草木犀藥材的uplc指紋圖譜的構(gòu)建方法及其標準指紋圖譜的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及藥物分析技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及草木犀藥材的超高效液相色譜（UPLC) 指紋圖譜的構(gòu)建方法及其標準指紋圖譜。
【背景技術(shù)】
[0002] 草木犀·又寫作草木禪，為?科草木犀·屬（Melilotus Miller)，一年生或二年生草 本植物。草木犀常見生于沙丘、山坡、草原、海邊，分布于我國大部分省區(qū)，又名辟漢草、省頭 草、野苜蓿及鐵掃把。目前在我國栽培的多為白花草木犀和黃花草木犀。黃花草木犀由于 其自身的生長優(yōu)勢和化學成分適宜，在中國被用作很好的香料原料。草木犀可以以全草入 藥，民間以葉、花制成軟膏，用作外用藥，或煎服用于治療浮腫、腹痛、瘧疾等癥。
[0003] 由于草木犀的生長地域差異，所以作為中藥材使用的草木犀存在質(zhì)量控制不穩(wěn) 定、并且難以進行定性和定量分析等問題。中藥指紋圖譜是指中藥樣本經(jīng)光譜或色譜等現(xiàn) 代分析技術(shù)得到的中藥各組分群體的特征圖譜，目前已成為國內(nèi)外公認的鑒別中藥品種和 評價中藥質(zhì)量的最有效手段之一。目前最新的指紋圖譜測試方法之一是超高效液相色譜 (Ultra Performance Liquid Chromatography, UPLC)，這是最近幾年出現(xiàn)的一種新型液相 色譜技術(shù)，采用1. 7 μ m的小粒徑色譜柱填料，不僅使柱效得以提高，而且在較寬的流速范 圍內(nèi)柱效保持恒定，從而有利于通過提高流動相的流速而縮短分析時間，提高分析通量。相 對于常規(guī)HPLC(高效液相色譜，High Performance Liquid Chromatography)而言，UPLC有 更好的分離效率、峰容量以及靈敏度。但是，在草木犀藥材分析技術(shù)領(lǐng)域，還仍未有用UPLC 對草木犀藥材進行質(zhì)量控制分析以及報道其指紋圖譜。
[0004] 因此，本發(fā)明提供一種首次利用UPLC技術(shù)，對草木犀藥材指紋圖譜進行研究，為 草木犀藥材質(zhì)量控制提供了新的技術(shù)方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明提供一種草木犀藥材的超高效液相色譜指紋圖譜的構(gòu)建方法，以及由此方 法得到的草木犀藥材標準指紋圖譜及其在草木犀藥材優(yōu)化篩選、品質(zhì)的鑒別和控制中的應 用。根據(jù)本發(fā)明的構(gòu)建方法解決了草木犀藥材的成分分析中不能有效地反映和控制草木犀 藥材的整體質(zhì)量的問題，彌補了現(xiàn)有質(zhì)量控制技術(shù)的不足。
[0006] 根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供一種草木犀藥材的超高效液相色譜指紋圖譜的構(gòu)建 方法，包括：
[0007] (1)制備草木犀藥材的多個供試樣品溶液及香豆素對照樣品溶液；
[0008] (2)將步驟（1)所制備的供試樣品溶液及對照樣品溶液分別進行超高效液相色譜 分析，得到超高效液相色譜圖；
[0009] (3)以對照樣品溶液的超高效液相色譜圖作為對照，從步驟（2)所得到的供試樣 品溶液的超高效液相色譜圖中選擇共有特征峰構(gòu)建草木犀的標準指紋圖譜，
[0010] 所述步驟（2)中超高效液相色譜分析的條件為：
[0011] 采用反相填料色譜柱，用流動相乙腈-〇. 05~0. 2體積％磷酸或醋酸水溶液進行 梯度洗脫，紫外檢測波長為220~277nm。
