超嗜熱聚合酶可實(shí)現(xiàn)的鄰近延伸分析的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及針對(duì)樣品中分析物進(jìn)行的基于鄰近探針的檢測(cè)分析(“鄰近分析”)，特別是鄰近探針延伸分析(PEA)，且尤其是涉及對(duì)降低非特異性“背景”信號(hào)的方法進(jìn)行的改進(jìn)，其中改進(jìn)包括在這樣的分析中使用超嗜熱聚合酶，所述方法包括：(a)將樣品與至少第一和第二鄰近探針的至少一組接觸，每個(gè)探針包括分析物結(jié)合結(jié)構(gòu)域和核酸結(jié)構(gòu)域，并能夠同時(shí)結(jié)合至分析物；(b)在鄰近探針與分析物結(jié)合時(shí)，使鄰近探針的核酸結(jié)構(gòu)域彼此相互作用，其中所述相互作用包括雙鏈體的形成；(c)延伸所述雙鏈體的至少一個(gè)核酸結(jié)構(gòu)域的3’端以生成延伸產(chǎn)物，其中，延伸反應(yīng)包括將分析的溫度提高至超過室溫并使用聚合酶，所述聚合酶的特征在于40℃時(shí)其具有小于最大酶活性的20％的活性且25℃時(shí)其具有小于最大酶活性的10％的活性，其中，所述聚合酶的最大活性的最適溫度是高于40℃，且所述聚合酶選自強(qiáng)烈火球菌(Pfu)DNA聚合酶和沃氏火球菌(Pwo)DNA聚合酶，或者它們的衍生物或突變體，優(yōu)選地其中所述衍生物是序列-修飾的衍生物；和(d)擴(kuò)增和檢測(cè)延伸產(chǎn)物。
【專利說明】超嗜熱聚合酶可實(shí)現(xiàn)的鄰近延伸分析

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種針對(duì)樣品中分析物進(jìn)行的基于鄰近探針的檢測(cè)分析（"鄰近分 析"），具體涉及鄰近探針延伸分析（PEA)。特別地，本發(fā)明涉及對(duì)方法的改進(jìn)，以便減少非 特異性"背景"信號(hào)，所述非特異性"背景"信號(hào)出現(xiàn)在所有樣品類型中，并且在復(fù)雜的生物 樣品中可能是特別有問題的。本發(fā)明的方法還可產(chǎn)生有利于所述分析的自動(dòng)化和再現(xiàn)性的 簡化方法。所述改進(jìn)包括在室溫下具有最小活性或無活性的聚合酶，特別是超嗜熱聚合酶， 在上述分析中的使用。本發(fā)明還提供了一種試劑盒，包含聚合酶，其是用于本發(fā)明方法的、 在室溫下具有最小活性或無活性的聚合酶。

【背景技術(shù)】
[0002] 在鄰近探針延伸分析中使用了鄰近探針，所述鄰近探針結(jié)合于分析物并具有核酸 結(jié)構(gòu)域（或標(biāo)記），所述核酸結(jié)構(gòu)域與所述分析物結(jié)合以鄰近依賴性方式相互作用。所述相 互作用通常通過一個(gè)或多個(gè)核酸雙鏈體的形成（通過核酸結(jié)構(gòu)域的雜交）進(jìn)行，所述相互 作用使得至少一個(gè)核酸結(jié)構(gòu)域從其3'端延伸。該延伸產(chǎn)物形成可檢測(cè)的，優(yōu)選可擴(kuò)增的， 核酸檢測(cè)產(chǎn)物或檢測(cè)標(biāo)記，借助其可以檢測(cè)到所述分析物。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明中，在室溫下具有最小活性或無活性的聚合酶可在所述聚合酶無活性或具 有最小活性的條件下加入，例如，在實(shí)驗(yàn)室條件下。所述聚合酶可以在產(chǎn)生延伸產(chǎn)物所必需 的其它分析組分之前加入，或者與其它分析組分同時(shí)加入，或者在其它分析組分之后加入。 因此，人們認(rèn)為，除非改變反應(yīng)條件，特別是溫度條件，使聚合酶在該參數(shù)條件下是有活性 的，即具有可檢測(cè)到的活性或者高于最小聚合物活性，否則在室溫下具有最小活性或無活 性的聚合酶不能夠與樣品中的核酸分子，例如鄰近探針的核酸結(jié)構(gòu)域，發(fā)生相互作用產(chǎn)生 延伸產(chǎn)物。
[0004] 本發(fā)明中，在室溫具有最小活性或無活性的聚合酶同時(shí)包含其它反應(yīng)組分，可減 少分析方法的步驟數(shù)目，即減少了從業(yè)者與反應(yīng)混合物之間相互接觸的次數(shù)，所述其它反 應(yīng)組分例如是靶標(biāo)分析物的延伸、擴(kuò)增和檢測(cè)所需的組分。這有利于產(chǎn)生一致的分析結(jié)果。 在室溫下具有最小活性或無活性的聚合酶不論是在其它分析組分之前加入，還是與其它分 析組分同時(shí)加入或在其后加入，所述聚合酶的使用都能夠使從業(yè)者不必直接接觸反應(yīng)混合 物就可控制延伸產(chǎn)物的產(chǎn)生，即封閉管反應(yīng)。在本發(fā)明的方法中，直到反應(yīng)條件有利于激發(fā) 聚合酶活性，才會(huì)產(chǎn)生延伸產(chǎn)物。這使得樣品能夠與分析組分一起進(jìn)行培養(yǎng)足夠的時(shí)間，包 括在聚合酶存在下進(jìn)行培養(yǎng)，以便使鄰近探針的核酸結(jié)構(gòu)域之間的非特異性相互作用最小 化，從而增強(qiáng)了分析的特異性和靈敏性。
[0005] 通常，鄰近分析依賴于"鄰近探測(cè)"原理，其中通過多個(gè)（即兩個(gè)或多個(gè)，通常是兩 個(gè)或三個(gè)）探針的結(jié)合來檢測(cè)分析物，當(dāng)所述探針通過結(jié)合于分析物（因此是"鄰近探針"） 而進(jìn)入鄰近時(shí)，使得信號(hào)生成。一般地，鄰近探針中的至少一個(gè)包括連接于探針的分析物結(jié) 合結(jié)構(gòu)域（或部分）的核酸結(jié)構(gòu)域（或部分），并且信號(hào)的生成涉及核酸部分和/或由其它 探針（或多個(gè)探針）攜帶的另外的功能部分之間的相互作用。因此信號(hào)生成取決于探針之 間（更具體地由它們攜帶的核酸或其它功能部分/結(jié)構(gòu)域之間）的相互作用，因此僅當(dāng)兩 個(gè)（或多個(gè)）必須的探針都結(jié)合于分析物時(shí)才生成信號(hào)，從而向檢測(cè)系統(tǒng)提供改善的特異 性。近年來發(fā)展了鄰近探測(cè)的概念，現(xiàn)在基于該原則的許多分析在本領(lǐng)域是熟知的。例如， "鄰近探針延伸分析"或"鄰近延伸分析"（PEA)是指具體類型的分析，所述分析利用核酸結(jié) 構(gòu)域的延伸，即核苷酸模板化地加入核酸分子的末端，以生成可檢測(cè)的信號(hào)。
[0006] 基于鄰近探針的檢測(cè)分析，特別是鄰近延伸分析使得能夠通過將樣品中的一種或 多種分析物的存在的形式轉(zhuǎn)化成可以容易地檢測(cè)的或者可定量的基于核酸的信號(hào)，以靈 敏、快速且方便地檢測(cè)或者定量該一種或多種分析物，并且所述的分析可以按照均質(zhì)或異 質(zhì)形式進(jìn)行。
[0007] 本領(lǐng)域的鄰近探針通常成對(duì)使用，并且各自地由對(duì)靶標(biāo)分析物具有特異性的分 析物結(jié)合結(jié)構(gòu)域和功能結(jié)構(gòu)域所構(gòu)成，所述功能結(jié)構(gòu)域例如是偶聯(lián)在其上的核酸結(jié)構(gòu)域。 所述分析物結(jié)合結(jié)構(gòu)域例如可以是核酸"適體"（Fredriksson等人（2002),自然生物技 術(shù) 20:473-477) (Fredriksson et al(2002)Nat Biotech20:473-477)或可以是蛋白質(zhì) 的，諸如單克隆或多克隆抗體（Gullberg等人（2004)，美國科學(xué)院院刊101:8420-8424) (Gullberg et al(2004)Proc Natl Acad Sci USA101:8420_8424)。每個(gè)鄰近探針對(duì)的各 自的分析物結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以針對(duì)分析物上的不同結(jié)合位點(diǎn)具有特異性，所述分析物可以由 單一分子或者相互作用的分子復(fù)合物構(gòu)成，或者可以具有相同的特異性，例如在靶標(biāo)分析 物存在的情況下作為多聚體存在。當(dāng)鄰近探針對(duì)變得彼此緊密鄰近時(shí)，這主要當(dāng)兩個(gè)均結(jié) 合于相同分析物分子上的其各自的位點(diǎn)時(shí)發(fā)生，功能結(jié)構(gòu)域（例如，核酸結(jié)構(gòu)域）能夠相互 作用。在本發(fā)明的上下文中，例如，核酸結(jié)構(gòu)域可以含有彼此互補(bǔ)的區(qū)域，因此鄰近探針對(duì) 的核酸結(jié)構(gòu)域可以雜交以形成雙鏈體。一個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)域可以延伸以形成新的核酸序列， 這通常借助由其它鄰近探針的核酸結(jié)構(gòu)域模板化的聚合反應(yīng)來進(jìn)行。由此，生成的新核酸 序列用于報(bào)告樣品中分析物的存在與否或含量，并且生成的新核酸序列可以被定性或定量 檢測(cè)，例如通過實(shí)時(shí)定量PCR(q-PCR)定量檢測(cè)。
[0008] 基于鄰近探針的分析存在許多變化。例如，國際專利W001/61037,美國專利 6, 511，809和國際專利W02006/137932中對(duì)鄰近延伸分析進(jìn)行了描述，并且基于鄰近探針 的分析的異質(zhì)（即分析物首先借助特異性分析物結(jié)合試劑固定在固體基質(zhì)上）和均質(zhì)（即 在溶液中）形式在如下文獻(xiàn)中被公開：國際專利W001/61037,國際專利W003/044231，國際 專利 W02005/123963, Fredriksson 等人（2002)自然生物技術(shù) 20:473-477 (Fredriksson et al (2002)Nat Biotech20:473-477)和 Gullberg 等人（2004)美國科學(xué)院院刊 101:8420-8424(Gullberg et al (2004)Proc Natl Acad Sci USA101:8420-8424)。
[0009] 雖然通常使用鄰近探針對(duì)，但是鄰近探針檢測(cè)分析的修飾已描述于例如國際專利 W001/61037,國際專利W02005/123963和國際專利W02007/107743,其中使用三種鄰近探針 來檢測(cè)單個(gè)的分析物分子。例如，第三鄰近探針可以用來提供可以與前兩種鄰近探針的核 酸結(jié)構(gòu)域相互作用的另外的核酸結(jié)構(gòu)域。
[0010] 除了對(duì)鄰近探針檢測(cè)分析的修飾，鄰近探針本身結(jié)構(gòu)的修飾已描述于例如國際專 利W003/044231中，其中使用了多價(jià)鄰近探針。這樣的多價(jià)鄰近探針包括至少兩個(gè)，但是多 達(dá)100個(gè)的分析物結(jié)合結(jié)構(gòu)域，所述分析物結(jié)合結(jié)構(gòu)域綴合于至少一個(gè)核酸，優(yōu)選多于一 個(gè)核酸。
[0011] 基于鄰近探針的檢測(cè)分析，且特別是鄰近延伸分析，已經(jīng)證明在許多不同的應(yīng)用 中在蛋白質(zhì)的特異性和靈敏性檢測(cè)中是非常有用的，所述應(yīng)用例如是檢測(cè)弱表達(dá)或低豐度 蛋白質(zhì)。然而，就分析的靈敏度和特異性兩方面而言，這樣的分析都不是沒有其問題，并且 存在改進(jìn)空間。
[0012] 例如上述鄰近延伸分析的傳統(tǒng)鄰近分析的靈敏度受兩個(gè)主要因素的限制：（i)分 析物結(jié)合結(jié)構(gòu)域?qū)Π袠?biāo)分析物的親和力，和（ii)由非結(jié)合探針特別是探針對(duì)的隨機(jī)鄰近 產(chǎn)生的非特異性背景信號(hào)。使用具有對(duì)分析物親和力高的結(jié)合結(jié)構(gòu)域時(shí)，靈敏度被限制在 檢測(cè)約6000個(gè)分子。傳統(tǒng)地，為了實(shí)現(xiàn)低水平的背景，必須使用非常低濃度的鄰近探針。這 阻止了試圖通過使用高濃度的探針來補(bǔ)償包括低親和力分析物結(jié)合結(jié)構(gòu)域的探針的任何 嘗試。因此發(fā)現(xiàn)這可能限制分析的靈敏度和可能獲得定量結(jié)果的范圍。
[0013] 已經(jīng)提出了用于減少非特異性背景信號(hào)的其它方法，諸如使用封閉劑，例如封閉 寡核苷酸，所述封閉劑結(jié)合于鄰近探針上的核酸結(jié)構(gòu)域的游離端，直到被取代，例如被置換 劑寡核苷酸取代。在允許鄰近探針結(jié)合于分析物之后加入置換劑寡核苷酸，意味著鄰近探 針的核酸結(jié)構(gòu)域的相互作用僅可能發(fā)生在結(jié)合于靶標(biāo)分析物的鄰近探針上。
[0014] 改善鄰近探針分析特別是鄰近延伸分析的靈敏度的其它方法使用了包含3'核酸 外切酶活性的組分，例如具有3'核酸外切酶活性的聚合酶，所述組分被認(rèn)為是通過降解具 有游離且未被保護(hù)的3'端的鄰近探針核酸結(jié)構(gòu)域來降低背景活性，所述游離且未被保護(hù)的 3'端是指鄰近探針上沒有結(jié)合于靶標(biāo)分析物且因此不形成特異性相互作用或雙鏈體的結(jié) 構(gòu)域。這會(huì)阻止由非雜交的或"非雙鏈的"核酸結(jié)構(gòu)域產(chǎn)生非特異性延伸產(chǎn)物，因而同時(shí)增 強(qiáng)分析的特異性和靈敏性。減少背景信號(hào)的其它方法集中在改進(jìn)核酸延伸產(chǎn)物的檢測(cè)上。
[0015] 然而，仍然有改進(jìn)背景信號(hào)水平的空間，并且為了克服鄰近分析的局限性，特別是 如上所述的本領(lǐng)域已知的鄰近延伸分析，已發(fā)現(xiàn)使用在室溫下具有最小活性或無活性的聚 合酶能顯著改善分析的靈敏性和特異性，所述聚合酶在其它反應(yīng)組分之前加入，或者與其 它反應(yīng)組分同時(shí)加入或在其后加入。優(yōu)選地，在聚合酶無活性的條件下，例如在實(shí)驗(yàn)室條件 下，將在室溫下具有最小活性或無活性的聚合酶與樣品接觸。在優(yōu)選的【具體實(shí)施方式】中，如 果靶標(biāo)分析物存在于樣品中，那么在已經(jīng)使鄰近探針與靶標(biāo)分析物相互作用之后，加入用 于延伸核酸結(jié)構(gòu)域的聚合酶。在一些【具體實(shí)施方式】中，用于延伸核酸結(jié)構(gòu)域的聚合酶與其 它反應(yīng)組分例如延伸反應(yīng)所需的組分同時(shí)加入，這樣，鄰近延伸分析就是封閉管系統(tǒng)，即， 反應(yīng)混合物可以在使鄰近探針與分析物相互作用（或者，在加入延伸反應(yīng)組分之后，使反 應(yīng)混合物均勻且使鄰近探針之間的相互反應(yīng)穩(wěn)定）但聚合酶不具有活性或不具有最小活 性的條件下，例如在室溫條件下，進(jìn)行培養(yǎng)，隨后在使聚合酶具有活性的條件下，例如高于 室溫的條件下，對(duì)反應(yīng)混合物進(jìn)行培養(yǎng)。因此，在一種特別優(yōu)選的【具體實(shí)施方式】中，在室溫 下具有最小活性或無活性的聚合酶是超嗜熱聚合酶。
[0016] 通過在分析中包括在室溫下具有最小活性或無活性的聚合酶，而有可能減少分析 中存在的非特異性背景信號(hào)。或者，使用在室溫下具有最小活性或無活性的聚合酶可以視 為減少或防止不需要的、不希望的或非特異性的延伸產(chǎn)物的產(chǎn)生。
[0017] 在室溫下具有最小活性或無活性的聚合酶在檢測(cè)樣品中分析物的方法中的應(yīng)用， 特別是在本發(fā)明的鄰近延伸分析中的應(yīng)用，提供了與先前的基于鄰近探針的分析相比獨(dú)特 且出乎意料的優(yōu)點(diǎn)。
[0018] 一般地，特別地選擇基于鄰近探針的分析的組分，以便在分析的最適條件下具有 最大或接近最大的活性。鄰近探針分析預(yù)期是依賴于在分析條件下靈敏且有效的分析組 分，以便所述分析能夠檢測(cè)小量的分析物。因此，使用具有極端活性分布的組分，例如在分 析所采用的溫度范圍之外的溫度下具有最佳活性的酶，預(yù)期會(huì)延遲或阻礙充當(dāng)標(biāo)明靶標(biāo)分 析物存在的信號(hào)的核酸分子的產(chǎn)生，例如，通過與最適分析條件下具有最大活性的酶相比 降低了核酸分子的產(chǎn)生速度。
[0019] 然而，本發(fā)明的方法依賴于當(dāng)室溫下具有最小活性或無活性的聚合酶在PEA中接 觸樣品時(shí)所看到的背景的顯著降低（即：噪音比升高）。特別地，室溫下具有最小活性或 無活性的聚合酶與鄰近延伸分析的其它組分中的至少一些同時(shí)與樣品有利地接觸?；蛘?， 也可以在分析的其它組分已經(jīng)相互作用之后再提供室溫下具有最小活性或無活性的聚合 酶。由此可見，室溫下具有最小活性或無活性的聚合酶可以在分析的任何合適階段與樣品 接觸。
[0020] 雖然不希望受理論約束，但是理論認(rèn)為，在組分首次接觸的條件下，室溫下具有最 小活性或無活性的聚合酶不能夠延伸鄰近探針的核酸結(jié)構(gòu)域。在這方面，在鄰近探針的分 析物結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以相互作用并且與分析物（如果存在于樣品中）結(jié)合的條件下，反應(yīng)混 合物的全部分析組分可以存在于單個(gè)反應(yīng)容器（例如，管），并且鄰近探針的核酸結(jié)構(gòu)域之 間形成的、均結(jié)合至靶標(biāo)分析物的雙鏈體可形成穩(wěn)定的相互作用（在分析條件下，一旦結(jié) 合，鄰近探針就不容易從靶標(biāo)分析物分離，從而實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定，即形成了非短暫的或長久的雙鏈 體）。在無聚合酶活性或只有最小聚合酶活性的情況下形成雙鏈體，會(huì)促進(jìn)聚合物最終激活 時(shí)特異性延伸產(chǎn)物的生產(chǎn)，即，只有結(jié)合于靶標(biāo)分析物的鄰近探針會(huì)形成穩(wěn)定的雙鏈體，在 聚合酶有活性時(shí)進(jìn)行延伸。由于在鄰近探針雙鏈體的形成過程中聚合酶可以存在于反應(yīng)混 合物中，因此不向反應(yīng)混合物中加入任何其它組分也有可能激活聚合酶，例如，通過提高反 應(yīng)混合物的溫度來激活聚合酶?？梢约僭O(shè)的是，在聚合酶無活性或只有最小活性的情況下 加入聚合酶，會(huì)給分析帶來進(jìn)一步水平的控制。給分析物檢測(cè)分析增加其它步驟通常是不 希望的，因?yàn)檫@會(huì)使方法變復(fù)雜，從而增加了自動(dòng)化和/或適用于高通量應(yīng)用的困難。類似 地，向分析中添加組分會(huì)增加樣品的復(fù)雜性，即，加入其它組分后反應(yīng)混合物必須均衡，其 它組分會(huì)降低分析的靈敏性。因此，室溫下無活性或具有最小活性的聚合酶的使用，使得在 酶在激活之前反應(yīng)混合物中的組分能夠穩(wěn)定或均衡。這很難采用室溫下具有活性的聚合酶 來實(shí)現(xiàn)，因?yàn)樾枰獙⒕酆厦冈跓o活性的條件下加入，例如低溫，而這樣的條件會(huì)干擾或影響 鄰近探針和靶標(biāo)分析物之間的相互作用，和/或，結(jié)合于靶標(biāo)分析物的、鄰近的兩個(gè)鄰近探 針的核酸結(jié)構(gòu)域的相互作用。
[0021] 正是因?yàn)榧尤肓耸覝叵聼o活性或具有最小活性的聚合酶，而導(dǎo)致鄰近探針延伸分 析中非特異性背景信號(hào)的改進(jìn)地減少。如實(shí)施例所更詳細(xì)地顯示的，本發(fā)明代表了與本領(lǐng) 域已知的鄰近延伸分析相比更顯著的進(jìn)步。令人吃驚的是，顯示出，在使用室溫下無活性或 具有最小活性的聚合酶的本發(fā)明方法中觀察到非特異性背景活性的降低，甚至可與利用室 溫下具有一些活性或顯著活性的嗜熱聚合酶或標(biāo)準(zhǔn)聚合酶的樣品相比。另外，更出乎意料 地發(fā)現(xiàn)，在PEA的典型溫度下，例如30-40°C，具有小于其最大活性的20%的聚合酶在本發(fā) 明的方法中是特別有用的。室溫下無活性或具有最小活性的聚合酶的加入引起了分析中信 號(hào)：噪音比的相似改進(jìn)，其中，在例如37°C的PEA典型溫度下以及例如45-55°C的較高溫度 下實(shí)施所述分析，這完全是出乎意料的。背景信號(hào)的這種減少的結(jié)果是鄰近探針檢測(cè)分析 的特異性和靈敏性均提高。
[0022] 此外，本文公開的方法還包括簡化的PEA，其中，室溫下無活性或具有最小活性的 聚合酶活化之前，可以將用于擴(kuò)增延伸產(chǎn)物的組分與延伸分析的組分相結(jié)合。如下所討論 的，室溫下無活性或具有最小活性的聚合酶也可用作擴(kuò)增反應(yīng)中的聚合酶活性，從而在分 析的延伸步驟之后避免了提供例如熱穩(wěn)定聚合酶的其它聚合酶和擴(kuò)增組分的需要。然而， 本文公開的方法描述了能夠使兩個(gè)分析階段的試劑預(yù)混合的各種組分的修飾。有利的是， 這導(dǎo)致較少的移液步驟和較少的動(dòng)手操作時(shí)間，這使得此分析易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化且減少了誤 差。
[0023] 因此，可以看出本發(fā)明提供了室溫下無活性或具有最小活性的聚合酶在鄰近探針 延伸分析用于檢測(cè)樣品中分析物的用途，其中延伸產(chǎn)物隨后被擴(kuò)增和檢測(cè)。
[0024] 更具體地，室溫下無活性或具有最小活性的聚合酶使用來生成延伸產(chǎn)物，其是在 用于鄰近分析的鄰近探針的核酸結(jié)構(gòu)域相互作用（這樣的相互作用通常是核酸結(jié)構(gòu)域的 雜交，以及隨后的至少一個(gè)結(jié)構(gòu)域的延伸；一般說來，核酸結(jié)構(gòu)域雜交，以便一個(gè)核酸結(jié)構(gòu) 域可以模板化另一個(gè)結(jié)構(gòu)域的延伸）之后，在鄰近探針延伸分析中生成延伸產(chǎn)物的步驟 中，特別是在進(jìn)行聚合酶催化的延伸反應(yīng)的步驟中進(jìn)行的。因此，室溫下無活性或具有最 小活性的聚合酶包括在下述步驟中：基于鄰近探針的延伸分析中產(chǎn)生初始延伸產(chǎn)物的步驟 中，或換言之，鄰近探針延伸分析中由鄰近探針的核酸結(jié)構(gòu)域的相互作用而產(chǎn)生延伸產(chǎn)物 的步驟中。
[0025] 可選地，本發(fā)明的這個(gè)方面提供了一種檢測(cè)樣品中分析物的方法，該方法包括鄰 近探針延伸分析，其中，所述分析包括在分析的延伸步驟中應(yīng)用室溫下無活性或具有最小 活性的聚合酶，以及隨后對(duì)延伸產(chǎn)物進(jìn)行擴(kuò)增和檢測(cè)。
[0026] 另一方面，本發(fā)明提供了在用于檢測(cè)樣品中的分析物的鄰近探針延伸分析中減少 非特異性延伸產(chǎn)物（或者提高信號(hào)：噪聲比）的方法，所述方法包括在所述分析的延伸步驟 中使用包括室溫下無活性或具有最小活性的聚合酶，其中，隨后對(duì)特異性延伸產(chǎn)物進(jìn)行擴(kuò) 增和檢測(cè)。
[0027] 如上所述，鄰近探針延伸分析的延伸步驟是生成初始延伸產(chǎn)物的步驟，所述初始 延伸產(chǎn)物隨后作為檢測(cè)分析物的手段而被檢測(cè)。換言之，延伸步驟是生成延伸產(chǎn)物的步驟， 其基于鄰近探針的核酸結(jié)構(gòu)域的相互作用，特別是基于核酸結(jié)構(gòu)域的雜交和隨后至少一個(gè) 結(jié)構(gòu)域的延伸，例如，使用另一個(gè)作為模板來進(jìn)行延伸。
[0028] 本發(fā)明的方法是基于鄰近探針的分析，并且將室溫下無活性或具有最小活性的聚 合酶是用于基于鄰近探針的分析中的，所述探針是鄰近探針?；卩徑结樀姆治隹梢允?本領(lǐng)域已知的任何分析，例如如上所述的，所述分析使用鄰近探針來檢測(cè)樣品中的分析物。 具體地，該分析是鄰近延伸分析，其基于通過雜交來檢測(cè)鄰近探針的核酸結(jié)構(gòu)域之間的相 互作用，和一個(gè)或多個(gè)這種結(jié)構(gòu)域的延伸。
[0029] 因此，在一個(gè)優(yōu)選的方面，本發(fā)明提供了一種檢測(cè)樣品中分析物的方法，包括：
[0030] (a)將所述樣品與至少第一和第二鄰近探針的至少一組接觸，每個(gè)探針包括分析 物結(jié)合結(jié)構(gòu)域和核酸結(jié)構(gòu)域，并能夠同時(shí)結(jié)合至分析物；
[0031] (b)在所述鄰近探針與所述分析物結(jié)合時(shí)，使鄰近探針的核酸結(jié)構(gòu)域彼此相互作 用，其中所述相互作用包括雙鏈體的形成；
[0032] (c)延伸所述雙鏈體的至少一個(gè)核酸結(jié)構(gòu)域的3'端以生成延伸產(chǎn)物，其中，延伸 反應(yīng)使用聚合酶，所述聚合酶的特征在于40°C時(shí)其具有小于最大酶活性的20%的活性，其 中，所述聚合酶的最大活性的最適溫度是高于40°C ;和
[0033] ⑷擴(kuò)增和檢測(cè)延伸產(chǎn)物。
[0034] 如下更詳細(xì)地描述，分析物結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以直接地或間接地結(jié)合分析物。
[0035] 因此，可以看出，室溫下無活性或具有最小活性的聚合酶可以用于擴(kuò)大鄰近延伸 分析的敏感性和/或特異性。因此，本發(fā)明的方法可以認(rèn)為是提高（針對(duì)分析物的）鄰近 延伸分析的信號(hào)：噪音比的方法。用另一種方式表達(dá)，本發(fā)明的方法可以用于降低在鄰近延 伸分析中的非特異性延伸產(chǎn)物的量。或者，本發(fā)明可以看做是提供了一種減少實(shí)施鄰近延 伸分析所需步驟數(shù)目的方法。此外，本發(fā)明可以看做是提供了一種使用鄰近延伸分析來檢 測(cè)靶標(biāo)分析物的簡化方法。
[0036] 可以看出，該方法包括改變或修改分析的條件以活化或增強(qiáng)聚合酶活性的其它步 驟。因此，該方法可包括如下步驟：在聚合酶不具有（聚合酶）活性或具有最?。ň酆厦福?活性的條件下，例如，在室溫或低于室溫的條件下，使聚合酶與樣品（或反應(yīng)混合物）接觸。 可選地，聚合酶可以與其它分析組分同時(shí)與樣品（或反應(yīng)混合物）接觸，其它分析組分例如 是延伸反應(yīng)所需的組分。在一個(gè)優(yōu)選的【具體實(shí)施方式】中，聚合酶與樣品接觸的步驟發(fā)生在 步驟（b)之后。
[0037] 該方法還可包括改變或修飾樣品已經(jīng)接觸聚合酶之后的分析條件以活化或增強(qiáng) 聚合酶活性的步驟。在一個(gè)優(yōu)選的【具體實(shí)施方式】中，該步驟包括將分析（反應(yīng)混合物）的 溫度提高至室溫之上。在一個(gè)特別優(yōu)選的【具體實(shí)施方式】中，將分析的溫度提供到至少30°C， 優(yōu)選至少35°C或40°C，或者至少45°C或50°C。在一些【具體實(shí)施方式】中，可以將分析的溫 度提高到至少55、60、70或75°C。因此，分析的溫度可以由室溫提高到30-80°C之間，優(yōu)選 地，35-75°C、35-70°C、35-65°C、35-60°C或 35-55°C，更優(yōu)選 37-52°C，或者可選地，提高到 37-55°C，40-55°C、40-52°C或40-50°C之間。因此，延伸所述雙鏈體的至少一個(gè)核酸結(jié)構(gòu)域 的3'端以生成延伸產(chǎn)物的步驟可以在上述溫度范圍中的任何溫度下實(shí)施，諸如30、31、32、 33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、 58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74 或 75?。
[0038] 在本發(fā)明方法的另一個(gè)【具體實(shí)施方式】中，一個(gè)或多個(gè)鄰近探針可被提供為展開鄰 近探針，以便所述一個(gè)或多個(gè)探針的核酸結(jié)構(gòu)域能夠在其3'端形成發(fā)卡環(huán)，如下所示。
[0039] 在本發(fā)明的另一個(gè)【具體實(shí)施方式】中，本發(fā)明的方法包括使用具有3 '核酸外切酶活 性的組分。具有3'核酸外切酶活性的組分在用于延伸步驟的聚合酶之前加入，或者與用于 延伸步驟的聚合酶同時(shí)加入。在一些【具體實(shí)施方式】中，用于鄰近延伸分析的延伸步驟的聚 合酶具有3'核酸外切酶活性。
[0040] 綜上所述，鄰近延伸分析涉及在兩個(gè)或多個(gè)鄰近探針的核酸結(jié)構(gòu)域之間形成雙鏈 體之后延伸至少一個(gè)核酸結(jié)構(gòu)域，其中所述探針結(jié)合于靶標(biāo)分析物。然而，所述雙鏈體（兩 個(gè)互補(bǔ)核酸結(jié)構(gòu)域的雜交體）可以按照多種方式形成，這取決于鄰近探針上的核酸結(jié)構(gòu)域 的方向。
[0041] 鄰近延伸分析形式的代表性的例子示意性地顯示在圖1中，并且這些具體實(shí)施方 式在下面進(jìn)行更詳細(xì)地描述。然而，這些不同"版本"的PEA并不意在限制本發(fā)明的范圍。 根據(jù)以下的描述，其它排列方式對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，并且意在將其包括 在本發(fā)明中。實(shí)際上，本發(fā)明僅要求至少一個(gè)鄰近探針（如所示，雖然這是發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選 的方面，但是不限于蛋白質(zhì)分子或抗體）具有包括能夠延伸的游離3'端的核酸結(jié)構(gòu)域，且 其中所述延伸可以被第二鄰近探針的核酸結(jié)構(gòu)域模板化。在這方面，以及如下所更詳細(xì)地 描述的，鄰近探針的核酸結(jié)構(gòu)域可以是單鏈的或者部分雙鏈的，但是被配置以便結(jié)構(gòu)域的 單鏈區(qū)域可以用于通過雜交而進(jìn)行的彼此相互作用。各鄰近探針的核酸結(jié)構(gòu)域也可以通過 各自雜交于共同的"夾板"核酸分子而相互作用，從而間接地形成雙鏈體。因此，在上述方 法的步驟（b)中，核酸結(jié)構(gòu)域形成雙鏈體的相互作用可以是直接的或者間接的；連接于鄰 近探針的分析物結(jié)合結(jié)構(gòu)域的核酸結(jié)構(gòu)域可以彼此雜交以直接形成雙鏈體，或者它們可以 通過各自雜交于另外的核酸分子來間接地形成雙鏈體。這樣的另外的核酸分子可以被視為 部分雙鏈核酸結(jié)構(gòu)域的第二條鏈；它將與連接于鄰近探針的分析物結(jié)合結(jié)構(gòu)域的核酸分子 的至少一個(gè)區(qū)域雜交（從而形成部分雙鏈的核酸結(jié)構(gòu)域，所述核酸結(jié)構(gòu)域通過它的一條鏈 進(jìn)行連接），留下一個(gè)末端（例如3'）單鏈區(qū)域，所述單鏈區(qū)域與另一個(gè)鄰近探針的核酸結(jié) 構(gòu)域的區(qū)域互補(bǔ)，因此，所述單鏈區(qū)域可以用于通過與所述另一個(gè)鄰近探針的核酸結(jié)構(gòu)域 雜交而相互作用?；蛘撸?夾板"可以作為另外的鄰近探針的核酸結(jié)構(gòu)域提供。
