專利名稱：一種與miRNA相關(guān)的功能性分子標(biāo)記的開發(fā)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子遺傳技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種與miRNA相關(guān)的功能性分子標(biāo)記的開發(fā)方法。
背景技術(shù)：
以PCR為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記技術(shù)在種質(zhì)資源評(píng)估、遺傳多樣性分析、遺傳圖譜構(gòu)建、 基因定位和克隆以及分子標(biāo)記輔助選擇育種等方面都起著非常重要的作用。目前應(yīng)用較多的標(biāo)記是 simple sequence repeats (SSR) Λ Amplified fragment length polymorphism (AFLP)等標(biāo)記，這些標(biāo)記技術(shù)由于存在許多不足之處，因而限制了其應(yīng)用，如SSR標(biāo)記系統(tǒng)雖然具有較高的穩(wěn)定性、準(zhǔn)確性和可操作性，但多態(tài)性較差，一般在一個(gè)物種中設(shè)計(jì)的引物在本物種中擴(kuò)增的多態(tài)性比例不超過30%，多數(shù)SSR引物擴(kuò)增的標(biāo)記數(shù)僅為1-2個(gè)，效率較低。AFLP標(biāo)記技術(shù)的多態(tài)性和高效性比SSR高，但是其操作過程復(fù)雜，穩(wěn)定性較差。所以有必要開發(fā)一種新的具有高穩(wěn)定性、準(zhǔn)確性、多態(tài)性和可操作性等特點(diǎn)的標(biāo)記系統(tǒng)，使其同時(shí)具備SSR和AFLP技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，提高標(biāo)記系統(tǒng)的使用效率。目前進(jìn)行了基因組測(cè)序的物種主要是模式生物、具有重要價(jià)值的部分微生物、植物和動(dòng)物，絕大多數(shù)物種基因組序列還未知，在短期內(nèi)較難獲得。一個(gè)物種的標(biāo)記系統(tǒng)的建立是開展該物種分子遺傳學(xué)研究的基礎(chǔ)，目前主要應(yīng)用不需要序列信息的AFLP標(biāo)記和 RAPD標(biāo)記等傳統(tǒng)的標(biāo)記技術(shù)建立物種標(biāo)記系統(tǒng)，或者用近緣種或模式生物引物信息進(jìn)行移植開發(fā)，但這些方法較難滿足研究的需要，因?yàn)榍罢叻€(wěn)定性較差，后者由于物種序列特異性較強(qiáng)而使物種之間序列可移植性較弱。因此有必要根據(jù)近緣種或模式生物的保守序列設(shè)計(jì)引物，然后將引物信息移植到被研究的物種中，加快研究進(jìn)程。MicroRNAs(miRNAs)是一種生物體的內(nèi)源性非編碼RNA分子，是一類長(zhǎng)度為20 25 nt的小分子序列，其典型特征是具有發(fā)卡結(jié)構(gòu)。無論在低等的線蟲還是在高等植物和哺乳動(dòng)物中，miRNA都廣泛存在。成熟的miRNAs是由較長(zhǎng)的初級(jí)轉(zhuǎn)錄物經(jīng)過一系列核酸酶的剪切加工而成，隨后與特異蛋白質(zhì)組裝形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體，再通過與堿基互補(bǔ)配對(duì)的方式識(shí)別靶mRNA，并根據(jù)互補(bǔ)程度的差異調(diào)控沉默復(fù)合體降解靶mRNA或者阻遏靶 mRNA的翻譯。miRNA通過各種途徑對(duì)生物體進(jìn)行調(diào)控，包括生長(zhǎng)、發(fā)育、生物脅迫、病毒侵襲、器官形成、細(xì)胞增殖和凋亡、脂肪代謝、表觀遺傳學(xué)調(diào)控和轉(zhuǎn)座子活動(dòng)等等。目前被鑒定的15172條(截止2010年9月)miRNAs均被由著名的Sanger研究所主辦的miRBase公開網(wǎng)站(http //microrna. sanger. ac. uk/)所整理并加以注釋。由于目前miRNA研究的歷程較短，驗(yàn)證工作困難，所以每一物種最終的小RNA數(shù)目還未確定，但據(jù)估計(jì)miRNAs的數(shù)量約為生物體中編碼基因數(shù)量的1%，并且同源拷貝數(shù)較多和數(shù)目龐大，這為標(biāo)記的開發(fā)做好了鋪墊。在不同的物種中，其成熟的miRNA具有較大的序列同源性，以及前體的莖環(huán)結(jié)構(gòu)具有相當(dāng)大的保守性。