[0012] 在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方式中，所述步驟（1)制備草木犀藥材的供試樣品溶液 及香豆素對照樣品溶液的方法包括用30~70體積％的甲醇水溶液處理；優(yōu)選地，所述甲醇 水溶液為50體積％的甲醇水溶液。
[0013] 在本發(fā)明的另一優(yōu)選實施方式中，本發(fā)明中所使用的反相填料色譜柱為Waters Acquity UPLC? BEH C18,該色譜柱尺寸為50mm X 2. 1mm，填料顆粒度為1. 7 μ m。
[0014] 在本發(fā)明的另一優(yōu)選實施方式中，梯度洗脫程序為：0min - 1. 5min - 3. 5~ 4. Omin - 5. Omin，乙臆5~10體積％ - 13~22體積％ - 13~22體積％ - 5~10體 積％ ;優(yōu)選地，梯度洗脫程序為乙腈5體積％ - 13~15體積％ - 13~15體積％ - 5體 積％ ;更優(yōu)選地，梯度洗脫程序為Omin - 1. 5min - 4. Omin - 5. Omin，乙腈5體積13 體積％ - 13體積％ - 5體積％。
[0015] 在本發(fā)明的另一優(yōu)選實施方式中，流動相的流速為0. 3~0. 7mL/min，柱溫在25~ 40°C范圍內(nèi)；優(yōu)選地，流速為0. 6~0. 7mL/min，柱溫為30°C。
[0016] 在本發(fā)明的另一優(yōu)選實施方式中，步驟（2)中超高效液相色譜分析的條件為：所 述流動相為乙腈-ο. 1體積％磷酸水溶液，流速為〇. 6mL/min，波長為277nm，柱溫為30°C。
[0017] 根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供一種草木犀藥材標準指紋圖譜，其通過本發(fā)明的 上述草木犀藥材的超高效液相色譜指紋圖譜的構(gòu)建方法獲得的。
[0018] 優(yōu)選地，本發(fā)明的草木犀藥材的標準指紋圖譜為超高效液相色譜UPLC的指 紋圖譜，并且包含14個共有特征峰，以12號峰香豆素為參照峰，其相對保留時間分 別為：0.062(±5 % )、0.080(±5 % )、0· 102(±5 % )、0.345(±5 % )、0.445(±5 % )、 0.669(±5 %)、0.686(±5 %)、0.713(±5 %)、0.801(±5 %)、0.866(±5 %)、 0.912(±5% )、1.000(±5% )、1.036(±5% )和 1. 101(±5% )。
[0019] 其中，上述14個共有特征峰中，峰10為草木犀酸；峰12為香豆素；峰14為鄰香豆 酸。
[0020] 優(yōu)選地，本發(fā)明的草木犀藥材的標準指紋圖譜為超高效液相色譜UPLC的指紋圖 譜，在紫外檢測波長220nm時得到的供試樣品溶液的超高效液相色譜圖中選擇共有特征 峰構(gòu)建了 UPLC標準指紋圖譜，包括16個共有特征峰，以14號峰香豆素為參照峰，其相 對保留時間分別為：峰 1 :〇. 〇62(±5% )、峰 2 :0. 080(±5% )、峰 3 :0. 093(±5% )、峰 4 :0· 383(±5 % )、峰 5 :0· 445(±5 % )、峰 6 :0· 607(±5 % )、峰 7 :0· 669(±5 % )、峰 8 : 0. 686 (±5% )、峰 9 :0.713 (±5% )、峰 10 :0.747 (±5% )、峰 11 :0.801 (±5% )、峰 12 : 0· 866(±5% )、峰 13 :0· 912(±5% )、峰 14 :1· 000(±5% )、峰 15 :1· 036(±5% )和峰 16 : 1. 101(±5% )。