[0042] 圖1的版本1描繪了"傳統(tǒng)的"鄰近延伸分析，其中，每個(gè)鄰近探針的核酸結(jié)構(gòu)域 (顯示為箭頭）通過其5'端連接于分析物結(jié)合結(jié)構(gòu)域（顯示為倒置的"Y")，從而留下兩個(gè) 游離的3'端。當(dāng)所述鄰近探針結(jié)合于其各自的分析物上的分析物結(jié)合靶時(shí)（圖中未顯示 分析物），在3'端互補(bǔ)的探針的核酸結(jié)構(gòu)域能夠通過雜交而相互作用，即形成雙鏈體。核 酸聚合酶的加入或活化，使得使用另一個(gè)鄰近探針的核酸結(jié)構(gòu)域能夠來延伸每個(gè)核酸結(jié)構(gòu) 域，以模板化所述延伸。根據(jù)本發(fā)明的方法，可以特異性地?cái)U(kuò)增和檢測(cè)延伸產(chǎn)物，從而檢測(cè) 革巴分析物。
[0043] 圖1的版本2描繪了供選擇的鄰近延伸分析，其中，第一鄰近探針的核酸結(jié)構(gòu)域通 過其5'端連接于分析物結(jié)合結(jié)構(gòu)域，以及第二鄰近探針的核酸結(jié)構(gòu)域通過其3'端連接于 分析物結(jié)合結(jié)構(gòu)域。因此，第二鄰近探針的核酸結(jié)構(gòu)域具有游離的5'端（顯示為鈍箭頭）， 所述游離的5'端不能使用通常的核酸聚合酶（其僅延伸3'端）來延伸。第二鄰近探針的 3'端被有效地"封閉"，即它不是"游離的"且由于綴合于分析物結(jié)合結(jié)構(gòu)域上因而被其封 閉而不能被延伸。在這個(gè)【具體實(shí)施方式】中，當(dāng)鄰近探針結(jié)合于分析物上的它們各自的分析 物結(jié)合靶時(shí)，在3'端共享互補(bǔ)區(qū)域的探針核酸結(jié)構(gòu)域能夠通過雜交而相互作用，即形成雙 鏈體。然而，與版本1相比，僅有第一鄰近探針的核酸結(jié)構(gòu)域（其具有游離的3'端）可以 使用第二鄰近探針的核酸結(jié)構(gòu)域作為模板進(jìn)行延伸。如上所述，可以擴(kuò)增并檢測(cè)延伸產(chǎn)物， 從而檢測(cè)靶標(biāo)分析物。
[0044] 在圖1的版本3中，與版本2類似，第一鄰近探針的核酸結(jié)構(gòu)域通過其5'端連接 到分析物結(jié)合結(jié)構(gòu)域，并且第二鄰近探針的核酸結(jié)構(gòu)域通過其3'端連接到分析物結(jié)合結(jié)構(gòu) 域。因此，第二鄰近探針的核酸結(jié)構(gòu)域具有游離的5'端（顯示為鈍箭頭），所述5'端不能 被延伸。然而，在這個(gè)【具體實(shí)施方式】中，連接到各自的鄰近探針的分析物結(jié)合結(jié)構(gòu)域的核酸 結(jié)構(gòu)域沒有互補(bǔ)區(qū)域，因此不能直接形成雙鏈體。作為替代，提供了第三核酸分子，其具有 與每個(gè)鄰近探針的核酸結(jié)構(gòu)域同源的區(qū)域，該區(qū)域在核酸結(jié)構(gòu)域之間充當(dāng)"分子橋"或"夾 板"。該"夾板"寡核苷酸橋接了核酸結(jié)構(gòu)域之間的間隙，使它們彼此能間接相互作用，即每 個(gè)核酸結(jié)構(gòu)域與夾板寡核苷酸形成雙鏈體。因此，當(dāng)鄰近探針結(jié)合到各自的在分析物上的 分析物結(jié)合靶時(shí)，探針的核酸結(jié)構(gòu)域各自通過雜交，即通過形成雙鏈體來與夾板寡核苷酸 相互作用。由此可見，第三核酸分子或夾板可以看作是在鄰近探針之一上提供的部分雙鏈 的核酸結(jié)構(gòu)域的第二條鏈。例如，鄰近探針中的一個(gè)可以具有部分雙鏈的核酸結(jié)構(gòu)域，所述 結(jié)構(gòu)域通過一條鏈的3'端連接于分析物結(jié)合結(jié)構(gòu)域，并且其中另一條（未連接的）鏈具有 游離的3'端。因此，這樣的核酸結(jié)構(gòu)域具有末端單鏈區(qū)域，所述單鏈區(qū)域具有游離的3'端。 在這個(gè)【具體實(shí)施方式】中，第一鄰近探針的核酸結(jié)構(gòu)域（其具有游離的3'端）可以使用"夾 板寡核苷酸"（或另一個(gè)核酸結(jié)構(gòu)域的單鏈的3'端區(qū)域）作為模板延伸，并且可以有利地 連接到第二鄰近探針的核酸結(jié)構(gòu)域的5'端（具體地為連接鏈的5'端，或者可選地是指核 酸結(jié)構(gòu)域的雙鏈部分的5'端）。可選地或另外地，夾板寡核苷酸的游離3'端（即未連接的 鏈，或3'單鏈區(qū)域）可以使用第一鄰近探針的核酸結(jié)構(gòu)域作為模板進(jìn)行延伸。如上所述， 可以擴(kuò)增和檢測(cè)延伸產(chǎn)物，從而檢測(cè)靶標(biāo)分析物。
[0045] 在優(yōu)選的【具體實(shí)施方式】中，本發(fā)明的方法并不涉及連接步驟或反應(yīng)，即一個(gè)或多 個(gè)核酸分子的5'和3'端的綴合或結(jié)合。更具體地，鄰近探針的核酸結(jié)構(gòu)域并不連接在一 起，即本發(fā)明的方法不包括分子間的連接。
[0046] 從以上描述可以清楚地看出，在一種【具體實(shí)施方式】中，夾板寡核苷酸可以作為分 析的單獨(dú)組分而提供。換言之，可以將其單獨(dú)加入反應(yīng)混合物中（即與鄰近探針分別地加 入到含有分析物的樣品中）。盡管如此，由于其雜交到作為鄰近探針的部分的核酸分子，并 且當(dāng)與這樣的核酸分子接觸時(shí)會(huì)這樣做，因此，盡管它是單獨(dú)加入的，但是仍將其視為部分 雙鏈的核酸結(jié)構(gòu)域的一條鏈?？蛇x地，所述夾板可以預(yù)先雜交到鄰近探針的一個(gè)核酸結(jié)構(gòu) 域，即在將鄰近探針與樣品接觸之前進(jìn)行雜交。在這個(gè)【具體實(shí)施方式】中，夾板寡核苷酸可 以直接看作鄰近探針的核酸結(jié)構(gòu)域的部分，即，其中核酸結(jié)構(gòu)域是部分雙鏈的核酸分子，例 如，鄰近探針可以通過將雙鏈核酸分子連接到分析物結(jié)合結(jié)構(gòu)域（優(yōu)選地，核酸結(jié)構(gòu)域通 過單鏈綴合于分析物結(jié)合結(jié)構(gòu)域）并且（使用能夠雜交到其它鄰近探針的核酸結(jié)構(gòu)域的單 鏈突出端）修飾所述核酸分子以生成部分的雙鏈核酸結(jié)構(gòu)域來制備。因此，如本文所定義 的鄰近探針的核酸結(jié)構(gòu)域的延伸還包括"夾板"寡核苷酸的延伸。有利地，當(dāng)延伸產(chǎn)物由夾 板寡核苷酸的延伸產(chǎn)生時(shí)，所產(chǎn)生的延伸的核酸鏈僅通過核酸分子的兩條鏈之間的相互作 用（通過兩條核酸鏈之間的雜交）偶聯(lián)于鄰近探針對(duì)。因此，在這些【具體實(shí)施方式】中，可以 使用變性條件將所述延伸產(chǎn)物從鄰近探針對(duì)上解離，所述變性條件例如是升高溫度、降低 鹽濃度等。這在異質(zhì)形式中是特別有用的，其中靶標(biāo)分析物結(jié)合于固體基質(zhì)，由于延伸產(chǎn)物 可以容易地從分析的其它組分上分離，例如，結(jié)合于固定化的分析物的鄰近探針可以在固 相中，而延伸產(chǎn)物在變性之后可以在液相中。
[0047] 雖然在圖1的版本3中描繪的夾板寡核苷酸顯示為與全長的第二鄰近探針的核酸 結(jié)構(gòu)域的互補(bǔ)，但是這僅僅是一個(gè)例子，并且對(duì)于夾板而言，能夠與鄰近探針的核酸結(jié)構(gòu)域 的末端（或在末端附近）形成雙鏈體就足夠了，即能夠?qū)㈤g隙進(jìn)行橋接就足夠了，如下進(jìn)一 步定義的。
[0048] 在另一個(gè)【具體實(shí)施方式】中，夾板寡核苷酸可以作為如國際專利W02007/107743所 描述的第三鄰近探針的核酸結(jié)構(gòu)域提供，該國際專利通過引用整體并入本文，其說明將夾 板寡核苷酸作為第三鄰近探針的核酸結(jié)構(gòu)域而提供能夠進(jìn)一步提高鄰近探針分析的靈敏 性和特異性。
[0049] 圖1的版本4是版本1的修飾，其中第一鄰近探針的核酸結(jié)構(gòu)域包括在其3'端與 第二鄰近探針的核酸結(jié)構(gòu)域不完全互補(bǔ)的序列。因此，當(dāng)所述鄰近探針結(jié)合到分析物上它 們各自的分析物結(jié)合靶時(shí)，所述探針的核酸結(jié)構(gòu)域能夠通過雜交，即形成雙鏈體，而相互作 用，但是第一鄰近探針的核酸結(jié)構(gòu)域的3'最末端（包括游離3'羥基的核酸分子的部分）不 能雜交，因此作為單鏈的未雜交的"下垂物"（flap)存在。在加入或者活化核酸聚合酶時(shí)， 通過如下方法只有第二鄰近探針的核酸結(jié)構(gòu)域可以被延伸：使用第一鄰近探針的核酸結(jié)構(gòu) 域來模板化該延伸。如上所述，可以特異性地?cái)U(kuò)增和檢測(cè)延伸產(chǎn)物，從而檢測(cè)靶標(biāo)分析物。
[0050] 在這種構(gòu)型中，在分析還包括具有3'核酸外切酶活性的組分的【具體實(shí)施方式】中， 有益的是對(duì)第一鄰近探針的核酸結(jié)構(gòu)域3'端的一個(gè)或多個(gè)核苷酸進(jìn)行修飾，例如，以使其 具有對(duì)3'核酸外切酶活性的抗性。下面對(duì)合適的修飾作了進(jìn)一步描述。如果核酸結(jié)構(gòu)域 是抗3'核酸外切酶活性的，那么只有第二鄰近探針的核酸結(jié)構(gòu)域可以被延伸。相反地，如 果核酸結(jié)構(gòu)域?qū)?'核酸外切酶活性是敏感的，那么"下垂物"可以被降解，產(chǎn)生與第二鄰近 探針的核酸結(jié)構(gòu)域完全雜交（退火）的3'端。因此，第一鄰近探針的核酸結(jié)構(gòu)域也可以使 用第二鄰近探針的核酸結(jié)構(gòu)域作為模板來延伸。
[0051] 圖1中描繪的最后的【具體實(shí)施方式】，即版本5,可以看作是版本3的修飾。然而， 與版本3相比，兩個(gè)鄰近探針的核酸結(jié)構(gòu)域均通過它們的5'端連接到它們各自的分析物結(jié) 合結(jié)構(gòu)域。在這個(gè)【具體實(shí)施方式】中，核酸結(jié)構(gòu)域的3'端不互補(bǔ)，因此鄰近探針的核酸結(jié)構(gòu) 域不能相互作用或直接形成雙鏈體。作為替代，提供了第三核酸分子，其具有與每個(gè)鄰近探 針的核酸結(jié)構(gòu)域同源的區(qū)域，該區(qū)域在核酸結(jié)構(gòu)域之間充當(dāng)"分子橋"或"夾板"。該"夾板" 寡核苷酸橋接了核酸結(jié)構(gòu)域之間的間隙，使得它們能夠彼此間接地相互作用，即每個(gè)核酸 結(jié)構(gòu)域與夾板寡核苷酸形成雙鏈體。因此，當(dāng)鄰近探針結(jié)合于分析物上它們各自的分析物 結(jié)合靶時(shí)，探針的核酸結(jié)構(gòu)域各自通過雜交即形成雙鏈體而與夾板寡核苷酸相互作用。因 此，根據(jù)版本3可以看出，第三核酸分子或夾板可以看作是在一個(gè)鄰近探針上提供的部分 雙鏈的核酸結(jié)構(gòu)域的第二條鏈。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，可以將探針之一與部分雙鏈的核 酸結(jié)構(gòu)域一起提供，所述結(jié)構(gòu)域通過一條鏈的5'端連接到分析物結(jié)合結(jié)構(gòu)域，并且其中另 一條（未連接的）鏈具有游離的3'端。因此，這樣的核酸結(jié)構(gòu)域具有末端單鏈區(qū)域，該區(qū) 域具有至少一個(gè)游離3'端。在這個(gè)【具體實(shí)施方式】中，第二鄰近探針的核酸結(jié)構(gòu)域（其具有 游離3'端）可以使用"夾板寡核苷酸"作為模板延伸?？蛇x地或另外地，夾板寡核苷酸的 游離3'端（即，未連接的鏈，或第一鄰近探針的3'單鏈區(qū)域）可以使用第二鄰近探針的核 酸結(jié)構(gòu)域作為模板進(jìn)行延伸。如上所述，可以擴(kuò)增和檢測(cè)延伸產(chǎn)物，從而檢測(cè)靶標(biāo)分析物。
[0052] 如上所討論，與版本3相關(guān)，夾板寡核苷酸可以作為分析的單獨(dú)的組分提供。另一 方面，由于它雜交到作為鄰近探針的部分的核酸分子，并且當(dāng)與這樣的核酸分子接觸時(shí)會(huì) 這樣，因此，盡管它是單獨(dú)加入的，但是仍將其視為部分雙鏈的結(jié)構(gòu)域的一條鏈。可選地，夾 板可以預(yù)先雜交到鄰近探針的一個(gè)核酸結(jié)構(gòu)域，即，在將鄰近探針與樣品接觸之前進(jìn)行雜 交。在這個(gè)【具體實(shí)施方式】中，夾板寡核苷酸可以直接看作鄰近探針的核酸結(jié)構(gòu)域的部分， 艮P，其中核酸結(jié)構(gòu)域是部分雙鏈的核酸分子，例如，鄰近探針可以通過將雙鏈核酸分子連接 到分析物結(jié)合結(jié)構(gòu)域（優(yōu)選地，核酸結(jié)構(gòu)域通過單鏈綴合到分析物結(jié)合結(jié)構(gòu)域）并且（使 用能夠雜交到其它鄰近探針的核酸結(jié)構(gòu)域的單鏈突出端）修飾所述核酸分子以產(chǎn)生部分 雙鏈的核酸結(jié)構(gòu)域。因此，如本文所定義的鄰近探針的核酸結(jié)構(gòu)域的延伸還包括"夾板"寡 核苷酸的延伸。有利地，當(dāng)延伸產(chǎn)物由夾板寡核苷酸的延伸產(chǎn)生時(shí)，所產(chǎn)生的延伸的核酸鏈 僅通過核酸分子的兩條鏈之間的相互作用（通過兩條核酸鏈之間的雜交）偶聯(lián)于鄰近探針 對(duì)。因此，在這些【具體實(shí)施方式】中，可以使用變性條件將所述延伸產(chǎn)物從鄰近探針對(duì)上解 離，所述變性條件例如是升高溫度、降低鹽濃度等。這在異質(zhì)形式中是特別有用的，其中靶 標(biāo)分析物結(jié)合于固體基質(zhì)，由于延伸產(chǎn)物可以容易地從分析的其它組分上分離，例如，結(jié)合 于固定化的分析物的鄰近探針可以在固相中，而延伸產(chǎn)物在變形之后可以在液相中。
[0053] 雖然在圖1的版本5中描繪的夾板寡核苷酸顯示為與第一鄰近探針的全長核酸結(jié) 構(gòu)域的互補(bǔ)，但是這僅僅是一個(gè)例子，并且對(duì)于夾板而言，能夠與鄰近探針的核酸結(jié)構(gòu)域的 末端（或在末端附近）形成雙鏈體就足夠了，即能夠?qū)㈤g隙橋接就足夠了，如下進(jìn)一步定義 的。
[0054] 在另一個(gè)【具體實(shí)施方式】中，夾板寡核苷酸可以作為如國際專利W02007/107743所 描述的第三鄰近探針的核酸結(jié)構(gòu)域提供，該國際專利通過引用整體并入本文，其說明將夾 板寡核苷酸作為第三鄰近探針的核酸結(jié)構(gòu)域而提供能夠進(jìn)一步提高鄰近探針分析的靈敏 性和特異性。
[0055] 從以上可以理解的是，鄰近延伸分析有多個(gè)排列，其都依賴于當(dāng)兩個(gè)（或多個(gè)）鄰 近探針結(jié)合于分析物時(shí)，憑借探針之間相互作用形成包括可延伸的3'端（用于模板化的延 伸）的核酸雙鏈體。因此，探針之間（或更具體地，在它們各自的核酸結(jié)構(gòu)域之間，所述核 酸結(jié)構(gòu)域包括夾板寡核苷酸）的相互作用是鄰近依賴性的；檢測(cè)探針在分析物上的結(jié)合共 同地使得它們鄰近，以使它們（或更具體地，它們的核酸結(jié)構(gòu)域）可以相互作用。因此，可 以通過檢測(cè)該相互作用（或由此生成的延伸產(chǎn)物）來檢測(cè)分析物。在本發(fā)明的方法中，鄰 近探針可以通過彼此雜交而（直接地或間接地）相互作用，以使得一個(gè)或多個(gè)核酸分子能 夠延伸。該延伸可以導(dǎo)致兩個(gè)鄰近探針的核酸結(jié)構(gòu)域綴合或相互連接，并且夾板寡核苷酸 (其可以形成鄰近探針的核酸結(jié)構(gòu)域的部分）協(xié)助或介導(dǎo)該相互作用（綴合）?？蛇x地，本 發(fā)明的方法并不包括連接反應(yīng)，例如，鄰近探針的核酸結(jié)構(gòu)域不連接。延伸（如果適用，綴 合）可以通過檢測(cè)延伸和/或綴合產(chǎn)物（相互作用產(chǎn)物）來檢測(cè)。
[0056] 雖然不希望受理論約束，但是理論認(rèn)為，本發(fā)明的方法依賴于室溫下無活性或具 有最小活性的聚合酶的加入，這使得在沒有聚合酶活性或只有最小聚合酶活性的有利條件 下對(duì)分析組分進(jìn)行均衡和穩(wěn)定。據(jù)認(rèn)為，如果聚合酶在加入的條件下是有活性的，那么它的 加入會(huì)干擾反應(yīng)，這會(huì)產(chǎn)生非特異性/背景延伸產(chǎn)物，從而干擾分析物的檢測(cè)。例如，將活 性聚合酶與其它分析組分，例如引物、夾板、延伸反應(yīng)組分、鄰近探針等，一起加入反應(yīng)混合 物，或者將活性聚合酶在其它分析組分之前加入反應(yīng)混合物，這會(huì)導(dǎo)致所述探針的核酸結(jié) 構(gòu)域的延伸，從而產(chǎn)生非特異性/背景延伸產(chǎn)物，其中，所述探針的核酸結(jié)構(gòu)域是非特異性 地和/或短暫地（暫時(shí)地）結(jié)合于其它未結(jié)合鄰近探針或分析組分的。據(jù)認(rèn)為，在分析的鄰 近探針，例如結(jié)合于靶標(biāo)分析物的鄰近探針和相鄰結(jié)合的探針的雙鏈形式的核酸結(jié)構(gòu)域， 已相互作用之后再將組分加入到反應(yīng)混合物中，可暫時(shí)地使這些相互作用不穩(wěn)定。聚合酶 在有活性的條件下加入到反應(yīng)混合物中的分析可導(dǎo)致由不穩(wěn)定的鄰近探針產(chǎn)生非特異性/ 背景延伸產(chǎn)物。然而，如果聚合酶在其加入到反應(yīng)時(shí)的條件下是無活性的，那么它就不會(huì)干 擾其它組分的相互作用。因此，聚合酶的存在可以使反應(yīng)混合物的組分之間的相互作用穩(wěn) 定，其中，不需要修飾反應(yīng)組分就可活化所述聚合酶，即，只需要修飾反應(yīng)條件，例如溫度。
[0057] 核酸聚合酶是這樣的酶：通過催化核酸分子3'端末端核苷酸與游離核苷酸之間 形成磷酸二酯鍵而延伸核酸分子。通常，聚合酶反應(yīng)以單鏈（或部分單鏈）核酸分子為模 板，來直接形成新的分子。已知存在眾多類型的核酸聚合酶，它們可以由DNA和/或RNA模 板來合成DNA和/或RNA。
[0058] 可用于本發(fā)明方法的聚合酶包括室溫下無活性或具有最小活性的酶，這樣，就可 以在室溫將聚合酶加入到鄰近延伸分析中，而不會(huì)催化反應(yīng)混合物中存在的核酸分子而發(fā) 生延伸?？梢栽谙鄬?duì)于特定酶在其最適條件下，特別是最適溫度條件下的最大活性來定義 室溫下的最?。ɑ蚩珊雎缘模┗钚?。因此，在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選【具體實(shí)施方式】中，在其它參 數(shù)是最適的分析條件下來測(cè)定不同溫度下聚合酶的活性，所述其它參數(shù)例如是緩沖液、pH、 鹽濃度、模板和引物濃度、核苷酸濃度等。不同溫度下酶的活性分布可以看作是特定條件下 的平均活性，所述條件優(yōu)選是除溫度之外的其它參數(shù)的最適條件，即，其中發(fā)生修飾的條件 只是溫度。因此，酶的最大活性是包括最適溫度的最適條件下的平均活性。除非特別說明， 否則本文中提到的酶活性應(yīng)解讀為特定條件下的平均酶活。
[0059] 因此，室溫下具有最小或可忽略活性的聚合酶可被定義為這樣的聚合酶：其在它 參數(shù)處于最適條件，在室溫下，其活性小于最大活性的5% (平均）。優(yōu)選地，這其它參數(shù)處 于最適條件，在室溫下，所述聚合酶的活性小于其最大活性的4%、3%、2%或1%。
[0060] 通常，室溫用來描述20-25°C的溫度范圍。因此，用于本發(fā)明的聚合酶在20-25°C 的活性通常小于其最大活性的5 % (平均）。優(yōu)選地，室溫可被定義為標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境溫度（SAT)， 其是25°C (298. 15開爾文）。因此，在一個(gè)優(yōu)選的【具體實(shí)施方式】中，用于本發(fā)明的聚合酶在 25°C的活性小于其最大活性的5% (平均）。
[0061] 用于本發(fā)明方法的優(yōu)選的聚合酶可以定義為超嗜熱聚合酶。通常，超嗜熱酶是由 超嗜熱生物體衍生或獲得的，所述生物體在高于90°c的極端溫度下最適生長，例如，在約 l〇〇°C (相比于在約70°C最適生長，70°C通常適合于絕大部分嗜熱生物）。超嗜熱聚合酶 (或更具體地，來自超嗜熱生物體的聚合酶）在高于正常生理（即一般的生物）溫度下具有 最佳酶活性，例如高于37°C，諸如高于40、50、60或70°C，一般高于60°C或70°C。顯著地，在 諸如室溫的較低溫度下，例如在25°C或30°C，這樣的酶有利地顯示了低的或降低的活性。 特別有利地，直至達(dá)到至少45°C或50°C的溫度，聚合酶的活性是低的。已經(jīng)從生活在極端 溫度條件下的生物體中，例如古生菌（諸如強(qiáng)烈火球菌（Pyrococcus furiosus)和沃氏火 球菌（Pyrococcus woesei)等），鑒定出了這樣的酶。這些生物體中特別令人關(guān)注的酶是這 樣的聚合酶：它們已經(jīng)用于很多分子生物學(xué)技術(shù)的研發(fā)中，尤其是PCR。除了自然發(fā)生的超 嗜熱酶之外，還可以對(duì)高溫下活性最佳的熱穩(wěn)定酶進(jìn)行修飾以使其具有在室溫降低的或低 的活性，以便產(chǎn)生與自然發(fā)生的超嗜熱酶具有相同或相似性質(zhì)的酶，特別是具有相同或相 似溫度活性分布的酶，即高的最適溫度下（例如高于50、55或60°C )與室溫下（或在諸如 30°C、37°C或40°C的較低溫度下）具有低的或降低的活性相結(jié)合。這樣的經(jīng)過修飾的聚合 酶可包括所謂的Taq聚合酶"熱起始（hotstart)"衍生物，其在約50°C獲得活性。如本文 所用，術(shù)語"超嗜熱聚合酶"不僅包括自然發(fā)生的酶，還包括所有這樣的修飾衍生物，所述修 飾衍生物還包括自然發(fā)生的超嗜熱聚合酶的衍生物。
[0062] 因此，用于本發(fā)明方法的聚合酶的特征在于其在40°C的活性小于等于其最大活性 的20%，其中，所述聚合酶的最大活性的最適溫度高于40°C?？蛇x地，相比于聚合酶在較高 溫度下的最大活性，可以根據(jù)在特定溫度諸如40°C測(cè)定的酶活性來對(duì)用于本發(fā)明方法的聚 合酶進(jìn)行定義。因此，當(dāng)在40°C對(duì)用于本發(fā)明方法的聚合酶的活性進(jìn)行測(cè)定時(shí)，它們的活性 小于等于它們最大活性的20%，S卩，在最適條件下，即最適溫度下獲得的活性的20%。優(yōu)選 地，所述聚合酶的特征在于，其在40°C的活性小于等于其最大酶活性的15 %，優(yōu)選小于等 于其最大酶活性的10%，例如小于等于其最大酶活性的9%、8%、7%、6%或5%。
[0063] 可選地或另外地，所述聚合酶的特征在于，其在50°C的活性小于等于其最大酶活 性的30 %，其中，所述聚合酶的最大活性的最適溫度高于50°C。優(yōu)選地，所述聚合酶的特 征在于，其在50°C的活性小于等于其最大酶活性的20%，優(yōu)選小于等于其最大酶活性的 15%，例如小于等于其最大酶活性的14%、13%、12%、11 %或10%。
[0064] 用于本發(fā)明方法的聚合酶的進(jìn)一步的特征在于，其在25°C的活性小于等于其最大 酶活性的10%，優(yōu)選地，其在25°C的活性小于等于其最大活性的5%，例如，小于等于其最 大活性的4%、3%、2%或1%。
[0065] 因此，例如，本發(fā)明的聚合酶的特征在于，其在40°C的活性小于等于其最大酶活性 的20%，且其在25°C的活性小于等于其最大酶活性的10%，其中，所述聚合酶最大活性的 最適溫度大于40°C?？蛇x地，所述聚合酶的特征在于，其在50°C的活性小于等于其最大酶 活性的30 %，且其在25°C的活性小于等于其最大酶活性的10 %，其中，所述聚合酶最大活 性的最適溫度大于50°C。
[0066] 在特別優(yōu)選的【具體實(shí)施方式】中，用于本發(fā)明方法的聚合酶包括至少是50°C的最大 活性的最適溫度，優(yōu)選至少是60°C或70°C。
[0067] 基于上述限定的溫度活性分布的其它組合也適合于限定用于本發(fā)明方法的聚合 酶。因此，上述特征的任何組合，其限定了在50°C或低于50°C時(shí)具有相對(duì)低活性（小于最 大活性的30% )的聚合酶，優(yōu)選地，在例如25°C的室溫沒有活性或具有最小活性，且其最大 活性的最適溫度高于40°C，例如50°C、60°C或70°C。
[0068] 可以使用本領(lǐng)域已知的任何便捷方法來測(cè)定聚合酶活性。例如，可以通過監(jiān)測(cè)聚 合酶反應(yīng)期間標(biāo)記的核苷酸，例如[ 3h]ttp，摻入高分子量核酸來測(cè)定聚合酶活性。方便地， 用于本發(fā)明方法的聚合酶的聚合酶活性可在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)中測(cè)定。
[0069] 用于本申請(qǐng)方法的特別優(yōu)選的超嗜熱酶包括Pfu DNA聚合酶和Pwo DNA聚合酶以 及它們的衍生物，例如序列-修飾衍生物，及其突變體。
[0070] 因此，本發(fā)明特別優(yōu)選的方面提供了一種檢測(cè)樣品中分析物的方法，包括：
[0071] (a)將所述樣品與至少第一和第二鄰近探針的至少一組接觸，每個(gè)探針包括分析 物結(jié)合結(jié)構(gòu)域和核酸結(jié)構(gòu)域，并能夠同時(shí)結(jié)合至分析物；
[0072] (b)在所述鄰近探針與所述分析物結(jié)合時(shí)，使鄰近探針的核酸結(jié)構(gòu)域彼此相互作 用，其中所述相互作用包括雙鏈體的形成；
[0073] (c)延伸所述雙鏈體的至少一個(gè)核酸結(jié)構(gòu)域的3'端以生成延伸產(chǎn)物，其中，延伸 反應(yīng)使用聚合酶，所述聚合酶選自強(qiáng)烈火球菌（Pfu)DNA聚合酶和沃氏火球菌（Pwo)DNA聚 合酶或者它們的衍生物或突變體；和
[0074] (d)擴(kuò)增和檢測(cè)延伸產(chǎn)物。
[0075] Pfu DNA聚合酶或Pwo DNA聚合酶的序列-修飾衍生物或突變體包括保留了野 生型序列的至少一些功能活性的突變體，所述功能活性例如是聚合酶活性。突變會(huì)影響酶 的活性分布，例如，在不同反應(yīng)條件下，提高或降低聚合反應(yīng)速率，其中反應(yīng)條件例如是溫 度、模板濃度、引物濃度等。突變或序列修飾也會(huì)影響酶的保真性，例如，抑制或降低核酸 外切酶活性。聚合酶可以作為包括其它組分的組合物的一部分而提供，所述其它組分例如 是穩(wěn)定組分可增強(qiáng)或改善聚合酶活性，例如美國專利US6183997和US6444428(通過引用 整體并入本文）對(duì)這樣的組合物進(jìn)行了描述。Pfu DNA聚合酶或Pwo DNA聚合酶的很多序 列-修飾衍生物或突變體以及包含未修飾的和修飾的酶的組合物是本領(lǐng)域已知的且可市 購得到，例如，超超新星 ?(Pwo) (Hypernova?(Pwo))，德爾塔 ?(Pwo) (Delta3?(Pwo))，索爾 金特?(Pfu) (S〇lGentTM(Pfu))，并且，如上所述的，所有保留了必要溫度活性分布的酶都被 認(rèn)為是可用于本發(fā)明的方法中的。
[0076] 因此，在一個(gè)【具體實(shí)施方式】中，本發(fā)明的優(yōu)選的超嗜熱聚合酶由包括SEQ ID NO: 1 的核苷酸序列或者與其具有至少80%、85%或90%序列一致性的核苷酸序列所編碼。可 選地或另外地，本發(fā)明的優(yōu)選的超嗜熱聚合酶包括SEQ ID N0:2的多肽序列或者與其具 有至少80 %、85 %或90 %序列一致性的多肽序列。因此，本發(fā)明的超嗜熱聚合酶可以是 Pfu酶或Pwo酶的天然變體或衍生物，例如，來自于諸如是火球菌（Pyrococcus)替代菌株 或種的另一超嗜熱生物體。例如，已經(jīng)從其它火球菌的種，諸如甘氏火球菌（Pyrococcus glycovorans)和深海火球菌（Pyrococcus abyssi)(參見登錄號(hào) AAA37131. 1、CAB81809. 1 和NP127396. 1，其通過引用整體并入本文），識(shí)別出眾多天然變體或衍生物。
[0077] 優(yōu)選地，所述核苷酸序列或多肽序列與其所比對(duì)的序列至少具有90%、91 %、 92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或 99%的一致性。
[0078] 核苷酸分子的序列一致性可以通過使用GCG接口的FASTA搜索來測(cè)定，所述搜索 具有缺省值和可變的姆因子，缺口產(chǎn)生罰分設(shè)為12. 0,缺口延伸罰分設(shè)為4. 0,具有6個(gè)核 苷酸的窗口。
[0079] 優(yōu)選地，這樣的序列一致性相關(guān)的核酸分子在功能上等效于SEQ ID NO: 1中列出 的核酸分子。這樣的功能等效的核酸分子可以采用衍生物的形式并被認(rèn)為是功能等效物， 前提是它們編碼根據(jù)本文描述的聚合酶活性測(cè)試被認(rèn)為是功能等效物的多肽。優(yōu)選的功能 等效物是編碼上文所記載的優(yōu)選多肽的那些核酸分子。
[0080] 多肽分子的序列一致性可以通過使用具有可變的帕姆因子的FASTA pep-cmp的 SWISS-PR0T蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫來測(cè)定，缺口產(chǎn)生罰分設(shè)為12. 0,缺口延伸罰分設(shè)為4. 0,具 有2個(gè)氨基酸的窗口。優(yōu)選地，所述比對(duì)是針對(duì)全長序列進(jìn)行的，但是，也可以對(duì)較小的窗 口進(jìn)行比對(duì)，例如，小于600、500、400、300、200、100或50連續(xù)氨基酸。
[0081] 優(yōu)選地，這樣的序列一致性相關(guān)的多肽在功能上等效于SEQ ID N0:2中列出的多 肽。如此，就可對(duì)具有SEQ ID N0:2中列出的序列的多肽進(jìn)行不影響多肽的序列的修飾。 [0082] 不影響多肽序列的修飾包括化學(xué)修飾，例如去糖基化和糖基化。通過多肽的后期 合成/分離修飾，例如特定殘基的糖基化和甲基化，來制備這樣的多肽，而不會(huì)影響特定殘 基的功能。
[0083] 如本文所提到，為了實(shí)現(xiàn)"功能等效"，多肽在聚合酶活性上可顯示出一些相對(duì)于 母體分子（即多肽所源自的分子，例如通過氨基酸替代）的增加或降低的功效，但是優(yōu)選 地，多肽與母體分子同樣有效或更高效。在一些【具體實(shí)施方式】中，在功能等效多肽中，部分 原酶活性例如核酸外切酶活性可能會(huì)降低或受到抑制。因此，功能等效涉及這樣的多肽：其 在鄰近延伸反應(yīng)中具有能夠延伸核酸結(jié)構(gòu)域的聚合酶活性，但是在室溫不具有聚合酶活性 或只具有最小聚合酶活性。通過衍生多肽的聚合酶活性相對(duì)于其所源自的多肽的比較，以 定量方式，來測(cè)試等效多肽，如上所述。在本發(fā)明的方法中，衍生物優(yōu)選與母體多肽至少是 30%、50%、70%或 90%等效的。
