專利名稱：嗜熱酯酶/磷脂酶基因、工程菌、酶及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，具體涉及一種嗜熱酯酶/磷脂酶A2的基因、由該基因重組載體在常溫宿主中表達(dá)的工程菌、利用該工程菌構(gòu)建的嗜熱酯酶/磷脂酶A2及該酶在工業(yè)中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
自1985年第一種嗜熱酶即TaqDNA聚合酶被成功地用于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)后，生長(zhǎng)在特殊高熱環(huán)境下的微生物正日益引起人們的重視。許多具有水解酶活性的嗜熱酶(thermophilic enzyme， 55-80℃)相繼得到了開發(fā)，并在許多領(lǐng)域發(fā)揮了重要作用。近年來，人們從海底熱流的嗜熱性古生菌中分離得到超級(jí)嗜熱酶(hyperthermophilic enzyme，80-113℃)，為現(xiàn)代酶工程技術(shù)展現(xiàn)了新的應(yīng)用前景(王柏婧等，微生物學(xué)報(bào)，2002，42259-262；Fujiwara S，et al.J.Biosci.Bioeng.2002，94(6)518-525)。嗜熱酶不僅具有化學(xué)催化劑無法比擬的優(yōu)點(diǎn)，如催化效率高和底物專一性強(qiáng)，而且酶的穩(wěn)定性極好。它可以克服中溫酶(mesophilic enzyme，20-55℃)及低溫酶(psychrophilic enzyme，-2-20℃)在應(yīng)用過程中常常出現(xiàn)的生物學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定的現(xiàn)象，從而使很多高溫化學(xué)反應(yīng)得以實(shí)現(xiàn)，這將極大地促進(jìn)生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，帶動(dòng)技術(shù)水平和生活質(zhì)量的提高。
利用嗜熱酶作為生物催化劑有如下優(yōu)點(diǎn)(1)酶制劑的制備成本降低。因?yàn)槭葻崦傅姆€(wěn)定性高，因而可以在室溫下分離提純和包裝運(yùn)輸，并且能長(zhǎng)久地保持活性；(2)加快動(dòng)力學(xué)反應(yīng)。隨著反應(yīng)溫度的提高，分子運(yùn)動(dòng)速度加快，酶催化能力加強(qiáng)；(3)減少了能耗。因?yàn)樵诟邷厍闆r下反應(yīng)，因此對(duì)反應(yīng)器冷卻系統(tǒng)的要求標(biāo)準(zhǔn)降低；(4)提高了產(chǎn)物的純度。在嗜熱酶催化反應(yīng)條件下(超過70℃)，很少有雜菌生存，從而減少了細(xì)菌代謝物對(duì)最終產(chǎn)物的污染。由于嗜熱酶的高溫反應(yīng)活性，以及對(duì)有機(jī)溶劑、去污劑和變性劑的較強(qiáng)抗性，使它在食品、醫(yī)藥、制革、石油開采及廢物處理等方面都有廣泛的應(yīng)用潛力。
酯酶(Esterases，EC 3.1.1.1)是一類廣泛分布于組織與器官的絲氨酸水解酶類，能水解許多含有羧酯鍵、硫酯鍵、酰胺鍵的內(nèi)源性及外源性物質(zhì)。其在生物體內(nèi)的主要功能是參與脂質(zhì)代謝、信號(hào)傳導(dǎo)及維持生物膜結(jié)構(gòu)的完整性；在體外主要用于酯水解和在有機(jī)相中完成酯化、酯交換等眾多反應(yīng)(Klibanov A M.2001，Nature，409241-246)。利用酯酶的立體專一性，還可以催化不對(duì)稱性反應(yīng)，制備許多利用化學(xué)法難以合成的手性化合物(如液晶、光學(xué)活性藥物和農(nóng)藥等)。近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，國外對(duì)酯酶基因的克隆研究很活躍，已有幾種微生物酯酶基因得到控制和表達(dá)，為了提高酯酶的熱穩(wěn)定性和底物特異性，應(yīng)用定點(diǎn)突變和定向進(jìn)化技術(shù)已對(duì)酶進(jìn)行了分子改造(Giver JC，Arnold FH，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.1998，9512809-13；Henke E，Bornscheuer UT，Biol.Chem.，1999，3801029-33)。由于嗜熱菌微生物培養(yǎng)條件苛刻，因此對(duì)于嗜熱酯酶的研究還很少。
