梅花的遺傳圖譜程。
文檔編號C12Q1/68GK103184277SQ201110454348
公開日2013年7月3日 申請日期2011年12月30日 優(yōu)先權日2011年12月30日
發(fā)明者張啟翔, 孫麗丹, 徐宗大, 張 杰, 陳晶鑫 申請人:北京林業(yè)大學