[0084] 與自然發(fā)生的蛋白質(zhì)有關(guān)或源自自然發(fā)生的蛋白質(zhì)的功能等效蛋白質(zhì)，通過一個(gè) 或多個(gè)氨基酸的取代、添加和/或刪除（假設(shè)它們滿足上述序列一致的要求）來修飾天然 氨基酸但不破壞分子功能從而獲得功能等效蛋白質(zhì)。優(yōu)選地，天然序列具有小于20個(gè)取 代、添加或刪除，例如小于1〇、5、4、3、2或1個(gè)這樣的修飾。這樣的蛋白質(zhì)由"功能等效核酸 分子"編碼，其中"功能等效核酸分子"是由一個(gè)或多個(gè)堿基的適當(dāng)?shù)娜〈?、添加?或刪除 而產(chǎn)生。
[0085] 在本發(fā)明的一個(gè)【具體實(shí)施方式】中，本發(fā)明的方法可包括使用具有3 '核酸外切酶活 性的組分。因此，本發(fā)明的方法包括使樣品接觸具有3'核酸外切酶活性的組分的另外步驟。 具有3'核酸外切酶活性的組分在聚合酶之前加入或與之同時(shí)加入。在一些【具體實(shí)施方式】 中，鄰近延伸分析的延伸步驟所用的聚合酶具有3'核酸外切酶活性。
[0086] 因此，本發(fā)明提供了一種檢測(cè)樣品中分析物的方法，包括：
[0087] (a)將所述樣品與至少第一和第二鄰近探針的至少一組接觸，每個(gè)探針包括分析 物結(jié)合結(jié)構(gòu)域和核酸結(jié)構(gòu)域，并能夠同時(shí)結(jié)合至分析物；
[0088] (b)在所述鄰近探針與所述分析物結(jié)合時(shí)，使鄰近探針的核酸結(jié)構(gòu)域彼此相互作 用，其中所述相互作用包括雙鏈體的形成；
[0089] (b'）使所述樣品與具有3'核酸外切酶活性的組分接觸；
[0090] (c)延伸所述雙鏈體的至少一個(gè)核酸結(jié)構(gòu)域的3'端以生成延伸產(chǎn)物，其中，該步 驟可與步驟（b'）同時(shí)發(fā)生或在步驟（b'）之后發(fā)生，且其中，延伸反應(yīng)使用聚合酶，所述聚 合酶的特征在于，其在40°C的活性小于其最大酶活性的20%，其中所述聚合酶最大活性的 最適溫度大于40°C ;和
[0091] ⑷擴(kuò)增和檢測(cè)延伸產(chǎn)物。
[0092] 核酸外切酶是這樣起作用的酶：通過在3'端或5'端水解磷酸二酯鍵從而從多核 苷酸鏈末端一次一個(gè)地?cái)嗔押塑账?。因此，核酸外切酶作?'核酸外切酶或3'核酸外切 酶而存在，這種命名是參考斷裂的起始端，即，3'核酸外切酶沿3'至5'的方向降解核酸分 子。已知存在眾多類型的核酸外切酶，它們降解DNA和/或RNA并且作用于雙鏈核酸或單鏈 核酸。雖然核酸外切酶可以是截然不同的實(shí)體（不同的酶，具有唯一的降解核酸的功能）， 例如5'RNA核酸外切酶和來自大腸桿菌的核酸外切酶I，其中，在真核生物和原核生物中都 發(fā)現(xiàn)了 5' RNA核酸外切酶，其用于mRNA的轉(zhuǎn)換，而來自大腸桿菌的核酸外切酶I以3' -5' 方向降解單鏈DNA，很多核酸外切酶活性來自具有多種功能的酶，例如，很多DNA聚合酶也 具有3'和/或5'核酸外切酶活性（來自強(qiáng)烈火球菌的Pfu DNA聚合酶）。
[0093] 因此，用于本發(fā)明方法的具有3'核酸外切酶活性的組分包括能夠從3'端降解核 酸的任何要素。在本發(fā)明的優(yōu)選方面，具有3'核酸外切酶活性的組分優(yōu)先作用于單鏈核酸， 艮P，它對(duì)單鏈分子比對(duì)雙鏈具有更大的活性，例如，對(duì)單鏈核酸分子具有至少2、3、4、5、10、 20、50或100倍活性。
[0094] 包含核酸外切酶活性的組分必需能夠完全地或部分地降解未結(jié)合的鄰近探針的 核酸結(jié)構(gòu)域，未結(jié)合的鄰近探針即沒有結(jié)合到靶標(biāo)分析物的探針，其中，所述核酸結(jié)構(gòu)域具 有游離的且未被保護(hù)的3'端。如下面所討論的，鄰近探針的核酸結(jié)構(gòu)域可以由能夠參與沃 森-克里克型或同功堿基對(duì)相互作用的任何核苷酸殘基所構(gòu)成。然而，在一些具體實(shí)施方 式中，其中，核酸結(jié)構(gòu)域包括DNA，具有3'核酸外切酶活性的組分作用于DNA，且優(yōu)選地，其 對(duì)DNA具有比對(duì)RNA更高的活性，例如，其對(duì)DNA具有對(duì)RNA的至少2、3、4、5、10、20、50或 100倍活性。類似地，在【具體實(shí)施方式】，其中，核酸結(jié)構(gòu)域包括RNA，具有3'核酸外切酶活性 的組分作用于RNA，且優(yōu)選地，其對(duì)RNA具有比對(duì)DNA更高的活性，例如，其對(duì)RNA具有對(duì)DNA 的至少2、3、4、5、10、20、50或100倍活性。
[0095] 在本發(fā)明的一個(gè)方面，具有3'核酸外切酶活性的組分是酶。在特別優(yōu)選的具體實(shí) 施方式中，所述酶是同樣具有3'核酸外切酶活性的能夠延伸核酸分子3'端的核酸聚合酶。 特別地，具有3'核酸外切酶活性的組分是選自包括如下物質(zhì)的組的任一個(gè)或多個(gè)：強(qiáng)烈火 球菌（Pfu)DNA聚合酶和沃氏火球菌（Pwo)DNA聚合酶以及它們的序列-修飾衍生物或突變 體，如上所描述。因此，在一些【具體實(shí)施方式】中，具有3'核酸外切酶活性的組分可以是超嗜 熱酶，特別是如上定義的具有3'核酸外切酶活性的超嗜熱聚合酶。
[0096] 在其他【具體實(shí)施方式】中，用于鄰近探針核酸結(jié)構(gòu)域（和/或夾板寡核苷酸）的延 伸的聚合酶活性可以由無3'核酸外切酶活性或具有最小3'核酸外切酶活性的酶，例如 Pfu (外切-)DNA聚合酶、Pwo (外切-)DNA聚合酶等來提供，并且，包括3'核酸外切酶組分 可以作為獨(dú)立的實(shí)體而被提供，獨(dú)立的實(shí)體例如是具有3'核酸外切酶活性的其它酶。因此， 無3'核酸外切酶活性或具有最小3'核酸外切酶活性的聚合酶可以是如上定義的超嗜熱聚 合酶。在另外的【具體實(shí)施方式】中，可以以多種形式來包括具有3'核酸外切酶活性的組分， 艮P，可以提供多于一種的有3'核酸外切酶活性的組分，例如，作為聚合酶的一部分以及作為 具有其主要功能3'核酸外切酶活性的獨(dú)立的酶。在本發(fā)明的一個(gè)方面，具有3'核酸外切 酶活性的組分是核酸外切酶I。
[0097] 有利地，在核酸結(jié)構(gòu)域延伸所需的組分即聚合酶之前或與之同時(shí)，但是在鄰近探 針的核酸結(jié)構(gòu)域已相互作用之后，具有3'核酸外切酶活性的組分與樣品接觸以形成雙鏈 體。在該方面，與樣品接觸時(shí)，鄰近探針的核酸結(jié)構(gòu)域必需至少是部分單鏈的，以便在結(jié)合 到靶標(biāo)分析物后它們能夠相互作用。因此，如果在前述雙鏈體形成之前存在（以活性形式 存在）具有3'核酸外切酶活性的組分，那么具有游離且未被保護(hù)的3'端的所有鄰近探針 的核酸結(jié)構(gòu)域?qū)?duì)降解敏感。相反，一旦結(jié)合到靶標(biāo)分析物的鄰近探針之間已經(jīng)形成了雙 鏈體，那么只有未結(jié)合的鄰近探針的核酸結(jié)構(gòu)域可降解。
[0098] 在【具體實(shí)施方式】中，其中如上所述的聚合酶具有3'核酸外切酶活性，所述聚合酶 (即具有3'核酸外切酶活性的組分）可在鄰近探針的核酸結(jié)構(gòu)域已相互作用之前接觸樣 品，其中，鄰近探針的核酸結(jié)構(gòu)域是在聚合酶具有最小活性或無活性的條件下相互接觸的， 例如室溫或標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境溫度。在這些條件下，具有3'核酸外切酶活性的組分將不會(huì)干擾鄰近 結(jié)合的探針的核酸結(jié)構(gòu)域之間的相互作用，因?yàn)樗雒甘菬o活性的。
[0099] 沒有結(jié)合到靶標(biāo)分析物的探針不會(huì)形成穩(wěn)定的雙鏈體，并且，雖然它們會(huì)與其它 未結(jié)合探針或樣品的其它組分相互作用，但是這些相互作用很可能是短暫的（暫時(shí)的），從 而意味著，一旦加入到樣品中或被活化（就具有3'核酸外切酶活性的超嗜熱聚合酶而言）， 這些探針的核酸結(jié)構(gòu)域?qū)⑹蔷哂?'核酸外切酶活性的組分的可利用的底物。
[0100] 如果具有3'核酸外切酶活性的組分與樣品接觸且同時(shí)與核酸結(jié)構(gòu)域延伸所需的 組分接觸，例如其中所述聚合酶具有3'核酸外切酶活性，那么延伸反應(yīng)和降解反應(yīng)將同時(shí) 發(fā)生。
[0101] 如果具有3'核酸外切酶活性的組分在核酸結(jié)構(gòu)域延伸所需的組分之前與樣品接 觸，例如其中具有3'核酸外切酶活性的獨(dú)立的酶（無實(shí)質(zhì)的或可檢測(cè)到的聚合酶活性）與 樣品接觸，那么在延伸反應(yīng)之前，未結(jié)合探針的具有游離且未被保護(hù)的3'端的核酸結(jié)構(gòu)域 將被降解，且具有3'核酸外切酶活性的組分會(huì)被滅活（例如，移除、抑制或變性）。然而，在 延伸步驟和擴(kuò)增步驟，3'核酸外切酶活性會(huì)被保留。
[0102] 在一個(gè)【具體實(shí)施方式】中，在擴(kuò)增延伸產(chǎn)物的步驟之前，具有3'核酸外切酶活性的 組分是滅活的，以便阻止擴(kuò)增步驟所需組分的降解。術(shù)語"滅活"（inactivated)意思是組 分被例如熱所抑制、變性或者從樣品中物理移除。在該方面，僅3'核酸外切酶活性需要滅 活。
[0103] 例如，其中延伸產(chǎn)物由PCR擴(kuò)增，標(biāo)準(zhǔn)的未修飾引物（具有游離且未被保護(hù)的3' 端）是3'核酸外切酶的底物，不能滅活該活性會(huì)導(dǎo)致這些PCR試劑的降解從而限制擴(kuò)增或 使擴(kuò)增無法進(jìn)行。
[0104] 在一個(gè)優(yōu)選的【具體實(shí)施方式】中，在樣品接觸具有3'核酸外切酶活性的組分之前， 將擴(kuò)增反應(yīng)所用的一些或全部試劑加入到樣品。在特別優(yōu)選的【具體實(shí)施方式】中，在上述步 驟（b'）和（c)之間，加入所述試劑。可選地，擴(kuò)增反應(yīng)所用的一些或全部試劑與具有3'核 酸外切酶活性的組分同時(shí)加入到樣品，即同時(shí)地或同步地。
[0105] 在一個(gè)【具體實(shí)施方式】中，以修飾形式提供引物，以便它們具有抗3'核酸外切酶活 性。對(duì)核酸分子進(jìn)行修飾或?qū)怂岱肿影暮塑账徇M(jìn)行修飾以阻止核酸外切酶引起的降 解，這是本領(lǐng)域公知的，且通常是利用受保護(hù)端的，例如3'端的，一個(gè)或多個(gè)殘基的修飾。本 發(fā)明的方法可以利用適合于抗3'核酸外切酶活性的保護(hù)的任何修飾。在該方面，用于本發(fā) 明的引物優(yōu)選包含3'端至少一個(gè)修飾的核苷酸。例如，所述修飾可選擇下述的任一個(gè)或多 個(gè)：硫代磷酸酯-修飾的核苷酸、鎖核酸核苷酸（不可進(jìn)入的RNA核苷酸）、2' -OMe-CE亞 磷酰胺修飾的核苷酸，或肽核酸核苷酸。
[0106] 對(duì)于本發(fā)明方法中延伸產(chǎn)物的擴(kuò)增步驟，使用"熱起始"引物（描述于Kaboev等 人，2000，核酸研究，28(21)，e94 頁（Kaboev et al·，2000, Nuc. Acids Res. ,28(21)，ρρ· e94)，其通過引用整體并入本文）是有利的。熱起始引物是寡核苷酸引物，其包含依賴于3' 端和5'端互補(bǔ)區(qū)的莖-環(huán)結(jié)構(gòu)。在該方面，將引物設(shè)計(jì)為與靶序列（延伸產(chǎn)物的特定區(qū) 域）互補(bǔ)，并且將至少5-6個(gè)核苷酸添加到引物的5'端，形成與引物3'端互補(bǔ)的序列。在 低溫，例如反應(yīng)的組分進(jìn)行混合的溫度或進(jìn)行延伸反應(yīng)的溫度，引物形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)且不能 發(fā)揮延伸產(chǎn)物擴(kuò)增的有效引物的作用。然而，在加熱至PCR退火溫度之后，引物獲得了線性 結(jié)構(gòu)且能夠開始引物延伸（擴(kuò)增）。據(jù)認(rèn)為，熱啟動(dòng)引物的使用可阻止PCR引物對(duì)本方法鄰 近探針之間相互作用的干擾且進(jìn)一步保護(hù)所述引物免受3'核酸外切酶活性的影響。
[0107] 在本發(fā)明的一個(gè)特別優(yōu)選的【具體實(shí)施方式】中，一些或全部反應(yīng)組分，"反應(yīng)混合 物"，例如鄰近探針、聚合酶、擴(kuò)增試劑和檢測(cè)試劑，可同時(shí)接觸或在同一反應(yīng)容器中接觸， 以便在不加入任何其它組分的情況下能夠產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物，該擴(kuò)增產(chǎn)物在樣品中靶標(biāo)分析物 存在時(shí)是無活性的。因此，可在單一反應(yīng)容器中，例如反應(yīng)管中，來準(zhǔn)備"反應(yīng)混合物"，以實(shí) 現(xiàn)"封閉的"或"封閉管"反應(yīng)。在這一【具體實(shí)施方式】中，可以通過將反應(yīng)混合物的溫度提高 到足以活化聚合酶的溫度來開始延伸反應(yīng)，即以便使核酸雙鏈體的至少一個(gè)核酸結(jié)構(gòu)域延 伸以生成延伸產(chǎn)物。合適的溫度和反應(yīng)條件在下面進(jìn)行詳細(xì)描述，但是其可以是至少35°C， 優(yōu)選至少 37°C，例如至少 40、45、50、55、60、65、70 或 75°C。
[0108] 在一些【具體實(shí)施方式】中，延伸產(chǎn)物的擴(kuò)增步驟可以在相同的反應(yīng)容器中進(jìn)行，即 可以修飾反應(yīng)條件來開始擴(kuò)增反應(yīng)，例如PCR。下面描述了合適的PCR條件。在其它具體實(shí) 施方式中，可以將含有延伸產(chǎn)物的反應(yīng)混合物的一份轉(zhuǎn)移到新的反應(yīng)容器中，分析的剩余 步驟可在一個(gè)或多個(gè)分開的反應(yīng)容器中進(jìn)行。
[0109] 在本發(fā)明的另一【具體實(shí)施方式】中，一個(gè)或多個(gè)鄰近探針的核酸結(jié)構(gòu)域可作為展開 的鄰近探針而被提供，其包含偶聯(lián)至具有至少一個(gè)發(fā)夾結(jié)構(gòu)的核酸結(jié)構(gòu)域的分析物結(jié)合結(jié) 構(gòu)域。發(fā)夾結(jié)構(gòu)也被稱為發(fā)夾-環(huán)或莖-環(huán)，這些術(shù)語在本文中可互換使用。發(fā)夾是可發(fā) 生在單鏈DNA或RNA分子中的分子內(nèi)堿基配對(duì)模式。當(dāng)同一鏈的兩個(gè)區(qū)域通過堿基配對(duì)形 成了雙螺旋（雙鏈體）時(shí)，發(fā)夾發(fā)生，其中，沿反方向閱讀時(shí)所述兩個(gè)區(qū)域在核苷酸序列上 通常是互補(bǔ)的，且所述雙螺旋（雙鏈體）終止于不配對(duì)的環(huán)即單鏈環(huán)。可將產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)描 述為棒棒糖形狀（lollipop-shaped)。
[oho] 在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的【具體實(shí)施方式】中，一個(gè)或多個(gè)鄰近探針的核酸結(jié)構(gòu)域被提 供，以便游離的3'可延伸端能夠形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。因此，一個(gè)或多個(gè)鄰近探針可提供為展開 鄰近探針，其中，發(fā)夾結(jié)構(gòu)可以是展開的以使核酸結(jié)構(gòu)域的3'端與反應(yīng)混合物中的其它核 酸分子相互作用，如上所述，以便與第二鄰近探針的核酸結(jié)構(gòu)域形成雙鏈體，其中所述第二 鄰近探針結(jié)合到與第一、展開鄰近探針鄰近的靶標(biāo)分析物上。因此，展開后，（如上定義的） 第一和第二鄰近探針的核酸結(jié)構(gòu)域互相互補(bǔ)，或與通用模板互補(bǔ)。雖然不希望受理論約束， 但是理論認(rèn)為，使用展開鄰近探針可阻止或降低鄰近探針之間非特異性/背景相互作用的 數(shù)目，即，兩個(gè)鄰近探針核酸結(jié)構(gòu)域中的一個(gè)或者二者的3'端不能自由地相互作用或者僅 是暫時(shí)地游離的，那么就不大可能發(fā)生鄰近探針之間的非特異性相互作用，例如，鄰近探針 不結(jié)合至靶標(biāo)分析物的相互作用。
[0111] 在本發(fā)明的使用一個(gè)或多個(gè)展開鄰近探針的【具體實(shí)施方式】中，明顯的是，對(duì)于鄰 近探針的直接或間接相互作用的核酸結(jié)構(gòu)域而言，一個(gè)或多個(gè)展開探針的核酸結(jié)構(gòu)域必需 是展開的。在一些【具體實(shí)施方式】中，可以設(shè)計(jì)一個(gè)或多個(gè)展開鄰近探針的核酸結(jié)構(gòu)域的發(fā) 夾結(jié)構(gòu)，以使發(fā)夾結(jié)構(gòu)是不穩(wěn)定的，如此，在分析的條件下，發(fā)夾結(jié)構(gòu)可以隨機(jī)地由開放形 式（展開、線性狀態(tài)）轉(zhuǎn)變?yōu)榉忾]形式（折疊的發(fā)夾狀態(tài)）。可對(duì)發(fā)夾結(jié)構(gòu)進(jìn)行設(shè)計(jì)以確保 鄰近探針的核酸結(jié)構(gòu)域之間形成的雙鏈體比發(fā)夾結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定。因此，如果一個(gè)或多個(gè)展開 鄰近探針的核酸結(jié)構(gòu)域展開在可形成穩(wěn)定相互作用的核酸的鄰近處，例如在結(jié)合至靶標(biāo)分 析物的探針的鄰近處，那么在反應(yīng)條件下不易斷裂的延伸雙鏈體將形成，即這樣的核酸雙 鏈體：該雙鏈體中的一個(gè)或多個(gè)游離3'端可使用該雙鏈體的另一鏈為模板通過聚合酶來 延伸。
[0112] 在其它【具體實(shí)施方式】中，可將一個(gè)或多個(gè)展開鄰近探針的核酸結(jié)構(gòu)域設(shè)計(jì)為在其 它條件下展開。也可通過將發(fā)夾結(jié)構(gòu)的雙鏈元件的至少部分?jǐn)嗔讯鴮?shí)現(xiàn)展開。這可以通過 改變樣品條件而實(shí)現(xiàn)，以便發(fā)夾結(jié)構(gòu)不再是熱力學(xué)有利結(jié)構(gòu)，例如，通過改變?nèi)芤旱臏囟然?鹽濃度。因此，在一些【具體實(shí)施方式】中，活化聚合酶所需的溫度的提高可有利于展開過程， 艮P，促進(jìn)開放形式或狀態(tài)的而非封閉形式或狀態(tài)的鄰近探針。
[0113] 可選地，通過使發(fā)夾結(jié)構(gòu)的雙鏈元件與"抗封閉"寡核苷酸競爭可使發(fā)夾結(jié)構(gòu)展 開。例如，在高濃度的、與發(fā)夾結(jié)構(gòu)的一條鏈互補(bǔ)的抗封閉寡核苷酸存在的情況下，抗封閉 寡核苷酸與鄰近探針的核酸結(jié)構(gòu)域之間的相互作用（雜交）強(qiáng)于發(fā)夾結(jié)構(gòu)。因此，在本發(fā) 明的鄰近分析中，"抗封閉"寡核苷酸可以是鄰近探針的核酸結(jié)構(gòu)域的形式，例如，延伸模板 寡核苷酸或夾板寡核苷酸。明顯的是，當(dāng)鄰近探針都結(jié)合到分析物時(shí)，所述探針的核酸結(jié)構(gòu) 域以高的局部濃度而有效存在。因此，如果鄰近探針的核酸結(jié)構(gòu)域之間的相互作用（雜交） 比展開鄰近探針的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的元件之間的相互作用更穩(wěn)定（熱力學(xué)有利的），那么發(fā)夾結(jié) 構(gòu)將展開以實(shí)現(xiàn)鄰近探針的核酸結(jié)構(gòu)域之間的相互作用。
[0114] 在一些優(yōu)選的【具體實(shí)施方式】中，鄰近分析包括一個(gè)或多個(gè)展開鄰近探針。在這樣 的【具體實(shí)施方式】中，明顯的是，這樣的展開鄰近探針的發(fā)夾結(jié)構(gòu)可以在同一反應(yīng)中以不同 的方式來展開，例如，第一展開鄰近探針可通過抗封閉寡核苷酸而展開，第二展開鄰近探針 可通過與另一鄰近探針的核酸結(jié)構(gòu)域競爭而展開。例如，展開第一鄰近探針可產(chǎn)生引起第 二鄰近探針的發(fā)夾結(jié)構(gòu)斷裂的互補(bǔ)區(qū)域。
[0115] 在其它【具體實(shí)施方式】中，一個(gè)或多個(gè)展開鄰近探針可以與"標(biāo)準(zhǔn)"非-展開鄰近探 針聯(lián)合使用。在優(yōu)選的【具體實(shí)施方式】中，這樣的標(biāo)準(zhǔn)鄰近探針可利用封閉寡核苷酸（如下 所進(jìn)一步描述）來保護(hù)（掩飾或遮蔽）所述鄰近探針的核酸結(jié)構(gòu)域的反應(yīng)元件，以便使它 們與其它鄰近探針的核酸結(jié)構(gòu)域或樣品中的其它組分的相互作用最小化。
[0116] 第一和第二鄰近探針的核酸結(jié)構(gòu)域可被視為相互作用以形成可檢測(cè)的產(chǎn)物的核 酸"標(biāo)記"，可檢測(cè)所述產(chǎn)物以報(bào)告對(duì)分析物的檢測(cè)。因此，核酸結(jié)構(gòu)域可被視為反應(yīng)核酸官 能度，其相互作用以提供信號(hào)，借助該信號(hào)可檢測(cè)分析物（更具體地，形成信號(hào)-發(fā)出的產(chǎn) 物）。換言之，核酸結(jié)構(gòu)域可被視為"檢測(cè)標(biāo)記"，其相互作用以形成"檢測(cè)"標(biāo)記或產(chǎn)物，或 者其能夠形成檢測(cè)"標(biāo)記或產(chǎn)物。當(dāng)同一樣品中存在兩個(gè)或多個(gè)分析物時(shí)，可以使用兩組或 多組鄰近探針同時(shí)對(duì)它們進(jìn)行檢測(cè)，其中，將每組鄰近探針設(shè)計(jì)為在相互作用后形成一個(gè) 或多個(gè)唯一的核酸序列延伸產(chǎn)物或"檢測(cè)標(biāo)記"。在擴(kuò)增同時(shí)或之后，使用文獻(xiàn)中已知的方 法分別對(duì)這些唯一的"檢測(cè)標(biāo)記"進(jìn)行檢測(cè)和定量，文獻(xiàn)中已知的方法包括液相色譜法、電 泳法、質(zhì)譜分析法、DNA測(cè)序、基于微球的以及平面的DNA陣列技術(shù)和多色實(shí)時(shí)PCR。
[0117] 在優(yōu)選的【具體實(shí)施方式】中，通過定量PCR(qPCR)來對(duì)可檢測(cè)標(biāo)記（即延伸產(chǎn)物） 進(jìn)行擴(kuò)增和檢測(cè)，定量PCR(qPCR)也稱為實(shí)時(shí)PCR。在特別優(yōu)選的【具體實(shí)施方式】中，qPCR使 用了插入核酸分子以提供檢測(cè)信號(hào)的染料，所述檢測(cè)信號(hào)優(yōu)選是熒光信號(hào)。在本發(fā)明中特 別有用的熒光插入染料是SYBR Green?和EvaGreen?，雖然本發(fā)明qPCR【具體實(shí)施方式】并不 限于這些染料。
[0118] 在本發(fā)明的方法中，第一和第二鄰近探針的核酸結(jié)構(gòu)域的一個(gè)或兩個(gè)可被延伸， 這會(huì)導(dǎo)致可被擴(kuò)增和檢測(cè)的新的核酸分子或"延伸產(chǎn)物"的形成。
[0119] 在一些【具體實(shí)施方式】中，在一個(gè)核酸結(jié)構(gòu)域延伸之后，核酸結(jié)構(gòu)域可被連接到一 起（即分子間連接），以產(chǎn)生延伸產(chǎn)物或檢測(cè)標(biāo)記，即，使用"夾板"寡核苷酸作為模板由聚 合酶"填入"核酸結(jié)構(gòu)域之間的間隙。在核酸結(jié)構(gòu)域被連接的【具體實(shí)施方式】中，這種連接由 夾板介導(dǎo)，如上所述，可認(rèn)為所述夾板是鄰近探針之一的核酸結(jié)構(gòu)域的一部分，即，其中核 酸結(jié)構(gòu)域是部分雙鏈的。夾板可以作為游離核酸分子而提供，或者夾板可以作為第三鄰近 探針的核酸結(jié)構(gòu)域而被提供。
[0120] 所述連接引起可被擴(kuò)增和檢測(cè)的新的核酸分子或序列的形成。
[0121] 在優(yōu)選的【具體實(shí)施方式】中，本發(fā)明的方法不包括連接反應(yīng)或步驟。更特別地，本發(fā) 明的方法不包括連接鄰近探針的核酸結(jié)構(gòu)域的步驟，例如，本發(fā)明不包括分子間連接，即， 其中兩個(gè)或多個(gè)核酸分子，例如兩個(gè)或多個(gè)鄰近探針的核酸結(jié)構(gòu)域相連接以形成單一核酸 分子。然而，在一些【具體實(shí)施方式】中，本發(fā)明的方法可包括分子內(nèi)連接，例如，其中單一鄰近 探針的核酸結(jié)構(gòu)域（例如，夾板寡核苷酸）（在其已延伸之后）進(jìn)行連接以形成環(huán)狀核酸分 子，或者，其中鎖式探針使用核酸結(jié)構(gòu)域的延伸部分作為連接模板而進(jìn)行連接。
[0122] 核酸結(jié)構(gòu)域可以是單鏈核酸分子（例如，寡核苷酸），部分雙鏈且部分單鏈的分 子，或者雙鏈分子，所述雙鏈分子包括雙鏈區(qū)域和兩條核酸鏈不互補(bǔ)因此是單鏈的區(qū)域。因 此，在特定的【具體實(shí)施方式】中，核酸結(jié)構(gòu)域由單鏈核酸組成。在其它【具體實(shí)施方式】中，核酸 結(jié)構(gòu)域可以由兩條部分互補(bǔ)的核酸鏈組成，其中，這兩條鏈包括雜交的區(qū)域和未雜交的區(qū) 域。在其它【具體實(shí)施方式】中，如上所述，核酸結(jié)構(gòu)域可包括發(fā)夾結(jié)構(gòu)。
[0123] 第一和第二鄰近探針的核酸結(jié)構(gòu)域必需能夠通過雜交而相互作用，即形成一個(gè)或 多個(gè)雙鏈體。這種相互作用可以是直接的，例如，核酸結(jié)構(gòu)域包括彼此互補(bǔ)的區(qū)域，優(yōu)選在 它們的3'端（雖然互補(bǔ)區(qū)域可以在一個(gè)核酸結(jié)構(gòu)域的內(nèi)部，參見圖1的版本2和4)，或者， 這種相互作用也可以是間接的，例如，所述第一和第二鄰近探針的核酸結(jié)構(gòu)域可以各自與 稱作"夾板"寡核苷酸的區(qū)域雜交。
[0124] 核酸結(jié)構(gòu)域通常都足夠長，以便當(dāng)結(jié)合到靶標(biāo)分析物（夾板-介導(dǎo)的相互作用） 時(shí)能與另一鄰近探針的核酸結(jié)構(gòu)域相互作用。核酸結(jié)構(gòu)域的長度范圍通常是約8個(gè)至約 1000個(gè)核苷酸，其中，在特定的【具體實(shí)施方式】中，它們的長度范圍是約8個(gè)至約500個(gè)核苷 酸，包括約8個(gè)至約250個(gè)核苷酸，例如，約8個(gè)至約160個(gè)核苷酸，諸如約12個(gè)至約150個(gè) 核苷酸，約14個(gè)至約130個(gè)核苷酸，約16個(gè)至約110個(gè)核苷酸，約8個(gè)至約90個(gè)核苷酸， 約12個(gè)至約80個(gè)核苷酸，約14個(gè)至約75個(gè)核苷酸，約16個(gè)至約70個(gè)核苷酸，約16個(gè)至 約60個(gè)核苷酸，等等。在特定的具有代表性的【具體實(shí)施方式】中，核酸結(jié)構(gòu)域的長度范圍是 約10個(gè)至約80個(gè)核苷酸，約12個(gè)至約75個(gè)核苷酸，約14個(gè)至約70個(gè)核苷酸，約34個(gè)至 約60個(gè)核苷酸，以及上述長度范圍間的任何長度。在一些【具體實(shí)施方式】中，核酸結(jié)構(gòu)域的 長度通常不大于約 28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、44、46、50、55、60、 65或70個(gè)核苷酸。
[0125] 核酸結(jié)構(gòu)域可以由核糖核苷酸和/或脫氧核糖核苷酸以及合成的核苷酸殘基組 成，所述合成的核苷酸殘基能夠參與沃森-克里克型或同功堿基對(duì)相互作用，即"雜交"或 形成"雙鏈體"。因此，核酸結(jié)構(gòu)域可以是DNA或RNA或它們的任何變型，例如PNA或含有非 核苷酸主鏈的其它衍生物。
[0126] 第一和第二鄰近探針的核酸結(jié)構(gòu)域的序列（即"檢測(cè)"核酸結(jié)構(gòu)域）可以是這樣 的任何序列：其能夠形成雙鏈體且可相對(duì)彼此或夾板，如果存在，而被選擇。因此，只要第一 和第二結(jié)構(gòu)域可以彼此雜交，或雜交至第三核酸結(jié)構(gòu)域（夾板），那么所述序列就不至關(guān)重 要。然而，應(yīng)當(dāng)對(duì)所述序列進(jìn)行選擇，以避免如下雜交事件的發(fā)生：沒有發(fā)生在第一和第二 鄰近探針的核酸結(jié)構(gòu)域之間的雜交，或者不是與夾板寡核苷酸的核酸結(jié)構(gòu)域發(fā)生的雜交。 一旦序列被選擇或鑒定，就可使用任何便捷的方法來合成核酸結(jié)構(gòu)域。
[0127] 術(shù)語"擴(kuò)增" (amplifying)或"擴(kuò)增的" (amplified)在本文中通常用于包括在分析 中增加延伸產(chǎn)物或其部分的拷貝數(shù)的任何手段，作為指示樣品中靶標(biāo)分析物存在的手段。 例如,本領(lǐng)域已知的任何擴(kuò)增手段都可以用于本發(fā)明的方法中，例如,PCR、LCR、RCA、MDA等。 根據(jù)樣品中靶標(biāo)分析物的豐度，可能需要擴(kuò)增延伸產(chǎn)物或其部分，以使延伸產(chǎn)物的濃度翻 倍，即在擴(kuò)增前存在的拷貝數(shù)的2倍?？蛇x擇地，可以優(yōu)選地使拷貝數(shù)增加多個(gè)數(shù)量級(jí)。在 一些【具體實(shí)施方式】中，樣品中的擴(kuò)增結(jié)果包括了延伸產(chǎn)物或其部分的初始量的至少2、3、4、 5、6、7、8、9、10、15、20、50或75倍。在進(jìn)一步優(yōu)選的【具體實(shí)施方式】中，優(yōu)選地?cái)U(kuò)增延伸產(chǎn)物 以使樣品包括延伸產(chǎn)物或其部分的初始量的至少1〇 2、1〇3、1〇4、1〇5、1〇6、1〇 7、1〇8、1〇9、101°倍。
[0128] 明顯的是，不需要擴(kuò)增所有延伸產(chǎn)物以確定樣品是否包括靶標(biāo)分析物。僅有必要 擴(kuò)增一部分延伸產(chǎn)物，所述延伸產(chǎn)物在延伸反應(yīng)發(fā)生之前不存在與樣品中。例如，延伸產(chǎn)物 將有效地包括兩部分：含有由鄰近探針（或夾板）的核酸結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的核苷酸序列的第一 "舊的"部分（現(xiàn)有的部分），和含有由模板化的延伸反應(yīng)生成的核苷酸序列的第二"新的" 部分（延伸的部分）。對(duì)第二"新的"部分或"延伸"的部分的檢測(cè)使得能夠檢測(cè)靶標(biāo)分析 物，即如果沒有分析物，就沒有延伸，因此沒有"新的"或"延伸的"部分。因此，在本發(fā)明優(yōu) 選的方面，擴(kuò)增延伸產(chǎn)物的步驟包括擴(kuò)增延伸產(chǎn)物的延伸部分的一部分。