磷脂酶A2(PLA2)，系統(tǒng)名稱為磷脂酰2-酯酰水解酶(phosphatidylcholine-2-acylhydrolase)，它能酶促水解甘油磷脂的第二位酯酰鍵，生成溶血磷脂和脂肪酸，如下式所示 (卵)磷脂溶血(卵)磷脂 脂肪酸PLA2具有很多生物學(xué)功能，如作為神經(jīng)毒素、肌肉毒素和心臟毒素，參與許多生理活動(dòng)，如脂質(zhì)消化和代謝、信號(hào)傳導(dǎo)以及消除炎癥過程，從而引起國內(nèi)外研究學(xué)者的廣泛關(guān)注。目前，國內(nèi)主要集中于蛇PLA2的研究；國外對(duì)蛇毒PLA2的克隆、表達(dá)與晶體結(jié)構(gòu)模擬等都已有詳細(xì)報(bào)道，另外對(duì)蜂毒PLA2的DNA重組及結(jié)構(gòu)也進(jìn)行了初步研究，但這些酶大多數(shù)屬于中溫酶。而嗜熱PLA2，特別是古生菌嗜熱酶PLA2的研究還處于初始階段，到現(xiàn)在為止，只在Pyrococcus horikoshii中發(fā)現(xiàn)了嗜熱PLA2的活力(Feng，Y.，et al.American Oil Chemistry Society，2000，771147-1152.)，但是由于其分子結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，還沒有成功地構(gòu)建表達(dá)嗜熱PLA2的工程菌。
PLA2在油脂工業(yè)中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。在進(jìn)行高品質(zhì)油脂生產(chǎn)過程中，需要對(duì)油脂進(jìn)行脫膠化處理，將混于油脂中的脂溶性磷脂分子分解為水溶性的磷脂衍生物，從而除去磷脂，提高油脂的純度和質(zhì)量。目前在色拉油等高品質(zhì)油脂生產(chǎn)中通常采用化學(xué)法和物理法脫膠，但是該法不僅工藝復(fù)雜、成本高，而且污染嚴(yán)重。近十年來，歐洲等地如德國已嘗試使用酶法對(duì)此工藝進(jìn)行改造(K.Dahlke and H.Buchold，Information，1995，6(12)1284-1291)。他們應(yīng)用豬胰磷脂酶轉(zhuǎn)化磷脂分子取得了很好的效果。不僅生產(chǎn)效率提高，而且生產(chǎn)成本也降低了43％。因?yàn)槊钢苿┥a(chǎn)的安全性和高效性，該方法得到了廣泛的注意，國內(nèi)貿(mào)易部西安油脂科學(xué)研究設(shè)計(jì)院及天津正大集團(tuán)油脂有限公司也組織研究人員對(duì)酶法工藝進(jìn)行了研究(劉智鋒，高忠霞，油脂精煉技術(shù)的新進(jìn)展，中國油脂，1998，23(2)3)。但目前還沒有達(dá)到生產(chǎn)規(guī)模，仍停留在研究階段。主要的問題是所用的豬胰磷脂酶耐熱性差(在60℃以內(nèi)表現(xiàn)最佳催化活力)，而油脂脫膠化過程需要較高的溫度(70-80℃)。常規(guī)酶由于反應(yīng)溫度的限制，使脫膠過程的生產(chǎn)效率和成本都未達(dá)到最佳程度。
所以，為應(yīng)用于較高溫度的反應(yīng)體系，尋找在高溫環(huán)境下仍具有較高催化活力的酯酶和磷脂酶A2是非常重要的，而對(duì)嗜熱古生菌功能蛋白的開發(fā)將有利于發(fā)現(xiàn)和制備新型高溫水解酶。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是在嗜熱性古生菌中提取一種嗜熱酯酶/磷脂酶A2基因；本發(fā)明的另一個(gè)目的是利用上述嗜熱酯酶/磷脂酶A2基因通過生物工程技術(shù)構(gòu)建一種嗜熱酯酶/磷脂酶A2工程菌；本發(fā)明的再一個(gè)目的是利用上述嗜熱酯酶/磷脂酶A2工程菌制備一種穩(wěn)定性好、耐熱性強(qiáng)、催化效率高的嗜熱酯酶/磷脂酶A2。
