專利名稱：自動捕獲、識別細胞生物芯片及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物細胞學檢測技術(shù)，具體地講是一種細胞芯片——自動捕獲、識別細胞的生物芯片及其制備方法。
背景技術(shù)：
近年來，隨著后基因組時代的到來，生物芯片技術(shù)得到了迅猛發(fā)展，包括基因芯片、蛋白芯片、 抗體芯片、細胞芯片、組織芯片在內(nèi)的不同功能的生物芯片相繼問世?；蛐酒夹g(shù)的研究成果應用范圍最為廣泛。它不但可以應用于疾病發(fā)病機理、功能基因組學等方面的基礎(chǔ)研究，還可以用于遺傳病檢測、感染性疾病檢測、腫瘤相關(guān)基因檢測等多方面的疾病診斷。但基因芯片只能檢測樣品中核酸，往往由于其高成本和特殊的設(shè)備需要，限制了其在臨床中的應用。蛋白、抗體芯片用于分析樣品中的蛋白質(zhì)種類及其含量?，F(xiàn)有的細胞芯片是在芯片上制成微池陣列，然后在不同的微池中人為的加入不同類型的細胞，用于觀察不同種類的細胞生理、生化指標的變化；另一類細胞芯片是將細胞在芯片上培養(yǎng)形成單細胞層，研究細胞的單生理現(xiàn)象，尤其有利于神經(jīng)細胞神經(jīng)信號產(chǎn)道方面的研究。目前，檢測檢測某些細胞的方法，如惡性腫瘤細胞的檢測方法主要是原位雜交和免疫組化。原位雜交只能一次檢測一個標本，當許多標本需要檢測時，則需要一個一個檢測，費時費力，不能進行高通量檢測。而將免疫組化應用在組織芯片中彌補了這一缺陷，但組織芯片在制片過程中細胞核通常被切斷，不能提供完整的信息。所以需要一種新的高通量檢測細胞并且省時省錢的方法。

發(fā)明內(nèi)容
1、發(fā)明目的本發(fā)明提供一種自動捕獲、識別細胞生物芯片及其制備方法，其目的在于提供一種高通量檢測、又能提供完整的信息、和降低檢測的成本及不需要特殊設(shè)備。
2、技術(shù)方案本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來加以實現(xiàn)的一種自動捕獲、識別細胞的生物芯片，其特征在于它是在玻璃基片上分布有多個不同區(qū)域的微陣列，在每個微陣列區(qū)域中，分別固定識別不同類型細胞膜表面特殊的生物分子特異性探針，同時另設(shè)有質(zhì)控探針和陣列位置指示探針。
一種自動捕獲、識別細胞的生物芯片的制備方法，其特征在于配制探針點樣溶液，溶液濃度為150mg/L，PH＝9.5；在玻璃基片上進行點樣，點的大小為50～500微米；點好的芯片于37℃下水化45分鐘，然后在40℃下烘干2小時；以緩沖液及蒸餾水沖洗玻片，吹干；以封閉液封閉玻片，之后洗滌3次后，制備成成品。
一種自動捕獲、識別細胞的生物芯片的使用方法，其特征在于使用方法按如下步驟進行(1)洗滌細胞取含有游離細胞的樣品，用PBS洗三次，每次5分鐘，調(diào)整細胞濃度在108/L；(2).細胞雜交將細胞懸液直接滴在芯片上，室溫濕盒中雜交20分鐘，中間搖動三次；(3).雜交結(jié)果觀察用室溫放置的PBS漂洗玻片，用普通光學顯微鏡低倍鏡觀察，以背景干凈為宜；
(5).細胞固定用2.5％戊二醛固定細胞5分鐘；(6).形態(tài)觀察用瑞氏染液常規(guī)染色，時間為15分鐘；(7).分群鑒定用三色熒光染料對細胞芯片進行染色，用熒光掃描儀掃描觀察、檢測。
