一種全人源抗MAGEA1的全分子IgG抗體及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種全人源抗MAGEA1的全分子IgG抗體，包含輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)，所述的輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，或者是該序列經(jīng)一個(gè)或多個(gè)氨基酸添加、刪除、替換、修飾的保守性突變而獲得的保守性變異體；且所述的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，或者是該序列經(jīng)一個(gè)或多個(gè)氨基酸添加、刪除、替換、修飾的保守性突變而獲得的保守性變異體。本發(fā)明還公開了上述全分子IgG抗體的DNA分子、表達(dá)載體、宿主細(xì)胞和應(yīng)用。
【專利說明】
一種全人源抗MAGEA1的全分子I gG抗體及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明涉及生物免疫技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種全人源抗MAGEA1的全分子IgG抗體， 還涉及該全分子IgG抗體的DNA分子、表達(dá)載體、宿主細(xì)胞和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 黑色素瘤抗原（MAGE)是首先從黑色素瘤中發(fā)現(xiàn)的一組腫瘤相關(guān)抗原。MAGE A1 (melanoma antigen A1)實(shí)際上是MAGE基因家族的一分子，其編碼蛋白見于多種腫瘤組織 及正常的睪丸組織而其它正常組織不表達(dá)，因此又稱之為腫瘤-睪丸抗原。它是一種腫瘤排 斥抗原，可在細(xì)胞內(nèi)加工產(chǎn)生抗原肽，并經(jīng)HLA-IV類分子遞呈，被自身細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞 識(shí)別，經(jīng)過抗原遞呈以及機(jī)體免疫應(yīng)答，產(chǎn)生體液免疫和細(xì)胞免疫的應(yīng)答效應(yīng)，特異性地殺 傷相應(yīng)腫瘤細(xì)胞。因此MAGE A1被用來做腫瘤治療的靶點(diǎn)?？筂AGE A1的抗體的研究顯得尤 為重要。
[0003] 目前關(guān)于MAGE A1抗體的中國專利，尚未見報(bào)道，只有關(guān)于MAGE A1基因治療的相 關(guān)專利。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 基于【背景技術(shù)】存在的技術(shù)問題，本發(fā)明的目的在于提供一種全人源抗MAGEA1的全 分子IgG抗體。
[0005] 本發(fā)明的目的又在于提供一種編碼上述全人源抗MAGEA1的全分子IgG抗體的DNA 分子。
[0006] 本發(fā)明的目的又在于提供一種含有能編碼上述全人源抗MAGEA1的全分子IgG抗體 的DNA分子表達(dá)載體。
[0007] 本發(fā)明的目的又在于提供一種被上述的表達(dá)載體所轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
[0008] 本發(fā)明的目的還在于提供上述全人源抗MAGEA1的全分子IgG抗體的應(yīng)用。
[0009] 為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，發(fā)明人通過大量試驗(yàn)研究，包括全人源Fab噬菌體抗體庫 的篩選，抗MAGEA1特異性抗體的純化，抗MAGEA1全分子抗體IgG的制備、表達(dá)及純化，抗 MAGEA1全分子抗體IgG的特性分析，最終獲得了 一種全人源抗MAGEA1的全分子IgG抗體，包 含輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)，
[0010] (1)所述的輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID N0.3所示，或者是該序列經(jīng)一個(gè)或 多個(gè)氨基酸添加、刪除、替換、修飾的保守性突變而獲得的保守性變異體；