本發(fā)明的最后一個(gè)目的是通過對(duì)嗜熱酯酶/磷脂酶A2的理化性質(zhì)的研究，提供嗜熱酯酶/磷脂酶A2在工業(yè)生產(chǎn)中的多種用途。
嗜熱古生菌Aeropyrum pernix K1來源于日本深?；鹕娇冢钸m生長(zhǎng)溫度為95℃。我們?cè)谇捌诠ぷ髦邪l(fā)現(xiàn)該菌所表達(dá)的蛋白同時(shí)具有嗜熱酯酶和磷脂酶A2的活力，因此可將其DNA分子中表達(dá)嗜熱酯酶/磷脂酶A2活性的基因序列稱為嗜熱酯酶/磷脂酶A2基因。由于嗜熱古生菌(包括來源于日本深?；鹕娇诘氖葻峁派?人工培養(yǎng)困難，生長(zhǎng)周期較長(zhǎng)，所含嗜熱酯酶/磷脂酶A2的量非常低，因此不能直接利用古生菌培養(yǎng)物來生產(chǎn)嗜熱酯酶/磷脂酶A2。將嗜熱酯酶/磷脂酶A2基因轉(zhuǎn)入可快速繁殖、培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單的常溫宿主如大腸桿菌內(nèi)，能夠有效地解決上述問題。
對(duì)來源于日本深?；鹕娇诘氖葻峁派鶤eropyrum pernix K1通過培養(yǎng)、目的基因釣取，得到本發(fā)明所述嗜熱蛋白基因，我們委托寶生物工程(大連)有限公司進(jìn)行基因測(cè)序，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示。
我們將嗜熱酶基因裝載在pET系統(tǒng)載體上，然后轉(zhuǎn)入到大腸桿菌宿主中，得到一株工程菌(命名為JDA1)。該工程菌菌株已于2002年12月02日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC No.0844。分類命名大腸埃希氏菌(Escherichia coli)。
工程菌表達(dá)產(chǎn)物是細(xì)胞可溶性蛋白，通過細(xì)胞超聲破碎、加熱失活大腸桿菌雜蛋白，即可進(jìn)行分離純化得到嗜熱蛋白。
應(yīng)用大腸桿菌工程菌(JDA1)表達(dá)的嗜熱蛋白經(jīng)活性實(shí)驗(yàn)鑒定，不僅具有磷脂酶A2活性，還有酯酶活性；該嗜熱蛋白即為本發(fā)明所述的嗜熱酯酶/磷脂酶A2，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示，它具有普通酯酶和磷脂酶A2所不具備的優(yōu)點(diǎn)，能在高溫條件(80-100℃)下催化反應(yīng)，有很強(qiáng)的抗高溫和化學(xué)物質(zhì)變性的能力；運(yùn)用到生產(chǎn)中，有儲(chǔ)運(yùn)成本低、加快動(dòng)力學(xué)反應(yīng)、對(duì)反應(yīng)器冷卻系統(tǒng)要求標(biāo)準(zhǔn)低等優(yōu)點(diǎn)。該重組酶能催化酯合成、酯交換和酯水解反應(yīng)，在生物化工、油脂脫膠、工具酶等領(lǐng)域都具有重要的應(yīng)用潛力。
將本發(fā)明的嗜熱酯酶/磷脂酶A2基因與表達(dá)載體重組，形成重組表達(dá)載體，本發(fā)明不限于特定的表達(dá)載體，優(yōu)選的表達(dá)載體采用真核或原核表達(dá)載體，進(jìn)一步優(yōu)選的為pET15b載體。
上述重組表達(dá)載體可按常規(guī)方法導(dǎo)入適宜的宿主細(xì)胞，適宜的宿主細(xì)胞包括原核細(xì)胞和真核細(xì)胞。本發(fā)明不局限于任何特定的宿主細(xì)胞，只要它能夠表達(dá)所述重組表達(dá)載體。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明使用E.coli BL21(DE3)codon plus菌株。
以上技術(shù)方案中所有基本分子生物學(xué)操作均參照“分子克隆實(shí)驗(yàn)指南”(第三版，科學(xué)出版社，2002年)。
本發(fā)明的嗜熱酯酶/磷脂酶A2催化反應(yīng)所利用的底物范圍不局限于任何指定的酯類、磷脂類、有機(jī)酸、醇等物質(zhì)，只要能參與水解、合成、轉(zhuǎn)酯反應(yīng)發(fā)生的化學(xué)物質(zhì)都可以。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明使用對(duì)硝基苯酚脂肪酸酯和NBD-卵磷脂(1-hexadecanoyl-2-[N-(7-nitrobenz-2-oxa-1，3-diazol-4-yl)aminohexanoyl]-sn-glycero-3-phosphocholine，NBD-PC)作為底物。