3、優(yōu)點及效果本發(fā)明設(shè)計了一種新型的細胞芯片，其原理是應用細胞膜表面特殊的生物分子，與結(jié)合在玻片上能與細胞表面特殊分子發(fā)生特異性結(jié)合，通過一次實驗可以將被測細胞懸液中不同類型的細胞分離、固定在同一張玻片的不同區(qū)域。由于以玻片為介質(zhì)，擺脫了硝酸纖維素膜的易脆性和不透明性，繼而為后續(xù)的各種操作奠定了良好的基礎(chǔ)。而且檢測結(jié)果觀察可以不需特殊設(shè)備，僅應用一臺普通光學顯微鏡即可。如果條件允許，也可以進行雜交信號的掃描等高通量分析。
四、實施方式；我們研制的細胞芯片利用生物大分子間的相互作用，將能與細胞表面分子發(fā)生結(jié)合作用的生物分子，以陣列的形式固定在玻璃表面不同的位點上，通過特異結(jié)合實現(xiàn)對不同種類細胞自動捕捉、識別、在特定位點分別固定不同種類的細胞。尤其在惡性腫瘤中，基因的突變產(chǎn)生特異性蛋白質(zhì)，通常這種蛋白質(zhì)會在病變細胞的不同部位得以表現(xiàn)，所以細胞學檢測在惡性腫瘤的診斷與治療中的作用是十分重要的。
一種自動捕獲、識別細胞的生物芯片，其特征在于它是在玻璃基片上分布有多個不同區(qū)域的微陣列，在每個微陣列區(qū)域中，分別固定識別不同類型細胞的膜蛋白、膜糖類特異性探針，同時另設(shè)有質(zhì)控探針和陣列位置指示探針。能夠?qū)崿F(xiàn)在陣列點原位自動捕獲、識別不同類型細胞，達到篩選、定點固定細胞的目的。
根據(jù)不同細胞表面分子的特征，選擇細胞調(diào)亡調(diào)控因子抗體，用于研究惡性腫瘤的預后；選擇細胞表面糖蛋白抗體，用于鑒別不同類型(腫瘤)細胞及耐藥性抗藥研究；選擇原癌基因蛋白的抗體，研究乳腺癌、卵巢癌、肺癌、胃癌、食道癌、宮頸癌、涎腺癌、膀胱癌等預后及鑒別良惡型細胞；利用細胞骨架蛋白抗體，研究惡性腫瘤轉(zhuǎn)移及浸潤機制；利用白細胞表面分類抗原，分析血液和各種體液中細胞的種類及惡性腫瘤的鑒別；利用細胞表面膜受體抗體，鑒別不同細胞類型；利用惡性腫瘤細胞膜標志物抗體，鑒別腫瘤的類型。
由于芯片是在玻璃基片捕獲并且固定細胞，因此在捕獲細胞后，可以針對該細胞進行常規(guī)染色、組織化學染色、原位雜交、細胞培養(yǎng)、藥物分析等多種后續(xù)處理，進行細胞學分析、觀察。
本發(fā)明實施的具體步驟是(1).根據(jù)需要設(shè)定點樣程序，矩陣分布根據(jù)檢測要求及點樣方便與否安排。使用CEL公司生產(chǎn)的玻璃基片，用BioRobotics公司的點樣儀按預先設(shè)定好的程序進行點樣。按照不同要求從幾十點到上千點，點的大小為50-500微米左右，點間距依點的數(shù)量而定?？贵w點樣溶劑為PBS水溶液pH＝9.5；溶質(zhì)為蛋白，抗體濃度150mg/L，然后將點好的芯片于37℃下水化45分鐘，然后在40℃下烘干2小時。以緩沖液(PBS，0.1％SDS)及蒸餾水沖洗玻片，吹干。以封閉液(1％BSA，PH＝7 0.01mol/l PB)封閉玻片，之后洗滌3次。吹干備用。
上述自動捕獲、識別細胞芯片的應用方法包括以下步驟(以CD3；CD4；CD8淋巴細胞檢測為例)
(1).洗滌細胞取含有游離細胞的樣品，用PBS洗三次，每次5分鐘，調(diào)整細胞濃度在108/L。