[0129] 一部分延伸的部分需要具有足夠的尺寸以使其可以與存在于樣品中的其它序列 區(qū)分開。實(shí)際上，延伸產(chǎn)物的延伸部分的部分充當(dāng)與靶標(biāo)分析物的存在相對(duì)應(yīng)的獨(dú)特的標(biāo) 志物或信號(hào)。因此，如果該部分包括了不存在于樣品中的核苷酸序列，則該序列的擴(kuò)增足以 指示樣品中靶標(biāo)分析物的存在和定量。
[0130] 因此，所述部分可以包括至少8個(gè)核苷酸，優(yōu)選至少9、10、11、12、13、14、15、16、 17、18、19、20個(gè)核苷酸。延伸產(chǎn)物的延伸部分的部分長度范圍通常是約8個(gè)至約1000個(gè)核 苷酸，其中在特定的【具體實(shí)施方式】中，它們的長度范圍是約8個(gè)至約500個(gè)核苷酸，包括約 8個(gè)至約250個(gè)核苷酸，例如，約8個(gè)至約160個(gè)核苷酸，諸如約12個(gè)至約150個(gè)核苷酸， 約14個(gè)至約130個(gè)核苷酸，約16個(gè)至約110個(gè)核苷酸，約8個(gè)至約90個(gè)核苷酸，約12個(gè) 至約80個(gè)核苷酸，約14個(gè)至約75個(gè)核苷酸，約16個(gè)至約70個(gè)核苷酸，約16個(gè)至約60個(gè) 核苷酸，等等。在特定的具有代表性的【具體實(shí)施方式】中，延伸產(chǎn)物的延伸部分的長度范圍是 約10個(gè)至約80個(gè)核苷酸，約12個(gè)至約75個(gè)核苷酸，約14個(gè)至約70個(gè)核苷酸，約34個(gè)至 約60個(gè)核苷酸，以及上述長度范圍間的任何長度。
[0131] 雖然設(shè)想的是可以擴(kuò)增整個(gè)延伸產(chǎn)物，即現(xiàn)有的和延伸的部分，但擴(kuò)增產(chǎn)物包括 延伸產(chǎn)物的延伸部分的至少一部分就足夠了。在本發(fā)明的一個(gè)方面，引物可以設(shè)計(jì)成在延 伸產(chǎn)物的延伸部分的部分的任一側(cè)，并且可以如下所描述的來檢測(cè)例如通過PCR進(jìn)行的該 部分的擴(kuò)增，和擴(kuò)增產(chǎn)物（包括延伸產(chǎn)物的部分）。在本發(fā)明的另一個(gè)方面，延伸產(chǎn)物的延 伸部分的部分可以形成用于連接例如鎖式探針的（如本文別處所述的）模板以形成環(huán)狀寡 核苷酸，并且該序列的擴(kuò)增，例如通過滾環(huán)擴(kuò)增（RCA)進(jìn)行的該序列的擴(kuò)增會(huì)產(chǎn)生包括與 延伸產(chǎn)物的延伸部分的部分相對(duì)應(yīng)的序列的多個(gè)拷貝而得到擴(kuò)增產(chǎn)物。因此，以這種方式 可以擴(kuò)增延伸產(chǎn)物，或更具體地?cái)U(kuò)增其部分?？蛇x地或另外地，延伸產(chǎn)物的延伸部分的部分 可以充當(dāng)用于環(huán)狀寡核苷酸的RCA的引物，所述寡核苷酸包括與延伸產(chǎn)物的延伸部分互補(bǔ) 的序列。如上所述，得到的產(chǎn)物會(huì)包括與延伸產(chǎn)物的延伸部分的部分相對(duì)應(yīng)的序列的多個(gè) 拷貝，如下所述，可以對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)。因此，在該【具體實(shí)施方式】中，也擴(kuò)增了延伸產(chǎn)物，或更 具體地?cái)U(kuò)增了其部分。
[0132] 在"夾板"寡核苷酸被延伸的【具體實(shí)施方式】中，所述延伸的寡核苷酸可以被環(huán)化 (即分子內(nèi)連接）以提供用于擴(kuò)增的模板，優(yōu)選用于滾環(huán)擴(kuò)增的模板。在這些具體實(shí)施方 式中，延伸的寡核苷酸的3'端（延伸端）連接于延伸的寡核苷酸的5'端（非延伸端），其 中所述連接可以由任何合適的手段來介導(dǎo)，如本文別處所描述的。在特別優(yōu)選的具體實(shí)施 方式中，連接反應(yīng)是模板化的連接，其中，延伸的寡核苷酸的3'端和5'端通過雜交于核酸 分子而彼此鄰近，所述核酸分子例如是加入到反應(yīng)中以便在延伸的寡核苷酸的3'端和5' 端之間充當(dāng)"夾板"或"分子橋"的寡核苷酸（如本文別處所述）。當(dāng)延伸的寡核苷酸的末 端與"夾板"核酸分子雜交時(shí)，末端可以連接，例如通過連接酶的活性連接，以形成含有延伸 產(chǎn)物的延伸部分的環(huán)狀寡核苷酸。因此，所述環(huán)狀寡核苷酸的擴(kuò)增，例如通過滾環(huán)擴(kuò)增的擴(kuò) 增，導(dǎo)致延伸產(chǎn)物的擴(kuò)增。在這種情況下，擴(kuò)增產(chǎn)物包括與延伸產(chǎn)物的延伸部分互補(bǔ)的序 列。因此，環(huán)化的寡核苷酸的擴(kuò)增導(dǎo)致延伸產(chǎn)物的間接擴(kuò)增。
[0133] 從上文顯而易見的是，延伸產(chǎn)物的延伸部分僅需要包括相對(duì)少量的核苷酸。此外， 延伸產(chǎn)物的最大尺寸將取決于鄰近探針的核酸結(jié)構(gòu)域和/或充當(dāng)用于延伸產(chǎn)物的模板的 夾板寡核苷酸（如下所定義）的尺寸。延伸產(chǎn)物可以由核酸結(jié)構(gòu)域和/或夾板寡核苷酸的 全部或部分延伸而產(chǎn)生，即，延伸反應(yīng)可以產(chǎn)生延伸到模板核酸的末端的延伸產(chǎn)物，或延伸 反應(yīng)可以使用條件以使延伸產(chǎn)物僅為模板核酸的部分互補(bǔ)鏈。
[0134] 術(shù)語"檢測(cè)"（detecting)或"檢測(cè)"（detected)廣泛地用于本文中，包括測(cè)定分 析物存在（即，其存在與否）的任何手段或測(cè)量分析物的任意形式。在本發(fā)明的方法中，通 過擴(kuò)增延伸產(chǎn)物（其包括擴(kuò)增基于或來自延伸產(chǎn)物或使用延伸產(chǎn)物生成的產(chǎn)物）并檢測(cè)所 述擴(kuò)增產(chǎn)物來間接地檢測(cè)分析物。因此，檢測(cè)分析物相當(dāng)于檢測(cè)上述定義的擴(kuò)增產(chǎn)物，并且 這些術(shù)語在本文中可互換使用。
[0135] 因此，"檢測(cè)"（detecting)可以包括以任何方式測(cè)定、測(cè)量、評(píng)估或分析分析物的 存在或不存在或量或位置。包括了定量和定性測(cè)定、測(cè)量或評(píng)估，包括半定量。這樣的測(cè) 定、測(cè)量或評(píng)估可以是相對(duì)的，例如當(dāng)樣品中的兩種或多種不同的分析物被檢測(cè)時(shí)，或者這 樣的測(cè)定、測(cè)量或評(píng)估也可以是絕對(duì)的。因此，當(dāng)用于定量樣品中的靶標(biāo)分析物（或多種靶 標(biāo)分析物）的情況下，術(shù)語"定量"是指絕對(duì)或相對(duì)定量。絕對(duì)定量可以通過包括已知濃度 (或多個(gè)濃度）的一種或多種對(duì)照分析物和/或?qū)袠?biāo)分析物的檢測(cè)水平與對(duì)照分析物進(jìn) 行對(duì)照（例如，通過生成標(biāo)準(zhǔn)曲線）來實(shí)現(xiàn)。可選地，相對(duì)定量可以通過比較兩種或多種不 同的靶標(biāo)分析物的檢測(cè)水平或量以提供兩種或多種不同的靶標(biāo)分析物中每個(gè)的相對(duì)定量， 即相對(duì)于彼此的量，來實(shí)現(xiàn)。
[0136] "分析物"可以是想要通過本發(fā)明的方法檢測(cè)的任何物質(zhì)（例如分子）或?qū)嶓w。分 析物是本發(fā)明的分析方法的"靶標(biāo)"。因此，分析物可以是希望檢測(cè)的任何生物分子或化學(xué) 化合物，例如，肽或蛋白質(zhì)，或者核酸分子或小分子，包括有機(jī)分子和無機(jī)分子。分析物可以 是細(xì)胞或微生物，包括病毒或者其片段或其產(chǎn)物。因此，可以看出分析物可以是可形成特異 性結(jié)合伴侶（例如，親和結(jié)合伴侶）的任何物質(zhì)或?qū)嶓w。所有要求的是，分析物能夠同時(shí)結(jié) 合至少兩個(gè)結(jié)合伴侶（更具體地，至少兩個(gè)鄰近探針的分析物結(jié)合結(jié)構(gòu)域）?；卩徑结?的分析，如本發(fā)明的分析，在蛋白質(zhì)或多肽的檢測(cè)中是特別有用的。因此，令人特別感興趣 的分析物可以包括蛋白質(zhì)分子，諸如肽、多肽、蛋白質(zhì)或者朊病毒或者包括蛋白質(zhì)或多肽組 分的任何分子，等等，或者它們的片段。在本發(fā)明特別優(yōu)選的【具體實(shí)施方式】中，分析物完全 地或部分地是蛋白質(zhì)分子。分析物可以是含有兩個(gè)或多個(gè)分子亞基的單一分子或復(fù)合物， 所述亞基可以或可以不彼此共價(jià)結(jié)合，并且可以是相同的或不同的。因此，除了細(xì)胞或微 生物，這樣的復(fù)合物分析物也可以是蛋白質(zhì)復(fù)合物。因此，這樣的復(fù)合物可以是均多聚體或 雜多聚體。例如蛋白質(zhì)的分子的聚集體也可以是靶標(biāo)分析物，例如相同蛋白質(zhì)或不同蛋白 質(zhì)的聚集體。分析物也可以是蛋白質(zhì)或肽與諸如DNA或RNA的核酸分子之間的復(fù)合物。令 人特別感興趣的是蛋白質(zhì)與核酸之間的相互作用，例如，調(diào)節(jié)因子，諸如轉(zhuǎn)錄因子和DNA或 RNA。
[0137] 包括所有的生物和臨床樣品，例如生物體的任何細(xì)胞或組織樣品，或者任何體液 或來自其的制劑，以及諸如細(xì)胞培養(yǎng)物、細(xì)胞制劑、細(xì)胞裂解物等的樣品。環(huán)境樣品也包括 在內(nèi)，例如，土壤和水樣品或食物樣品。樣品可以是新鮮制備的，或者它們可以是以任何便 捷的方式被前處理過的，例如用于儲(chǔ)存。
[0138] 因此，代表性的樣品包括任何材料，所述材料可以含有生物分子，或任意其它希望 的分析物或靶標(biāo)分析物，包括例如食物和有關(guān)產(chǎn)品、臨床樣品和環(huán)境樣品。樣品可以是生物 樣品，所述生物樣品可以含有任何病毒或細(xì)胞材料，包括所有原核或真核細(xì)胞、病毒、噬菌 體、支原體、原生質(zhì)體和細(xì)胞器。因此，這樣的生物材料可以包括所有類型的哺乳動(dòng)物細(xì)胞 和非哺乳動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞、包括藍(lán)綠藻的藻類、真菌、細(xì)菌、原生動(dòng)物等。因此，代表性的 樣品包括全血和血衍生物產(chǎn)品、尿液、糞便、腦脊液或任何其它液體（例如，呼吸道分泌物、 唾液、乳汁等）、組織、活體組織切片、細(xì)胞培養(yǎng)物、細(xì)胞混懸液、條件培養(yǎng)基或細(xì)胞培養(yǎng)物成 分的其它樣品等，其中所述全血和血衍生物產(chǎn)品諸如是血漿、血清、白細(xì)胞層、血細(xì)胞?？梢?按照任何便捷或理想的方式對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理以制備用于本發(fā)明的方法中，例如，通過細(xì) 胞裂解或分析物的純化、分離等。
[0139] 用于本發(fā)明方法的鄰近探針包括分析物結(jié)合結(jié)構(gòu)域和核酸結(jié)構(gòu)域，并且實(shí)際上， 它們是（通過分析物結(jié)合結(jié)構(gòu)域）結(jié)合于分析物的檢測(cè)探針，可以通過在這樣的結(jié)合后檢 測(cè)其核酸結(jié)構(gòu)域之間發(fā)生的相互作用來檢測(cè)所述檢測(cè)探針的結(jié)合（以檢測(cè)分析物）。因此， 可以將探針視為核酸標(biāo)記的親和配體或針對(duì)分析物的結(jié)合伴侶，所述分析物結(jié)合結(jié)構(gòu)域是 親和結(jié)合伴侶，并且核酸結(jié)構(gòu)域是核酸標(biāo)記。核酸結(jié)構(gòu)域偶聯(lián)于分析物結(jié)合結(jié)構(gòu)域，并且該 "偶聯(lián)"或連接可以采用本領(lǐng)域已知的任何手段，且其可以是所希望的或便捷的，可以是直 接的或間接的，例如通過連接基團(tuán)。例如，結(jié)構(gòu)域可以通過共價(jià)連接（例如化學(xué)交聯(lián)）或通 過非共價(jià)結(jié)合來彼此相連，例如，通過基于鏈酶親和素-生物素的偶聯(lián)（在一個(gè)結(jié)構(gòu)域上提 供生物素，在另一個(gè)結(jié)構(gòu)域上提供鏈酶親和素）。
[0140] 分析物結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以是針對(duì)靶標(biāo)分析物的任何結(jié)合伴侶，并且可以是針對(duì)其的 直接或間接結(jié)合伴侶。因此，它可以直接結(jié)合于靶標(biāo)分析物，或通過中間分子或結(jié)合于靶標(biāo) 分析物的結(jié)合伴侶來間接地結(jié)合于靶標(biāo)分析物，所述分析物結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合于所述中間分 子（結(jié)合伴侶）。特別地，分析物結(jié)合結(jié)構(gòu)域或中間結(jié)合伴侶是針對(duì)分析物的特異性結(jié)合伴 侶。結(jié)合伴侶是能夠與其靶標(biāo)結(jié)合的任意分子或?qū)嶓w，所述靶標(biāo)例如是靶標(biāo)分析物，并且， 特異性結(jié)合伴侶是能夠特異性結(jié)合于其靶標(biāo)（例如靶標(biāo)分析物）的結(jié)合伴侶，即結(jié)合伴侶 以比樣品中其它組分更高的親和力和/或特異性而結(jié)合于靶標(biāo)（例如分析物）。因此，與靶 標(biāo)分析物的結(jié)合可以區(qū)別于非靶標(biāo)分析物；特異性結(jié)合伴侶不結(jié)合于非靶標(biāo)分析物或可忽 略地或不可檢測(cè)地結(jié)合于非靶標(biāo)分析物，或者任何這樣的非特異性結(jié)合，如果發(fā)生的話，就 可被區(qū)分。靶標(biāo)分析物及其結(jié)合伴侶之間的結(jié)合通常是非共價(jià)的。
[0141] 可以選擇分析物結(jié)合結(jié)構(gòu)域以具有針對(duì)靶標(biāo)分析物的高的結(jié)合親和力。高的結(jié)合 親和力是指至少約1(Γ4Μ，通常至少約1(Γ4Μ或更高，例如1(Γ9Μ或更高。分析物結(jié)合結(jié)構(gòu)域 可以是多種不同類型的分子的任一種，只要它在作為鄰近探針的部分存在時(shí)顯示針對(duì)靶標(biāo) 蛋白的所需的結(jié)合親和力。在其它【具體實(shí)施方式】中，分析物結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以是對(duì)其靶標(biāo)分 析物具有中等或甚至低親和力的配體，例如，小于約1(Γ 4Μ。
[0142] 分析物結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以是小分子配體或大分子配體。小分子配體是指尺寸為約50 至約10, 000道爾頓的配體，通常為約50至約5, 000道爾頓，更通常地為約100至約1000 道爾頓。大分子配體是指尺寸為約10, 〇〇〇道爾頓或分子量更大的配體。
[0143] 小分子可以是能夠以需要的親和力結(jié)合于靶標(biāo)分析物的任何分子，以及它們的結(jié) 合部分或片段。一般地，小分子是能夠結(jié)合于感興趣的靶標(biāo)分析物的有機(jī)小分子。小分子 會(huì)包括與靶標(biāo)分析物結(jié)構(gòu)相互作用所必需的一個(gè)或多個(gè)官能團(tuán)，例如疏水、親水、靜電或甚 至共價(jià)相互作用所需的基團(tuán)。當(dāng)靶標(biāo)分析物是蛋白質(zhì)時(shí)，小分子配體包括與蛋白質(zhì)在結(jié)構(gòu) 上相互作用所需的官能團(tuán)，如氫鍵、疏水-疏水相互作用、靜電相互作用等，并通常包括至 少一個(gè)氨基、酰胺基、巰基、羰基、羥基或羧基，優(yōu)選地至少兩個(gè)化學(xué)官能團(tuán)。小分子還可以 包括一個(gè)這樣的區(qū)域：其可以被修飾和/或參與鄰近探針的核酸結(jié)構(gòu)域的共價(jià)連接，而基 本沒有不利地影響小分子結(jié)合于其靶標(biāo)分析物的能力。
[0144] 小分子親和配體通常包括被一個(gè)或多個(gè)上述官能團(tuán)取代的碳環(huán)或雜環(huán)結(jié)構(gòu)和/ 或芳香或聚芳香結(jié)構(gòu)。此外，令人感興趣的小分子還是在生物分子中發(fā)現(xiàn)的結(jié)構(gòu)，它們的衍 生物、結(jié)構(gòu)類似物或組合，其中在生物分子中發(fā)現(xiàn)的結(jié)構(gòu)包括肽、多糖、脂肪酸、留體、嘌呤、 嘧啶?？梢詫?duì)這樣的化合物進(jìn)行篩選以確定感興趣的化合物，其中多種不同的篩選方案在 本領(lǐng)域是已知的。
[0145] 小分子可以來自由多種來源獲得的天然存在或合成的化合物，包括合成或天然化 合物庫。例如，可以使用許多方法來隨機(jī)和定向合成多種有機(jī)化合物和生物分子，包括隨機(jī) 化的制備寡核苷酸和寡肽?？蛇x地，細(xì)菌、真菌、植物和動(dòng)物提取物形式的天然化合物庫是 可得的或容易制備的。此外，天然或合成制備的庫和化合物容易通過傳統(tǒng)的化學(xué)、物理和生 物化學(xué)手段修飾，并且可以用于制備組合庫。已知的小分子可以進(jìn)行定向或隨機(jī)的化學(xué)修 飾，諸如?；?、烷基化、酯化、酰胺化等，以產(chǎn)生結(jié)構(gòu)類似物。
[0146] 如此，所述的小分子可以從天然存在或合成分子庫中獲得，所述的庫包括通過組 合手段制備的化合物庫，即化合物多樣性組合庫。當(dāng)從這樣的庫中獲得時(shí)，在便捷的結(jié)合 親和力分析中采用的小分子會(huì)顯示對(duì)蛋白質(zhì)靶標(biāo)具有某些理想的親和力。組合庫及其制 備和篩選方法是本領(lǐng)域已知的，并描述于下述美國專利文獻(xiàn)中：US5, 741，713 ;5, 734, 018 ; 5, 731, 423 ；5, 721, 099 ；5, 708, 153 ；5, 698, 673 ；5, 688, 997 ；5, 688, 696 ；5, 684, 711 ； 5, 641, 862 ； ；5, 639, 603 ；5, 593, 853 ；5, 574, 656 ；5, 571, 698 ；5, 565, 324 ；5, 549, 974 ； 5, 545, 568 ; ;5, 541，061 ;5, 525, 735 ;5, 463, 564 ;5, 440, 016 ;5, 438, 119 ;5, 223, 409,這些 專利文獻(xiàn)通過引用整體并入本文。
[0147] 分析物結(jié)合結(jié)構(gòu)域也可以是大分子。特別令人感興趣的大分子分析物結(jié)合結(jié)構(gòu)域 是抗體，及其結(jié)合片段和衍生物或其模擬物。當(dāng)抗體是分析物結(jié)合結(jié)構(gòu)域時(shí)，它們可以來 自多克隆組合物，以使通過從特異性上進(jìn)行區(qū)分的抗體的異種群體各自"標(biāo)記"相同的標(biāo)記 核酸（核酸結(jié)構(gòu)域），或它們可以來自單克隆組合物，其中對(duì)靶標(biāo)分析物具有相同特異性的 相同抗體的同種群體各自標(biāo)記相同的標(biāo)記核酸。因此，分析物結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以是單克隆抗 體或多克隆抗體。在其它【具體實(shí)施方式】中，親和配體是抗體結(jié)合片段或其衍生物或其模擬 物，其中這些片段、衍生物和模擬物對(duì)靶標(biāo)分析物具有所需要的結(jié)合親和力。例如，抗體片 段，諸如？1?( &13)2和？&13，可以通過裂解完整蛋白質(zhì)來制備，例如，通過蛋白酶或化學(xué)裂解 來進(jìn)行裂解。令人感興趣的還有重組地或合成地制備的抗體片段或衍生物，諸如單鏈抗體 或scFvs,或者其它抗體衍生物諸如嵌合抗體或CDR-接枝的抗體，其中該重組地或合成地 制備的抗體片段保留了上述抗體的結(jié)合特性。這樣的抗體片段或衍生物通常至少包括抗體 的V H和 '結(jié)構(gòu)域，以保留主體抗體的結(jié)合特性。本發(fā)明的這樣的抗體片段、衍生物或模擬 物可以使用任何便捷的方法制備，諸如在美國專利第5, 851，829號(hào)和第5, 965, 371號(hào)中公 開的方法；這些專利通過引用整體并入本文。
[0148] 上面描述的抗體、其片段、衍生物和其模擬物可以由商業(yè)來源獲得和/或使用任 何便利的技術(shù)制備，其中制備多克隆抗體，單克隆抗體，它們的片段、衍生物和模擬物的方 法，包括制備它們的重組衍生物的方法，是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。
[0149] 此外，適合用作結(jié)合結(jié)構(gòu)域的是多聚核酸適體。多聚核酸適體可以是RNA寡 核苷酸，其作用是以與受體或抗體相同的方式選擇性地結(jié)合蛋白質(zhì)（Conrad等人， 酶學(xué)方法·（1996),267(組合化學(xué)），336-367) (Conrad et al·，Methods Enzymol. (1996)，267 (Combinatorial Chemistry)，336-367)。在分析物結(jié)合結(jié)構(gòu)域是例如適體的核 酸的特定【具體實(shí)施方式】中，靶標(biāo)分析物并不是核酸。
[0150] 重要的是，分析物結(jié)合結(jié)構(gòu)域是包括如下部分的結(jié)構(gòu)域：該部分能夠共價(jià)連接于 核酸分子結(jié)構(gòu)域而基本不消除分析物結(jié)合結(jié)構(gòu)域?qū)ζ浒袠?biāo)分析物的結(jié)合親和力。
[0151] 除了基于抗體的肽/多肽或基于蛋白質(zhì)的結(jié)合結(jié)構(gòu)域，分析物結(jié)合結(jié)構(gòu)域也可以 是凝集素，可溶性的細(xì)胞表面受體或其衍生物，親和體或來自如下的任意組合衍生的蛋白 質(zhì)或肽：噬菌體展示或核糖體展示或任何類型的組合肽或蛋白質(zhì)庫?？梢允褂萌我夥治鑫?結(jié)合結(jié)構(gòu)域的組合。
[0152] 分析物上的結(jié)合位點(diǎn)可以是相同的或不同的，所述結(jié)合位點(diǎn)是針對(duì)一組中的鄰近 探針的各分析物結(jié)合結(jié)構(gòu)域的。因此，例如在同聚蛋白質(zhì)復(fù)合物或聚集物包括兩種或多種 相同的亞基或蛋白質(zhì)組分的情況下，兩個(gè)或多個(gè)探針的分析物結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以是相同的。 當(dāng)分析物為單一分子或包括不同的亞基或組分時(shí)（例如，異聚復(fù)合物或不同蛋白質(zhì)聚集 體），分析物結(jié)合結(jié)構(gòu)域是不同的。
[0153] 由于鄰近探針的核酸結(jié)構(gòu)域的長度可以構(gòu)建成跨越不同的分子距離，分析物上的 針對(duì)分析物結(jié)合結(jié)構(gòu)域的結(jié)合位點(diǎn)不需要在相同的分子上。它們可以在不同的但是緊挨著 的分子上。例如，可以通過本發(fā)明的方法靶向生物體的多個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域，所述生物體例如是 細(xì)菌或細(xì)胞，或病毒。
[0154] 如上所述，分析物結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以直接或間接地結(jié)合于分析物上。在間接結(jié)合的 情況下，靶標(biāo)分析物可以首先被特異性結(jié)合伴侶（或親和配體）所結(jié)合，并且鄰近探針的分 析物結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以結(jié)合于特異性結(jié)合伴侶。這使得鄰近探針能夠作為通用試劑來設(shè)計(jì)。 例如，分析物特異性結(jié)合伴侶可以是抗體，并且通用鄰近探針可以通過結(jié)合于各種不同的 分析物特異性抗體的Fc區(qū)域而用于檢測(cè)不同的分析物。
[0155] 鄰近探針的兩個(gè)組分通過鍵直接地連接在一起或通過連接基團(tuán)間接地連接在一 起。當(dāng)采用連接基團(tuán)時(shí)，可以選擇這樣的基團(tuán)以提供核酸和分析物結(jié)合結(jié)構(gòu)域通過連接基 團(tuán)進(jìn)行共價(jià)連接，以及維持分析物結(jié)合結(jié)構(gòu)域?qū)ζ浒袠?biāo)分析物理想的結(jié)合親和力。令人感 興趣的連接基團(tuán)可以根據(jù)分析物結(jié)合結(jié)構(gòu)域而有很大不同。在很多【具體實(shí)施方式】中，當(dāng)連 接基團(tuán)存在時(shí)，其是生物惰性的。各種連接基團(tuán)是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，并且在所述鄰 近探針中是有用的。在具有代表性的【具體實(shí)施方式】中，連接基團(tuán)通常為至少約50道爾頓， 通常為至少約100道爾頓，并且可以是1000道爾頓或更大，例如，如果連接基團(tuán)含有間隔 子（spacer)那么可高達(dá)1000000道爾頓，但是通常不會(huì)超過約500道爾頓且通常不超過約 300道爾頓。通常地，這樣的連接物包括間隔子基團(tuán)，該基團(tuán)在任一端以能夠共價(jià)結(jié)合于核 酸或分析物結(jié)合部分的反應(yīng)官能團(tuán)封端。令人感興趣的間隔子基團(tuán)可以包括脂肪族和不飽 和的烴鏈、含有雜原子如氧（醚，如聚乙二醇）或氮（多胺）的間隔子、肽、糖類、可以含有 雜原子的環(huán)狀或非環(huán)狀系統(tǒng)。間隔子基團(tuán)也可以包含結(jié)合于金屬的配體，以使金屬離子與 兩個(gè)或多個(gè)配體配位以形成復(fù)合物。特異性的間隔子元件包括：1，4-二氨基己烷，苯二甲 撐二胺，對(duì)苯二甲酸，3, 6-二氧雜辛烷二酸，乙二胺-N，N-二乙酸，1，Γ -亞乙基雙（5-氧 代-3-吡咯烷羧酸），4, 4'-亞乙基二哌啶?？赡艿姆磻?yīng)官能團(tuán)包括親核官能團(tuán)（胺、醇、 硫醇、酰肼），親電官能團(tuán)（醛、酯、乙烯基酮、環(huán)氧化物、異氰酸酯、馬來酰亞胺），能夠環(huán)加 成反應(yīng)、形成二硫鍵或者結(jié)合于金屬的官能團(tuán)。具體的例子包括伯胺和仲胺，異羥肟酸， N-羥基琥珀酰亞胺酯，N-羥基琥珀酰亞胺基碳酸酯，氧基羰基咪唑，硝基苯基酯，三氟乙基 酯，縮水甘油醚，乙烯基砜和馬來酰亞胺?？捎糜谒鲟徑结樀木唧w的連接基團(tuán)包括雜官 能化合物，諸如疊氮苯甲酰肼、N-[4-(對(duì)疊氮基水楊基氨基）丁基]-3' _[2' -吡啶基二硫 代]丙酰胺）、雙-磺基琥珀酰亞胺辛二酸酯、二亞胺代己二酸二甲酯、二琥珀酰亞胺酒石 酸酯、N-馬來酰亞胺丁?；趸牾啺孵?、N-羥基硫代琥珀酰亞胺基-4-疊氮基苯甲 酸酯、N-琥珀酰亞胺基[4-疊氮基苯基]_1，3'_二硫代丙酸酯、N-琥珀酰亞胺基[4-碘乙 ?；鵠氨基苯甲酸酯、戊二醛和琥珀酰亞氨基-4_[N-馬來酰亞胺甲基]環(huán)己烷-1-羧酸 酯、3-(2-吡啶二硫代）丙酸N-羥基琥珀酰亞胺酯（SH)P)、4-(N-馬來酰亞胺甲基）-環(huán)己 烷-1-羧酸N-羥基琥珀酰亞胺酯（SMCC)以及類似的物質(zhì)。
[0156] 可以使用任何便捷的方法來制備本發(fā)明的方法所采用的鄰近探針。在具有代表 性的【具體實(shí)施方式】中，核酸結(jié)構(gòu)域可以直接或通過連接基團(tuán)綴合于分析物結(jié)合結(jié)構(gòu)域。如 本領(lǐng)域已知的，可以通過官能團(tuán)而將組分彼此共價(jià)連接，其中，這樣的官能團(tuán)可以存在于組 分上或使用一個(gè)或多個(gè)步驟而被引入到組分中，所述步驟例如是氧化反應(yīng)、還原反應(yīng)、裂解 反應(yīng)等。可用于將組分共價(jià)連接到一起以產(chǎn)生鄰近探針的官能團(tuán)包括：羥基、巰基、氨基 等。經(jīng)修飾以提供用于共價(jià)連接的不同組分的具體部分可以經(jīng)選擇以便于基本上不會(huì)不 利地干擾組分對(duì)靶標(biāo)分析物所需的結(jié)合親和力。如果必要和/或需要的話，可以使用如本 領(lǐng)域已知的封閉基團(tuán)來保護(hù)組分的某些部分，參見例如Green和Wuts著，有機(jī)合成中的保 護(hù)基團(tuán)（John Wiley&Sons 出版社）（1991) (Green&Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis(John Wiley&Sons) (1991))。用于產(chǎn)生核酸/抗體綴合物的方法對(duì)本領(lǐng)域技術(shù) 人員是眾所周知的。參見美國專利第5, 733, 523號(hào)，其通過引用而整體并入本文。
[0157] 在其它【具體實(shí)施方式】中，可以使用產(chǎn)生核酸-蛋白質(zhì)綴合物的體外方法來 制備鄰近探針，所述核酸-蛋白質(zhì)綴合物即具有共價(jià)連接至蛋白質(zhì)的核酸的分子， 例如編碼序列，即其中通過載體在體外產(chǎn)生編碼鄰近探針的分析物結(jié)合結(jié)構(gòu)域。這 樣的令人感興趣的體外方法包括：基于R印A的方法（參見Fitzgerald,藥物發(fā) 現(xiàn)·今天（2000)5:253-258(Fitzgerald, Drug Discov.Today(2000)5:253-258)和 國際專利W098/37186)，基于核糖體展示的方法（參見Hanes等人，美國科學(xué)院院 刊（1997)94:4937-42(Hanes et al.，Proc. Natl Acad.Sci. USA(1997)94:4937-42); Roberts,生物化學(xué)當(dāng)代觀點(diǎn)（1999)六月；3:268-73 (Roberts, Curr Opin Chem Biol (1999) Jun ;3:268-73) ;Schaffitzel 等人，免疫學(xué)方法雜志（1999)十二月 10 ; 231:119-35(Schaffitzel et al.，J Immunol Methods(1999)Decl0;231:119-35);和國際 專利 W098/54312)等。