該酶的底物不局限于任何指定的酯、磷脂、有機(jī)酸、醇等物質(zhì)，只要能參與酯水解、酯合成及轉(zhuǎn)酯反應(yīng)的化學(xué)物質(zhì)都是該酶的適用底物。
取37.4g Bacto marine broth 2216(Difco)(培養(yǎng)基)溶于990ml蒸餾水中，濕熱滅菌；取1.0g Na2S2O3·5H2O(營養(yǎng)鹽)溶于10ml蒸餾水中，0.45m濾膜過濾除菌后加入到滅菌的培養(yǎng)基中。古生菌Aeropyrum pernix K1的干細(xì)胞加入0.5ml培養(yǎng)基，溶解后轉(zhuǎn)移至裝有5mL上述培養(yǎng)基的試管中，混勻；從中取0.5ml轉(zhuǎn)移至裝有5ml新鮮培養(yǎng)基的試管，90℃靜止培養(yǎng)7天。然后轉(zhuǎn)移至裝有100ml培養(yǎng)基的錐型瓶中90℃振蕩培養(yǎng)3天，-40℃保存菌體備用。
取1.5ml的古生菌培養(yǎng)物收集菌體，用200μL的25mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH8.0，含50mmol/L葡萄糖、10mmol/L EDTA)重懸沉淀，加入50μl的50mg/ml溶菌酶，4℃消化1小時(shí)；加入125μl的SDS溶液(終濃度為2％)反應(yīng)10分鐘；加入等體積的酚氯仿異戊醇，混勻，離心5分鐘，將上清液轉(zhuǎn)移到另一支離心管中；向沉淀中加入2倍體積的無水乙醇，沉淀菌體DNA，12000rpm離心5分鐘，倒去上清后，用70％的乙醇洗滌DNA；離心后除去上清，用TE溶液重新溶解，所得染色體DNA溶液放4℃冰箱中備用。
(2)引物設(shè)計(jì)及用PCR法釣取酶的基因制備重組載體古生菌Aeropyrum pernix K1基因組中含有幾段可能的脂肪酶基因。通過測(cè)序，我們選擇其核苷酸序列如表SEQ ID NO.1所示的基因作為研究對(duì)象，并稱之為嗜熱酯酶/磷脂酶A2基因。該酶基因通過已知PCR方法從步驟(1)所得染色體DNA中擴(kuò)增而得到。兩個(gè)引物是根據(jù)該基因的序列及表達(dá)載體的多酶切位點(diǎn)而設(shè)計(jì)的，委托上海生工生物工程公司合成。
上游引物TTTAGAATTCGCGCATATGGGTGTTAACGAGG，劃線部分為Nde I位點(diǎn)；下游引物TTTTGGTACCTTAGGATCCAATTAGTGTTTAGCCTCCG，劃線部分為BamH I位點(diǎn)。
兩個(gè)引物所設(shè)置的酶切位點(diǎn)與表達(dá)載體pET15b的NdeI和BamHI相匹配，適合于在大腸桿菌中高效表達(dá)。
PCR反應(yīng)在100μl反應(yīng)體系中含1μl Vent DNA聚合酶，10μl Vent DNA聚合酶緩沖液，1.5μl dNTP混合物(每種核苷酸濃度25nmol/L)，4μl染色體DNA，1μl上游引物，1μl下游引物，81.5μl超純水。每循環(huán)中94℃變性0.5分鐘，55℃退火0.5分鐘，72℃延伸1分鐘，最后一次循環(huán)延至10min，共35個(gè)循環(huán)。用2.0％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，分子量與預(yù)期的(474bp)一致。使用PCR產(chǎn)物純化試劑盒對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化。
將純化的PCR產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶BamH I酶切，37℃下保溫1小時(shí)后，加入1μl 0.5M NaCl，2μl Nde I，再在37℃下保溫1小時(shí)。酶切完畢，在2.0％的瓊脂糖凝膠上電泳，應(yīng)用DNA凝膠檢測(cè)試劑盒回收酶切后的DNA片段。
