專利名稱：一種快速檢測風(fēng)疹病毒抗體的酶免疫學(xué)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于臨床醫(yī)學(xué)檢測領(lǐng)域，更具體涉及一種改良的酶免疫學(xué)方法檢測風(fēng)疹病毒的方法。
常規(guī)間接酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)檢測風(fēng)疹病毒IgM抗體的步驟為1.配制碳酸鹽緩沖液，將1.59克碳酸鈉和2.93克碳酸氫鈉溶于1000毫升(ml)雙蒸水中。
2.將風(fēng)疹可溶性抗原用碳酸鹽緩沖液作最適抗原濃度稀釋(最適抗原濃度可根據(jù)棋盤滴定法確定)。
3.用稀釋的抗原致敏聚苯乙烯酶標(biāo)板，每孔加100微升(ul)，在4℃孵育過夜。
4.配制pH值9.6的磷酸鹽緩沖液(PBS)，將4.8克磷酸氫二鈉加熱溶解于適量雙蒸水中，再加入4.3克磷酸二氫鉀和68克氯化鈉，攪拌混勻后，補(bǔ)足溶液總量至10000毫升。
5.取上述PBS500ml，加入50微升的吐溫-20，配成含1/1000吐溫-20的PBS洗液。
6.取PBS500ml，加入25ml的小牛血清，配成含5％牛血清的PBS稀釋液。
7.甩去酶標(biāo)板孔內(nèi)的抗原溶液，用上述PBS洗液洗滌3次，每次3～5分鐘。
8.待測血清及陽性對照和陰性對照血清用上述PBS稀釋液作1∶200(或1∶100)稀釋后，于酶標(biāo)板中每孔加入100ul，置濕盒中37℃作用1小時。取出用PBS洗液洗滌，方法同上。
9.將辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗人免疫球蛋白MIgM用稀釋液作1∶1500(或1∶2000，1∶3000)稀釋，每孔加入100ul，置濕盒中37℃作用1小時。
10. 配制底物緩沖液，將3.4克乙酸鈉和5.25克的檸檬酸加入500ml的雙蒸水中混勻，調(diào)pH值至4.8。
11.配制底物溶液，在10ml上述底物緩沖液中加入100ul 1％的四甲基乙二胺(TMB)和10ul雙氧水(H2O2)混勻。
12.取出酶標(biāo)板，用PBS洗滌3次，方法同上。每孔加入100ul該混合物，置溫盒中37℃作用15分鐘，在酶標(biāo)儀上讀取波長為450納米時的吸光度值或肉眼觀察結(jié)果。判定標(biāo)準(zhǔn)以待檢血清(P)與已知陰性對照血清(N)的比值P/N≥2.1為陽性。
本方法除去包被抗原時間，各步溫育時間分別為1小時，1小時，15分鐘，總耗時達(dá)2～3小時，不宜于應(yīng)即檢測和大規(guī)模的流行病學(xué)調(diào)查。酶聯(lián)捕獲法(EIA)檢測風(fēng)疹病毒IgM抗體的步驟為1.配制抗體包被液。
2.將羊抗人IgM用包被液稀釋。
3.將羊抗人IgM溶液包被于酶標(biāo)板，37℃溫育2小時。
4.制pH值9.6的PBS，將1.48克磷酸氫二鈉加熱溶解于適量雙蒸水中，再加入0.43克磷酸二氫鉀和6.80克氯化鈉，攪拌混勻后，補(bǔ)足溶液總量至1000毫升。
5.上述PBS500ml，加入50微升吐溫-20，配成含1/1000吐溫-20的PBS洗液。
6.取250ml的PBS，加入50ml的牛血清，配成20％牛血清的PBS封閉液。
7.取PBS250ml，加入12.5ml的小牛血清，配成含5％牛血清的樣本稀釋液。
8.甩去酶標(biāo)板孔內(nèi)的羊抗人IgM溶液，用上述PBS洗液洗滌3次，每次3～5分鐘。
9.每孔加入封閉液100ul，室溫過夜，洗3次，方法同上。