[0158] 在利用夾板寡核苷酸（其可以是第三鄰近探針的核酸結(jié)構(gòu)域）的【具體實(shí)施方式】 中，所述夾板寡核苷酸的功能是介導(dǎo)第一和第二鄰近探針的核酸結(jié)構(gòu)域（即"檢測(cè)"結(jié)構(gòu) 域）之間的相互作用。如上所述，夾板寡核苷酸也可充當(dāng)待延伸的的核酸結(jié)構(gòu)域，產(chǎn)生延伸 產(chǎn)物以根據(jù)本發(fā)明方法而被擴(kuò)增和檢測(cè)。因此，夾板可以視為"連接者"（connector)寡核 苷酸，其作用是使第一和第二鄰近探針的檢測(cè)結(jié)構(gòu)域進(jìn)行連接或"結(jié)合在一起"，如此，它們 可相互作用或可連接在一起?？蛇x地，本發(fā)明的方法并不包括連接反應(yīng)或步驟，特別是分子 間連接，即，其中，第一和第二鄰近探針的核酸結(jié)構(gòu)域是連接在一起的?？蛇x地或另外地，夾 板可以視為核酸結(jié)構(gòu)域或標(biāo)記的可延伸的結(jié)構(gòu)域，或者單獨(dú)的核酸結(jié)構(gòu)域，其充當(dāng)用于延 伸的"引物"以生成用于擴(kuò)增和檢測(cè)的延伸產(chǎn)物。
[0159] 在這些【具體實(shí)施方式】中，夾板與第一和第二鄰近探針的核酸結(jié)構(gòu)域雜交。更具體 地，夾板同時(shí)與至少第一和第二鄰近探針的核酸結(jié)構(gòu)域雜交（退火）。然而，其中，將"夾板" 寡核苷酸預(yù)雜交至至少一個(gè)所述鄰近探針的核酸結(jié)構(gòu)域，它先與一個(gè)鄰近探針的核酸結(jié)構(gòu) 域雜交，再與另一個(gè)雜交。然而，優(yōu)選地，"夾板"將與兩個(gè)鄰近探針的核酸結(jié)構(gòu)域同時(shí)雜交 以形成能夠被延伸的穩(wěn)定復(fù)合物。
[0160] 當(dāng)夾板寡核苷酸作為第三鄰近探針的核酸結(jié)構(gòu)域提供時(shí)，所有鄰近探針組的核酸 結(jié)構(gòu)域的這種相互雜交提高了結(jié)合于靶標(biāo)分析物后的探針-靶標(biāo)復(fù)合物的親和力。通過支 持產(chǎn)生信號(hào)的鄰近探針-靶標(biāo)分析物復(fù)合物的形成，該親和力的影響有助于提高分析的靈 敏性。
[0161] 本文所用的術(shù)語"雜交（hybridisation) "和"雜交（hybridise) "是指核苷酸序列 之間的雙鏈體的形成，所述核苷酸序列足夠互補(bǔ)以通過沃森-克里克堿基配對(duì)來形成雙鏈 體。當(dāng)兩個(gè)核苷酸序列具有堿基配對(duì)組織同源性時(shí)，兩個(gè)核苷酸序列彼此"互補(bǔ)"。"互補(bǔ)" 的核苷酸序列在合適的雜交條件下將特異性地結(jié)合以形成穩(wěn)定的雙鏈體。例如，當(dāng)?shù)谝恍?列的一部分可以按照反式平行的方式結(jié)合于第二序列的一部分時(shí)，兩個(gè)序列是互補(bǔ)的，其 中每個(gè)序列的3'端結(jié)合于另一個(gè)序列的5'端，并且一個(gè)序列的每個(gè)A、T(U)、G和C與另 一個(gè)序列的T (U)、A、C和G分別配對(duì)。RNA序列也可以包括互補(bǔ)的A = U或U = A堿基對(duì)。 因此，在本發(fā)明中，兩個(gè)序列不需要為了"互補(bǔ)"而具有完美的同源性。通常當(dāng)至少約80% (優(yōu)選至少約90%，且最優(yōu)選至少約95% )的核苷酸在限定長度的分子或結(jié)構(gòu)域上具有確 定互補(bǔ)的堿基對(duì)組織時(shí)，兩個(gè)序列是充分互補(bǔ)的。因此，第一和第二鄰近探針的核酸結(jié)構(gòu)域 含有對(duì)另一個(gè)鄰近探針的核酸結(jié)構(gòu)域互補(bǔ)的區(qū)域?？蛇x地，當(dāng)使用夾板寡核苷酸時(shí)，第一和 第二鄰近探針含有與夾板寡核苷酸（可能存在于第三鄰近探針上）互補(bǔ)的區(qū)域，反過來說， 夾板寡核苷酸含有對(duì)第一和第二鄰近探針的每個(gè)核酸結(jié)構(gòu)域互補(bǔ)的區(qū)域。
[0162] 互補(bǔ)的區(qū)域（S卩，雜交區(qū)域）的長度范圍是4_30bp，例如6-20、6-18、7_15或 8-12bp〇
[0163] 夾板核苷酸的長度通常足以提供第一和第二探針的核酸結(jié)構(gòu)域進(jìn)行如上文所述 的同時(shí)結(jié)合。在具有代表性的【具體實(shí)施方式】中，夾板寡核苷酸的長度范圍是約6至約500 個(gè)核苷酸，包括約20至約40個(gè)核苷酸，例如約25至約30個(gè)核苷酸。
[0164] 如上所述，第一和第二鄰近探針的核酸結(jié)構(gòu)域之間的相互作用主要是雙鏈體的形 成，其中，核酸結(jié)構(gòu)域的一個(gè)或兩個(gè)都可以被延伸，特別是使用另一個(gè)鄰近探針的核酸結(jié)構(gòu) 域作為模板進(jìn)行模板導(dǎo)向的延伸。這會(huì)導(dǎo)致形成完全雙鏈的核酸，例如其中兩個(gè)結(jié)構(gòu)域完 全延伸，或?qū)е滦纬刹糠蛛p鏈的分子，例如僅有一條單鏈延伸或兩條鏈部分的延伸。因此， 一個(gè)或兩個(gè)核酸結(jié)構(gòu)域的延伸可以被認(rèn)為是各自結(jié)構(gòu)域的"接合"，例如，由兩條單鏈的分 子產(chǎn)生一個(gè)雙鏈核酸。
[0165] 在其它【具體實(shí)施方式】中，該"接合"可以是連接，特別地，其中，例如，第一鄰近探針 的核酸結(jié)構(gòu)域被延伸以使其3'端與第二鄰近探針的5'端鄰近，以使得兩個(gè)結(jié)構(gòu)域模板導(dǎo) 向連接，即分子間連接。在這種情況下，可清楚理解的是，連接模板可以由夾板提供，所述夾 板可以形成核酸結(jié)構(gòu)域之一的部分，或可以在溶液中分別游離地被提供，或作為第三鄰近 探針的核酸結(jié)構(gòu)域提供。這樣的連接可以使用連接酶進(jìn)行，所述連接酶可以在聚合酶介導(dǎo) 的第一鄰近探針的核酸結(jié)構(gòu)域的延伸之后加入反應(yīng)中。
[0166] 因此，在本發(fā)明方法的優(yōu)選的【具體實(shí)施方式】中，第一和第二探針的核酸結(jié)構(gòu)域可 以借助這樣的反應(yīng)而連接：該反應(yīng)由雜交的夾板而被模板化，使所述核酸結(jié)構(gòu)域連接（在 其中一個(gè)核酸結(jié)構(gòu)域延伸后），并且對(duì)"連接"產(chǎn)物進(jìn)行擴(kuò)增和檢測(cè)，所述"連接"產(chǎn)物也是 延伸產(chǎn)物。因此，在這樣的【具體實(shí)施方式】中，夾板可以視為"夾板模板"或"連接模板"或"夾 板寡核苷酸"。在這樣的【具體實(shí)施方式】中，還可以延伸夾板以產(chǎn)生另外的"延伸產(chǎn)物"，對(duì)所 述"延伸產(chǎn)物"進(jìn)行擴(kuò)增和檢測(cè)。
[0167] 在一些【具體實(shí)施方式】中，本發(fā)明的方法不包括連接步驟或反應(yīng)。更具體地，本發(fā)明 不包括分子間連接。
[0168] 如上所述，為了使核酸結(jié)構(gòu)域之間發(fā)生各種相互作用，第一和第二鄰近探針的核 酸結(jié)構(gòu)域需要按照特定的方向來偶聯(lián)到分析物結(jié)合結(jié)構(gòu)域上。例如，為了延伸兩個(gè)包括單 鏈核酸的結(jié)構(gòu)域，每個(gè)核酸結(jié)構(gòu)域必須通過其5'端偶聯(lián)到分析物結(jié)合結(jié)構(gòu)域，留下游離的 3'羥基端，當(dāng)鄰近時(shí)，所述3'羥基端可以"退火"或"雜交"。然而，為了單一結(jié)構(gòu)域的延伸 和/或兩個(gè)結(jié)構(gòu)域的綴合，通常（雖然不是必須的，參見圖1的版本4)通過5'端偶聯(lián)第一 鄰近探針的核酸結(jié)構(gòu)域（留下可以被延伸的游離的3'羥基端），而另外的結(jié)構(gòu)域可以通過 其3'端偶聯(lián)（留下游離的5'磷酸酯端，其不能使用傳統(tǒng)聚合酶來延伸）。
[0169] 在核酸結(jié)構(gòu)域是可連接的【具體實(shí)施方式】中，第一和第二核酸結(jié)構(gòu)域各自雜交于夾 板或其中一個(gè)鄰近探針的核酸結(jié)構(gòu)域是部分雙鏈的，其具有單鏈突出段，另一個(gè)鄰近探針 的核酸結(jié)構(gòu)域雜交于該突出段的結(jié)構(gòu)域。隨后可以將具有3'端的結(jié)構(gòu)域通過模板導(dǎo)向的延 伸來延伸至另一個(gè)結(jié)構(gòu)域的5'磷酸酯，其中可以利用連接酶將兩條鏈結(jié)合在一起。因此， 3'和5'端不立即在各自彼此鄰近地在夾板（模板）上雜交，而是雜交于夾板，在它們之間 留下空間（或一段核苷酸）。
[0170] 兩端之間的間隔或空間或一段核苷酸的長度范圍是約8至約1000個(gè)核苷酸，其 中，在特定的【具體實(shí)施方式】中，長度范圍是約8至約500個(gè)核苷酸，包括約8至約250個(gè)核 苷酸，例如約8至約160個(gè)核苷酸，諸如約12至約150個(gè)核苷酸，約14至約130個(gè)核苷酸， 約16至約110個(gè)核苷酸，約8至約90個(gè)核苷酸，約12至約80個(gè)核苷酸，約14至約75個(gè)核 苷酸，約16至約70個(gè)核苷酸，約16至約60個(gè)核苷酸，等等。在特定的代表性具體實(shí)施方 式中，核酸結(jié)構(gòu)域的長度范圍是約10至約80個(gè)核苷酸，約12至約75個(gè)核苷酸，約14至約 70個(gè)核苷酸，約34至約60個(gè)核苷酸，和以及上述長度范圍間的任何長度。在一些具體實(shí)施 方式中，核酸結(jié)構(gòu)域的長度通常不超過約28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、 42、44、46、50、55、60、65 或 70 個(gè)核苷酸。
[0171] 因此，夾板可以包括與5'游離鄰近探針的核酸結(jié)構(gòu)域互補(bǔ)的第一 3'區(qū)域，和與 3'游離鄰近探針的核酸結(jié)構(gòu)域互補(bǔ)的第二5'區(qū)域。夾板的第一和第二區(qū)域的長度可以是 3至20,6至17,6至15或6至12或8至12個(gè)核苷酸，例如，約13至17,12至16,11至15 或12至14個(gè)核苷酸，或者約6至12, 7至11或8至10個(gè)核苷酸。
[0172] 如以下將更詳細(xì)地描述的，連接/延伸產(chǎn)物的擴(kuò)增在檢測(cè)過程之前或與檢測(cè)過程 同時(shí)進(jìn)行。因此，在一些【具體實(shí)施方式】中，所希望的是，設(shè)計(jì)夾板以盡量減少在這樣的步驟 中可能發(fā)生的任何假擴(kuò)增，例如，夾板充當(dāng)擴(kuò)增中使用的聚合酶的模板的任何可能性。因 此，例如，夾板可以作為RNA寡核苷酸或DNA/RNA雜交體而被提供；通常用于擴(kuò)增反應(yīng)的聚 合酶，例如Taq聚合酶、Pfu聚合酶、Pwo聚合酶，不能使用RNA模板。可選地，使用具有兩個(gè) 短雜交區(qū)域的DNA夾板可實(shí)現(xiàn)類似的效果；由于雜交是弱的，因此這樣的夾板將不能在PCR 所使用的高溫條件下模板化DNA聚合反應(yīng)。
[0173] 可選地，在其它優(yōu)選的【具體實(shí)施方式】中，使夾板有利地延伸以產(chǎn)生如上所定義的 延伸產(chǎn)物，根據(jù)本發(fā)明的方法對(duì)該延伸產(chǎn)物自身進(jìn)行擴(kuò)增與檢測(cè)。
[0174] 在特定的【具體實(shí)施方式】中，可針對(duì)兩種或多種不同的靶標(biāo)分析物來分析樣品。在 這樣的【具體實(shí)施方式】中，針對(duì)每個(gè)靶標(biāo)分析物，使樣品接觸一組鄰近探針，如此，與樣品接 觸的組的數(shù)目會(huì)是兩組或多組，例如，三組或多組，四組或多組等。這樣的方法在多重的或 高通量的應(yīng)用中是特別有用。
[0175] 可以選擇加入到樣品中的鄰近探針的量用以提供反應(yīng)混合物中足夠低濃度的鄰 近探針，以便確保鄰近探針在沒有結(jié)合到靶標(biāo)分析物時(shí)將不會(huì)隨機(jī)地彼此緊密鄰近，至少 不會(huì)達(dá)到緊密鄰近到任何大的或?qū)嵸|(zhì)的程度。因此，目的是，僅當(dāng)鄰近探針通過鄰近探針的 分析物結(jié)合結(jié)構(gòu)域與分析物的結(jié)合位點(diǎn)之間的結(jié)合相互反應(yīng)而結(jié)合分析物時(shí)，鄰近探針彼 此緊密鄰近。
[0176] 然而，已經(jīng)令人吃驚地發(fā)現(xiàn)，加入室溫下無活性或具有最小活性的聚合酶可以減 少未結(jié)合于靶標(biāo)分析物的鄰近探針之間的相互作用所產(chǎn)生的延伸產(chǎn)物的數(shù)目，這可能是暫 時(shí)的。在這方面，在聚合酶存在的情況下，在聚合酶無活性或具有最小活性的條件下，鄰近 探針可以相互作用。因此，不需要例如通過加入其它組分，來打破反應(yīng)混合物的平衡，以提 供聚合酶活性，并且聚合酶可優(yōu)先與穩(wěn)定的雙鏈體結(jié)合，所述穩(wěn)定的雙鏈體即結(jié)合于靶標(biāo) 分析物的鄰近探針的核酸結(jié)構(gòu)域之間形成的雙鏈體。因此，在本發(fā)明的方法中，有可能使用 之前在基于鄰近的檢測(cè)分析中不能使用的鄰近探針的濃度。當(dāng)鄰近探針的分析物結(jié)合結(jié)構(gòu) 域?qū)Π袠?biāo)分析物具有中度或低親和力時(shí)，這是特別有利的，并且因此在更高的濃度下需要 如此。
[0177] 已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了其它預(yù)料之外的優(yōu)點(diǎn)，其中分析也包括具有3'核酸外切酶活性的組 分，例如也具有3'核酸外切酶活性的在室溫下無活性或具有最小活性的聚合酶。據(jù)認(rèn)為， 通過降解具有游離且未受保護(hù)的3'端的核酸結(jié)構(gòu)域，可以減少未結(jié)合于靶標(biāo)分析物的鄰近 探針的相互作用的數(shù)目。在這方面，這樣的相互作用不如結(jié)合于靶標(biāo)分析物的探針之間的 相互作用穩(wěn)定，因此是暫時(shí)的。因此，通過具有3'核酸外切酶活性的組分對(duì)所述未結(jié)合的 鄰近探針進(jìn)行降解。因此，在本發(fā)明的方法中，有可能使用之前在基于鄰近的檢測(cè)分析中不 能使用的鄰近探針的濃度。當(dāng)鄰近探針的分析物結(jié)合結(jié)構(gòu)域?qū)Π袠?biāo)分析物具有中度或低親 和力時(shí)，這是特別有利的，并且因此在更高的濃度下需要如此。
[0178] 在本發(fā)明方法的【具體實(shí)施方式】中，還發(fā)現(xiàn)了其它的優(yōu)點(diǎn)，其中，一個(gè)或多個(gè)鄰近探 針是展開鄰近探針，包含具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的核酸結(jié)構(gòu)域。可以相信的是，展開鄰近探針也可減 少未結(jié)合于靶標(biāo)分析物的鄰近探針之間的相互作用的數(shù)目。只在穩(wěn)定的條件下，例如當(dāng)兩 個(gè)探針都結(jié)合于靶標(biāo)分析物時(shí)，展開鄰近探針的核酸結(jié)構(gòu)域可與其它鄰近探針的核酸結(jié)構(gòu) 域相互作用。因此，使用展開鄰近探針也使得有可能使用之前在基于鄰近的檢測(cè)分析中不 能使用的鄰近探針的濃度。如上所述，當(dāng)鄰近探針的分析物結(jié)合結(jié)構(gòu)域?qū)Π袠?biāo)分析物具有 中度或低親和力時(shí)，這是特別有利的，并且因此在更高的濃度下需要如此。
[0179] 在具有代表性的【具體實(shí)施方式】中，在與樣品組合后，反應(yīng)混合物中的鄰近探針的 濃度范圍是約lfM至1 μ M，諸如約ΙρΜ至約InM，包括約ΙρΜ至約ΙΟΟηΜ。
[0180] 在樣品和鄰近探針組進(jìn)行組合后，如果分析物存在于樣品中，可以將反應(yīng)混合物 培養(yǎng)一段時(shí)間，該時(shí)間足夠使鄰近探針結(jié)合靶標(biāo)分析物。在代表性的【具體實(shí)施方式】中，可以 在約4°C至約50°C，優(yōu)選約4°C至約40°C，包括約20°C至約37°C的溫度下，將產(chǎn)物混合物 (反應(yīng)混合物或分析混合物）培養(yǎng)約5分鐘至約48小時(shí)的一段時(shí)間，包括約30分鐘至約 12小時(shí)。反應(yīng)混合物維持的條件應(yīng)進(jìn)行優(yōu)化以促進(jìn)鄰近探針與分析物的特異性結(jié)合，同時(shí) 抑制非特異性相互作用。條件應(yīng)使得在上述的核酸結(jié)構(gòu)域之間能有效的和特異的雜交。
[0181] 在鄰近探針在上述聚合酶存在下進(jìn)行培養(yǎng)的【具體實(shí)施方式】中，在使聚合酶活性最 小化的條件下，將聚合酶加入反應(yīng)混合物中，和/或，培養(yǎng)反應(yīng)混合物。因此，在一些具體實(shí) 施方式中，在低于40°C的溫度下，優(yōu)選低于35°C或30°C的溫度下，加入聚合酶，和/或，培養(yǎng) 反應(yīng)混合物。在特別優(yōu)選的【具體實(shí)施方式】中，在室溫或更低的條件下，即25°C或更低，例如 24、23、21、20°C或更低，培養(yǎng)包含聚合酶的反應(yīng)混合物。
[0182] 在一些【具體實(shí)施方式】中，鄰近探針是凍干的。在本發(fā)明的一個(gè)方面，所述凍干的鄰 近探針在接觸含分析物的樣品之前是再水化的。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的方面，凍干鄰近探 針在加入含靶標(biāo)分析物的樣品時(shí)是在水化的。
[0183] 在特定的【具體實(shí)施方式】中，至少在鄰近探針結(jié)合于靶標(biāo)分析物的培養(yǎng)步驟期間， 減小培養(yǎng)混合物的有效體積，假設(shè)靶標(biāo)分析物存在于樣品中。在這些【具體實(shí)施方式】中，可出 于多種原因而減小培養(yǎng)混合物的有效體積。在特定的【具體實(shí)施方式】中，減小培養(yǎng)混合物的 有效體積以使用中度或低親和力分析物結(jié)合結(jié)構(gòu)域和/或提高分析的敏感性。例如，在一 些特定的【具體實(shí)施方式】中，當(dāng)培養(yǎng)混合物的有效體積減小時(shí)，分析物結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以是中 度或低親和力結(jié)合劑，借此意味著分析物結(jié)合結(jié)構(gòu)域?qū)λ鼈兊撵霕?biāo)分析物的親和力小于約 1(Γ 4Μ，諸如約InM Kd。在特定的【具體實(shí)施方式】中，可以提高分析的靈敏度，以便分析可以檢 測(cè)1 μ 1樣品中少至約100個(gè)或更少的靶標(biāo)分析物，包括1 μ 1樣品中少至約75個(gè)或更少的 靶標(biāo)分析物，包括1 μ 1樣品中少至約50個(gè)或更少的靶標(biāo)分析物。
[0184] 在特定【具體實(shí)施方式】中，在上述培養(yǎng)步驟的過程中，在混合物中包括"加濃試劑" 或"體積排阻劑"，例如，用來在鄰近探針與其靶標(biāo)分析物結(jié)合的過程中降低培養(yǎng)混合物的 有效體積。典型地，"加濃試劑"是水溶性的大分子材料。適合的大分子材料廣泛地包括 平均分子量為約1500至幾百萬的生物相容的天然或合成聚合物，所述聚合物不與混合物 中的其它試劑或產(chǎn)物特異性地相互作用。這樣的聚合物在本領(lǐng)域中稱為"體積排阻劑"，因 為其主要功能是占據(jù)體外反應(yīng)介質(zhì)中的體積并為生化反應(yīng)提供高度濃縮的環(huán)境，例如接近 于體內(nèi)條件的環(huán)境。體積排阻聚合物當(dāng)然必須足夠可溶以提供所需的濃度。合適的典型 聚合物包括但不限于：市售的聚乙二醇（PEG),例如具有高于約2000的平均分子量的聚乙 二醇聚合物，F(xiàn)IC0LL聚合物如具有約70, 000的平均分子量的那些，牛血漿白蛋白，糖原， 聚乙烯吡咯烷酮，葡聚糖，例如交聯(lián)葡聚糖sephadex?，等等。在具有代表性的具體實(shí)施 方式中，采用了更高分子量的PEG聚合物，特別是分別具有約1450、3000-3700、6000-7500 和 15, 000-20, 000 的平均分子量的 PEG1450、PEG3350、PEG6000 (也作為 PEG8000 出售）和 PEG20,000。具有代表性的【具體實(shí)施方式】中采用了 PEG6000和PEG8000。在具有代表性的具 體實(shí)施方式中，培養(yǎng)反應(yīng)中的體積排阻聚合物的濃度根據(jù)聚合物的類型及其分子量落入約 5% w/v至約45% w/v的范圍。一般地，所希望的是，給定類型的更高的分子量的聚合物需 要以比相同類型的分子量較低的聚合物更低的濃度存在，以實(shí)現(xiàn)酶活性的相同效果。
[0185] 在優(yōu)選的【具體實(shí)施方式】中，加濃試劑或體積排阻劑是交聯(lián)葡聚糖。在特別優(yōu)選的

【具體實(shí)施方式】中，交聯(lián)葡聚糖是G-100型。
[0186] 在采用體積排阻劑的那些【具體實(shí)施方式】中，在方法的下一步驟之前，可以由于存 在體積排阻劑而根據(jù)存在的體積排阻劑的量、稀釋流體的性質(zhì)等將培養(yǎng)混合物稀釋，例如 稀釋到至少約2倍或更多，如至少約5倍或更多，包括至少約10倍或更多，其中，在具有代 表性的【具體實(shí)施方式】中，稀釋流體是水，或者水和一種或多種溶質(zhì)的其它的合適的水性流 體，所述溶質(zhì)例如是鹽、緩沖劑等。
[0187] 作為體積排阻劑的替代，或在使用體積排阻劑的同時(shí)，可以通過將一部分水從培 養(yǎng)混合物中除去，來減少培養(yǎng)混合物在培養(yǎng)過程中的體積，例如通過蒸發(fā)。在這些具體實(shí) 施方式中，根據(jù)需要，流體的體積可以減少至少約2倍或更多，如至少約5倍或更多，包括 至少10倍或更多。重要的是，在這些【具體實(shí)施方式】中，并非所有的水均從培養(yǎng)混合物中除 去。可以采用任何便捷的方法，通過從培養(yǎng)混合物中除去選擇的部分的水，來減小培養(yǎng)混 合物的體積?？梢圆捎猛ㄟ^監(jiān)測(cè)和調(diào)節(jié)濕度與溫度來控制蒸發(fā)的儀器，其中在某些具體實(shí) 施方式中，培養(yǎng)混合物的體積被監(jiān)測(cè)，例如通過連續(xù)測(cè)量培養(yǎng)混合物的體積來進(jìn)行監(jiān)測(cè)，其 中，當(dāng)適當(dāng)?shù)卣舭l(fā)時(shí)，可以加入如上所述聚合酶和PCR混合物。根據(jù)需要，可以使用加熱塊 來加快蒸發(fā)，優(yōu)選地，如果反應(yīng)混合物中存在聚合酶，那么在使聚合酶活性最小化的溫度條 件下，使用加熱塊來加快蒸發(fā)。可選地，通過將水過濾掉，可以減小培養(yǎng)混合物的體積。在 具有代表性的【具體實(shí)施方式】中，使用體積排阻過濾器來選擇性地容納尺寸大于臨界值的分 子，而較小的分子和水將通過過濾器而被除去。施加于溶液使其通過過濾器的力可以通過 離心或真空抽吸而達(dá)到。
[0188] 當(dāng)鄰近探針的結(jié)合結(jié)構(gòu)域與分析物結(jié)合時(shí)，鄰近探針的核酸結(jié)構(gòu)域互相緊密鄰 近。因此，第一和第二鄰近探針的核酸結(jié)構(gòu)域能夠彼此直接雜交或間接雜交，所述間接雜交 例如是通過夾板間接雜交。
[0189] 當(dāng)存在時(shí)，夾板可以在鄰近探針之如、與鄰近探針冋時(shí)或在鄰近探針之后加入樣 品中。在一個(gè)【具體實(shí)施方式】中，夾板預(yù)先雜交至鄰近探針。在另一個(gè)【具體實(shí)施方式】中，夾板 寡核苷酸形成了鄰近探針的核酸結(jié)構(gòu)域的一部分。在另一個(gè)【具體實(shí)施方式】中，夾板寡核苷 酸可以以第三鄰近探針的形式偶聯(lián)至分析物結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中，優(yōu)選地，將其與第一和第二 鄰近探針同時(shí)加入。
[0190] 樣品與鄰近探針組合后，可將樣品稀釋，優(yōu)選地，通過加入延伸反應(yīng)的酶組分和/ 或非酶組分，例如緩沖液、鹽、核苷酸等，但是不加入具有3'核酸外切酶活性的組分，來將樣 品稀釋，但是如果具有3'核酸外切酶活性的組分以室溫下無活性或具有最小活性的聚合酶 的形式存在，那么可將其加入。在優(yōu)選的【具體實(shí)施方式】中，稀釋還可包括用于擴(kuò)增反應(yīng)的試 齊U，例如緩沖液、鹽、核苷酸、引物和聚合酶。稀釋步驟的作用是降低未結(jié)合鄰近探針之間相 互作用的可能性和/或它們與樣品中其它組分相互作用的可能性。
[0191] 稀釋還可以破壞結(jié)合的探針的核酸結(jié)構(gòu)域之間的相互作用。然而，由于結(jié)合的探 針緊密鄰近，因此在合適的條件下將使被破壞的任何相互作用穩(wěn)定化（即重新退火或重新 雜交）。因此，在一個(gè)【具體實(shí)施方式】中，樣品可以被培養(yǎng)更長的一段時(shí)間，該時(shí)間足以使結(jié)合 的鄰近探針之間的相互作用穩(wěn)定化。在具有代表性的【具體實(shí)施方式】中，在約4°C至約50°C， 優(yōu)選約4°C至約40°C，包括約20°C至約37°C的溫度下，可將產(chǎn)物混合物培養(yǎng)約1分鐘至約 48小時(shí)的一段時(shí)間，包括約5分鐘至約12小時(shí)。應(yīng)當(dāng)對(duì)反應(yīng)混合物培養(yǎng)的條件進(jìn)行優(yōu)化， 以維持鄰近探針與分析物的特異性結(jié)合，同時(shí)抑制非特異性相互作用。條件也應(yīng)使得在上 述的核酸結(jié)構(gòu)域之間發(fā)生有效的和特異性的雜交。
[0192] 在上述聚合酶存在的情況下鄰近探針被重新培養(yǎng)的【具體實(shí)施方式】中，可在使聚合 酶活性最小化的條件下對(duì)反應(yīng)混合物進(jìn)行培養(yǎng)。因此，在一些【具體實(shí)施方式】中，可在低于 40°C的溫度下，優(yōu)選低于35°C或30°C的溫度下培養(yǎng)反應(yīng)混合物。在特別優(yōu)選的具體實(shí)施方 式中，可在室溫或更低的溫度下，即25°C或更低，例如24°C、23°C、21°C、20°C或更低，重現(xiàn) 培養(yǎng)含有聚合酶的反應(yīng)混合物。
[0193] 在一些【具體實(shí)施方式】中，在已經(jīng)對(duì)鄰近探針進(jìn)行培養(yǎng)以與靶標(biāo)分析物相互作用之 后，或者在已經(jīng)對(duì)鄰近探針進(jìn)行重現(xiàn)培養(yǎng)以使結(jié)合于靶標(biāo)分析物的鄰近探針的核酸結(jié)構(gòu)域 之間的相互作用穩(wěn)定之后，將室溫下無活性或具有最小活性的聚合酶加入到反應(yīng)混合物 中。優(yōu)選地，在使聚合酶活性最小化的條件下，將聚合酶加入到反應(yīng)混合物中。因此，在一些

【具體實(shí)施方式】中，在低于40°C的溫度下，優(yōu)選低于35°C或30°C的溫度下，加入聚合酶。在一 些特別優(yōu)選的【具體實(shí)施方式】中，在室溫或更低的溫度下，即25°C或更低，例如24°C、23°C、 21 °C、20°C或更低，可將聚合酶加入反應(yīng)混合物中。例如，可在15°C、10°C或5°C或更低的溫 度下，加入聚合酶。
[0194] 在一些【具體實(shí)施方式】中，將聚合酶與其它組分一起加入反應(yīng)混合物中，所述其它 組分例如是用于本文別處所述方法的延伸、擴(kuò)增和/或檢測(cè)步驟的組分。
[0195] 在一些【具體實(shí)施方式】中，在聚合酶活性最小的條件下將聚合酶和/或其它組分加 入之后，可使反應(yīng)混合物均衡，所述條件例如是聚合酶加入到樣品中的條件。這可以起到穩(wěn) 定結(jié)合于靶標(biāo)分析物的鄰近探針核酸結(jié)構(gòu)域之間的相互作用的作用。因此，在約4°C至約 30°C，優(yōu)選約4°C至約25°C，包括約20°C至約25°C的溫度下，可使反應(yīng)混合物均衡約1分鐘 至約1小時(shí)的一段時(shí)間，包括約5分鐘至約30分鐘。
[0196] 一些方法包括具有3'核酸外切酶活性的組分并且在培養(yǎng)探針與樣品的步驟之后 將擴(kuò)增試劑加入樣品中，在這樣的方法的【具體實(shí)施方式】中，優(yōu)選的是，例如如上所述通過引 物的3'端進(jìn)行修飾，來保護(hù)引物的3'核酸外切酶活性。在進(jìn)一步優(yōu)選的【具體實(shí)施方式】中， 可選地或另外地，引物可以是熱起始PCR引物，例如，莖環(huán)引物。在一個(gè)優(yōu)選的具體實(shí)施方 式中，使用同一聚合酶來延伸鄰近探針的核酸結(jié)構(gòu)域并擴(kuò)增延伸產(chǎn)物。在另一優(yōu)選的具體 實(shí)施方式中，緩沖液和/或鹽活化加入樣品中的所有酶。
[0197] 在一些【具體實(shí)施方式】中，在延伸步驟完成之后，將等分的反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)移到新的 容器中以擴(kuò)增和檢測(cè)。單獨(dú)的反應(yīng)容器可包含另一聚合酶（和反應(yīng)組分），諸如，如下進(jìn)一 步限定的嗜熱聚合酶。
[0198] 一些方法包含與室溫下無活性或具有最小活性的聚合酶分開的且具有3'核酸外 切酶活性的組分，在該方法的【具體實(shí)施方式】中，在任何稀釋步驟之后，具有3'核酸外切酶活 性的組分與樣品接觸。該步驟可包括進(jìn)一步稀釋樣品，例如，加入具有合適緩沖液的組分和 /或其它鹽/組分。如上所述，具有3'核酸外切酶活性的組分可以在延伸反應(yīng)所需的聚合 酶之前加入，或與之同時(shí)加入。在優(yōu)選的【具體實(shí)施方式】中，用于本發(fā)明方法的聚合酶還具 有3'核酸外切酶活性?？稍诤线m的條件下進(jìn)一步培養(yǎng)樣品，以使3'核酸外切酶活性作用 在未結(jié)合鄰近探針的核酸結(jié)構(gòu)域。如果樣品中存在聚合酶，那么所述條件還應(yīng)當(dāng)有利于核 酸結(jié)構(gòu)域的延伸。在一些【具體實(shí)施方式】中，可在具有3'核酸外切酶活性的組分之后加入聚 合酶，其中可以進(jìn)一步培養(yǎng)樣品以產(chǎn)生延伸產(chǎn)物。培養(yǎng)條件將取決于反應(yīng)所用的組分，且一 些典型的條件如上所述。然而，在一些【具體實(shí)施方式】中，用于延伸核酸結(jié)構(gòu)域的聚合酶是如 上定義的超嗜熱聚合酶，例如，修飾的Taq聚合酶、Pfu DNA聚合酶、Pwo DNA聚合酶，在該 方法的核酸外切酶和/或延伸階段可優(yōu)選其它反應(yīng)條件，特別是溫度條件。例如，用于延伸 反應(yīng)的、且如果聚合酶還具有3'核酸外切酶活性則也用于核酸外切酶反應(yīng)的溫度的范圍是 約25°C至約80°C，包括約25°C至約75°C，約30°C至約65°C，或約40°C至約60°C，最優(yōu)選約 45°C 至約 55°C。