應(yīng)用類似的方法酶切pET15b載體，然后再用堿性磷酸酶(CAP)處理，在0.7％瓊脂糖凝膠中檢測(cè)線性載體并提純酶切后的載體。在16℃應(yīng)用T4DNA聚合酶來連接酯酶基因片段和載體。將連接載體轉(zhuǎn)入E.coli BL21(DE3)Codon Plus中，用含氨芐青霉素的瓊脂糖平板進(jìn)行單克隆菌株的篩選和鑒定。從菌落中挑取載體，用限制性內(nèi)切酶Nde I和BamH I作用載體，得到大小兩個(gè)片段，其大小分別與酯酶基因和pET15b/NdeI+BamHI的片段大小一致。重組載體的構(gòu)建過程如圖2所示。
(3)重組載體在宿主細(xì)菌中的表達(dá)重組載體可轉(zhuǎn)化到E.coli BL21(DE3)和E.coli BL21(DE3)Codon Plus等宿主細(xì)胞中，在E.coli BL21(DE3)Codon Plus中表達(dá)的嗜熱酶含量較高。大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞制備及其載體轉(zhuǎn)化方法參照“分子克隆實(shí)驗(yàn)指南”一書。挑取陽性轉(zhuǎn)化菌，置5ml含氨芐青霉素的培養(yǎng)液中37℃振蕩培養(yǎng)過夜，次日接種到100ml新鮮LB培養(yǎng)基中，37℃繼續(xù)培養(yǎng)4h。將初步放大的種子液以1％的比例接入2L的培養(yǎng)液中，在空氣搖床震蕩培養(yǎng)(37℃，120rpm/min)。待菌體生長(zhǎng)到A600為0.6～1.0時(shí)，加入100mM的異丙基硫代β-D-半乳糖苷(IPTG)至終濃度為1mM，降低培養(yǎng)溫度至25℃，對(duì)菌體進(jìn)行誘導(dǎo)使其產(chǎn)生大量目的蛋白，培養(yǎng)10-12小時(shí)后收獲菌體，得到本發(fā)明所述工程菌。該工程菌菌株已于2002年12月02日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC No0844。分類命名大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)。
把菌體于-30℃冷凍1小時(shí)，融化，加入菌體5-10倍體積的50mM Tris-HCl(pH8.0)緩沖液，超聲破碎10分鐘；將破碎液于85℃加熱處理30分鐘，離心除去變性的大腸桿菌雜蛋白(12000rpm，20min)，收集上清得粗酶液。
因?yàn)橹亟M嗜熱酶N-末端含有His-Tag，應(yīng)用鎳親和柱(Ni-Chelating Column)對(duì)重組蛋白進(jìn)行分離，用100mM咪唑洗脫與層析柱結(jié)合得到嗜熱酶。應(yīng)用SDS-PAGE(12％)電泳檢測(cè)重組蛋白的純度，可見在18000Da附近可見一電泳條帶，如圖3所示。實(shí)施例2重組嗜熱酯酶/磷脂酶A2的特性(1)最適反應(yīng)溫度反應(yīng)溫度是影響酶催化活力的重要因素。一般而言，嗜熱酯酶/磷脂酶A2在高溫下的反應(yīng)活力遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于低溫?？紤]到底物的穩(wěn)定性，在此酶催化活力檢測(cè)的最高溫度僅為100℃。
以NBD-PC作為反應(yīng)底物，在50-100℃的溫度范圍內(nèi)測(cè)定磷脂酶A2活力。由圖4(a)可見，其活力在50-90℃溫度范圍內(nèi)隨溫度的升高而提高，在90℃以上，活力下降，最適溫度為90℃。
以對(duì)硝基苯酚丙酸酯為底物，我們還研究了該重組酶在不同溫度下的酯酶活力。結(jié)果如圖4(b)所示，當(dāng)溫度達(dá)到90℃時(shí)，該酶表現(xiàn)出最大催化活力。
嗜熱酯酶/磷脂酶A2活力測(cè)定以帶有NBD熒光標(biāo)記的卵磷酯作為底物，通過觀測(cè)NBD衍生物產(chǎn)生的熒光，就可以通過薄板掃描儀(WALLAC ARTHUR，England，1442MULTI-WAVELEN GTH FLUOROIMAGER)來檢測(cè)酶的活力。
取20ul NBD-PC(0.1mg/ml，溶于氯仿)放入2ml玻璃瓶中，吹氮?dú)庖允孤确抡舭l(fā)。加入1.5ml Tris-HCl緩沖液(pH為8.0，終濃度為50mmol/L)和20ul本發(fā)明所述酶液，90℃反應(yīng)1小時(shí)后，置冰浴中終止反應(yīng)。將3ml乙酸乙酯/丙酮(2∶1，v∶v)加入到上述反應(yīng)液中，振搖混合物以萃取殘余底物和產(chǎn)物NBD-acid。2500rpm離心10分鐘，收集上層溶液(2.5ml)，用氮?dú)飧稍飿悠贰堄喙腆w溶于150μl甲醇/氯仿(1∶1，v/v)，取10μl樣品點(diǎn)在薄板上，自然干燥，然后用氯仿/甲醇/水(35∶65∶4，v/v/v)作為展層劑，分離NBD卵磷脂-和NBD酸。