10.每孔加入兔抗風(fēng)疹病毒抗體，37℃作用1小時后洗板，方法同上。
11.每孔加入羊抗兔IgM酶標(biāo)抗體，37℃作用1小時后洗板，方法同上。
12.每孔加入兔抗風(fēng)疹病毒抗體，37℃作用1小時后洗板，方法同上。
13.待測血清及陽性對照和陰性對照血清用樣本稀釋液作1∶200(或1∶100)稀釋后，于酶標(biāo)板中每孔加入100ul，置濕盒中37℃作用1小時。取出用PBS洗液洗滌，方法同上。
13. 配制底物緩沖液，將3.4克乙酸鈉和5.25克的檸檬酸加入500ml的雙蒸水中混勻，調(diào)pH值至4.8。
14.配制底物溶液，在10ml上述底物緩沖液中加入100ul 1％的四甲基乙二胺(TMB)和10ul雙氧水(H2O2)混勻。
15.取出酶標(biāo)板，用PBS洗滌3次，方法同上。每孔加入100ul該混合物，置溫盒中37℃作用15分鐘，在酶標(biāo)儀上讀取波長為450納米時的吸光度值或肉眼觀察結(jié)果。判定標(biāo)準(zhǔn)以待檢血清(P)與已知陰性對照血清(N)的比值P/N≥2.1為陽性。
酶聯(lián)捕獲法(EIA)用于檢測風(fēng)疹病毒IgM抗體，較常規(guī)間接ELISA法特異性明顯提高，且可以消除ELISA方法中可能出現(xiàn)的RF因子的影響，但該方法敏感性較間接ELISA低，且步驟繁瑣。
另外還有利用單克隆抗體作為酶標(biāo)抗體的間接ELISA法，也可以大大提高傳統(tǒng)方法的特異性和敏感性，但由于單克隆抗體制備過程復(fù)雜，且價格昂貴，不宜普及。
為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)措施聚乙二醇(PEG)是1，2-亞乙基二醇聚合而成的一類分子量不同的化合物，目前應(yīng)用較多的有聚乙二醇4000(分子量為4000)，聚乙二醇6000，聚乙二醇10000，聚乙二醇12000，聚乙二醇20000等。近年來研究表明，聚乙二醇類化合物可以提高抗原抗體反應(yīng)的敏感性，加快抗原抗體結(jié)合的速度。將分子量6000的聚乙二醇用于快速檢測風(fēng)疹病毒抗體，并同時加入血清稀釋液和酶標(biāo)記物稀釋液中(酶標(biāo)記物濃度較間接ELISA法提高)，以促使抗原抗體反應(yīng)的加速，以縮短反應(yīng)時間，簡化操作。
具體步驟1.配制碳酸鹽緩沖液，將1.59克碳酸鈉和2.93克碳酸氫鈉溶于1000毫升(ml)雙蒸水中。
2.風(fēng)疹可溶性抗原用碳酸鹽緩沖液以1∶200或1∶400或1∶800稀釋后包被于96孔聚苯乙烯反應(yīng)板，每孔加100微升(ul)，在4℃孵育過夜或37℃溫育2～4小時。
3.配制pH值9.6的磷酸鹽緩沖液(PBS)，將4.8克磷酸氫二鈉加熱溶解于適量雙蒸水中，再加入4.3克磷酸二氫鉀和68克氯化鈉，攪拌混勻后，補(bǔ)足溶液總量至1000毫升。
4.取上述磷酸鹽緩沖液(PBS)500ml，加入50微升的吐溫-20，配成含1/1000吐溫-20的磷酸鹽緩沖液(PBS)洗液。
5.取磷酸鹽緩沖液(PBS)500ml，加入25ml的小牛血清和20克的聚乙二醇(PEG)6000，配成含4％聚乙二醇(PEG)的樣本稀釋液。
6.甩去酶標(biāo)板孔內(nèi)的抗原溶液，用上述磷酸鹽緩沖液(PBS)洗液洗滌3～5次，每次3～5分鐘。
7.待測血清及陽性對照和陰性對照血清用含4％聚乙二醇(pEG)的樣本稀釋液作1∶200(或1∶100)稀釋后，于酶標(biāo)板中每孔加入100ul，置濕盒中37℃作用5～30分鐘。取出用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗液洗滌，方法同上。