(2).細胞雜交將細胞懸液直接滴在芯片上，室溫濕盒中雜交20分鐘，中間搖動三次。
(3).雜交結(jié)果觀察用室溫放置的PBS漂洗玻片，用普通光學顯微鏡低倍鏡觀察，以背景干凈為宜。
(4).細胞固定用2.5％戊二醛固定細胞5分鐘。
(5).形態(tài)觀察用瑞氏染液常規(guī)染色，時間為15分鐘。
(6).分群鑒定用CD3-Cy5+CD4-FITC+CD8-RPE三色熒光染料對細胞芯片進行染色，用Genomic Solutions公司的熒光掃描儀掃描觀察。
權(quán)利要求
1.一種自動捕獲、識別細胞的生物芯片，其特征在于它是在玻璃基片上分布有多個不同區(qū)域的微陣列，在每個微陣列區(qū)域中，分別固定識別不同類型細胞膜表面特殊的生物分子特異性探針，同時另設(shè)有質(zhì)控探針和陣列位置指示探針。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種自動捕獲、識別細胞的生物芯片的制備方法，其特征在于配制探針點樣溶液，溶液濃度為150mg/L，PH＝9.5；在玻璃基片上進行點樣，點的大小為50～500微米；點好的芯片于37℃下水化45分鐘，然后在40℃下烘干2小時；以緩沖液及蒸餾水沖洗玻片，吹干；以封閉液封閉玻片，之后洗滌3次后，制備成成品。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種自動捕獲、識別細胞的生物芯片的使用方法，其特征在于使用方法按如下步驟進行(1)洗滌細胞取含有游離細胞的樣品，用磷酸鹽緩沖液洗三次，每次5分鐘，調(diào)整細胞濃度在108/L；(2).細胞雜交將細胞懸液直接滴在芯片上，室溫濕盒中雜交20分鐘，中間搖動三次；(3).雜交結(jié)果觀察用室溫放置的磷酸鹽緩沖液漂洗玻片，用普通光學顯微鏡低倍鏡觀察，以背景干凈為宜；(4).細胞固定用2.5％戊二醛固定細胞5分鐘；(5).形態(tài)觀察用瑞氏染液常規(guī)染色，時間為15分鐘；(6).分群鑒定用三色熒光染料對細胞芯片進行染色，用熒光掃描儀掃描觀察、檢測。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物細胞學檢測技術(shù)，它是在玻璃基片上分布有多個不同區(qū)域的微陣列，在每個微陣列區(qū)域中，分別固定有可以與細胞表面生物分子特異結(jié)合有機分子。利用有機分子與細胞表面生物分子相互作用，將不同種類的細胞分離、固定在同一張芯片不同的點位上，經(jīng)掃描儀掃描或顯微鏡觀察芯片上不同位點細胞結(jié)合的情況進行處理分析，獲得細胞類型的信息。這種芯片能同時檢測多種類型細胞的形態(tài)，并分析其不同類型及耐藥特性，可以用于胸水、腹水、尿液、血液、細針穿刺、組織勻漿等細胞學檢測，具有診斷快速準確、特異性高、信息量大的特點，對臨床診斷和流行病學篩查都有很大幫助。
文檔編號C12Q1/00GK1515906SQ0311153
公開日2004年7月28日 申請日期2003年4月24日 優(yōu)先權(quán)日2003年4月24日
發(fā)明者趙雨杰, 侯偉健, 秦海明, 吳廣平, 潘忠誠, 何群, 馬汝海, 王紹成, 張玉魁, 王天驕, 馬佳明 申請人:趙雨杰, 侯偉健, 秦海明, 吳廣平, 潘忠誠, 何群, 馬汝海, 王紹成, 張玉魁, 王天驕, 馬佳明