[0011] 且(2)所述的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID N0.4所示，或者是該序列經(jīng)一個(gè) 或多個(gè)氨基酸添加、刪除、替換、修飾的保守性突變而獲得的保守性變異體。
[0012] 優(yōu)選地，所述的輕鏈可變區(qū)的三個(gè)抗原互補(bǔ)區(qū)⑶R的氨基酸序列為SEQ ID N0.5、 SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示；所述的重鏈可變區(qū)的三個(gè)抗原互補(bǔ)區(qū)⑶R的氨基酸序列 SSEQIDN0.8、SEQIDN0.^PSEQIDN0.1(^；f*。
[0013] 本發(fā)明還提出的一種全人源抗MAGEA1的全分子IgG抗體，包含輕鏈恒定區(qū)和重鏈 恒定區(qū)，所述的輕鏈恒定區(qū)的氨基酸序列為SEQ ID NO. 11所示，所述的重鏈恒定區(qū)的氨基 酸序列為SEQ ID NO. 12所示。
[0014] 本發(fā)明還提出的一種DNA分子，其編碼上述的全分子IgG抗體的重鏈或/和輕鏈。 [0015] 優(yōu)選地，其編碼輕鏈可變區(qū)的核酸序列為SEQID NO. 1所示，編碼重鏈可變區(qū)的核 酸序列為SEQ ID N0.2所示。
[0016] 本發(fā)明還提出的一種表達(dá)載體，包含有上述的DNA分子以及與該DNA分子操作性 相連的表達(dá)調(diào)控序列。
[0017] 本發(fā)明還提出的一種宿主細(xì)胞，被上述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化。
[0018]優(yōu)選地，該宿主細(xì)胞可以是被上述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的293Freestyle細(xì)胞。
[0019]本發(fā)明還提出的上述全分子IgG抗體在制備與MAGEA1表達(dá)相關(guān)的腫瘤（如黑色素 瘤、乳腺癌及肺癌等）中的診斷試劑或治療藥物中的用途。
[0020] 本發(fā)明通過噬菌體抗體庫技術(shù)篩選到了對(duì)MAGEA1具有高度親和力的人源Fab抗 體，并獲取了賦予所述抗體優(yōu)異特性的重鏈和輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列和核苷酸序列，并 將所述抗體的重鏈和輕鏈可變區(qū)與含有抗體恒定區(qū)的表達(dá)載體連接，最終獲得了具有特異 的抗原結(jié)合性和在細(xì)胞學(xué)上證明抗體可以殺傷腫瘤細(xì)胞。
[0021] 本發(fā)明提供了一種具有高特異性、良好親和力的抗MAGEA1的全分子全人源單克隆 抗體。MAGEA1骨髓來源的血液疾病細(xì)胞中廣泛表達(dá)，而在正常組織中不表達(dá)，因此本發(fā)明的 抗MAGEA1抗體可應(yīng)用于有關(guān)MAGEA1陽性的腫瘤的診斷和治療。本發(fā)明以MAGEA1為靶分子， 在噬菌體抗體庫技術(shù)的基礎(chǔ)上制備出全分子人源抗體。對(duì)制備的人源抗MAGEA1抗體做功能 鑒定，顯示該抗體能夠與MAGEA1特異性結(jié)合，體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)抗體能夠殺傷MAGEA1陽性 的腫瘤細(xì)胞。
[0022] 本發(fā)明人通過腫瘤細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)，證明在抗MAGEA1抗體的作用下，MAGEA1陽 性的腫瘤細(xì)胞，細(xì)胞存活率為25 %左右，而對(duì)MAGEA1陰性細(xì)胞沒有殺傷作用。
【附圖說明】
[0023]圖1為本發(fā)明實(shí)施例1所得純化全人源抗MAGEA1的全分子IgG抗體的SDS-PAGE檢測(cè) 結(jié)果;其中1為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)品，2為抗MAGEA1抗體，3為細(xì)胞培養(yǎng)上清，4為流穿;可見使用 Pro. A柱純化抗MAGEA1抗體的效果好，抗體純度在95 %以上。
[0024]圖2為本發(fā)明實(shí)施例1所得抗MAGEA1抗體的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果，可見抗 MAGEA1抗體與MAGEA1蛋白的結(jié)合能力較強(qiáng)。