[0021] 其中，上述16個共有特征峰中，峰12為草木犀酸、峰14為香豆素、峰16為鄰香豆 酸。
[0022] 優(yōu)選地，本發(fā)明的草木犀藥材的標準指紋圖譜為超高效液相色譜UPLC的指紋圖 譜，在紫外檢測波長275nm時得到的供試樣品溶液的超高效液相色譜圖中選擇了共有特 征峰構(gòu)建了 UPLC標準指紋圖譜，包括15個共有特征峰，以13號峰香豆素為參照峰，其相 對保留時間分別為：峰 1 :〇. 〇62(±5% )、峰 2 :0. 080(±5% )、峰 3 :0. 337(±5% )、峰 4 :0· 446(±5 % )、峰 5 :0· 475(±5 % )、峰 6 :0· 617(±5 % )、峰 7 :0· 679(±5 % )、峰 8 : 0.700 (±5% )、峰 9 :0.723 (±5% )、峰 10 :0.772 (±5% )、峰 11 :0.813 (±5% )、峰 12 : 0· 865(±5% )、峰 13 :1· 000(±5% )、峰 14 :1· 030(±5% )、峰 15 :1· 087(±5% )。
[0023] 其中，上述15個共有特征峰中，峰12為草木犀酸、峰13為香豆素、峰15為鄰香豆 酸。
[0024] 根據(jù)本發(fā)明的再一個方面，提供上述草木犀藥材的標準指紋圖譜在草木犀藥材以 及含草木犀藥材的制劑的檢測中的應用。
[0025] 根據(jù)本發(fā)明的再一個方面，提供一種檢測草木犀藥材的方法，其中，所述方法包括 將待測草木犀藥材的指紋圖譜與本發(fā)明上述草木犀藥材的標準指紋圖譜相比較。
[0026] 根據(jù)本發(fā)明的草木犀藥材的超高效液相色譜指紋圖譜的構(gòu)建方法或者獲得的標 準指紋圖譜與現(xiàn)有技術(shù)相比具有下述顯著的優(yōu)點：
[0027] (1)本發(fā)明首次利用UPLC技術(shù)，對草木犀藥材進行指紋圖譜研究，為草木犀藥材 質(zhì)量控制提供了新的分析方法。
[0028] (2)將草木犀藥材作為整體對待，通過比較其共有峰，可以找出不同藥材之間的細 微差異，適用于草木犀藥材真?zhèn)?、產(chǎn)地和品質(zhì)的鑒別和控制。
[0029] (3)本發(fā)明供試樣品制作簡單，色譜條件容易實現(xiàn)，精密度高，而且其穩(wěn)定性和重 現(xiàn)性較好，本發(fā)明采用的檢測波長出峰較多，反映的信息完全。
[0030] (4)與傳統(tǒng)HPLC方法相比較，在不影響整體效果的前提下，大大縮短了在線分析 時間，節(jié)省了材料成本和時間成本。
【附圖說明】
[0031] 圖1是根據(jù)本發(fā)明實施例1獲得的草木犀藥材的標準UPLC指紋圖譜。
[0032] 圖2是根據(jù)本發(fā)明實施例1構(gòu)建的10批次草木犀藥材的UPLC指紋圖譜（S1-S10) 與標準UPLC指紋圖譜（R)的對比圖。
[0033] 圖3是香豆素對照樣品的UPLC指紋圖譜
[0034] 圖4是根據(jù)本發(fā)明實施例2獲得的草木犀藥材的標準UPLC指紋圖譜。
[0035] 圖5是根據(jù)本發(fā)明實施例2構(gòu)建的10批次草木犀藥材的UPLC指紋圖譜（S1-S10) 與標準UPLC指紋圖譜（R)的對比圖。
[0036] 圖6是根據(jù)本發(fā)明實施例3獲得的草木犀藥材的標準UPLC指紋圖譜。
[0037] 圖7是根據(jù)本發(fā)明實施例3構(gòu)建的10批次草木犀藥材的UPLC指紋圖譜（S1-S10) 與標準UPLC指紋圖譜（R