人們可以根據(jù)比較基因組學(xué)方法并結(jié)合生物信息軟件對(duì)已知序列進(jìn)行搜索比對(duì)，再根據(jù)同源性的程度進(jìn)行RNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)和最小自由折疊能系數(shù)計(jì)算，將符合條件的候選miRNA與已經(jīng)通過實(shí)驗(yàn)鑒定的miRNA分子進(jìn)行比較分析，最終確定該物種 miRNA的分布及數(shù)量。miRNA所具有的較高的保守性也說明了它具有較好的移植性(一個(gè)物種的DNA序列片段在另外一個(gè)物種也可以被檢測(cè)到)。miRNA對(duì)應(yīng)的DNA片段，在本發(fā)明中被命名為miDNA，作為基因組的特殊組成部分，具有數(shù)目多，同源拷貝數(shù)多和可 移植性好的特點(diǎn)。miDNA作為新的功能性標(biāo)記的開發(fā)目前還未有報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種與miRNA相關(guān)的功能性分子標(biāo)記的開發(fā)方法。該方法的技術(shù)方案如下
將miRNA數(shù)據(jù)庫中已知的miRNA序列與被研究物種已公開的DNA序列進(jìn)行BlastN比對(duì)，根據(jù)堿基錯(cuò)配的數(shù)目和相似程度確定miDNA候選序列，然后將其左右延伸一定距離達(dá)到150bp左右，再經(jīng)過莖環(huán)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)和最小自由折疊能系數(shù)的計(jì)算確定前體miDNA位點(diǎn)；將篩選出的所有前體miDNA序列進(jìn)行分類比對(duì)，根據(jù)保守序列設(shè)計(jì)引物，然后將設(shè)計(jì)好的引物在數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行電子比對(duì)，確定其是否為miDNA特有序列；最后根據(jù)各引物的退火溫度大小相互組合，開發(fā)出一種效率高和多態(tài)性好的功能性標(biāo)記。本發(fā)明具體通過以下步驟實(shí)現(xiàn)
(1)從miRNA數(shù)據(jù)庫(http://www.mirbase.org/)中下載所有的miRNA序列，以下載的序列為種子序列即query序列，然后與被研究物種的已知序列進(jìn)行blastN (http://www. ncbi. nlm. nih. gov/BLAST/)比對(duì)，符合以下條件的為miDNA候選序列
條件一若query序列為被研究物種序列，則匹配序列容忍存在3個(gè)以內(nèi)堿基的錯(cuò)配； 若query序列為被研究物種之外的序列，則匹配序列容忍存在5個(gè)以內(nèi)堿基的錯(cuò)配； 條件二 query序列與匹配序列相似性達(dá)到90%以上； 條件三query序列與匹配序列E值在0. 1以下；
(2)將miDNA候選序列向左右延伸大致相等的長(zhǎng)度達(dá)到150bp左右，得到被稱為可能的前體miDNA，簡(jiǎn)稱為pre-miDNA ；
(3)禾I」MRNA structure 5. 1(http//www. softpedia. com/get/Science-CAD/ RNAstructure. shtml)對(duì)可能的pre-miDNA序列進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)，并計(jì)算最低自由折疊能系數(shù)
若miDNA候選序列在可能的pre-miDNA序列莖環(huán)結(jié)構(gòu)的莖上，同時(shí)miDNA中A + U含量在30% 70%之間、miDNA與其在另一臂上的互補(bǔ)鏈之間的錯(cuò)配不超過6個(gè)堿基、并且自由折疊能系數(shù)(MFEI)為-85 kcal/mol以上，則此序列為miDNA序列；
(4)將miDNA序列所對(duì)應(yīng)的前體序列pre-miDNA，進(jìn)行all-by-allBlastN比對(duì)分析， 然后根據(jù)比對(duì)的E值將pre-miDNA分成不同的亞類，E值小于e,為符合，然后再將每個(gè)亞類利用本地化的 Blast (http://blast, ncbi. nlm. nih. gov/Blast. cgi)軟件進(jìn)行序列提取，將提取的序列進(jìn)行 ClustalW(http://www. ebi. ac. uk/Tools/msa/clustalw2/)比對(duì)， 尋找出保守序列；