8.將辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗人免疫球蛋白M(lgM)用含4％聚乙二醇(PEG)的樣本稀釋液作1∶1000或1∶500或1∶2000稀釋，每孔加入100ul，置濕盒中37℃作用5～30分鐘。
9.配制底物緩沖液，將3.4克乙酸鈉和5.25克的檸檬酸加入500ml的雙蒸水中混勻，調(diào)pH值至4.8。
10.配制底物溶液，在10ml上述底物緩沖液中加入100ul 1％的四甲基乙二胺(TMB)和10ul雙氧水(H2O2)混勻。
11.取出酶標(biāo)板，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次，方法同上。每孔加入100ul該混合物，置溫盒中37℃作用5～15分鐘，在酶標(biāo)儀上讀取波長為450納米時的吸光度值或肉眼觀察結(jié)果。判定標(biāo)準(zhǔn)以待檢血清(P)與已知陰性對照血清(N)的比值P/N≥2.1為陽性。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和效果本方法最大的特點(diǎn)是將常規(guī)間接ELISA反應(yīng)時間由原來的2-3小時縮至最短30分鐘以內(nèi)。可以將常規(guī)間接ELISA的兩步溫育時間同時縮短，溫育時間由5分鐘到30分鐘，本底改變不明顯，均可得出滿意的結(jié)果，因此在實(shí)際操作中，溫育時間可任意選用，快、慢可靈活掌握，快到5分鐘，慢到30分鐘，特別適用于即時檢測。本發(fā)明還可以縮短顯色時間至5分鐘，有時甚至可以立即讀數(shù)；可提高吸光度值，陰性本底無明顯升高，反應(yīng)模式清晰，陰陽性反差明顯，與常規(guī)間接ELISA比較，陽性顯色明顯提高而陰性本底升高不明顯；延長反應(yīng)時間，陽性增色明顯強(qiáng)于陰性增色，無礙結(jié)果判斷；無論是目測還是酶標(biāo)儀讀數(shù)計算P/N值都易于判定，并且穩(wěn)定性和重復(fù)性均較好。
本方法的建立為孕期風(fēng)疹病毒感染的快速檢測和流行病學(xué)調(diào)查提供了新的手段。
實(shí)施步驟1.制碳酸鹽緩沖液，將1.59克碳酸鈉和2.93克碳酸氫鈉溶于1000毫升(ml)雙蒸水中。
2.風(fēng)疹可溶性抗原用碳酸鹽緩沖液以1∶400稀釋后包被于96孔聚苯乙烯反應(yīng)板，每孔加100微升(ul)，在4℃孵育過夜。
3.配制pH值9.6的磷酸鹽緩沖液(PBS)，將4.8克磷酸氫二鈉加熱溶解于適量雙蒸水中，再加入4.3克磷酸二氫鉀和68克氯化鈉，攪拌混勻后，補(bǔ)足溶液總量至1000毫升。
4.取上述PBS500ml，加入50微升的吐溫-20，配成含1/1000吐溫-20的PBS洗液。
5.取PBS500ml，加入25ml的小牛血清和20克的PEG 6000，配成含4％PEG的樣本稀釋液。
6.甩去酶標(biāo)板孔內(nèi)的抗原溶液，用上述PBS洗液洗滌3次，每次3分鐘。
7.待測血清及陽性對照和陰性對照血清用含4％PEG的樣本稀釋液作1∶100稀釋后，于酶標(biāo)板中每孔加入100ul，置濕盒中37℃作用10分鐘。取出用PBS洗液洗滌，方法同上。
8.將辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗人IgM用含4％PEG的樣本稀釋液作1∶1500稀釋，每孔加入100ul，置濕盒中37℃作用10分鐘。
9.配制底物緩沖液，將3.4克乙酸鈉和5.25克的檸檬酸加入500ml的雙蒸水中混勻，調(diào)pH值至4.8。