酯酶活性的檢測(cè)以對(duì)硝基苯酚丙酸酯作為脂肪酶水解底物，反應(yīng)體系為1ml，緩沖體系為50mM Tris-HCl(pH8.0)，對(duì)硝基苯酚辛酸酯的終濃度為0.2mM，加入20ul的酶，70℃用日立557型紫外分光光度計(jì)測(cè)定420nm的光吸收值。1個(gè)酶活力單位是1分鐘水解底物生成1μmol對(duì)硝基苯酚(ε＝0.016μM-1.cm-1)所需要的酶量。
(2)最適pH環(huán)境pH值會(huì)影響酶分子中帶電氨基酸的解離狀態(tài)和酶的構(gòu)象，進(jìn)而影響酶的催化活力。以對(duì)硝基苯酚丙酸酯作為底物，在70℃下測(cè)定嗜熱酶在pH5-11范圍內(nèi)的比活(pH5.0-7.0，磷酸緩沖液；pH7.5-8.8，Tris-HCl緩沖液；pH9.0-11.0，Gly-NaOH緩沖液)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示，在pH值7.5至8.5之間能夠有效地催化對(duì)硝基苯酚丙酸酯的水解，且表明本發(fā)明酶的最適pH為8.0。
(3)底物特異性稱取各種對(duì)硝基苯酚脂肪酸酯，將它們分別溶于乙腈配成10mmol/L的底物溶液，參照上述酯酶測(cè)定條件進(jìn)行酶活力測(cè)定。
由表1可知，嗜熱酯酶/磷脂酶A2對(duì)底物對(duì)硝基苯酚軟脂酸酯和對(duì)硝基苯酚硬酸酯不表現(xiàn)催化活力；以對(duì)硝基苯酚辛酸酯、對(duì)硝基苯酚月桂酸酯為底物時(shí)有部分活力；在對(duì)硝基苯酚丙酸酯作為底物時(shí)表現(xiàn)有最高活力。因此可見，短鏈的脂肪酸酯是酶的適宜底物。短鏈的脂肪酸酯廣泛存在于油脂、化工產(chǎn)品中，因此本發(fā)明所述酶在生物化工、油脂加工、工具酶等領(lǐng)域中具有廣泛的應(yīng)用。
表1.嗜熱酶的底物特異性底物 相對(duì)活力(％)
對(duì)硝基苯酚丙酸酯 100.0對(duì)硝基苯酚辛酸酯 79.5對(duì)硝基苯酚月桂酸酯23.7對(duì)硝基苯酚軟脂酸酯0對(duì)硝基苯酚硬脂酸酯0(4)溫度及pH穩(wěn)定性將純化的酶置于不同溫度(50-100℃)下(pH8，Tris-HCl)緩沖液保溫一小時(shí)后迅速冷卻，然后測(cè)定其殘留的酶活力。結(jié)果如圖6(a)所示，表明該酶在80℃保溫后殘余酶活力仍為76.64％；90℃時(shí)的殘余酶活力為68.23％；95℃的殘余酶活力為53.56％，這說明該酶的熱穩(wěn)定性較高。
將本發(fā)明所得酶液放置于50mM不同pH的緩沖液(pH5.0-7.0，磷酸緩沖液；pH7.5-8.8，Tris-HCl緩沖液；pH9.0-11.0，Gly-NaOH緩沖液)中，在室溫放置24小時(shí)，70℃測(cè)其殘余活力。由圖6(b)可以看出，該酶在堿性(pH6-10)范圍內(nèi)穩(wěn)定性較高，殘余酶活力在60％以上。
(5)金屬離子對(duì)酶活的影響測(cè)試了5種無機(jī)離子(Na+、K+、Ca2+、Mg2+和Zn2+)在濃度為1mmol/L時(shí)對(duì)酶活力的影響(表2)。結(jié)果表明各種金屬離子均無明顯的激活作用。Zn2+對(duì)酶有較強(qiáng)的抑制作用外，其余離子也有一定的抑制作用。因此在使用該酶時(shí)，應(yīng)避免高濃度金屬離子的存在。
2.金屬離子對(duì)酶活力的影響金屬離子比活(U/mg) 相對(duì)活力(％)對(duì)照171.89 100.00Na+100.58 58.51K+135.58 78.88Ca2+141.28 82.11Mg2+123.23 71.60Zn2+00本發(fā)明所公開的內(nèi)容，相信本領(lǐng)域技術(shù)人員可最大限度地應(yīng)用本發(fā)明。因此前面的優(yōu)選具體實(shí)施方案應(yīng)被理解為僅是舉例說明，而非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。本領(lǐng)域研究人員在不偏離其主旨和范圍的情況下，可對(duì)本發(fā)明進(jìn)行各種變更和改進(jìn)。