[0199] 產(chǎn)生延伸產(chǎn)物之后，具有3'核酸外切酶活性的組分會(huì)滅活。在優(yōu)選的具體實(shí)施方 式中，通過熱變性，例如65-80°C 10分鐘，而使3'核酸外切酶活性喪失，雖然明顯的是所需 的條件會(huì)根據(jù)組分的性質(zhì)而不同，例如，通過上述條件不會(huì)使包括3'核酸外切酶的超嗜熱 聚合酶失去活性。在一些【具體實(shí)施方式】中，熱失活可能是擴(kuò)增反應(yīng)的第一步。
[0200] 在鄰近探針與樣品接觸的步驟之后，或者在分析的延伸步驟之前，如果不將擴(kuò)增 反應(yīng)物加入到樣品，那么所述反應(yīng)物將在該階段與樣品接觸。在優(yōu)選的【具體實(shí)施方式】中，將 等分的樣品轉(zhuǎn)移到包含擴(kuò)增組分的新容器中，以擴(kuò)增和檢測(cè)。在該方面，具有3'核酸外切 酶活性的組分滅活之后，引物不需要抗3'核酸外切酶活性。即使具有3'核酸外切酶活性 的組分不滅活，只要包含延伸產(chǎn)物的等份只含有最低3'核酸外切酶活性，那么也允許使用 不抗3'核酸外切酶活性的引物。
[0201] 在一些【具體實(shí)施方式】中，能夠延伸鄰近探針的核酸結(jié)構(gòu)域的聚合酶也可用于擴(kuò)增 反應(yīng)，例如，如果聚合酶是上述超嗜熱聚合酶，例如Pfu DNA聚合酶、Pwo DNA聚合酶、修飾 的Taq聚合酶等。
[0202] 如果在鄰近探針與樣品接觸的步驟之后將擴(kuò)增試劑加入到樣品中，那么有可能直 接進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。在優(yōu)選的【具體實(shí)施方式】中，將等分的反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)移到新容器以擴(kuò)增和 檢測(cè)。
[0203] 通常，可以采用能夠檢測(cè)鄰近相互作用存在的任何便捷的方法。檢測(cè)方法可以是 或可以不需要分離步驟。
[0204] 在一個(gè)具有代表性的【具體實(shí)施方式】中（本發(fā)明方法的其它具有代表性的具體實(shí) 施方式如上所述），通過第一和第二鄰近探針的核酸結(jié)構(gòu)域的游離3'羥基的核酸延伸可以 得到第一和第二鄰近探針的相互作用產(chǎn)生的延伸產(chǎn)物，并且通過隨后的延伸產(chǎn)物的擴(kuò)增和 檢測(cè)可以檢測(cè)該相互作用。在該具有代表性的【具體實(shí)施方式】中，通過在聚合酶有活性的條 件下使反應(yīng)混合物與聚合酶接觸來實(shí)現(xiàn)第一和第二鄰近探針的核酸結(jié)構(gòu)域的延伸。因此， 如上所述，在聚合酶無活性或具有最小活性的條件下，聚合酶可以在鄰近探針之前、與鄰近 探針同時(shí)、或在鄰近探針之后與樣品接觸。在適合鄰近探針與靶標(biāo)分析物相互作用且適合 鄰近探針的核酸結(jié)構(gòu)域相互作用的條件下培養(yǎng)反應(yīng)混合物之后，含有聚合酶的反應(yīng)混合物 可經(jīng)受并保持在如下條件下：該條件足以使核酸結(jié)構(gòu)域延伸，即反應(yīng)混合物的溫度提高到 聚合酶具有上述最小活性的溫度下，例如約25°C至約80°C，包括約25°C至約75°C，約30°C 至約65°C，或約40°C至60°C，最優(yōu)選約45°C至約55°C。
[0205] 如本領(lǐng)域已知的，聚合酶催化在并列的核苷酸之間形成磷酸二酯鍵，其中包括3' 羥基部分（3'端）的核苷酸可以形成已有的核苷酸聚合物的一部分，已有的核苷酸聚合物 即核酸。通常地，使核酸退火或雜交于互補(bǔ)的核酸分子，所述核酸分子的作用是模板化（即 模板核酸）具有游離3'端的核酸的延伸。隨后，與模板核酸上的下一個(gè)核苷酸互補(bǔ)的具有 游離5'磷酸酯部分的游離核苷酸連接于具有游離3'端的核酸以使其延伸，并重復(fù)該過程， 例如，直至到達(dá)模板的末端?？梢圆捎萌缟隙x的任何便利的聚合酶。用于本發(fā)明方法的特 別優(yōu)選的聚合酶包括Pfu DNA聚合酶和Pwo DNA聚合酶以及它們的突變體和/或衍生物， 例如其序列-修飾的衍生物，如上定義。突變體和衍生物可以包括具有或不具有3'核酸外 切酶活性的聚合酶，并且，修飾具有3'核酸外切酶活性的聚合酶以去除、滅活或抑制多肽的 3'核酸外切酶部分在本領(lǐng)域是常規(guī)的。某些RNA聚合酶也可用于本發(fā)明的方法中。
[0206] 當(dāng)通過無 3'核酸外切酶活性的聚合酶，例如Pfu (外切_) DNA聚合酶、Pwo (外切_) DNA聚合酶等，來實(shí)施延伸步驟時(shí)，包含3'核酸外切酶的組分，例如核酸外切酶，可在聚合 酶之前或與之同時(shí)被加入?？刹捎萌魏畏奖愕?'核酸外切酶，例如核酸外切酶I。本發(fā)明 的方法還可采用某些RNA核酸外切酶。
[0207] 在該延伸步驟中，如上定義的合適的聚合酶，如果需要的話和另外的3'核酸外切 酶，和需要的和/或希望的任何試劑與反應(yīng)混合物組合并維持在足以使雜交的核酸結(jié)構(gòu)域 發(fā)生延伸的條件。如果具有3'核酸外切酶活性的組分存在與反應(yīng)混合物中，那么所述條件 還應(yīng)該足以使未結(jié)合的鄰近探針的核酸結(jié)構(gòu)域發(fā)生降解。聚合酶和核酸外切酶反應(yīng)條件對(duì) 本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是已知的且如上所述。在延伸和/或降解過程中，某些【具體實(shí)施方式】 中的反應(yīng)混合物可保持在約4°C至約80°C，諸如約20°C至約75°C，約30°C至約60°C，例如 約45°C至約55°C或者約20°C至約37°C的溫度下（取決于分析中所用的聚合酶和/或核酸 外切酶的最適條件）約5秒至約16小時(shí)，諸如約1分鐘至約1小時(shí)的一段時(shí)間。在其它

【具體實(shí)施方式】中，反應(yīng)混合物可保持在如下的溫度保持一段時(shí)間，其中，所述溫度是約35°C 至約451：的范圍，諸如約371：至約421：，例如約381：、391：、401：或411：，或者約401：至 約 80°C 范圍，諸如 45°C至約 75°C，例如約 46°C、47°C、48°C、49°C、50°C、5rC、52°C、53°C、 54 °C、55 °C、56 °C、57 °C、58 °C、59 °C、60 °C、61 °C、62 °C、63 °C、64 °C、65 °C、66 °C、67 °C、68 °C、 69°C、70°C、71 °C、72°C、73°C、74°C或75°C，所述一段時(shí)間是約5秒至約16小時(shí)，諸如約1分 鐘至約1小時(shí)，包括約2分鐘至約8小時(shí)。反應(yīng)組分和條件的代表性【具體實(shí)施方式】在實(shí)施 例中進(jìn)行了描述。
[0208] 延伸之后，將延伸產(chǎn)物（例如，第一和第二探針的延伸的核酸結(jié)構(gòu)域）作為指示樣 品中的分析物的存在或作為度量樣品中分析物的量和其任意的位置來擴(kuò)增和檢測(cè)。如上所 述，延伸的產(chǎn)物可以包括單鏈或雙鏈核酸分子。單鏈核酸分子可以由夾板寡核苷酸的延伸 而產(chǎn)生，所述夾板寡核苷酸可以從第一和第二鄰近探針的核酸或在分析物結(jié)合結(jié)構(gòu)域中的 每個(gè)末端封端的第一和第二探針的兩個(gè)鄰近核酸結(jié)構(gòu)域的綴合產(chǎn)物上解離。
[0209] 延伸步驟之后，方法的下一步是確定反應(yīng)混合物中延伸產(chǎn)物的存在，以便檢測(cè)樣 品中的靶標(biāo)分析物。換言之，篩選（即，分析、評(píng)估、評(píng)價(jià)、測(cè)試等）反應(yīng)混合物中任何生成 的延伸產(chǎn)物的存在，以便檢測(cè)被分析樣品中靶標(biāo)分析物的存在。根據(jù)本發(fā)明，檢測(cè)步驟涉及 擴(kuò)增步驟以生成被檢測(cè)的擴(kuò)增產(chǎn)物，通常擴(kuò)增延伸產(chǎn)物的全部或一部分。
[0210] 有上述方法產(chǎn)生的延伸產(chǎn)物，或更具體地?cái)U(kuò)增產(chǎn)物，在最廣泛的意義上使用任何 便捷的方法進(jìn)行檢測(cè)。具體的檢測(cè)方法可以根據(jù)所要求的靈敏度和實(shí)施方法的應(yīng)用而變 化。在本文所述的本發(fā)明的方法中，檢測(cè)方法可以包括擴(kuò)增組分，其中延伸產(chǎn)物核酸（或其 部分）的拷貝數(shù)升高，例如，以提高具體分析的靈敏度。然而，可能的是，在其它方法中可以 無需任何擴(kuò)增而直接檢測(cè)延伸產(chǎn)物。
[0211] 雖然這不是本發(fā)明方法的優(yōu)選【具體實(shí)施方式】，其中無需擴(kuò)增的檢測(cè)是可實(shí)施的， 可以以許多不同的方式檢測(cè)核酸延伸產(chǎn)物。例如，一種或多種延伸產(chǎn)物可以是直接標(biāo)記的， 例如通過熒光，或通過分光光度法標(biāo)記，或通過放射性同位素標(biāo)記或使用任何產(chǎn)生信號(hào)的 標(biāo)記，以直接標(biāo)記延伸產(chǎn)物。在這些【具體實(shí)施方式】中，直接標(biāo)記的延伸產(chǎn)物可以從剩余反應(yīng) 混合物中按大小分離，包括以未延伸的寡核苷酸（即，核酸結(jié)構(gòu)域寡核苷酸或夾板寡核苷 酸）中分離，以檢測(cè)延伸的核酸?？蛇x地，可以采用構(gòu)象選擇的探針，例如分子信標(biāo)（如以 下更詳細(xì)地描述）來檢測(cè)延伸產(chǎn)物的存在，其中這些探針針對(duì)僅存在于延伸的核酸產(chǎn)物中 的序列。
[0212] 如上所述，在本發(fā)明方法的優(yōu)選【具體實(shí)施方式】中，檢測(cè)步驟包括擴(kuò)增步驟，其中增 加延伸核酸或其部分的拷貝數(shù)，例如，以提高分析的靈敏度。根據(jù)需要，擴(kuò)增可以是線性的 或指數(shù)的，其中令人感興趣的代表性擴(kuò)增方案包括但不限于：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR);等溫 擴(kuò)增，滾環(huán)擴(kuò)增等。在本發(fā)明一個(gè)特別優(yōu)選的【具體實(shí)施方式】中，擴(kuò)增方法是定量PCR(qPCR) 或?qū)崟r(shí)PCR。
[0213] 例如美國專利US6, 558, 928所描述的鎖式探針，或?qū)嶋H上使用任意環(huán)狀核酸分子 作為模板的滾環(huán)擴(kuò)增，也可以用于擴(kuò)增現(xiàn)有的"信號(hào)"核酸分子或其部分，例如，由鄰近延伸 分析生成的延伸產(chǎn)物。因此，在方法優(yōu)選的方面，延伸產(chǎn)物（或其部分）可以通過滾環(huán)擴(kuò)增 來擴(kuò)增。在一個(gè)【具體實(shí)施方式】中，使用鎖式探針進(jìn)行RCA。在另一個(gè)【具體實(shí)施方式】中，使用 環(huán)狀模板（環(huán)狀寡核苷酸）進(jìn)行RCA。
[0214] 當(dāng)檢測(cè)步驟包括擴(kuò)增步驟（更具體地，體外擴(kuò)增延伸產(chǎn)物或其部分的步驟），可以 檢測(cè)擴(kuò)增的產(chǎn)物（或擴(kuò)增產(chǎn)物）以檢測(cè)分析物。
[0215] 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)在本領(lǐng)域是已知的，在美國專利第4, 683, 202號(hào)、地 4, 683, 195號(hào)；第4, 800, 159號(hào)；第4, 965, 188號(hào)和第5, 512, 462號(hào)中進(jìn)行了描述，這些專 利通過引用整體并入本文。在代表性的PCR擴(kuò)增反應(yīng)中，將包括以上延伸的核酸或延伸產(chǎn) 物（也可是為擴(kuò)增反應(yīng)中的模板核酸）的反應(yīng)混合物與在引物延伸反應(yīng)中采用的一種或多 種引物組合，所述引物例如PCR引物（如在幾何（或指數(shù)）擴(kuò)增中采用的正向和反向引物， 或在線性擴(kuò)增中采用的單一引物）。與模板核酸（以下為方便起見稱為模板DNA)接觸的寡 核苷酸引物具有足夠的長度以提供在退化條件下的與互補(bǔ)模板DNA的雜交（以下更詳細(xì)地 描述）。引物通常為至少l〇bp的長度，通常為至少15bp的長度，更通常為至少16bp的長 度，可以是長達(dá)30bp的長度或更長，其中引物的長度一般地為18至50bp的長度，通常為約 20至35bp。根據(jù)是否需要引物延伸、模板DNA的線性或指數(shù)擴(kuò)增，可以將模板DNA與單一 引物或一組兩個(gè)的引物（正向引物和反向引物）接觸。
[0216] 如上所討論的，可以在加入聚合酶之前將引物加入到樣品中，也可以與聚合酶同 時(shí)或在加入聚合酶之后將引物加入到樣品中。在包含具有3'核酸外切酶活性的方法的具 體實(shí)施方式中，除非在3'核酸外切酶組分已經(jīng)滅活之后加入引物，否則可以對(duì)所述引物進(jìn) 行修飾以抗3'核酸外切酶活性，例如，修飾3'端。此外，引物也可以是熱起始引物，如上所 述。
[0217] 除了上述組分，本發(fā)明方法中產(chǎn)生的反應(yīng)混合物通常包括聚合酶和脫氧核苷三磷 酸（dNTP)?？梢杂梢环N或多種不同的聚合酶來提供所需的聚合酶活性。在優(yōu)選的具體實(shí)施 方式中，用于本發(fā)明方法的延伸步驟的聚合酶也用于擴(kuò)增步驟。
[0218] 然而，在一些【具體實(shí)施方式】中，含有延伸產(chǎn)物的等分反應(yīng)混合物可以被轉(zhuǎn)移到單 獨(dú)的反應(yīng)容器中進(jìn)行擴(kuò)增和檢測(cè)步驟。單獨(dú)的反應(yīng)容器可以含有擴(kuò)增反應(yīng)混合物，其包 括至少一種家族A聚合酶，其中，令人感興趣的代表性家族A聚合酶包括但不限于：水生 棲熱菌（Thermus aquaticus)聚合酶，包括天然存在的聚合酶（Taq)及其衍生物和其同 源物，諸如克萊因 taq(如Barnes等人，美國科學(xué)院院刊（1994)91:2216-2220 (Barnes et al，Proc.Natl.Acad.Sci USA(1994)91:2216-2220)中描述的）或 iTaq(美國伯樂 公司）（BioRad);嗜熱棲熱菌（Thermus thermophilus)聚合酶，包括天然存在的聚合酶 (Tth)及其衍生物和其同源物，以及諸如此類。在進(jìn)行的擴(kuò)增反應(yīng)是高保真反應(yīng)的某些具 體實(shí)施方式中，反應(yīng)混合物可進(jìn)一步包括具有3' -5'核酸外切酶活性的聚合酶，例如可由 家族B聚合酶提供，其中令人感興趣的家族B聚合酶包括但不限于：如Perler等人，美 國科學(xué)院院刊（1992)89:5577-5581所描述的嗜熱高溫球菌（Thermococcus litoralis) DNA 聚合酶（Vent);火球菌（Pyrococcus)種 GB-D (深 Vent);如 Lundberg 等人，基因 (1991) 108:1-6 (Lundberg et al·，Gene (1991) 108:1-6)所描述的強(qiáng)烈火球菌（Pyrococcus furiosus)DNA聚合酶（Pfu)，沃氏火球菌（Pyrococcus woesei) (Pwo)，以及諸如此類。當(dāng)反 應(yīng)混合物包括家族A和家族B聚合酶時(shí)，家族A聚合酶可以以大于家族B聚合酶的量存在 于反應(yīng)混合物中，其中活性的差異通常是至少10倍，且更通常是至少約100倍。
[0219] 通常，擴(kuò)增步驟的反應(yīng)混合物將包括4種不同類型的dNTP，這對(duì)應(yīng)于4種天然存在 堿基，即dATP、dTTP、dCTP和dGTP。在本發(fā)明的方法中，每種dNTP通常以約10至5000μΜ， 通常約20至1000 μ Μ的量存在。
[0220] 本發(fā)明方法的該檢測(cè)步驟中制備的反應(yīng)混合物可以進(jìn)一步包括水性緩沖液介質(zhì)， 所述水性緩沖液介質(zhì)包括單價(jià)離子源，二價(jià)陽離子源和緩沖劑。可以采用單價(jià)離子的任何 便利來源，諸如KC1、Κ-醋酸、ΝΗ 4-醋酸、Κ-谷氨酸、NH4C1、硫酸銨，等等。二價(jià)陽離子可以 是鎂、錳、鋅等，其中陽離子可以通常是鎂。可以采用任何鎂離子的便利來源，包括MgCl 2、 Mg-醋酸，等等。存在于緩沖液中的Mg2+的量可以是0. 5至10mM，但優(yōu)選是3至6mM，且理想 地是約5mM?？赡艽嬖谟诰彌_液中的代表性的緩沖劑或鹽包括三羥甲基氨基甲烷（Tris)、 三甲基甘氨酸（Tricine)、HEPES、M0PS，等等，其中緩沖劑量的范圍通常為約5至150mM，通 常為約10至100mM，且更通常為約20至50mM，其中在某些優(yōu)選的【具體實(shí)施方式】中，緩沖劑 將以足夠的量存在以提供約6. 0至9. 5的pH值，其中最優(yōu)選的是在約72°C下約7. 3的pH 值。其它可能存在于緩沖介質(zhì)中的試劑包括螯合劑，諸如EDTA、EGTA等。
[0221] 在本發(fā)明方法制備該步驟的反應(yīng)混合物時(shí)，各種組成組分可以按照任何方便的順 序合并。例如，緩沖液可以與引物、聚合酶結(jié)合、然后與模板DNA結(jié)合，或所有各種組成組分 可以同時(shí)結(jié)合以產(chǎn)生反應(yīng)混合物。在特別優(yōu)選的【具體實(shí)施方式】中，將擴(kuò)增反應(yīng)物與用于延 伸和降解反應(yīng)的組分結(jié)合。在這方面，反應(yīng)的組分優(yōu)選適合反應(yīng)的所有酶組分的活性，即， 適合于產(chǎn)生延伸產(chǎn)物的"第一"聚合酶和可選地適合于擴(kuò)增步驟的"第二"聚合酶，和如果具 有3'核酸外切酶活性的組分，其中"第二"聚合酶可不同于"第一"聚合酶（例如，如果擴(kuò)增 反應(yīng)發(fā)生在單獨(dú)的反應(yīng)容器中）。在優(yōu)選的【具體實(shí)施方式】中，"第一"和"第二"聚合酶是相 同的，即聚合酶能夠延伸鄰近探針的核酸結(jié)構(gòu)域并擴(kuò)增延伸的結(jié)構(gòu)域的至少一部分。在其 它【具體實(shí)施方式】中，聚合酶可具有3'核酸外切酶活性。例如，Pfu DNA聚合酶可用于采用 PCR檢測(cè)延伸反應(yīng)產(chǎn)物的【具體實(shí)施方式】中，即Pfu DNA聚合酶能夠被用作延伸組分、擴(kuò)增組 分和3'核酸外切酶組分，如果存在。
[0222] 擴(kuò)增反應(yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物可以使用任何便利的方法檢測(cè)，其中采用的具體方法可以非 特異性地或特異性地檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，如以下更詳細(xì)地描述的。令人感興趣的代表性非特異 性檢測(cè)方法包括采用信號(hào)生成系統(tǒng)的方法，所述信號(hào)生成系統(tǒng)例如通過嵌入選擇性地檢測(cè) 雙鏈DNA產(chǎn)物。用于這樣的【具體實(shí)施方式】中的代表性可檢測(cè)分子包括熒光核酸染色劑，諸 如菲陡（phenanthridinium)類的染料，包括其單體或同二聚體或異二聚體，當(dāng)其與核酸復(fù) 合時(shí)會(huì)產(chǎn)生增強(qiáng)的熒光。菲啶染料的例子包括乙啡啶同二聚體、溴化乙啡錠、碘化丙錠和其 它烷基取代的菲啶染料。在本發(fā)明的另一個(gè)【具體實(shí)施方式】中，核酸染色劑是吖啶染料或包 括吖啶染料，或其同二聚體或異二聚體，諸如吖啶橙、吖啶同二聚體、乙啡錠-吖啶異二聚 體，或9-氨基-6-氯-2-甲氧基吖啶。在本發(fā)明的另一個(gè)【具體實(shí)施方式】中，核酸染色劑是 吲哚或咪唑染料，諸如赫克斯特33258 (Hoechst33258)、赫克斯特33342 (Hoechst33342)、 赫克斯特34580(Hoechst34580)(生物探針34,分子探針公司，尤金，俄勒R州，（2000年5 月））（BI0PR0BES 34, Molecular Probes, Inc. Eugene, Oreg.，（May2000))、DAPI (4,，6-二脈 基-2-苯基吲哚）或DIPI (4'，6-(二咪唑啉-2-基）-2-苯基吲哚）。其它允許的核酸染 色劑包括但不限于7-氨基放線菌素 D、羥基司替巴脒、LDS751、選擇的補(bǔ)骨脂素（呋喃香豆 素）、苯乙烯基染料、金屬復(fù)合物如釕復(fù)合物，和過渡金屬復(fù)合物（例如，包括Tb3+和Eu3+)。 在本發(fā)明某些【具體實(shí)施方式】中，核酸染色劑是花青染料或花青染料的同二聚體或異二聚 體，當(dāng)其與核酸連接時(shí)會(huì)產(chǎn)生增強(qiáng)的熒光?？梢允褂萌缦聦＠墨I(xiàn)中所描述的任何染料： Lee的美國專利第4, 883, 867號(hào)（1989)、Yue等人的美國專利第5, 582, 977號(hào)（1996)、Yue 等人的美國專利第5, 321，130號(hào)（1994)和Yue等人的美國專利第5, 410, 030號(hào)（1995)(這 四篇專利通過引用整體并入本文），包括購自分子探針公司，尤金，俄勒R州（Molecular Probes, Inc.，Eugene, Oreg)的商標(biāo)為 TOTO、BOBO、POPO、YOYO、TO-PRO、BO-PRO、P0-PR0 和 YO-PRO的市售核酸染色劑?？梢允褂萌缦聦＠墨I(xiàn)中所描述的任何染料：Haugland等人的 美國專利第5, 436, 134號(hào)（1995)、Yue等人的美國專利第5, 658, 751號(hào)（1997)和Haugland 等人的美國專利第5, 863, 753號(hào)（1999)(這三篇專利通過引用整體并入本文），包括購自 分子探針公司，尤金，俄勒網(wǎng)州（Molecular Probes, Inc.，Eugene, Oreg)的商標(biāo)為SYBR Green、SYTO、SYTOX、PICOGREEN、OLIGREEN和RIBOGREEN的市售核酸染色劑。在本發(fā)明其它

【具體實(shí)施方式】中，核酸染色劑是是單體的、同二聚體的或異二聚體的花青染料，它們包括氮 雜苯并唑雜環(huán)或聚氮雜苯并唑雜環(huán)，諸如氮雜苯并惡唑、氮雜苯并咪唑或氮雜苯并噻唑，當(dāng) 與核酸結(jié)合時(shí)它們會(huì)產(chǎn)生增強(qiáng)的熒光，包括購自分子探針公司，尤金，俄勒R州（Molecular Probes, Inc.，Eugene, Oreg)的商標(biāo)為 SYTO、SYTOX、JOJO、JO-PRO、LOLO、L0-PR0 的市售核 酸染色劑?？捎糜诒景l(fā)明方法的其它嵌入染料是購自Biotium公司的EvaGreen?染料。
[0223] 在本發(fā)明特別優(yōu)選的【具體實(shí)施方式】中，延伸產(chǎn)物通過PCR擴(kuò)增，其中PCR是定量 PCR，且使用嵌入染料對(duì)擴(kuò)增的核酸分子進(jìn)行定量。在優(yōu)選的【具體實(shí)施方式】中，嵌入染料選 自 SYBR Green? 和 EvaGreen?。
[0224] 在特別優(yōu)選的【具體實(shí)施方式】中，當(dāng)樣品是血漿或血清時(shí)，定量PCR被用于本發(fā)明 方法的擴(kuò)增和檢測(cè)步驟。用于血漿或血清的特別有用的嵌入染料可選自SYBR Green?和 EvaGreen?。
[0225] 在其它【具體實(shí)施方式】中，可以采用對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物而非一般的雙鏈分子具有特異性的 信號(hào)產(chǎn)生系統(tǒng)來檢測(cè)擴(kuò)增。在這些【具體實(shí)施方式】中，信號(hào)產(chǎn)生系統(tǒng)可以包括探針核酸，該探 針核酸特異性結(jié)合于擴(kuò)增產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)的序列，其中，所述探針核酸可以用直接或間接可檢 測(cè)的標(biāo)記物進(jìn)行標(biāo)記。直接可檢測(cè)的標(biāo)記物是可以直接被檢測(cè)而無需使用另外的試劑的 標(biāo)記物，而間接可檢測(cè)的標(biāo)記物是通過采用一種或多種另外的試劑才可檢測(cè)的標(biāo)記物，例 如，其中標(biāo)記物是由兩種或多種組分構(gòu)成的信號(hào)產(chǎn)生系統(tǒng)的成員。在很多【具體實(shí)施方式】中， 標(biāo)記是直接可檢測(cè)的標(biāo)記，其中令人感興趣的直接可檢測(cè)的標(biāo)記包括但不限于：熒光標(biāo)記、 放射性同位素標(biāo)記、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記等。在很多【具體實(shí)施方式】中，標(biāo)記物是熒光標(biāo)記，其中在 這樣的【具體實(shí)施方式】中采用的標(biāo)記試劑是熒光標(biāo)記的核苷酸，例如熒光標(biāo)記的CTP (諸如 Cy3-CTP、Cy5-CTP)等?？梢杂糜跇?biāo)記核酸以產(chǎn)生標(biāo)記的探針核酸的熒光部分包括但不限 于：熒光素，花青染料如Cy3、Cy5、Alexa555、Bodipy630/650,等。其它標(biāo)記，如上所述的那 些，是本領(lǐng)域已知的，因此也可被采用。
[0226] 在某些【具體實(shí)施方式】中，特異性標(biāo)記的探針核酸是使用"能量轉(zhuǎn)移"標(biāo)記進(jìn)行標(biāo)記 的。如本文所用，"能量轉(zhuǎn)移"是指熒光基團(tuán)的熒光發(fā)射被熒光修飾基團(tuán)轉(zhuǎn)變的過程。如果 熒光修飾基團(tuán)是淬滅基團(tuán)，那么來自熒光基團(tuán)的熒光發(fā)射減弱（淬滅）。能量轉(zhuǎn)移可以通過 熒光共振能量轉(zhuǎn)移，或通過直接能量轉(zhuǎn)移而發(fā)生。在這兩種情況下確切的能量轉(zhuǎn)移機(jī)制是 不同的。應(yīng)當(dāng)理解的是，在本申請(qǐng)中所提到的任何能量轉(zhuǎn)移包括所有這些在機(jī)制上不同的 現(xiàn)象。如本文所用，"能量轉(zhuǎn)移對(duì)"是指參與能量轉(zhuǎn)移的任意兩個(gè)分子。通常地，一個(gè)分子充 當(dāng)熒光基團(tuán)，另一個(gè)充當(dāng)熒光修飾基團(tuán)。"能量轉(zhuǎn)移對(duì)"用來指形成單一復(fù)合物的分子的基 團(tuán)，在所述復(fù)合物中發(fā)生能量轉(zhuǎn)移。這樣的復(fù)合物可以包括，例如，彼此不同的兩個(gè)熒光基 團(tuán)和一個(gè)淬滅基團(tuán)，兩個(gè)淬滅基團(tuán)和一個(gè)熒光基團(tuán)，或包括多個(gè)熒光基團(tuán)和多個(gè)淬滅基團(tuán)。 在有多個(gè)熒光基團(tuán)和/或多個(gè)淬滅基團(tuán)的情況下，單個(gè)基團(tuán)可以彼此不同。如本文所用，"熒 光共振能量轉(zhuǎn)移"或"FRET"是指能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象，其中由激發(fā)熒光基團(tuán)發(fā)射的光至少部分地 被熒光修飾基團(tuán)吸收。如果熒光修飾基團(tuán)是淬滅基團(tuán)，那么基團(tuán)可以作為不同波長的光發(fā) 出吸收光，或可以作為熱散失。FRET取決于熒光基團(tuán)的發(fā)射光譜和淬滅基團(tuán)的吸收光譜之 間的重疊。FRET還取決于淬滅基團(tuán)和熒光基團(tuán)之間的距離。超過一定的臨界距離后，淬滅 基團(tuán)不能吸收由熒光基團(tuán)發(fā)射的光，或僅能很差地吸收。如本文所用，"直接能量轉(zhuǎn)移"是指 熒光轉(zhuǎn)移機(jī)制，其中熒光基團(tuán)和熒光修飾基團(tuán)之間的光子未發(fā)生傳遞。不被單一的機(jī)理束 縛，可以認(rèn)為在直接能量轉(zhuǎn)移中，熒光基團(tuán)和熒光修飾基團(tuán)干擾彼此的電子結(jié)構(gòu)。如果熒光 修飾基團(tuán)是淬滅基團(tuán)，這將導(dǎo)致淬滅基團(tuán)甚至阻止熒光基團(tuán)發(fā)射光。
[0227] 能量轉(zhuǎn)移標(biāo)記探針核酸，例如，寡核苷酸，可以按照各種不同的方式構(gòu)成，只要它 包括供體、受體和靶標(biāo)核酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域。因此，在本方法的這些【具體實(shí)施方式】中采用的能量 轉(zhuǎn)移標(biāo)記寡核苷酸是核酸檢測(cè)器，所述核酸檢測(cè)器包括熒光團(tuán)結(jié)構(gòu)域，其中放置了熒光能 量供體，即供體，并放置了熒光能量受體，即受體。如上所述，供體結(jié)構(gòu)域包括供體熒光團(tuán)。 供體熒光團(tuán)可以位于核酸檢測(cè)器的任意部位，但是通常存在于檢測(cè)器的5'端。受體結(jié)構(gòu)域 包括熒光能量受體。受體可以放置在核酸檢測(cè)器受體結(jié)構(gòu)域的任意部位，但通常存在于核 酸檢測(cè)器或探針的3'端。
[0228] 除了熒光團(tuán)和受體結(jié)構(gòu)域，能量轉(zhuǎn)移標(biāo)記的探針寡核苷酸還包括靶標(biāo)核酸結(jié)合結(jié) 構(gòu)域，所述結(jié)構(gòu)域結(jié)合于令人感興趣的擴(kuò)增產(chǎn)物中所發(fā)現(xiàn)的靶標(biāo)核酸序列（如上所述），所 述的結(jié)合例如是在嚴(yán)格的雜交條件下結(jié)合（如上所述）。這樣的靶標(biāo)結(jié)合結(jié)構(gòu)域的長度通 常是約10至約60個(gè)核苷酸，通常為約15至約30nt。根據(jù)寡核苷酸和分析本身的性質(zhì)，靶 標(biāo)結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以雜交于模板核酸的區(qū)域或引物延伸產(chǎn)物的區(qū)域。例如，當(dāng)分析是5'核酸 酶分析時(shí)，例如當(dāng)采用TaqMan?型寡核苷酸探針時(shí)，靶標(biāo)結(jié)合結(jié)構(gòu)域在嚴(yán)格的條件下雜 交于模板核酸的靶標(biāo)結(jié)合位點(diǎn)，所述結(jié)合位點(diǎn)是引物結(jié)合位點(diǎn)的下游或3'端。在可選的

【具體實(shí)施方式】中，例如，在分子信標(biāo)型分析中，靶標(biāo)結(jié)合結(jié)構(gòu)域雜交到引物延伸產(chǎn)物的結(jié)構(gòu) 域。在這些【具體實(shí)施方式】中采用的包括上述所有三個(gè)結(jié)構(gòu)域的能量轉(zhuǎn)移標(biāo)記寡核苷酸的總 長度，通常是約10至約60個(gè)核苷酸，通常是約15至約30個(gè)核苷酸。