10.配制底物溶液，在10ml上述底物緩沖液中加入100ul 1％的四甲基乙二胺(TMB)和10ul雙氧水(H2O2)混勻。
11.取出酶標(biāo)板，用PBS洗滌3次，方法同上。每孔加入100ul該混合物，置溫盒中37℃作用10分鐘，在酶標(biāo)儀上讀取波長為450納米時的吸光度值。判定標(biāo)準(zhǔn)以待檢血清(P)與已知陰性對照血清(N)的比值P/N≥2.1為陽性。
A.比較間接ELISA與改良ELISA法的結(jié)果表1間接ELISA與改良ELISA法對風(fēng)疹病毒IgM抗體陽性血清的檢測結(jié)果間接ELISA合計陽性陰性陽性 35 3 38改良陰性 1 0 1ELISA合計 36 3 39α＝0.05，χ2＝0.25，υ＝1，P＞0.05表2 間接ELISA與改良ELISA法對風(fēng)疹病毒IgM抗體陰性血清的檢測結(jié)果間接ELISA合計陰性陽性陰性 152 23 175改良ELISA陽性 9 0 9法合計 161 23 184α＝0.05，χ2＝5.28，υ＝1，P＜0.05從表1和表2可以看出，改良ELISA法對陽性血清的檢出率為97.4％(38/39)，高于間接ELISA法的檢出率92.3％(36/39)，但兩者差異無統(tǒng)計學(xué)意義，說明兩法的檢出率一致；改良ELISA法對陰性血清的檢出率為95.1％(175/184)，明顯高于間接ELISA法的檢出率87.5％(161/84)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
B.特異性試驗(yàn)(1)用HSV、EHF抗原取代RV抗原，結(jié)果為陰性。
(2)采用改良ELISA法分別檢測RV、CBV、HSV-1、HSV-2、RSV陽性血清各3份中的RV-IgM抗體，結(jié)果僅在RV陽性血清的標(biāo)本內(nèi)測到了相應(yīng)的RV-IgM抗體，其P/N值隨稀釋倍數(shù)而下降，而其余標(biāo)本結(jié)果均陰性，說明本法是特異的，見表3。
表3 快速ELISA法的特異性試驗(yàn)結(jié)果血清稀釋RV-IgM CBV-IgM HSV-1IgM HSV-2IgM RSV-IgM度1∶100 6.2 1.8 1.21.4 0.91∶200 5.0 1.5 1.31.3 1.01∶400 2.8 1.6 1.11.2 1.11∶800 2.1 1.2 1.11.4 0.91∶1600 1.5 0.9 0.81.1 0.8(3)穩(wěn)定性與重復(fù)性試驗(yàn)將風(fēng)疹I(lǐng)gM抗體陽性血清及風(fēng)疹I(lǐng)gM抗體陰性血清各5份，在同一塊板上重復(fù)加樣5次(孔)，測定其可重復(fù)性。測定A值基本一致，批間變異系數(shù)小于10％(見表4)；選擇陽性血清和陰性血清各1份在不同板和不同時間進(jìn)行5次測定，結(jié)果陽性血清CV＝10.3％，陰性血清CV＝9.92％，均在允許范圍。由此可見本系統(tǒng)穩(wěn)定性和重復(fù)性較好。見表4。
表4 風(fēng)疹I(lǐng)gM的可重復(fù)性測定結(jié)果陽性血清A值陰性血清A值次數(shù)1 2 3 4 5 67 8 9 101 0.43 0.33 0.60 0.37 0.66 0.08 0.12 0.08 0.11 0.092 0.42 0.35 0.60 0.38 0.68 0.10 0.14 0.08 0.13 0.073 0.45 0.35 0.60 0.39 0.69 0.10 0.13 0.10 0.12 0.074 0.43 0.32 0.62 0.38 0.65 0.09 0.14 0.09 0.11 0.08另外，同時作不加PEG的對照，僅提高酶標(biāo)記物濃度或血清稀釋度，其它條件同本方法，結(jié)果不能檢出陽性標(biāo)本，說明本發(fā)明中反應(yīng)時間縮短并不是由于酶標(biāo)記物濃度較常規(guī)間接ELISA提高所致，也不能由提高血清稀釋度來縮短。