附本發(fā)明所涉及嗜熱酯酶/磷脂酶A2基因核苷酸序列和嗜熱酯酶/磷脂酶A2氨基酸序列(1)SEQ ID NO.1 嗜熱酯酶/磷脂酶A2基因核苷酸序列表<110>吉林大學(xué)<120>嗜熱酯酶/磷脂酶基因、工程菌、酶及其應(yīng)用<160>2<210>1<211>477<212>DNA<213>古生菌(Aerobic Hyper-thermophilic crenarchaeon，Aeropyrum pernix K1)<220><221>CDS<222>(1)...(477)<400>1GTG GGT GTT AAC GAG GCT TAC GAG GCG CTG CTC CGA GCC TGT GGC GACVal Gly Val Asn Glu Ala Tyr Glu Ala Leu Leu Arg Ala Cys Gly Asp1 5 10 15GGG GAT TTT GAA GAG TGC AGG AGC GGC TAC CAA AGG TTT CTA GAA GAGGly Asp Phe Glu Glu Cys Arg Ser Gly Tyr Gln Arg Phe Leu Glu Glu20 25 30GCG TGC AGG GAG GCT GGC ACG TGT CCT AAG AGG AGG TCC TCG GGC GCTAla Cys Arg Glu Ala Gly Thr Cys Pro Lys Arg Arg Ser Ser Gly Ala35 40 45GGC CGG GGG AAA TAC GTG TGG GTG GAG AGC ATA ATC AGG TCT GGA GTGGly Arg Gly Lys Tyr Val Trp Val Glu Ser Ile Ile Arg Ser Gly Val50 55 60CCC GAC GGG CGC TCT AGG CTG ATA CTC TAC GTT ATA AGC AGG TAT CTTPro Asp Gly Arg Ser Arg Leu Ile Leu Tyr Val Ile Ser Arg Tyr Leu65 70 75 80GTC AAC GTT AAG GGT CTA GAG CCC GGT GAG GCT GAG GCT GTC ATA GACVal Asn Val Lys Gly Leu Glu Pro Gly Glu Ala Glu Ala Val Ile Asp85 90 95GAG TTC CTG AGG GTC TGC TGC GAG AAG CAC GGC AAC TGC AGG AAA ATCGlu Phe Leu Arg Val Cys Cys Glu Lys His Gly Asn Cys Arg Lys Ile100 105 110TAC AAA TCA TGG ATT AGG AAC GTG CTC AGG AGG GTT AGG GAG GGT GGGTyr Lys Ser Trp Ile Arg Asn Val Leu Arg Arg Val Arg Glu Gly Gly105 120 125TGG AGG CCC TGG ACG CTG GAG AGA ATC AGG AGC GAG GAC CCG GAG CTCTrp Arg Pro Trp Thr Leu Glu Arg Ile Arg Ser Glu Asp Pro Glu Leu130 135 140TAC AGG ATT ATA GAG CCT ATA GTG TCC GCC GGC GGA GGC TAA 477Tyr Arg Ile Ile Glu Pro Ile Val Ser Ala Gly Gly Gly(*)145 150 155(2)SEQ ID N0.2 嗜熱酯酶/磷脂酶A2氨基酸序列表<210>2<211>157<212>PRT<213>古生菌(Aerobic Hyper-thermophilic crenarchaeon，Aeropyrum pernix K1)<400>2Val Gly Val Asn Glu Ala Tyr Glu Ala Leu Leu Arg Ala Cys Gly Aspl 5 10 15Gly Asp Phe Glu Glu Cys Arg Ser Gly Tyr Gln Arg Phe Leu Glu