[0229] 在某些【具體實(shí)施方式】中，當(dāng)能量轉(zhuǎn)移標(biāo)記寡核苷酸不雜交于靶標(biāo)核酸時(shí)，對(duì)能量 轉(zhuǎn)移標(biāo)記的寡核苷酸進(jìn)行構(gòu)造以使熒光團(tuán)激發(fā)后在熒光團(tuán)和能量轉(zhuǎn)移標(biāo)記的寡核苷酸探 針的受體之間發(fā)生能量轉(zhuǎn)移。
[0230] 在某些【具體實(shí)施方式】中，寡核苷酸是不形成分子內(nèi)結(jié)構(gòu)的單鏈分子，并且由于供 體和受體的間距使得能按照單鏈線性形式進(jìn)行能量轉(zhuǎn)移，因此其中發(fā)生能量轉(zhuǎn)移。在這 些【具體實(shí)施方式】中，當(dāng)標(biāo)記的寡核苷酸探針雜交于靶標(biāo)核酸時(shí)，能量轉(zhuǎn)移也在熒光團(tuán)和標(biāo) 記的寡核苷酸探針的受體之間在熒光團(tuán)激發(fā)時(shí)發(fā)生。這樣的標(biāo)記寡核苷酸探針的具體 例子包括TaqMan?型探針，如美國專利第6, 248, 526號(hào)所描述，其公開的內(nèi)容通過引 用整體并入本文（以及Held等人，基因組研究（1996)6:986-994(Held et al.，Genome Res. (1996)6:986-994) ;Holland 等人，美國科學(xué)院院刊（1991)88:7276-7280(Holland et al.，Proc. Natl Acad. Sci. USA (1991) 88:7276-7280);和 Lee 等人，核酸研究 (1993) 21:3761-3766 (Lee et al.，Nuc. Acids Res. (1993) 21:3761-3766))。在許多這些具 體實(shí)施方式中，靶標(biāo)核酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域是與模板核酸的序列雜交的結(jié)構(gòu)域，也即與其互補(bǔ)的 結(jié)構(gòu)域，即靶標(biāo)核酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域的靶標(biāo)核酸是存在于模板核酸中的序列（即，偽靶標(biāo)或替 代核酸）。
[0231] 在其它【具體實(shí)施方式】中，當(dāng)能量轉(zhuǎn)移標(biāo)記寡核苷酸探針雜交于靶標(biāo)核酸時(shí)，對(duì)探 針寡核苷酸進(jìn)行構(gòu)造以使在熒光團(tuán)激發(fā)時(shí)在熒光團(tuán)和能量轉(zhuǎn)移標(biāo)記的寡核苷酸探針的受 體之間不發(fā)生能量轉(zhuǎn)移。這些類型的探針結(jié)構(gòu)的例子包括：蝎形探針（Scorpion probe) (描述于 Whitcombe 等人，自然生物技術(shù)（1999) 17:804-807(Whitcombe et al.，Nature Biotechnology(1999) 17:804-807);美國專利第6,326, 145號(hào)，其公開的內(nèi)容通過引 用整體并入本文），日出探針（Sunrise probe)(描述于Nazarenko等人，核酸研究 (1997)25:2516-2521 (Nazarenko et al.，Nuc.Acids Res. (1997)25:2516-2521);美國專 利第6, 117, 635號(hào)，其公開的內(nèi)容通過引用整體并入本文），分子信標(biāo)（Tyagi等人，自然生 物技術(shù)（1996) 14:303-308 (Tyagi et al·，Nature Biotechnology (1996) 14:303-308);美 國專利第5, 989, 823號(hào)，其公開的內(nèi)容通過引用整體并入本文），和構(gòu)象輔助探針（描述于 臨時(shí)申請(qǐng)第60/138, 376號(hào)，其公開的內(nèi)容通過引用整體并入本文）。在許多的這些具體實(shí) 施方式中，靶標(biāo)結(jié)合序列或結(jié)構(gòu)域包括與擴(kuò)增反應(yīng)的引物延伸產(chǎn)物的序列互補(bǔ)的雜交結(jié)構(gòu) 域，而不是與偽靶標(biāo)核酸中發(fā)現(xiàn)的序列互補(bǔ)的序列。
[0232] 本發(fā)明方法的下一步是由令人感興趣的標(biāo)記的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行的信號(hào)檢測(cè)，其中信 號(hào)檢測(cè)可以根據(jù)所采用的具體的信號(hào)產(chǎn)生系統(tǒng)而變化。在某些【具體實(shí)施方式】中，僅例如熒 光的可檢測(cè)信號(hào)的存在與否在所述分析中被測(cè)定和使用，以便通過確定偽靶標(biāo)核酸和/或 其擴(kuò)增產(chǎn)物來測(cè)定或識(shí)別靶標(biāo)核酸是否存在。根據(jù)所采用的具體標(biāo)記，信號(hào)的檢測(cè)可以指 示靶標(biāo)核酸的存在或不存在。
[0233] 在信號(hào)產(chǎn)生系統(tǒng)是熒光信號(hào)產(chǎn)生系統(tǒng)的那些【具體實(shí)施方式】中，信號(hào)檢測(cè)通常包括 檢測(cè)來自反應(yīng)混合物的熒光信號(hào)的變化以獲得分析結(jié)果。換言之，評(píng)估了由反應(yīng)混合物生 成的熒光信號(hào)的任何調(diào)節(jié)。根據(jù)采用的標(biāo)記的性質(zhì)，變化可以是熒光的增強(qiáng)或減弱，但在某 些【具體實(shí)施方式】中是熒光的增強(qiáng)?？梢允褂萌魏伪憬莸姆椒ㄡ槍?duì)熒光的增強(qiáng)對(duì)樣品進(jìn)行分 析，所述方法的裝置例如是合適的熒光計(jì)，諸如熱穩(wěn)定的比色皿或板式閱讀熒光計(jì)。使用已 知的熒光計(jì)對(duì)熒光進(jìn)行合適地監(jiān)測(cè)。來自這些裝置的信號(hào)，例如光電倍增管電壓形式的信 號(hào)，被發(fā)送到數(shù)據(jù)處理器板并轉(zhuǎn)化成與每種樣品管相關(guān)的光譜。可以同時(shí)評(píng)估多個(gè)管，例如 96個(gè)管。
[0234] 當(dāng)檢測(cè)方法是實(shí)時(shí)方法時(shí)，例如，如在實(shí)時(shí)PCR或定量PCR方法中所采用的，在整 個(gè)反應(yīng)中可以在頻繁的間隔下以這種方式收集數(shù)據(jù)，例如每3分鐘一次。通過監(jiān)測(cè)在每個(gè) 循環(huán)的過程中來自樣品的反應(yīng)性分子的熒光，可以按照各種方式來監(jiān)測(cè)擴(kuò)增反應(yīng)的進(jìn)展。 例如，可以通過計(jì)算解鏈峰下面積和根據(jù)循環(huán)數(shù)繪制的這些數(shù)據(jù)來分析由解鏈峰提供的數(shù) 據(jù)。在本發(fā)明的優(yōu)選【具體實(shí)施方式】中，使用嵌入雙鏈核酸分子的染料來實(shí)現(xiàn)熒光信號(hào)，優(yōu)選 地，其中嵌入染料選自SYBR Green?和EvaGreen?。
[0235] 以這種方式生成的光譜能夠被分辨，例如，使用預(yù)先選擇的熒光部分如染料的"擬 合"，以形成代表每個(gè)信號(hào)部分（即熒光團(tuán)）的峰?？梢詼y(cè)定峰下的面積，所述峰下的面積 代表每個(gè)信號(hào)的強(qiáng)度值，如果需要?jiǎng)t將其表達(dá)為彼此的商數(shù)quotients。信號(hào)強(qiáng)度和/或比 率的微分將使得能夠在整個(gè)反應(yīng)中或在不同反應(yīng)條件下記錄標(biāo)記探針變化，所述反應(yīng)條件 例如是溫度。這種變化涉及寡核苷酸探針和靶標(biāo)序列之間的結(jié)合現(xiàn)象或者結(jié)合于靶標(biāo)序列 的寡核苷酸探針的降解。微分峰下的面積的積分將使得能夠計(jì)算出標(biāo)記影響的強(qiáng)度值。
[0236] 根據(jù)在引物延伸反應(yīng)末，例如在擴(kuò)增反應(yīng)的每個(gè)循環(huán)后（例如，如在實(shí)時(shí)PCR監(jiān)測(cè) 中所做的），樣品是否被篩選了一次或多次，針對(duì)熒光變化對(duì)混合物進(jìn)行的篩選提供了一個(gè) 或多個(gè)分析結(jié)果。
[0237] 如上所述生成的數(shù)據(jù)可以按照多種方式進(jìn)行解釋。在其最簡單的形式中，在擴(kuò)增 反應(yīng)的過程中或末期，來自樣品的熒光的增強(qiáng)或減弱指示著樣品中存在的靶標(biāo)分析物的量 增加，例如，如與反應(yīng)混合物檢測(cè)中所檢測(cè)的擴(kuò)增產(chǎn)物的量相關(guān)，表明擴(kuò)增反應(yīng)已進(jìn)行并且 因此靶標(biāo)分析物確實(shí)存在于初始樣品中的事實(shí)。通過在整個(gè)擴(kuò)增過程中監(jiān)測(cè)擴(kuò)增反應(yīng)也可 能進(jìn)行定量。如上所述的定量也可以包括分析反應(yīng)混合物中的一種或多種核酸對(duì)照。
[0238] 以這種方式，可以容易地針對(duì)靶標(biāo)分析物的存在來篩選（或者評(píng)估或者分析等） 反應(yīng)混合物。該方法適合用于檢測(cè)單一靶標(biāo)分析物以及多重分析，其中在樣品中分析兩種 或多種不同的靶標(biāo)分析物。在這些后者的多重分析的情況下，可以采用的不同組的探針數(shù) 目通常是約2至約20或更多，例如高達(dá)100或更多，1000或更多，等等。
[0239] 采用本文描述的方法而獲得的提高了的特異性和靈敏性使如下分析成為可能：許 多分析物同時(shí)并且使用幾種不同的鄰近探針組（多重）在單一反應(yīng)中進(jìn)行的分析。可以對(duì) 每個(gè)探針組進(jìn)行設(shè)計(jì)以產(chǎn)生獨(dú)特的延伸產(chǎn)物，所述延伸產(chǎn)物可以用于確定探針組所探測(cè)的 分析物的存在或不存在，量和/或部位?？梢灾苯訖z測(cè)延伸產(chǎn)物，或者優(yōu)選地在擴(kuò)增后使用 任意已經(jīng)建立的用于分析核酸分子的方法來檢測(cè)延伸產(chǎn)物，所述方法從文獻(xiàn)中是已知的， 包括液相色譜法、電泳法、質(zhì)譜法、顯微鏡法、實(shí)時(shí)PCR(定量PCR)、熒光探針等。本發(fā)明方法 優(yōu)選的【具體實(shí)施方式】利用定量或?qū)崟r(shí)PCR。特別令人感興趣的是本發(fā)明的方法與"DNA陣 列"讀出形式的結(jié)合。來自本文所述的多重鄰近延伸分析的幾種獨(dú)特延伸產(chǎn)物可以雜交至 標(biāo)準(zhǔn)化的DNA陣列，所述DNA陣列攜帶許多與延伸產(chǎn)物序列互補(bǔ)的寡核苷酸序列（標(biāo)記）。 雜交于陣列的每種延伸產(chǎn)物可以通過其在DNA陣列上的位置確定，并且在給定的雜交斑點(diǎn) 中的檢測(cè)的強(qiáng)度將表明特異性延伸產(chǎn)物的量，從而也表明產(chǎn)生該延伸產(chǎn)物的分析物的量。 可以通過光譜法、熒光、放射性同位素等來檢測(cè)延伸產(chǎn)物。可以在擴(kuò)增反應(yīng)（PCR)中使用熒 光標(biāo)記的引物或熒光標(biāo)記的核苷酸將熒光部分方便地引入到延伸產(chǎn)物中。DNA陣列可以是 含有少量斑點(diǎn)的膜上的簡單的點(diǎn)印跡陣列，或攜帶成百上千的斑點(diǎn)的高密度陣列。
[0240] 可以對(duì)本發(fā)明的方法進(jìn)行修飾以進(jìn)一步降低與非特異性核酸雜交事件相關(guān)的背 景。這樣的修飾包括對(duì)降低任何非特異性核酸雜交事件的方法所進(jìn)行的調(diào)整。在一些具 體實(shí)施方式中，可以將蛋白質(zhì)加入含有樣品和鄰近探針的混合物中以減少弱的和非特異 性的DNA雜交事件。例如，已將大腸桿菌單鏈DNA結(jié)合蛋白用于提高引物延伸反應(yīng)和PCR 反應(yīng)的產(chǎn)率和特異性（美國專利第5, 449, 603號(hào)和第5, 534, 407號(hào)）。噬菌體T4的基因 32蛋白（單鏈DNA結(jié)合蛋白）明顯提高了擴(kuò)增更大的DNA片段的能力（Schwartz等人， 核酸研究 18:1079 (1990)) (Schwartz, et al.，Nucl. Acids Res. 18:1079 (1990))，并提高 了 DNA 聚合酶的保真度（Huang, DNA 和細(xì)胞生物學(xué) 15:589-594(1996)) (Huang, DNA Cell. Biol. 15:589-594(1996))。當(dāng)采用時(shí)，這樣的蛋白質(zhì)將用于在反應(yīng)混合物中達(dá)到的濃度范 圍是約〇· 〇lng/ μ L至約1 μ g/ μ L，如約0· lng/ μ L至約100ng/ μ L，包括約lng/ μ L至約 10ng/μ L〇
[0241] 在一些【具體實(shí)施方式】中，可以通過在分析中加入聚-A RNA(poly_A RNA)和/或主 體RNA來降低背景。主體RNA也稱總RNA，S卩，主體RNA僅僅是從例如細(xì)胞的樣品中提取的 總RNA，包括存在于所述樣品中一種以上的形式的RNA，優(yōu)選是所有不同形式的RNA，例如， mRNA,、rRNA、微小 RNA 等。
[0242] 在其它【具體實(shí)施方式】中，部分雙鏈的核酸可以用作第一和第二鄰近探針的核酸結(jié) 構(gòu)域以降低弱的和非特異性的DNA雜交事件。
[0243] 如上所述，對(duì)本發(fā)明的方法進(jìn)行設(shè)計(jì)，以使第一和第二探針的核酸結(jié)構(gòu)域之間的 相互作用只有在探針結(jié)合于分析物時(shí)才發(fā)生。然而，在該類型的所有分析的情況下，不能總 是保證這一點(diǎn)，并且如果探針在溶液中隨機(jī)地鄰近時(shí)，那么可能有核酸結(jié)構(gòu)域的一些背景 相互作用（該可能性在如下【具體實(shí)施方式】中會(huì)降低：需要探針的核酸結(jié)構(gòu)域借助夾板彼此 雜交以發(fā)生此類相互作用；與雙探針分析相比，所有三種結(jié)構(gòu)域隨機(jī)鄰近的機(jī)會(huì)降低，然而 這仍然可以在某些情況下發(fā)生）。為了使由于未結(jié)合的（即未反應(yīng)的）探針導(dǎo)致的背景的 可能性降低或最小化，除了上述的和本領(lǐng)域已知的任意其它封閉試劑以外，可以使用封閉 寡核苷酸。在優(yōu)選的【具體實(shí)施方式】中，樣品可以在加入鄰近探針之前與一種或多種封閉試 劑一起培養(yǎng)，所述封閉試劑是BSA等，如國際專利W02012/007511等所描述的封閉試劑。
[0244] 封閉寡核苷酸結(jié)合（即，雜交或退火）于第一和第二鄰近探針的核酸結(jié)構(gòu)域的游 離端。因此，封閉寡核苷酸可以結(jié)合于5'鄰近探針的核酸結(jié)構(gòu)域的游離3'0H端和3'鄰近 探針的核酸結(jié)構(gòu)域的5'磷酸酯端。封閉寡核苷酸的結(jié)合在高的局部濃度的夾板寡核苷酸 存在下可以具有更高的競爭力，如本發(fā)明的一些【具體實(shí)施方式】中所發(fā)生的。以這種方式，在 不存在分析物結(jié)合時(shí)，封閉寡核苷酸可以阻止第一和第二結(jié)構(gòu)域雜交至夾板。在其它具體 實(shí)施方式中，一種或多種特異性"競爭"寡核苷酸可以加入分析中，例如在鄰近探針與靶標(biāo) 分析物相連之后，以使封閉寡核苷酸從探針的核酸結(jié)構(gòu)域的末端解離，從而使得鄰近探針 的結(jié)構(gòu)域能相互作用。因此，可以阻止5'和/或3'探針的游離端相互作用，直到它們結(jié)合 于分析物之后。在夾板寡核苷酸被使用并形成第三鄰近探針的核酸結(jié)構(gòu)域的【具體實(shí)施方式】 中，當(dāng)所有三種探針結(jié)合于分析物時(shí)，夾板的局部濃度足以超過封閉寡核苷酸；第一和第二 結(jié)構(gòu)域雜交于夾板并且封閉寡核苷酸被取代。
[0245] 因此，封閉寡核苷酸使得能夠使用基于競爭的策略以降低背景，并從而提高分析 的靈敏度。
[0246] 封閉寡核苷酸的長度范圍是約4-100個(gè)核苷酸，例如6-75個(gè)或10-50個(gè)。它們 可以雜交至第一或第二探針的核酸結(jié)構(gòu)域的游離端或游離端附近（"附近"的意思是游離 3'或5'端的1-20個(gè)或1-10個(gè)核苷酸以內(nèi)，例如1-6個(gè)核苷酸）。雜交區(qū)域的長度可以是 3-15 個(gè)核苷酸，例如 3-12、3-10、3-8、4-8、3-6、4-6。
[0247] 封閉寡核苷酸通常相對(duì)于各探針過量使用，例如，過量2-1000倍，例如，20-500、 50-300、100-500 或 100-300 倍，例如，20、200 或 300 倍。
[0248] 競爭寡核苷酸通常相對(duì)于封閉寡核苷酸過量使用，例如，過量2-1000倍，例如， 20-500、50-300、100-500 或 100-300 倍，例如，20、200 或 300 倍。
[0249] 在使用具有低親和力和緩慢的結(jié)合動(dòng)力學(xué)的鄰近探針來檢測(cè)分析物的情況下，與 鄰近探針在足夠高的濃度下進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)的步驟促進(jìn)了鄰近探針與分析物的結(jié)合。該預(yù)培養(yǎng) 步驟可以快速在大體積的冷緩沖液中稀釋（例如，不包括分析物或鄰近探針的緩沖液），和 隨后將部分該稀釋液加入延伸反應(yīng)混合物中。低溫使得存在的鄰近探針分析物復(fù)合物的解 離最小化，而大量稀釋導(dǎo)致未結(jié)合鄰近探針的濃度降低，從而降低其反應(yīng)性和背景信號(hào)的 最小化，所述低溫例如是約〇°C至約20°C，包括約4°C至約10°C。
[0250] 在這樣的【具體實(shí)施方式】中，通過使用如下小的培養(yǎng)體積的樣品和鄰近探針來實(shí)施 分析：約1μ 1至約20μ 1，諸如約1μ 1，或約2μ 1，或約3μ 1，或約4μ 1，或約5μ 1或約 6 μ 1。因此，鄰近探針在最終培養(yǎng)體積中的有效濃度是被稀釋的，降低了背景，同時(shí)維持了 信號(hào)，這是由于在第一和第二核酸結(jié)構(gòu)域被延伸之前沒有時(shí)間解離探針和分析之間的結(jié)合 從而維持了信號(hào)。只要延伸產(chǎn)物可以由較大的體積來濃縮，諸如Ι00μ 1以上或更多，并且 隨后檢測(cè)鄰近依賴相互作用，那么該方法能夠具有極高的靈敏度。在這樣的【具體實(shí)施方式】 中，通過使用單鏈結(jié)合蛋白能夠減少探針-探針相互作用。
[0251] 與復(fù)雜樣品相關(guān)的問題可以通過在分析之前先稀釋復(fù)雜樣品來解決。這極大地減 少了可非特異性結(jié)合探針的蛋白質(zhì)的量，從而降低了所需探針的濃度。雖然樣品還將被稀 釋，但是高敏感性的鄰近探測(cè)將提供良好的檢測(cè)和定量。
[0252] 可如上所述均質(zhì)地（即在溶液中）或者可選地異質(zhì)地使用固相來采用本發(fā)明的方 法，所述使用固相例如是其中結(jié)合的分析物固定在固相上，允許使用洗滌步驟。固相分析的 使用提供了優(yōu)點(diǎn)，特別是對(duì)困難樣品的檢測(cè)提供了優(yōu)點(diǎn)：洗滌步驟可以有助于除去抑制性 組分，并且可以從不需要的大的樣品體積中富集分析物。由于未結(jié)合的分析物和探針可以 通過洗滌而除去，因此可以使用較高濃度和較大量的鄰近探針。通過洗滌除去未結(jié)合的或 未綴合的探針的能力也意味著固相分析與均質(zhì)分析相比可耐受更低純度的鄰近探針。
[0253] 將分析物固定在固相上可以采用多種方式來實(shí)現(xiàn)。因此，本發(fā)明固相分析的幾種

【具體實(shí)施方式】被考慮。在一種這樣的【具體實(shí)施方式】中，一個(gè)（或多個(gè)）第一或第二（或第 三鄰近探針，如果使用）可以被（或者能夠被）固定在固相（或者固體支持物）上。分析 物可以首先被一個(gè)（或多個(gè)）固定的（或可固定的）探針捕獲，其次再被隨后加入的探針 結(jié)合。在這樣的方案中，前述的親和力效果可不存在于結(jié)合步驟中，但是與洗滌步驟相關(guān)。 優(yōu)選地，在將非固定的/不可固定的探針加入反應(yīng)混合物的同時(shí)，使分析物與固相結(jié)合的 (即，固定的，或可固定的）探針接觸，使得親和力效果也有助于檢測(cè)（結(jié)合）步驟。
[0254] 固定化的鄰近探針可以被固定，S卩，以任何方便的方式結(jié)合于支持物。因此，固定 的方式或手段和固體支持物可以選擇，根據(jù)選擇需要，選自本領(lǐng)域眾所周知且在文獻(xiàn)中描 述的任何數(shù)量的固定裝置和固體支持物。因此，探針可以直接結(jié)合于支持物，例如通過分析 物結(jié)合結(jié)構(gòu)域（例如，化學(xué)交聯(lián)的），它也可以借助連接基團(tuán)或通過中間結(jié)合基團(tuán)間接地結(jié) 合（例如，通過接觸生物素 -鏈酶親和素相互作用）。因此，鄰近探針可以具有用于固定在 支持物上的裝置（例如，能夠結(jié)合于其結(jié)合伴侶的親和結(jié)合伴侶，例如生物素或半抗原，所 述結(jié)合伴侶即同源結(jié)合伴侶，例如鏈霉素或抗體）。探針可以在結(jié)合于分析物之前或之后固 定。此外，這樣的"可固定的"探針可以與支持物一起接觸樣品。
[0255] 固體支持物可以是目前廣泛使用的或建議用于固定、分離等的任何眾所周知的支 持物或基質(zhì)。這些可以呈現(xiàn)顆粒（例如，磁性或非磁性珠）、片、凝膠、濾器、膜、纖維、毛細(xì)管 或微量滴定條、管、板或孔等的形式。
[0256] 支持物可以由玻璃、硅膠、乳膠或聚合材料制成。適合的材料是具有結(jié)合分析物的 高表面積的材料。這樣的支持物可以具有不規(guī)則的表面并且可以是例如多孔的或顆粒狀 的，例如，顆粒、纖維、纖網(wǎng)、燒結(jié)物或篩。顆粒材料，例如珠，由于其較高的結(jié)合能力從而是 有用的，特別是聚合珠。
[0257] 便利地，根據(jù)本發(fā)明所使用的顆粒固體支持物將包括球形珠。珠的尺寸并不是關(guān) 鍵的，但是它們的直徑至少是1 μ m且優(yōu)選至少是2 μ m，并且最大直徑優(yōu)選不超過10 μ m，例 如不超過6 μ m。
[0258] 單分散顆粒，即尺寸基本均勻的顆粒（例如，具有小于5%的直徑標(biāo)準(zhǔn)偏差的 尺寸），具有提供非常均勻的反應(yīng)重現(xiàn)性的優(yōu)點(diǎn)。代表性的單分散聚合物可以通過在 US-A-4336173中描述的技術(shù)產(chǎn)生。
[0259] 然而，為了幫助操作和分離，磁性的珠是有利的。如本文所用的術(shù)語"磁性的"是 指當(dāng)置于磁場中時(shí)能夠被賦予磁矩的支持物，例如，支持物可以是順磁性的，因此支持物在 該場的作用下可以移動(dòng)。換言之，包括磁性顆粒的支持物可以容易地通過磁聚集而除去，所 述磁聚集在分析物結(jié)合步驟之后提供了快速、簡單和有效的分離顆粒的方式。
[0260] 在另一個(gè)【具體實(shí)施方式】中，除了均質(zhì)分析的非固定的鄰近探針以外，可以使用僅 包括結(jié)合結(jié)構(gòu)域（即，分析物捕獲探針）的固定化的（或可固定的）分析物特異性探針。因 此，在這樣的【具體實(shí)施方式】中，分析物首先被固定的或可固定的捕獲探針?biāo)东@，所述捕獲 探針僅用于將分析物固定在固相上，隨后固定的分析物與鄰近探針培養(yǎng)。在這樣的具體實(shí) 施方式中，捕獲探針可以是能夠直接或間接結(jié)合分析物的任何結(jié)合伴侶（例如，如以上就 鄰近探針的分析物結(jié)合結(jié)構(gòu)域所討論的）。更具體地，這樣的捕獲探針特異性結(jié)合于分析 物。由于該方法的這種【具體實(shí)施方式】需要至少三種探針（結(jié)合結(jié)構(gòu)域）同時(shí)結(jié)合于分析物 或分析物復(fù)合物，因此可能能夠探測(cè)至少三種不同的表位，使分析具有高特異性。
[0261] 在進(jìn)一步的【具體實(shí)施方式】中，分析物本身可以通過例如非特異性吸附來固定（或 可固定）在固相上。在具體的這樣的【具體實(shí)施方式】中，分析物可以存在于細(xì)胞內(nèi)，可選地被 固定和/或滲透，所述細(xì)胞（能夠）連接于固體支持物。
[0262] 上述方法提供對(duì)存在于反應(yīng)混合物的夾板介導(dǎo)的鄰近依賴性相互作用的檢測(cè)，其 反過來提供了對(duì)被分析的樣品中的靶標(biāo)分析物的量的測(cè)量。所述測(cè)量可以是定性或定量 的。
[0263] 因此，上述檢測(cè)一種或多種靶標(biāo)分析物存在的復(fù)雜樣品的方法可用于多種不同的 應(yīng)用。
[0264] 本發(fā)明的方法可以用于針對(duì)樣品中一種或多種靶標(biāo)分析物的存在或不存在來篩 選樣品。如上所述，本發(fā)明提供了對(duì)檢測(cè)樣品中一種或多種靶標(biāo)分析物的存在或者對(duì)樣品 中一種或多種靶標(biāo)分析物的量進(jìn)行定量的方法。
[0265] 本發(fā)明的方法可以用于檢測(cè)多種不同類型的樣品中一種或多種靶標(biāo)分析物的存 在，包括具有大量非靶標(biāo)實(shí)體的復(fù)雜樣品，其中本發(fā)明的方法提供對(duì)靶標(biāo)分析物的高靈敏 度檢測(cè)。因此，本發(fā)明的方法是檢測(cè)簡單樣品中或復(fù)雜樣品中的一種或多種靶標(biāo)分析物的 高靈敏度方法。在很多【具體實(shí)施方式】中，本發(fā)明的方法所分析的樣品是生理來源的，如上更 詳細(xì)地描述的。
[0266] 除了檢測(cè)多種分析物，本發(fā)明的方法還用于篩選化合物，所述化合物是用于調(diào)節(jié) 具有分析物結(jié)合區(qū)域的鄰近探針的分析物結(jié)合結(jié)構(gòu)域之間的相互作用，即，分析物結(jié)合結(jié) 構(gòu)域與分析物的結(jié)合。術(shù)語調(diào)節(jié)包括降低（例如抑制）和增強(qiáng)兩個(gè)分子之間的相互作用。 篩選方法可以是體外或體內(nèi)形式，其中兩種形式均容易由本領(lǐng)域技術(shù)人員研發(fā)。
[0267] 多種不同的候選試劑可以通過上述方法篩選。候選試劑包括大量的化學(xué)種類，但 是它們通常是有機(jī)分子，優(yōu)選分子量大于50且小于2500道爾頓的小有機(jī)化合物。候選試 劑包括與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)相互作用所必須的官能團(tuán)，所述相互作用特別是氫鍵，并且一般包括 至少氨基、羰基、羥基或羧基，優(yōu)選至少兩個(gè)化學(xué)官能團(tuán)。候選試劑通常包括被一個(gè)或多個(gè) 上述官能團(tuán)取代的環(huán)狀碳或雜環(huán)結(jié)構(gòu)和/或芳香或聚芳香結(jié)構(gòu)。候選試劑還可以是生物分 子，包括肽，糖類，脂肪酸，留體，嘌呤，嘧啶，它們的衍生物，結(jié)構(gòu)類似物或組合。
[0268] 候選試劑由多種來源獲得，所述來源包括合成或天然化合物的庫。例如，許多方法 可以用于多種有機(jī)化合物和生物分子的隨機(jī)和定向合成，包括寡核苷酸和寡肽的隨機(jī)化制 備?？蛇x地，細(xì)菌、真菌、植物和動(dòng)物提取物形式的天然化合物庫是可得的或容易制備的。此 夕卜，天然或合成制備的庫和化合物容易通過傳統(tǒng)的化學(xué)、物理和生物化學(xué)手段被修飾，并且 可以用于制備組合庫。已知的藥物試劑可以進(jìn)行定向或隨機(jī)化學(xué)修飾，諸如?；?、烷基化、 酯化、酰胺化等，以產(chǎn)生結(jié)構(gòu)類似物。
[0269] 在上述篩選分析中確定的試劑在多種方法中是有用的，包括調(diào)節(jié)靶標(biāo)分析物活性 的方法，和與其存在和/或活性相關(guān)的條件。
[0270] 本發(fā)明還提供了用于實(shí)施如上所述方法的試劑盒。例如，在一些【具體實(shí)施方式】中， 用于實(shí)施本發(fā)明方法的試劑盒包括至少一組鄰近探針，所述鄰近探針各自包括如上所述的 分析物結(jié)合結(jié)構(gòu)域和核酸結(jié)構(gòu)域。如上所述，某些方案將采用兩個(gè)或多個(gè)不同的這樣的探 針組，以同時(shí)檢測(cè)樣品中的兩種或多種分析物，例如，以多重和/或高通量形式。因此，在某 些【具體實(shí)施方式】中，試劑盒將包括兩個(gè)或多個(gè)不同的鄰近探針組。此外，在使用試劑盒組分 來實(shí)施的方案中可以存在需要或希望的其它試劑，所述其它試劑包括但不限于：一種或多 種如上所述的室溫下無活性或具有最小活性的聚合酶，具有3'核酸外切酶活性的組分，夾 板寡核苷酸（任選地以第三鄰近探針的形式），封閉寡核苷酸，競爭寡核苷酸，用于固定探 針、結(jié)合結(jié)構(gòu)域或分析物的固體支持物，用于固定探針、結(jié)合結(jié)構(gòu)域或分析物的裝置，擴(kuò)增 和檢測(cè)裝置，例如突光標(biāo)記的核苷酸或寡核苷酸或嵌入染料（例如，SYBR Green?和/或 EvaGreen?)，補(bǔ)充核酸對(duì)，單鏈結(jié)合蛋白，和PCR擴(kuò)增試劑（例如，核苷酸、緩沖液、陽離子 等）等。在某些【具體實(shí)施方式】中，試劑盒可以包括用于降低如上所述的培養(yǎng)混合物的有效 體積的元件，例如，體積排阻劑。試劑盒組分可以存在于單獨(dú)的容器中，或一種或多種組分 可以存在于相同的容器中，其中所述容器可以是儲(chǔ)存容器和/或在針對(duì)設(shè)計(jì)的分析過程的 試劑盒中采用的容器。
[0271] 除了上述組分，本發(fā)明試劑盒可以進(jìn)一步包括用于實(shí)施本發(fā)明方法的說明。這些 說明可以按照多種形式存在于本發(fā)明試劑盒中，所述一種或多種說明可以存在于試劑盒 中。這些說明可能存在的一種形式是作為在適合的介質(zhì)或基材上的印刷的信息，所述介質(zhì) 或基材例如是印刷了信息的一張或多張紙，在試劑盒的包裝中，在包裝說明書中等。另一種 裝置可以是記錄了信息的電腦可讀的介質(zhì)，例如，磁盤、CD、閃存盤等?？梢源嬖诘挠忠环N裝 置是網(wǎng)址，所述網(wǎng)址可以通過互聯(lián)網(wǎng)使用，以訪問遠(yuǎn)離的站點(diǎn)的信息。任何便利的裝置都可 以存在于試劑盒中。
[0272] 因此，在另一方面，本發(fā)明提供了一種用于檢測(cè)樣品中分析物的試劑盒，所述試劑 盒包括：
[0273] (a)至少第一和第二鄰近探針的至少一組，每個(gè)探針包括分析物結(jié)合結(jié)構(gòu)域和核 酸結(jié)構(gòu)域并且能夠同時(shí)結(jié)合至分析物，優(yōu)選地，其中一個(gè)或多個(gè)所述鄰近探針的核酸結(jié)構(gòu) 域包括發(fā)夾結(jié)構(gòu)；和
[0274] (b)聚合酶，其特征在于，其在40°C的活性小于其最大酶活性的20%，其中所述聚 合酶最大活性的最適溫度大于40°C ;和