權(quán)利要求
1.一種快速檢測風(fēng)疹病毒抗體的酶免疫學(xué)方法，配制碳酸鹽緩沖液，將1.59克碳酸鈉和2.93克碳酸氫鈉溶于1000毫升雙蒸水中、風(fēng)疹可溶性抗原用碳酸鹽緩沖液以1∶200或1∶400或1∶800稀釋后包被于96孔聚苯乙烯反應(yīng)板，每孔加100微升，在4℃孵育過夜或37℃溫育2～4小時，其特征在于A、配制pH值9.6的磷酸鹽緩沖液，將4.8克磷酸氫二鈉加熱溶解于適量雙蒸水中，再加入4.3克磷酸二氫鉀和68克氯化鈉，攪拌混勻后，補(bǔ)足溶液總量至1000毫升；B、取上述磷酸鹽緩沖液500ml，加入50微升的吐溫-20，配成含1/1000吐溫-20的磷酸鹽緩沖液洗液；C、取磷酸鹽緩沖液500ml，加入25ml的小牛血清和20克的聚乙二醇6000，配成含4％聚乙二醇的樣本稀釋液；D、甩去酶標(biāo)板孔內(nèi)的抗原溶液，用上述磷酸鹽緩沖液洗液洗滌3～5次，每次3～5分鐘；E、待測血清及陽性對照和陰性對照血清用含4％聚乙二醇的樣本稀釋液作1∶200或1∶100稀釋后，于酶標(biāo)板中每孔加入100ul，置濕盒中37℃作用5～30分鐘，取出用磷酸鹽緩沖液洗液洗滌，方法同上；F、將辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗人免疫球蛋白MIgM用含4％聚乙二醇的樣本稀釋液作1∶1000或1∶500或1∶2000稀釋，每孔加入100ul，置濕盒中37℃作用5～30分鐘；G、配制底物緩沖液，將3.4克乙酸鈉和5.25克的檸檬酸加入500ml的雙蒸水中混勻，調(diào)pH值至4.8；H、配制底物溶液，在10ml上述底物緩沖液中加入100ul 1％的四甲基乙二胺和10ul雙氧水混勻；I、取出酶標(biāo)板，用磷酸鹽緩沖液洗滌3次，方法同上，每孔加入100ul該混合物，置溫盒中37℃作用5～15分鐘，在酶標(biāo)儀上讀取波長為450納米時的吸光度值或肉眼觀察結(jié)果。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種快速檢測風(fēng)疹病毒抗體的酶免疫學(xué)方法，主要是利用PEG可以加快抗原抗體反應(yīng)，從而縮短常規(guī)ELISA的反應(yīng)時間。首先將可溶性抗原包被于酶標(biāo)板中；其次是配制PH9.6的PBS洗液和含PEG的樣本稀釋液；第三是將待測血清及陽性對照和陰性對照血清用含PEG的樣本稀釋液稀釋；第四將稀釋好的血清加入前述酶標(biāo)板孔中溫育；第五是甩去酶標(biāo)板孔內(nèi)的抗原溶液，用PBS洗液洗滌；第六是將已知的酶標(biāo)記抗體用含PEG的稀釋液稀釋；第七是酶標(biāo)板孔中加入稀釋好的酶標(biāo)記抗體溫育；第八是取出酶標(biāo)板，用PBS洗滌；最后加底物顯色。本發(fā)明操作簡便，敏感性特異性高，檢測時間短，費(fèi)用低。主要用于孕期風(fēng)疹病毒感染的快速檢測和流行病學(xué)調(diào)查。
文檔編號G01N33/535GK1434297SQ03118528
公開日2003年8月6日 申請日期2003年1月24日 優(yōu)先權(quán)日2003年1月24日
發(fā)明者周俊, 楊占秋, 徐連根, 肖紅, 文莉 申請人:武漢大學(xué)