[0025]圖3為本發(fā)明實(shí)施例1所得抗MAGEA1抗體的免疫印跡鑒定結(jié)果；其中1為抗MAGEA1 抗體與MAGEA1陽性細(xì)胞SK-Mel-37; 2為抗MAGEA1抗體與MAGEA1陰性的細(xì)胞HaCaT;可見抗體 與MAGEA1蛋白有特異性結(jié)合能力。
[0026] 圖4為本發(fā)明實(shí)施例1所得抗MAGEA1抗體的親和力檢測(cè)結(jié)果，KD值為3.156X 10-9Μ。
[0027] 圖5為本發(fā)明實(shí)施例1所得抗MAGEA1抗體對(duì)MAGEA1陽性細(xì)胞SK-Mel-37的殺傷作 用，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示抗體濃度在15ymol/mL時(shí)可以使細(xì)胞存活率降低至25%。
【具體實(shí)施方式】
[0028] 下面，通過具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行詳細(xì)說明。
[0029] 實(shí)施例1全人源抗MAGEA1的全分子IgG抗體的制備
[0030] 1)用MAGEA1抗原在人源Fab噬菌體庫中經(jīng)過六輪"吸附-洗脫-擴(kuò)增"的富集篩選， 獲得抗MAGEA1的Fab抗體，然后通過PCR擴(kuò)增測(cè)序獲得Fab抗體的可變區(qū)序列。
[0031] 2)根據(jù)已獲得的抗體的重輕鏈可變區(qū)序列，設(shè)計(jì)引物。
[0032] 3)擴(kuò)增抗MAGEA1抗體重鏈、輕鏈。
[0033] 以上述制備的人源Fab模板，分別以上述涉及的重鏈和輕鏈的上下游引物擴(kuò)增全 分子人源抗體重鏈、輕鏈基因。
[0034] (l)PCR
[0035] 反應(yīng)體系如下：
[0036]
[0037]反應(yīng)條件如下：
[0038]
[0039] (2)2%瓊脂糖凝膠電泳，紫外。
[0040] (3)膠回收試劑盒純化目的DNA片段，去離子水洗脫。
[0041 ] 4)雙酶切IgG表達(dá)質(zhì)粒
[0042] IgG表達(dá)質(zhì)粒pFUSE-CHIg-hGl、pFUSE-CLIg-hk(購自 Invivogen公司）包含IgGl型 人源的重鏈和輕鏈(Lambda)恒定區(qū)堿基編碼序列。
[0043] (1 )pFUSE-CHIg-hGl、pFUSE-CLIg-hk 模板載體的雙酶切
[0044] 反應(yīng)體系如下：
[0045]
[0046] 反應(yīng)條件為:37 °C酶切過夜。
[0047] (2)1%瓊脂糖凝膠電泳，紫外下切膠回收。
[0048] (3)膠回收試劑盒純化目的DNA片段，去離子水洗脫。
[0049] 5)Infusion PCR重組表達(dá)質(zhì)粒
[0050] 反應(yīng)體系如下：
[0051]
[0052] 反應(yīng)條件為：5(TC孵育15min。
[0053]取5yL反應(yīng)液轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌，鋪于相應(yīng)抗性的平板上，次日挑克隆送測(cè)序。將測(cè) 序結(jié)果正確的克隆保存菌種并擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒。
[0054] 6)抗MAGEA1抗體的表達(dá)
[0055] (1)取50yg重組后的重鏈質(zhì)粒于lmL的Opti-MEM培養(yǎng)基中，取50yg的輕鏈質(zhì)粒于 lmL的Opti-MEM培養(yǎng)基中，取200yL的293Fectin于2.8mL的Opti-MEM培養(yǎng)基中，將上述三種 混合液室溫靜置5min;
[0056] (2)然后將兩個(gè)質(zhì)?；旌弦夯旌暇鶆蚝?，補(bǔ)加500yL的Opti-MEM培養(yǎng)基混合均勻后 直接加入轉(zhuǎn)染試劑293Fectin的混合液，混合均勻后靜置20min。期間處理293F細(xì)胞，將293F 細(xì)胞離心后用293F Expression Medium重懸，然后計(jì)數(shù)以及用臺(tái)盼藍(lán)計(jì)算細(xì)胞活力比，吸 取IX 108個(gè)細(xì)胞于培養(yǎng)瓶中，用293F Expression Medium定容為94mL;