Glu20 25 30Ala Cys Arg Glu Ala Gly Thr Cys Pro Lys Arg Arg Ser Ser Gly Ala35 40 45Gly Arg Gly Lys Tyr Val Trp Val Glu Ser Ile Ile Arg Ser Gly Val50 55 60Pro Asp Gly Arg Ser Arg Leu Ile Leu Tyr Val Ile Ser Arg Tyr Leu65 70 75 80Val Asn Val Lys Gly Leu Glu Pro Gly Glu Ala Glu Ala Val Ile Asp85 90 95Glu Phe Leu Arg Val Cys Cys Glu Lys His Gly Asn Cys Arg Lys Ile100 105 110Tyr Lys Ser Trp Ile Arg Asn Val Leu Arg Arg Val Arg Glu Gly Gly105 120 125Trp Arg Pro Trp Thr Leu Glu Arg Ile Arg Ser Glu Asp Pro Glu Leu130 135 140Tyr Arg Ile Ile Glu Pro Ile Val Ser Ala Gly Gly Gly(*)145 150 15權(quán)利要求
1.一種嗜熱酯酶/磷脂酶A2基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一種嗜熱酯酶/磷脂酶A2工程菌，其于2002年12月02日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC No0844。
3.一種嗜熱酯酶/磷脂酶A2工程菌的構(gòu)建方法，包括古生菌的培養(yǎng)、目的基因釣取、構(gòu)建表達(dá)載體，及將載體轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞中4個(gè)步驟
4.根據(jù)權(quán)利3所述的嗜熱酯酶/磷脂酶A2工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于所使用的載體為真核或原核表達(dá)載體。
5.根據(jù)權(quán)利4所述的嗜熱酯酶/磷脂酶A2工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于所使用的載體為pET15b。
6.根據(jù)權(quán)利3所述的嗜熱酯酶/磷脂酶A2工程菌的構(gòu)建方法，其中所使用的宿主細(xì)胞不局限于任何特定的宿主細(xì)胞，只要它能夠表達(dá)所述重組表達(dá)載體。
7.根據(jù)權(quán)利6所述的嗜熱酯酶/磷脂酶A2工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于所使用的宿主細(xì)胞為大腸桿菌BL21(DE3)CodonPlus。
8.一種嗜熱酯酶/磷脂酶A2，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
9.如權(quán)利要求8所述的嗜熱酯酶/磷脂酶A2，其特征在于(1)在50-100℃表現(xiàn)催化活力，其酶活力最適反應(yīng)溫度為90℃；(2)能夠有效地催化對(duì)硝基苯酚丙酸酯、對(duì)硝基苯酚辛酸酯、對(duì)硝基苯酚月桂酸酯或NBD-卵磷脂的水解；(3)酶在pH6-10范圍內(nèi)穩(wěn)定性較高，殘余酶活力在60％以上。
10.權(quán)利要求8或9所述的嗜熱酯酶/磷脂酶A2，在生物化工、油脂加工、工具酶等領(lǐng)域中的應(yīng)用。
11.制備權(quán)利要求8或9所述嗜熱酯酶/磷脂酶A2的方法，包括工程菌發(fā)酵離心，收集沉淀，凍融、超聲破碎、熱處理、親和層析等步驟純化獲得。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，涉及一種嗜熱酯酶/磷脂酶A
文檔編號(hào)C12N9/16GK1451751SQ03111700
公開日2003年10月29日 申請(qǐng)日期2003年5月16日 優(yōu)先權(quán)日2003年5月16日
發(fā)明者馮雁, 曹淑桂, 盧冬梅, 高仁鈞, 韓四平, 任曉東 申請(qǐng)人:吉林大學(xué)