(5)禾丨J 用 Primer Premier 6. 0 (http://primer-premier. downloadaces. com/)軟件對(duì)保守序列進(jìn)行單條引物的設(shè)計(jì)，引物設(shè)計(jì)的原則為退火溫度為55-60°C，引物長(zhǎng)度在 18-25之間，最佳長(zhǎng)度為22個(gè)堿基，然后將設(shè)計(jì)的引物與在miRNA (http://www. mirbase.org/)數(shù)據(jù)庫中下載的序列和被研究物種的基因組序列進(jìn)行比對(duì)，確定設(shè)計(jì)的引物不能與 pre-miDNA之外的序列匹配上；
(6)將設(shè)計(jì)好的引物按退火溫度相近的引物放在一組組合的原則進(jìn)行隨機(jī)相互組合， 或者將設(shè)計(jì)的引物與ISSR引物進(jìn)行組合；
(7)將組合的引物對(duì)在被研究物種有代表性的材料中進(jìn)行引物篩選，挑選出帶型清楚、多態(tài)性好和穩(wěn)定性好的引物組合作為該物種的參考引物組合。 上述方法得到的參考引物組合可以被應(yīng)用于近緣種或其它物種中，增加近緣種或其它物種標(biāo)記開發(fā)能力。


圖1為甘藍(lán)型油菜中與MicroRNAs相關(guān)的功能性分子標(biāo)記優(yōu)良引物組合篩選結(jié)果，實(shí)驗(yàn)材料從左向右分別為中雙11號(hào)、華雙3號(hào)、油研9號(hào)、油研11號(hào)、浠水油菜白、黃巖寧波種、五峰紅桿子、余井花籽、三都黃油菜和德清金菜籽。所使用的引物組合分別為附表 3 中的 miBNl- miBN5。本發(fā)明的有益效果
(1)小RNA有關(guān)的標(biāo)記以PCR擴(kuò)增為基礎(chǔ)，具有較高的穩(wěn)定性和多態(tài)性，結(jié)合了SSR標(biāo)記和AFLP標(biāo)記的優(yōu)點(diǎn)；
(2)由于小RNA具有較高的保守性，所以小RNA有關(guān)的標(biāo)記具有較高的可移植性，尤其適合沒有基因組測(cè)序、信息量較少的物種的標(biāo)記開發(fā)研究；
(3)該方法開發(fā)的標(biāo)記為功能性標(biāo)記，能夠知道標(biāo)記對(duì)應(yīng)的序列作用的靶位點(diǎn)。不同材料的多態(tài)性差異可以顯示該標(biāo)記序列所調(diào)控的基因表達(dá)模式的差異。
具體實(shí)施例方式
以甘藍(lán)型油菜為例，開發(fā)功能性的與miRNA有關(guān)的分子標(biāo)記。(1)從 miRNA 數(shù)據(jù)庫(http://www.mirbase. org/)中下載所有的 miRNA 序列，同時(shí)下載甘藍(lán)型油菜公開的基因組部分序列(目前未測(cè)序完)(http://WWW. ncbi. nlm. nih. gov/)；以從miRNA下載的序列為種子序列(query序列)，然后與甘藍(lán)型油菜公開的序列進(jìn)行 BlastN (http//www. ncbi. nlm. nih. gov/BLAST/)比對(duì)，符合以下參數(shù)條件的為 miDNA 候選序列
參數(shù)設(shè)置如下
條件一 query序列中有25條序列為甘藍(lán)型油菜miRNA序列，在比對(duì)時(shí)則匹配序列容忍存在3個(gè)以內(nèi)堿基的錯(cuò)配；query序列中的其它序列，在比對(duì)時(shí)匹配序列容忍存在5個(gè)以內(nèi)堿基的錯(cuò)配；
條件二 query序列與匹配序列相似性達(dá)到90%以上； 條件三query序列與匹配序列E值在0. 1以下；
(2)將符合條件的miDNA候選序列2354條，向左右延伸大致相等的長(zhǎng)度達(dá)到150bp左右，得到被稱為可能的前體miDNA，簡(jiǎn)稱為pre-miDNA ；
3 禾I」M RNA structure 5. 1 $a # (http //www. softpedia. com/get/Science-CAD/ RNAstructure. shtml)對(duì)可能的pre-miDNA序列進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)，并計(jì)算最低自由折疊能系數(shù)；若miDNA候選序列在可能的pre-miDNA序列莖環(huán)結(jié)構(gòu)的莖上，同時(shí)miDNA中A + U含量在30% 70%之間、miDNA與其在另一臂上的互補(bǔ)鏈之間的錯(cuò)配不超過6個(gè)堿基、并且自由折疊能系數(shù)(MFEI)為-85 kcal/mol以上，則判斷此序列為miDNA序列，得到711條序列(第一次與NCBI中Brassica數(shù)據(jù)庫DNA比對(duì)處理后，最終得到132個(gè)；第二次與華農(nóng)白菜數(shù)據(jù)比對(duì)處理后得到579個(gè))；