[0057] (3)20min結(jié)束后將6mL的DNA、293Fectin的復(fù)合物加入準(zhǔn)備好的293F細(xì)胞中；
[0058] (4)將細(xì)胞放在搖床培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件8 %⑶2,120rmp，37 °C，6天后收集細(xì) 胞上清。
[0059] 7)抗MAGEA1抗體的純化
[0060] 將收集的細(xì)胞上清用0.22μπι的濾膜過濾，同時(shí)將平衡液和洗脫液過濾膜。用AKATA 純化儀按照Protein Α純化的標(biāo)準(zhǔn)步驟純化，以lmL/min的速度上樣，以1.5mL/min的速度洗 脫。
[0061 ] 結(jié)果成功表達(dá)并純化抗MAGEA1抗體。將純化抗MAGEA1抗體進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)，其 結(jié)果如圖1所示，由圖1可知純化的抗體純度很高，且用Pro.A柱純化效果較好。
[0062]實(shí)施例2抗MAGEA1抗體的功能活性鑒定 [0063] 1)酶聯(lián)免疫法
[0064] 用包被液(0.1M碳酸鹽緩沖液，pH9.6)MAGEA1蛋白至2yg/mL包被ELISA96孔板，每 孔加入100yL，4°C過夜;roST(PBS含0.5%Tween20)5%脫脂牛奶-洗滌緩沖液封閉，37°C孵 育2h; PBST洗滌5次后，每個(gè)孔中加入100yLPA21抗體(2yg/mL起始濃度，14個(gè)濃度梯度稀釋） 37°C2h;以1:4000稀釋的羊抗人二抗100μL7孔加入到孔內(nèi)，37°C孵育lh;過氧化物酶底物顯 色液100μL7孔，室溫下10分鐘后用2M硫酸中止反應(yīng)，上機(jī)檢測(cè)比色采用雙波長450nm/ 690nm〇
[0065] 結(jié)果如圖2示所示，由圖2可知:抗MAGEA1抗體能與MAGEA1蛋白起抗原抗體反應(yīng)，且 結(jié)合能力較強(qiáng)。
[0066] 2)ffestern blot
[0067] 將MAGEA1陽性細(xì)胞SK-Mel-37和MAGEA1陰性的細(xì)胞HaCaT裂解后進(jìn)行10%SDS-PAGE電泳并電轉(zhuǎn)到硝酸纖維膜上，將此膜與2yg/mL PA21抗體室溫孵育lh，1:4000稀釋HRP-羊抗人IgG(北京中杉公司）和ECL發(fā)光試劑盒(美國Pierce公司）曝光于凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad公司）。
[0068] 結(jié)果如圖3所示，由圖3可知:抗MAGEA1抗體與SK-Mel-37表達(dá)的MAGEA1蛋白有特異 性結(jié)合。
[0069] 3)親和力檢測(cè)
[0070] 根據(jù)MAGEA1的等電點(diǎn)以及按照BiacoreXIOOcontrol soft的protocol優(yōu)化偶聯(lián)條 件，斜率優(yōu)化選擇醋酸鈉作為偶聯(lián)稀釋緩沖液。用此緩沖液稀釋MAGEA1樣品稀釋至25yg/mL 后偶聯(lián)到CM5芯片上。預(yù)設(shè)偶聯(lián)水平1500RU。然后用pH7.4的Running buffer稀釋MAGEA1樣 品，稀釋一系列濃度至0nM、5nM、10nM 20碰、4〇11]\1、8〇11]\1。設(shè)置進(jìn)樣時(shí)間為18〇8，解離時(shí)間 lOmin，再生緩沖液用50mMpH2 · 2Gly_HCl。按照BiacoreXlOOcontrol soft的protocol進(jìn)行 上機(jī)測(cè)試。
[0071] 親和力檢測(cè)結(jié)果如圖4所示，KD值為3.156 ΧΙΟ-9M。
[0072] 4)MAGEA1抗體對(duì)MAGEA1陽性腫瘤殺傷