[0275] (c)可選地，具有3'核酸外切酶活性的組分；和
[0276] (d)可選地，用于擴(kuò)增和檢測(cè)所述延伸產(chǎn)物的裝置。
[0277] 如上所述，除了聚合酶，試劑盒還可包括延伸核酸結(jié)構(gòu)域的裝置，這樣的裝置可選 地可以進(jìn)一步包括聚合酶反應(yīng)所必須的試劑（例如核苷酸等）。用于擴(kuò)增和檢測(cè)延伸產(chǎn)物 的裝置，可以是上述在分析方法部分所討論的任何裝置，例如，擴(kuò)增裝置和檢測(cè)其擴(kuò)增產(chǎn)物 的裝置，例如，用于PCR反應(yīng)的試劑（例如，擴(kuò)增引物，和可選地聚合酶和/或核苷酸等）和 用于檢測(cè)PCR擴(kuò)增子等的試劑（例如Taqman?探針，嵌入染料，諸如SYBR Green?和/或 EvaGreen?,等等）。
[0278] 試劑盒可進(jìn)一步可選地包括針對(duì)第一和第二探針的夾板寡核苷酸和/或封閉寡 核苷酸。
[0279] 試劑盒可進(jìn)一步可選地包括針對(duì)分析物的固定化的捕獲探針，或裝備有用于固定 的裝置的捕獲探針?？蛇x地，試劑盒可以包括用于捕獲或結(jié)合于分析物的固相，或一種或多 種所述第一或第二鄰近探針可以固定或裝備有用于固定的裝置。
[0280] 參照以下附圖以及以下非限制性實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述，其中：
[0281] 圖1顯示了五個(gè)不同版本的鄰近延伸分析的示意圖。
[0282] 顯示的條形圖是描繪使用本發(fā)明方法檢測(cè)白細(xì)胞介素 _8 (ΙΟΟρΜ)所用各種 超嗜熱聚合酶和嗜熱聚合酶的活性的，這些酶中的一些具有3'核酸外切酶活性，在所述 檢測(cè)過程中，延伸反應(yīng)在室溫（實(shí)驗(yàn)室溫度）、37°C或45°C進(jìn)行。Pfu-具有3'核酸外切 酶活性的Pfu DNA聚合酶；TLA-具有3'核酸外切酶活性的超嗜熱古細(xì)菌（Thermococcus onnurineus)NAlDNA聚合酶；超超新星（Hypernova)-具有3'核酸外切酶活性的Pwo DNA聚 合酶的變體（突變體）；德爾塔3 (Delta3)-具有降低的3'核酸外切酶活性的Pwo DNA聚 合酶的變體（突變體）；K0D外切+(K0D exo+)-具有3'核酸外切酶活性的超嗜熱始原菌 (Thermococcus kodakaraensis)DNA 聚合酶；K0D 外切-(K0D ex〇-)_ 不具有 3'核酸外切酶 活性的超嗜熱始原菌（Thermococcus kodakaraensis)DNA聚合酶；夢(mèng)Taq(DreamTaq)-不具 有3'核酸外切酶活性的Taq DNA聚合酶的變體。
[0283] _顯示的條形圖是描繪使用本發(fā)明方法檢測(cè)白細(xì)胞介素 _8 (l〇〇pM)所用不同 超嗜熱聚合酶的活性的。Pfu-具有3'核酸外切酶活性的Pfu DNA聚合酶；Pfu外切-(Pfu exo-)-不具有3'核酸外切酶活性的Pfu DNA聚合酶；超超新星（Hypernova)-具有3'核 酸外切酶活性的Pwo DNA聚合酶的變體（突變體）。
[0284] Mi顯示的條形圖是使用本發(fā)明方法檢測(cè)白細(xì)胞介素 -8 (l〇〇pM)所用不同嗜熱聚 合酶的活性進(jìn)行比較的條形圖，其中包括聚合酶在內(nèi)的用于反應(yīng)的延伸步驟的組分在室溫 被加入。Pfu-具有3'核酸外切酶活性的Pfu DNA聚合酶；T4-具有3'核酸外切酶活性的 T4DNA聚合酶。
[0285] 顯示了條形圖描繪了使用本發(fā)明方法檢測(cè)白細(xì)胞介素 _8 (IL8)或神經(jīng)膠質(zhì) 細(xì)胞-衍生的神經(jīng)營養(yǎng)因子（⑶NF)時(shí)所用的Pfu DNA聚合酶活性，其中延伸反應(yīng)在45°C 或50°C進(jìn)行。被延伸以形成延伸產(chǎn)物的鄰近探針的核酸結(jié)構(gòu)域是線性的（原始Hyb)(Hyb Orig)或包括發(fā)夾結(jié)構(gòu)（Hyb#3或Hyb#5)。
[0286] 遷衛(wèi)是顯示在本發(fā)明方法中使用Pw〇 DNA聚合酶來檢測(cè)樣品中不同濃度的分析物 所產(chǎn)生的信號(hào)的折線圖。該圖顯示了使用偶聯(lián)至線性核酸結(jié)構(gòu)域（VEGF org)的鄰近探針 與偶聯(lián)至包含發(fā)夾結(jié)構(gòu)的核酸結(jié)構(gòu)域（VEGF HP5)的鄰近探針的分析之間的區(qū)別。
[0287] S1顯示了偶聯(lián)至具有如下結(jié)構(gòu)的核酸結(jié)構(gòu)域的鄰近探針的比較：線性結(jié)構(gòu)（1)， 封閉構(gòu)象的發(fā)夾結(jié)構(gòu)（2)和開放構(gòu)象的發(fā)夾結(jié)構(gòu)（3)。
[0288] _顯示了針對(duì)血漿樣品，PEA的不同定量PCR分析的比較。 實(shí)施例
[0289] 鄰近-探針的制備
[0290] 使用三份（batch)多克隆抗體（IL8(針對(duì)白細(xì)胞介素 -8) :RnD系統(tǒng)、AF-208-NA ; VEGF(針對(duì)血管內(nèi)皮生長因子）：AF-193-NA ;⑶NF(針對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞系-衍生的神經(jīng)營養(yǎng) 因子）：AF-212-NA)。使用Innovas Lightning-Link綴合技術(shù)將每一批多克隆抗體偶聯(lián)至 兩條不同的ssDNA鏈。每條鏈通過5'端偶聯(lián)至抗體：
[0291] A-綴合物（參見圖7)
[0292] 5' TCACGGTAGCATAAGGTGCAGTATGAGAACTTCGCTACAG-3' （SEQ ID N0:3);
[0293] B-綴合物（參見圖7)
[0294] 5, -GGCCCAAGTGTTAATTTGCTTCACGATGAGACTGGATGAA-3' （SEQ ID N0:4)。
[0295] 被稱為"延伸寡核苷酸"的第三寡核苷酸以4:1 (寡核苷酸：綴合物）的比值雜交 至A-綴合物。
[0296] 對(duì)三種不同的"延伸寡核苷酸"進(jìn)行了測(cè)試，其中它們中的兩種已被設(shè)計(jì)為在低溫 形成發(fā)夾環(huán)。
[0297] 原始的（線性寡核苷酸）：
[0298] 5'-CTGTAGCGAAGTTCTCATACTGCACCTTATGCTACCGTGACCTGCGAATCCAGTCT-3' （SEQ ID NO:5)；
[0299] HP3(發(fā)夾寡核苷酸）：
[0300] 5 '-CTGTAGCGAAGTTCTCATACTGCACCTTATGCTACCGTGAAGACTGAATCCAGTCT-3 ' (SEQ ID NO:6)；
[0301] HP5(發(fā)夾寡核苷酸）：
[0302] 5 '-CTGTAGCGAAGTTCTCATACTGCACCTTATGCTACCGTGAAGGCTGAATCCAGTCT-3 ' (SEQ ID NO: 7)
[0303] 以粗體加下劃線來標(biāo)出發(fā)夾寡核苷酸中的互補(bǔ)核苷酸。
[0304] 鄰沂延伸分析（PEA)中測(cè)試不同的聚合酶
[0305] 使用下面描述的方案來測(cè)試不同聚合酶以測(cè)定它們?cè)卩徑由旆治鲋械男省＝Y(jié) 果顯示在圖2中，圖2證實(shí)超嗜熱聚合酶，例如Pfu和Pwo (超超新星和德爾塔3)，能夠在室 溫下被加入到包含鄰近探針和靶標(biāo)分析物的樣品中，當(dāng)與不含酶的分析比較時(shí)，它們?cè)赑EA 中不會(huì)產(chǎn)生顯著的信號(hào)。這表明這些酶在室溫下是無聚合酶活性或只具有聚合酶最小活性 的。對(duì)于Pfu和Pwo而言，在37°C和45°C培養(yǎng)的PEA中產(chǎn)生的信號(hào)能夠清楚地區(qū)別于室溫 下培養(yǎng)的PEA中產(chǎn)生的信號(hào)。相反，在上述三個(gè)測(cè)試溫度中任一溫度下，使用嗜熱聚合酶的 分析中產(chǎn)生的信號(hào)不容易被區(qū)別開，即，這些聚合酶在PEA中顯示高背景活性。
[0306] 方案 #1
[0307] 將1 μ L樣品（PBS+0. 1 % BSA緩沖液，來自RnD系統(tǒng)的抗原標(biāo)準(zhǔn)品（IL-8 : 208-IL-010/CF ;VEGF :293-VE-010/CF ;⑶NF :212-GD-010/CF)，EDTA 血漿）與 4 μ L 含有如 下物質(zhì)的pH為6. 7的分析溶液進(jìn)行混合：0. 084mg/ml山羊IgG(西格瑪奧德里奇19140) (Sigma Aldrich 19140)，50 μ g/ml 單鏈鮭魚精子 DNA(西格瑪奧德里奇 D7656) (Sigma Aldrich D7656)，0.05%魚膠（西格瑪 G7765)(Sigma G7765)，0.1%BSA，4mM EDTA，0.1% Triton-X100,1 μ M 封閉綴合物（Olink AB，國際專利 W02012/007511)和 133pM 的每種 PEA 綴合物（鄰近探針，如上所述）。將反應(yīng)混合物在37°C培養(yǎng)1小時(shí)。
[0308] 在25°C，將96yL含有如下物質(zhì)的稀釋混合物加入到培養(yǎng)的樣品中：67.7mM 1'1^8-!1(：1口!18.8，171111硫酸銨，2.111111%(：1 2，1.〇1111二硫蘇糖醇，31.3 4]\1(每種）的(1階13和 〇· 5 單位的 DNA 聚合物（Pfu (富酶泰斯，EP0572) (Fermentas，EP0572)，TLA (柏業(yè)，E-3200) (Bioneer，E-3200)，超超新星（DNA 格旦斯克，RP23) (DNA Gdansk，RP23)，德爾塔 3(DNA 格旦 斯克，RP22) (DNA Gdansk，RP22)，K0D (東洋紡，K0D-101) (1'〇7〇13〇，1(00-101)，1(00外切-(東 洋紡）（Toyobo)，夢(mèng) Taq (富酶泰斯，EP0703) (Fermentas，EP0703))。反應(yīng)板在 PCR 儀中在 25°C培養(yǎng)10分鐘，隨后在25°C、37°C或45°C培養(yǎng)20分鐘，之后在80°C培養(yǎng)10分鐘。
[0309] 對(duì)于延伸產(chǎn)物的qPCR檢測(cè)，將4 μ L延伸產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到qPCR板中，并且與6yL 9?〇?混合物（25禮1^8-!1(：1?!18.2，11.31111氯化鎂，5〇1111氯化鉀，8.31111硫酸銨，8.3% 海藻糖（阿克羅斯有機(jī)，182550250) (Acros Organics，182550250)，333 μ Μ(每種）dNTP， 1. 67mM 二硫蘇糖醇，833nM 的每種引物（正向：5' -TCGTGAGCCCAAGTGTTAATTTGCTTCACGA-3' (SEQIDN0:8)，反向：5，-TGCAGTCTGTAGCGAAGTTCTCATACTGCA-3'（SEQIDN0:9))，0·25X SYBR Green (GTF 費(fèi)舍爾科技，307104406) (GTF Fisher Scientific，307104406)，0.25U 白 金 Taq (英駿，300100338) (Invitrogen，300100338)和 2μΜ R0X 參比物（GTF 費(fèi)舍爾科技， 307101211) (GTF Fisher Scientific, 307101211))進(jìn)行混合。兩步 qPCR 在如下條件下運(yùn) 行：起始的變性步驟在95°C進(jìn)行5分鐘，隨后是45個(gè)循環(huán)的變性，每次是95°C變性15秒， 之后是在60°C結(jié)合的退火和延伸進(jìn)行1分鐘。
[0310] 鄰沂延伸分析（PEA)中測(cè)試不同的鄰沂探針核酸結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)
[0311] 使用下面描述的方案來測(cè)試不同鄰近探針核酸結(jié)構(gòu)域以測(cè)定它們?cè)卩徑由旆?析中的效率。結(jié)果顯示在圖5中，圖5證實(shí)展開鄰近探針，即偶聯(lián)至含有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的核酸結(jié) 構(gòu)域的鄰近探針對(duì)于改善在PEA中信號(hào)：噪音比是有用的。
[0312] PEA 方案 #2
[0313] 將1 μ L樣品（PBS+0. 1 % BSA緩沖液，來自RnD系統(tǒng)208-IL-010的IL-8抗原 標(biāo)準(zhǔn)品，EDTA血漿）與4 μ L含有如下物質(zhì)的pH為6. 7的分析溶液進(jìn)行混合：0. 084mg/ ml山羊IgG (西格瑪奧德里奇19140) (Sigma Aldrich 19140)，50 μ g/ml單鏈鮭魚精子 0嫩（西格瑪奧德里奇07656)(3丨811^41(11^(*07656)，0.05%魚膠（西格瑪67765)(3丨 811^ G7765)，(λl%BSA，4mMEDTA，(λl%Triton-X100，lμM封閉綴合物（01inkAB，國際專利 W02012/007511)和133pM的每種PEA綴合物（鄰近探針，如上所述）。反應(yīng)混合物在37°C 培養(yǎng)1小時(shí)。
[0314] 在25°C，將96yL含有如下物質(zhì)的稀釋混合物加入到培養(yǎng)的樣品中：67.7mM 1'1^8-!1(：1?!18.8，171111硫酸銨，2.111111%(：12，1.〇1111二硫蘇糖醇和31.3 4]\1(每種）的(1階13。 然后，反應(yīng)板在45°C或50°C培養(yǎng)30分鐘。
[0315] 對(duì)于延伸產(chǎn)物的qPCR檢測(cè)，將4yL延伸產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到qPCR板中，并且與6yL qPCR 混合物（25mM Tris-HCl pH8. 2，11.3mM氯化鎂，50mM氯化鉀，8. 3mM硫酸銨，8. 3%海藻糖 (阿克羅斯有機(jī)，182550250) (Acros Organics，182550250)，333 μ Μ(每種）dNTP，1. 67mM 二 硫蘇糖醇，833nM 的每種引物（正向：5' -TCGTGAGCCCAAGTGTTAATTTGCTTCACGA-3'（SEQ ID NO: 10)，反向：5, -TGCAGTCTGTAGCGAAGTTCTCATACTGCA-3,（SEQ ID NO: 11)，Biomers 公司）， 0.25X SYBR Green(GTF 費(fèi)舍爾科技，307104406) (GTF Fisher Scientific，307104406)， 0.25U 白金Taq(英駿，300100338) (Invitrogen，300100338)和 2μΜ ROX參比物（GTF 費(fèi)舍 爾科技，307101211) (GTF Fisher Scientific, 307101211))進(jìn)行混合。兩步 qPCR 在如下條 件下運(yùn)行：起始的變性步驟在95°C進(jìn)行5分鐘，隨后是45個(gè)循環(huán)的變性，每次是95°C變性 15秒，之后是在60°C結(jié)合的退火和延伸進(jìn)行1分鐘。
[0316] 圖6顯示來自與上述方案等同分析的結(jié)果，其中，使用線性雜交寡核苷酸和一種 發(fā)夾寡核苷酸對(duì)檢測(cè)不同濃度VEGF進(jìn)行了測(cè)定。結(jié)果清楚地表明使用本發(fā)明方法中的發(fā) 夾寡核苷酸可進(jìn)一步改善信號(hào)：噪音比。
[0317] 在鄰沂延伸分析（PEA)中軺嗜熱聚合酶和非耐熱聚合酶的比較
[0318] 使用下面描述的方案對(duì)兩種聚合酶，即Pfu和T4DNA聚合酶，進(jìn)行比較以測(cè)定它 們?cè)卩徑由旆治鲋械男?。結(jié)果顯示于圖4中，圖4證實(shí)與室溫下具有高活性的酶例如 T4DNA聚合酶相比，室溫下無活性或具有最小活性的酶，例如Pfu,顯示了改善的信號(hào)：噪音 比。
[0319] PEA 方案 #3
[0320] 將1 μ L樣品（PBS+0. 1 % BSA緩沖液，來自RnD系統(tǒng)208-IL-010的IL-8抗原 標(biāo)準(zhǔn)品，EDTA血漿）與4 μ L含有如下物質(zhì)的pH為6. 7的分析溶液進(jìn)行混合：0. 084mg/ ml山羊IgG(西格瑪奧德里奇19140) (Sigma Aldrich 19140)，50 μ g/ml單鏈鮭魚精子 0嫩（西格瑪奧德里奇07656)(3丨811^41(11^(*07656)，0.05%魚膠（西格瑪67765)(3丨 811^ G7765)，(λl%BSA，4mMEDTA，(λl%Triton-X100，lμM封閉綴合物（01inkAB，國際專利 W02012/007511)和133pM的每種PEA綴合物（鄰近探針，如上所述）。反應(yīng)混合物在37°C 培養(yǎng)1小時(shí)。
[0321] 探針培養(yǎng)后，將樣品轉(zhuǎn)移至熱循環(huán)儀，放置在37°C。將76 μ L含有如下物質(zhì)的稀 釋混合物加入到培養(yǎng)的樣品中：56. 5mM Tris-HCl pH8. 8，16. 8mM硫酸銨，l.OlmM氯化鎂和 ImM二硫蘇糖醇。在37°C 5分鐘之后，第二次加入20 μ L延伸混合物（59. 3mM Tris-HCl pH8. 8,17. 7mM硫酸銨，1. 05mM二硫蘇糖醇，ImM氯化鎂，和1單位的T4DNA聚合酶（富酶 泰斯，#EP0062) (Fermentas，#EP0062)或 0· 5 單位的 Pfu DNA 聚合酶（富酶泰斯，EP0572) (Fermentas，EP0572))。延伸反應(yīng)在25°C或37°C進(jìn)行1或20分鐘，然后在85°C加熱滅活 10分鐘。
[0322] 對(duì)于延伸產(chǎn)物的qPCR檢測(cè)，將4yL延伸產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到qPCR板中，并且與6yL qPCR 混合物（24. 3mM Tris-HCl pH8. 2,10. 6mM氯化鎂，48. 3mM氯化鉀，8. ImM硫酸銨，8. 1%海藻 糖（阿克羅斯有機(jī)，182550250) (Acros Organics，182550250)，333 μ Μ(每種）dNTP，1. 62mM 二硫蘇糖醇，806nM 的每種引物（正向：5' -TCGTGAGCCCAAGTGTTAATTTGCTTCACGA-3'（SEQ IDN0:12)，反向：5'-TGCAGTCTGTAGCGAAGTTCTCATACTGCA-3'（SEQIDN0:13)，Biomers公 司），403nM 分子信標(biāo)（FAM-CCCGCTCGCTTATGCTACCGTGACCTGCGAATCCCGAGCGGG-DABSYL, (SEQ ID NO: 14)Biomers 公司），白金Taq(英駿，300100338) (Invitrogen，300100338)和 1· 93 μ Μ R0X 參比物（GTF 費(fèi)舍爾科技，307101211) (GTF Fisher Scientific, 307101211))進(jìn)行混合。 兩步qPCR在如下條件下運(yùn)行：起始的變性步驟在95°C進(jìn)行5分鐘，隨后是45個(gè)循環(huán)的變 性，每次是95°C變性15秒，之后是在60°C結(jié)合的退火和延伸進(jìn)行1分鐘。
[0323] 俥用不同的實(shí)時(shí)（定量）PCR分析的鄰沂延伸分析的比較
[0324] 圖8說明了標(biāo)準(zhǔn)化的熒光信號(hào)，隨和每次PCR循環(huán)（A-C)其是增加的。當(dāng)使用分子 信標(biāo)時(shí)觀察到了基線的明顯不同，這在使用非序列特異性的嵌入染料時(shí)是不會(huì)觀察到的， 嵌入染料諸如是SybrGreen?或EvaGreen?(比較A與B，和A與C)。相比于等體積的含 PBS的緩沖液，100 μ 1的總反應(yīng)體積中少至1 μ 1的血漿或血清可提高基線。血漿樣品中這 種升高的基線會(huì)影響對(duì)數(shù)期曲線的斜率，使得難以正確設(shè)置閾值，從而導(dǎo)致Ct值的誤算并 經(jīng)常導(dǎo)致回收率遠(yuǎn)超過100%。使用整合至雙鏈DNA的SybrGreen'?或EvaGreen?的分析 看起來并沒有受到?μ 1血漿或血清的影響，且更一致的給出了更接近約100%的回收率。
[0325] ΡΕΑ 方案 #4
[0326] 綴合于探針Α或探針Β (如上所述）的50ρΜ的VEGF抗體的混合物與1 μ 1緩沖液 或者1 μ 1人血漿（EDTA)或血清一起以4μ 1的總體積在37°C培養(yǎng)1小時(shí)。
[0327] 培養(yǎng)后，將96 μ 1延伸溶液與0. 25 μ Μ分子信標(biāo)、0.15x SybrGreen?或〇. i25x EvaGreen?加入到上述培養(yǎng)混合物（50mM三羥甲基氨基甲烷（Tris)，0. 75mM MgCl2， 0.75mM DTT，12.5mM AmS04,2mM Mg2S04,0.15% 曲通（Triton)，0.15%BSA，2.08%Trealos， 0. ImM的每種dNTP，lyM正向引物和反向引物，0. 6μΜ R0X，1U超超新星聚合酶（+1U獵豹 Taq(Cheeta Taq)，用于分子信標(biāo)分析））。起始延伸步驟（50°C20分鐘）之后進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增 步驟（對(duì)于分子信標(biāo)，95°C，15秒；60°C，30秒；76°C，30秒；xlO個(gè)循環(huán)，對(duì)于SybrGreen和 EvaGreen，95°C，15秒；60°C，1分鐘；xlO個(gè)循環(huán)）。預(yù)擴(kuò)增步驟之后，將20 μ 1反應(yīng)混合物轉(zhuǎn) 移到實(shí)時(shí)PCR板，并采用如下條件進(jìn)行分析和擴(kuò)增：分子信標(biāo)（MB) :95°C，5分鐘+ (95°C，10 秒；5CTC，30 秒；72°C，30 秒）x40 個(gè)循環(huán)；SybrGreen 和 EvaGreen (Sybr/EvaGreen) :95°C，5 分鐘+ (95°C，15秒；60°C，1分鐘）x40個(gè)循環(huán)）。
[0328] 表 1
[0329]

【權(quán)利要求】
1. 一種檢測(cè)樣品中分析物的方法，包括： (a) 將所述樣品與至少第一和第二鄰近探針的至少一組接觸，每個(gè)探針包括分析物結(jié) 合結(jié)構(gòu)域和核酸結(jié)構(gòu)域，并能夠同時(shí)結(jié)合至分析物； (b) 在所述鄰近探針與所述分析物結(jié)合時(shí)，使鄰近探針的核酸結(jié)構(gòu)域彼此相互作用，其 中所述相互作用包括雙鏈體的形成； (c) 延伸所述雙鏈體的至少一個(gè)核酸結(jié)構(gòu)域的3'端以生成延伸產(chǎn)物，其中，延伸反應(yīng) 包括將分析的溫度提高至超過室溫并使用聚合酶，所述聚合酶的特點(diǎn)是40°C時(shí)其具有小于 最大酶活性的20%的活性，且25°C時(shí)其具有小于最大酶活性的10%的活性，其中，所述聚 合酶的最大活性的最適溫度是高于40°C，且其中所述聚合酶選自強(qiáng)烈火球菌（Pfu) DNA聚 合酶和沃氏火球菌（Pwo) DNA聚合酶，或者它們的衍生物或其突變體，優(yōu)選地其中所述衍生 物是序列-修飾的衍生物；和 (d) 擴(kuò)增和檢測(cè)延伸產(chǎn)物。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，在其它參數(shù)是最適的分析條件下來測(cè)定不同溫 度下聚合酶的活性。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中，所述聚合酶的特點(diǎn)是在40°C時(shí)，其具有小于 最大酶活性的15%的活性,優(yōu)選地，其具有小于最大酶活性的10%的活性。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述聚合酶的最大活性的最適溫度是 至少50°C，優(yōu)選至少60°C或70°C。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述聚合酶由包括SEQ ID NO: 1的核苷 酸序列或者與其具有至少80^^85%或90%序列一致性的核苷酸序列所編碼。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述聚合酶包括SEQ ID NO: 2的多肽序 列或者與其具有至少80^^85%或90%序列一致性的多肽序列。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述的方法，其中，將所述分析的溫度提高到至少30°C，優(yōu) 選至少 35°C、40°C、45°C、50°C或 55°C。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)所述的方法，其中，鄰近探針組中的至少一個(gè)鄰近探針是 展開鄰近探針，包括偶聯(lián)至具有至少一個(gè)發(fā)夾結(jié)構(gòu)的核酸結(jié)構(gòu)域的分析物結(jié)合結(jié)構(gòu)域，優(yōu) 選地其中所述展開鄰近探針的核酸結(jié)構(gòu)域的發(fā)夾結(jié)構(gòu)包括核酸結(jié)構(gòu)域的游離3'可延伸端。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中，展開后，所述第一和第二鄰近探針的核酸結(jié)構(gòu)域 互相互補(bǔ)，或者與通用模板互補(bǔ)。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)所述的方法，其中，在所述樣品與聚合酶接觸之前，將步 驟（d)擴(kuò)增反應(yīng)所用的一些或全部試劑加入到樣品中，或者其中，所述一些或全部試劑與 聚合酶同時(shí)接觸樣品，優(yōu)選地其中，在步驟（b)和（c)之間加入所述試劑。
11. 根據(jù)權(quán)利要求1-10任一項(xiàng)所述的方法，其中，步驟（d)包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，優(yōu)選 地其中，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。
12. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中，定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)使用插入核酸分子以提 供檢測(cè)信號(hào)的染料，優(yōu)選熒光信號(hào)。
13. 根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中，插入核酸分子以提供檢測(cè)信號(hào)的染料是 SYBR Green?或 EvaGreen?。
14. 根據(jù)權(quán)利要求1-13任一項(xiàng)所述的方法，其中，第一和第二鄰近探針的一個(gè)或兩個(gè) 核酸結(jié)構(gòu)域在步驟（C)被延伸。
15. 根據(jù)權(quán)利要求1-13任一項(xiàng)所述的方法，其中，至少一個(gè)核酸結(jié)構(gòu)域是部分雙鏈的。
16. 根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中，部分雙鏈的核酸結(jié)構(gòu)域包括雜交至夾板寡核 苷酸的單個(gè)單鏈核酸結(jié)構(gòu)域，優(yōu)選地其中，步驟（a)之前，夾板寡核苷酸預(yù)雜交至所述鄰近 探針之一的核酸結(jié)構(gòu)域。
17. 根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中，夾板寡核苷酸在步驟（c)被延伸以形成延伸產(chǎn) 物。
18. 根據(jù)權(quán)利要求16或17所述的方法，其中，夾板寡核苷酸作為游離核酸分子而被單 獨(dú)提供。
19. 根據(jù)權(quán)利要求1-18任一項(xiàng)所述的方法，包括使用幾組的至少第一和第二鄰近探針 的多重分析，其中每組產(chǎn)生唯一的延伸產(chǎn)物。
20. 根據(jù)權(quán)利要求1-19任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述至少第一和第二鄰近探針中的 至少一個(gè)的分析物結(jié)合結(jié)構(gòu)域是抗體，或者其結(jié)合片段或其衍生物。
21. -種用于檢測(cè)樣品中分析物的方法所用的試劑盒，所述試劑盒包括： (a) 至少第一和第二鄰近探針的至少一組，每個(gè)探針包括分析物結(jié)合結(jié)構(gòu)域和核酸結(jié) 構(gòu)域并且能夠同時(shí)結(jié)合至分析物，優(yōu)選地，其中一個(gè)或多個(gè)所述鄰近探針的核酸結(jié)構(gòu)域包 括發(fā)夾結(jié)構(gòu)；和 (b) 聚合酶，其特點(diǎn)是其在40°C的活性小于其最大酶活性的20%并且其在25°C的活性 小于其最大酶活性的10%，其中所述聚合酶的最大活性的最適溫度是高于40°C，且其中所 述聚合酶選自強(qiáng)烈火球菌（Pfu) DNA聚合酶和沃氏火球菌（Pwo) DNA聚合酶，或者它們的衍 生物或其突變體，優(yōu)選地其中所述衍生物是序列-修飾的衍生物；和 (c) 可選地，具有3'核酸外切酶活性的組分；和 (d) 可選地，用于擴(kuò)增和檢測(cè)所述延伸產(chǎn)物的裝置。
22. 根據(jù)權(quán)利要求21所述的試劑盒，進(jìn)一步包括針對(duì)第一和/或第二探針的夾板寡核 苷酸和/或封閉寡核苷酸。
23. 根據(jù)權(quán)利要求21或22所述的試劑盒，其中，所述聚合酶如權(quán)利要求2-6任一項(xiàng)所 定義。
24. 根據(jù)權(quán)利要求21-23任一項(xiàng)所述的試劑盒，包括擴(kuò)增和檢測(cè)延伸產(chǎn)物的方法，其 中，所述用于擴(kuò)增的方法包括擴(kuò)增引物，并且所述用于檢測(cè)的方法包括嵌入染料，優(yōu)選地其 中，所述染料是 SYBR GreeiT? 或 EvaGreen?。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104114718SQ201380007279
【公開日】2014年10月22日 申請(qǐng)日期:2013年1月29日 優(yōu)先權(quán)日:2012年1月30日
【發(fā)明者】S·弗雷德里克松, M·倫德伯格, A·埃里克松, E·倫內(nèi)爾-狄更斯 申請(qǐng)人:歐凌科公司