(4)將miDNA序列所對(duì)應(yīng)的前體序列pre-miDNA，進(jìn)行all-by-allBlastN比對(duì)分析， 然后根據(jù)比對(duì)的E值(小于e_1(l為符合)將pre-miDNA分成不同的亞類，共分成15個(gè)亞類， 然后再將每個(gè)亞類利用本地化的 Blast (http://blast, ncbi. nlm. nih. gov/Blast. cgi) 軟件進(jìn)行序列提取，將提取的序列進(jìn)行ClustalW(http://www. ebi. ac. uk/Tools/msa/ clustalw2/)比對(duì)，尋找出保守序列；
(5)禾丨J用 Primer Premier 6· 0 (http://primer-premier, downloadaces. com/)軟件對(duì)保守序列進(jìn)行單條引物的設(shè)計(jì)，引物的退火溫度都為60°C左右，引物長(zhǎng)度在18-25之間，最佳長(zhǎng)度為為22個(gè)堿基，共設(shè)計(jì)了 35條引物，然后將設(shè)計(jì)的引物與在miRNA (http://www. mirbase. org/)數(shù)據(jù)庫中下載的序列和被研究物種的基因組序列進(jìn)行比對(duì)，確定設(shè)計(jì)的引物不能與pre-miDNA之外的序列匹配上，最終確定的引物為25條(引物序列在附表1中)。(6)將設(shè)計(jì)好的引物按退火溫度相近的引物放在一組組合的原則進(jìn)行隨機(jī)相互組合，或者將設(shè)計(jì)的引物與ISSR引物進(jìn)行組合(ISSR引物序列在附表2中)；
(7)將組合的引物對(duì)在被研究物種有代表性的材料中進(jìn)行引物篩選(附圖1)，挑選出帶型清楚、多態(tài)性好和穩(wěn)定性好的引物組合作為該物種的參考引物組合，有25個(gè)(引物序列在附表3中)。將上述方法得到的參考引物組合應(yīng)用于白菜、甘藍(lán)和甘藍(lán)型油菜中，表現(xiàn)出了比較好的擴(kuò)增效果，將33對(duì)miDNA引物在甘藍(lán)型油菜自然群體中進(jìn)行了驗(yàn)證，其中編號(hào)為 miBN5的組合(miRNA7-miRNA28)與控制開花的性狀有關(guān)，根據(jù)測(cè)序發(fā)現(xiàn)該片段與預(yù)期序列相符，其產(chǎn)生的miRNA能夠控制與AT3G04910. 1同源的生物節(jié)律基因。附表1甘藍(lán)型油菜中與MicroRNAs相關(guān)的優(yōu)良引物，靶位點(diǎn)和靶位點(diǎn)功能
權(quán)利要求
1.一種與miRNA相關(guān)的功能性分子標(biāo)記的開發(fā)方法，其特征在于，將miRNA數(shù)據(jù)庫中已知的miRNA序列與被研究物種已公開的DNA序列進(jìn)行BlastN比對(duì)，根據(jù)堿基錯(cuò)配的數(shù)目和相似程度確定miDNA候選序列，然后將其左右延伸一定距離達(dá)到150bp左右，再經(jīng)過莖環(huán)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)和最小自由折疊能系數(shù)的計(jì)算確定前體miDNA位點(diǎn)；將篩選出的所有前體 miDNA序列進(jìn)行分類比對(duì)，根據(jù)保守序列設(shè)計(jì)引物，然后將設(shè)計(jì)好的引物在數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行電子比對(duì)，確定其是否為miDNA特有序列；最后根據(jù)各引物的退火溫度大小相互組合，開發(fā)出一種效率高和多態(tài)性好的功能性標(biāo)記。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，具體通過以下步驟實(shí)現(xiàn)(1)從miRNA數(shù)據(jù)庫(http://www.mirbase.org/)中下載所有的miRNA序列，以下載的序列為種子序列即query序列，然后與被研究物種的已知序列進(jìn)行blastN (http://www. ncbi. nlm. nih. gov/BLAST/)比對(duì)，符合以下條件的為miDNA候選序列條件一若query序列為被研究物種序列，則匹配序列容忍存在3個(gè)以內(nèi)堿基的錯(cuò)配； 若query序列為被研究物種之外的序列，則匹配序列容忍存在5個(gè)以內(nèi)堿基的錯(cuò)配；條件二 query序列與匹配序列相似性達(dá)到90%以上；條件三query序列與匹配序列E值在0. 