[0073] 將被試MAGEA1陽性的人皮膚惡性黑色素瘤細(xì)胞SK-Mel-37和MAGEA1陰性的正常人 皮膚細(xì)胞HaCaT培養(yǎng)在含有10 %小牛血清(FBS)和1 %抗生素(P/S)的DMEM培養(yǎng)基中，37 °C 5%二氧化碳條件下培養(yǎng)。待細(xì)胞培養(yǎng)良好后轉(zhuǎn)種在96微孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，過夜培養(yǎng)當(dāng)細(xì)胞 生長在96微孔細(xì)胞培養(yǎng)板上達(dá)70 %時(shí)，無菌條件下加入不同劑量的抗體，繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)， 顯微鏡下觀察細(xì)胞死亡情況并照相，然后加 Cell Titer 96aqueous nonradioactive cell Proliferation assay(Promega MI)檢查LDH，計(jì)算分析細(xì)胞死亡百分?jǐn)?shù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。 [0074]抗MAGEA1抗體與肺癌細(xì)胞的相互作用結(jié)果如圖5所示，由圖5可知：在抗體的作用 下，MAGEA1陽性的腫瘤細(xì)胞，細(xì)胞存活率為25 %左右，而對(duì)MAGEA1陰性細(xì)胞沒有殺傷作用。
[0075] 上述文中Μ為mol/L的含義。
[0076] 以上所述，僅為本發(fā)明較佳的【具體實(shí)施方式】，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此， 任何熟悉本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明揭露的技術(shù)范圍內(nèi)，根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案及其 發(fā)明構(gòu)思加以等同替換或改變，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種全人源抗MAGEA1的全分子IgG抗體，包含輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)，其特征在 于， (1)所述的輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，或者是該序列經(jīng)一個(gè)或多個(gè) 氨基酸添加、刪除、替換、修飾的保守性突變而獲得的保守性變異體； 且（2)所述的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，或者是該序列經(jīng)一個(gè)或多 個(gè)氨基酸添加、刪除、替換、修飾的保守性突變而獲得的保守性變異體。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述全分子IgG抗體，其特征在于，所述的輕鏈可變區(qū)的三個(gè)抗原互 補(bǔ)區(qū)CDR的氨基酸序列為SEQIDN0.5、SEQIDN0.6和SEQIDN0.7所示 ；所述的重鏈可變 區(qū)的三個(gè)抗原互補(bǔ)區(qū)CDR的氨基酸序列為SEQIDN0.8、SEQIDN0.9和SEQIDN0.10所示。3. -種全人源抗MAGEA1的全分子IgG抗體，包含輕鏈恒定區(qū)和重鏈恒定區(qū)，其特征在 于，所述的輕鏈恒定區(qū)的氨基酸序列為SEQ ID NO. 11所示，所述的重鏈恒定區(qū)的氨基酸序 列為SEQ ID NO. 12所示。4. 一種DNA分子，其編碼權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的全分子IgG抗體的重鏈或/和輕鏈。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述DNA分子，其特征在于，其編碼輕鏈可變區(qū)的核酸序列為SEQID NO. 1所示，編碼重鏈可變區(qū)的核酸序列為SEQ ID NO.2所示。6. -種表達(dá)載體，包含有權(quán)利要求4或5所述的DNA分子以及與該DNA分子操作性相連的 表達(dá)調(diào)控序列。7. -種宿主細(xì)胞，被權(quán)利要求6所述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化。8. 權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的全分子IgG抗體在制備與MAGEA1表達(dá)相關(guān)的腫瘤中的診 斷試劑或治療藥物中的用途。
【文檔編號(hào)】C07K16/18GK106084042SQ201610483247
【公開日】2016年11月9日
【申請(qǐng)日】2016年6月24日
【發(fā)明人】朱進(jìn), 馮振卿, 許國貞, 劉振云, 唐奇, 熊四平
【申請(qǐng)人】安徽未名細(xì)胞治療有限公司