1以下；(2)將miDNA候選序列向左右延伸大致相等的長(zhǎng)度達(dá)到150bp左右，得到被稱為可能的前體miDNA，簡(jiǎn)稱為pre-miDNA ；(3)禾I」MRNA structure 5. 1(http//www. softpedia. com/get/Science-CAD/ RNAstructure. shtml)對(duì)可能的pre-miDNA序列進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)，并計(jì)算最低自由折疊能系數(shù)若miDNA候選序列在可能的pre-miDNA序列莖環(huán)結(jié)構(gòu)的莖上，同時(shí)miDNA中A + U含量在30% 70%之間、miDNA與其在另一臂上的互補(bǔ)鏈之間的錯(cuò)配不超過6個(gè)堿基、并且自由折疊能系數(shù)(MFEI)為-85 kcal/mol以上，則此序列為miDNA序列；(4)將miDNA序列所對(duì)應(yīng)的前體序列pre-miDNA，進(jìn)行all-by-allBlastN比對(duì)分析， 然后根據(jù)比對(duì)的E值將pre-miDNA分成不同的亞類，E值小于e,為符合，然后再將每個(gè)亞類利用本地化的 Blast (http://blast, ncbi. nlm. nih. gov/Blast. cgi)軟件進(jìn)行序列提取，將提取的序列進(jìn)行 ClustalW(http://www. ebi. ac. uk/Tools/msa/clustalw2/)比對(duì)， 尋找出保守序列；(5)禾丨J 用 Primer Premier 6. 0 (http://primer-premier, downloadaces. com/)軟件對(duì)保守序列進(jìn)行單條引物的設(shè)計(jì)，引物設(shè)計(jì)的原則為退火溫度為55-60°C，引物長(zhǎng)度在 18-25之間，最佳長(zhǎng)度為22個(gè)堿基，然后將設(shè)計(jì)的引物與在miRNA (http://www. mirbase. org/)數(shù)據(jù)庫中下載的序列和被研究物種的基因組序列進(jìn)行比對(duì)，確定設(shè)計(jì)的引物不能與 pre-miDNA之外的序列匹配上；(6)將設(shè)計(jì)好的引物按退火溫度相近的引物放在一組組合的原則進(jìn)行隨機(jī)相互組合， 或者將設(shè)計(jì)的引物與ISSR引物進(jìn)行組合；(7)將組合的引物對(duì)在被研究物種有代表性的材料中進(jìn)行引物篩選，挑選出帶型清楚、多態(tài)性好和穩(wěn)定性好的引物組合作為該物種的參考引物組合。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種與MicroRNA(簡(jiǎn)稱miRNA)相關(guān)的功能性標(biāo)記的開發(fā)方法。該方法將miRNA數(shù)據(jù)庫中已知的miRNA序列與被研究的物種已公開的DNA序列進(jìn)行BlastN比對(duì)，根據(jù)堿基錯(cuò)配的數(shù)目和相似程度確定miRNA對(duì)應(yīng)的DNA(簡(jiǎn)稱miDNA)序列，然后將其左右延伸一定距離，使總長(zhǎng)約150bp，再通過莖環(huán)二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)和最小自由折疊能系數(shù)的計(jì)算確定前體miDNA位點(diǎn)。將篩選出的所有前體miDNA序列進(jìn)行分類比對(duì)，根據(jù)保守序列設(shè)計(jì)引物，將設(shè)計(jì)好的引物在數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行電子比對(duì)，確定其為miDNA特有序列，最后根據(jù)各引物的退火溫度大小相互組合，開發(fā)出一種效率高和多態(tài)性好的功能性標(biāo)記。該標(biāo)記系統(tǒng)結(jié)合了SSR和AFLP等傳統(tǒng)標(biāo)記的優(yōu)點(diǎn)，具有較高的移植性、低成本性、多態(tài)性和穩(wěn)定性等優(yōu)良特點(diǎn)。
文檔編號(hào)G06F19/16GK102222175SQ20111011675
公開日2011年10月19日 申請(qǐng)日期2011年5月6日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月6日
發(fā)明者付東輝, 周慶紅, 李加納, 沈亮余, 魏麗娟 申請(qǐng)人:西南大學(xué)