專利名稱：脂肪酶非水相中生物轉(zhuǎn)化失水山梨醇單油酸酯的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物化工，具體地說是一種利用微生物脂肪酶在非水相體系中轉(zhuǎn)化合成糖酯類表面活性劑——失水山梨醇油酸酯的方法。
失水山梨醇單油酸酯作為一種重要的非離子表面活性劑，不僅具有良好的乳化性和穩(wěn)定性，而且無毒、無刺激；其具有生物可降解性，對環(huán)境無害；原料來源廣泛，價格便宜，已廣泛地應用在紡織、造紙、皮革、塑料、農(nóng)藥等許多領(lǐng)域，其優(yōu)質(zhì)產(chǎn)品在食品、醫(yī)藥、化妝品中也有重要應用。
傳統(tǒng)失水山梨醇脂肪酸酯的合成采用化學方法，以酸或堿作為催化劑，在高溫條件下失水、酯化制成，這種方法不可避免地一些問題一、生產(chǎn)中使用的無機催化劑易帶入鉛、砷等重金屬，而且反應產(chǎn)物十分復雜，其中有些是致敏或致癌物質(zhì)，在食品、化妝品及醫(yī)藥的高品質(zhì)產(chǎn)品中應用上受到限制；二、在高溫條件下反應，生產(chǎn)能耗高；三、化學法生產(chǎn)的產(chǎn)品品質(zhì)較低，容易導致產(chǎn)品色澤加深，單酯含量不高；四、從產(chǎn)品安全性和環(huán)保角度看，應用生物技術(shù)替代傳統(tǒng)化學合成途徑生產(chǎn)化合物符合國際發(fā)展潮流。酶法合成具有高效性和特異性、反應條件溫和、副產(chǎn)物較少等特點，近來發(fā)展很快。隨著酶工程研究，特別是近期異常環(huán)境——非水相酶促反應研究的發(fā)展，利用生物催化劑為合成糖酸酯提供了新的方法。
但是由于糖或糖醇與脂肪酸的溶解性質(zhì)相差較大，許多研究在水相中酶法合成酯，產(chǎn)率很低。利用脂肪酶以吡啶作溶劑合成了一些糖酸酯，產(chǎn)率比水相中要好些，但卻是以有毒的吡啶或是二甲基甲酰胺作為溶劑，將產(chǎn)品應用于食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域安全性不高。
因此，本發(fā)明的目的在于尋求一種脂肪酶非水相中生物轉(zhuǎn)化失水山梨醇單油酸酯的方法，利用微生物脂肪酶，在無溶劑系統(tǒng)中催化酯化反應，合成Span80(即失水山梨醇)，通過減壓蒸發(fā)除去水份，促進反應正向進行，經(jīng)有機溶劑提取得到產(chǎn)物。該方法避免了高溫及無機催化劑對人體可能造成的傷害，降低了能耗，改善了環(huán)境，提高了產(chǎn)品品質(zhì)。
為實現(xiàn)上述發(fā)明目的而采取的主要技術(shù)方案是
a、加料將底物脂肪酸——油酸與底物脂肪醇——失水山梨醇按摩爾濃度比為1∶1～10的比例加入到酶反應器中，再加入500～2000單位/克(或稱u/g)的失水山梨醇的脂肪酶后開始反應；b、反應在60±10℃，真空度低于-0.05Mpa的減壓條件下，旋轉(zhuǎn)攪拌反應48～72小時，至底物的摩爾轉(zhuǎn)化率達平衡狀態(tài)，通?？蛇_95％以上；c、分離反應結(jié)束后，將n倍體積的有機溶劑分m次加入到反應器中，每次振蕩h小時，過濾得到反應產(chǎn)物的有機溶劑溶液；不溶物為未反應的失水山梨醇和脂肪酶，可進行下一批反應；d、蒸餾將前述溶液液收集，于真空度-0.05～-0.07Mpa的條件下減壓蒸餾，除去有機溶劑，得到產(chǎn)物——失水山梨醇單油酸酯。
需要指出的是本申請中出現(xiàn)的m、n、h均為正整數(shù)，該正整數(shù)一般為1～10之間，具體多少對本發(fā)明的影響不大。
本發(fā)明的第2個特征是所用的油酸為經(jīng)過純化的油酸，純度大于99％，所用的脂肪酶為根霉(Rhizopus)脂肪酶，固定化假絲酵母(Candida)脂肪酶，米曲霉(Aspergillus)脂肪酶。
本發(fā)明的第3個特征是所用的失水山梨醇為山梨醇經(jīng)加熱脫水，得到失水山梨醇，其醚化度為1～1.2；具體制取方法為70％山梨醇或固體山梨醇在酸性催化劑或堿性催化劑存在的條件下，在溫度為150～230℃、真空狀態(tài)、通氮氣(N2)保護下反應1～3小時，分子內(nèi)脫去一摩爾水即為失水山梨醇，失水山梨醇的羥值在1150～1400mgKOH/g之間，色澤較深時可采用雙氧水(H2O2)、活性炭等脫色，使其色澤達到要求的黑曾值。本文中出現(xiàn)的mgKOH/g是指毫克的氫氧化鉀/克。
本發(fā)明的第4個特征是所用的脫色劑為雙氧水或活性炭。
本發(fā)明的第5個特征是在加料工序a中，反應器中的反應體系為無溶劑體系，底物脂肪酸與底物脂肪醇的摩爾濃度比為1∶3。
本發(fā)明的第6個特征是在反應工序b中，溫度為60℃，真空度低于-0.09Mpa。
本發(fā)明的第7個特征是在分離工序c中分離出的脂肪酶，經(jīng)有機溶劑和緩沖液洗滌后，可再次用于催化反應。
本發(fā)明的第8個特征是在蒸餾工序d中蒸發(fā)出的有機溶劑經(jīng)過冷凝、除水處理后，可回收使用；因此整個過程基本上無廢物排放。
本發(fā)明的第9個特征是提取所用的有機溶劑為正己烷或正庚烷。
本發(fā)明的第10個特征是所述酸性催化劑為對甲苯磺酸、甲基磺酸、磷酸(H3PO4)，所述堿性催化劑為氫氧化鈉(NaOH)、氫氧化鉀(KOH)。
本發(fā)明的反應方程式如下
酶活單位定義為在60℃反應條件下，每分鐘消耗1摩爾(mol)月桂酸所需酶量定義為1個脂肪酶酯化合成活力單位(u)。
在底物中加入少量的與產(chǎn)物同類型的表面活性劑，有助于底物間的接觸，從而促進了反應的進行。
提取所用的有機溶劑為正己烷，正庚烷效果也不錯。
本發(fā)明與其它合成方法相比具有以下優(yōu)點1、該反應是在無溶劑，減壓條件下進行的。經(jīng)過比較，無溶劑體系較有機溶劑和水相反應有較高的轉(zhuǎn)化率；而減壓條件有利于反應生成的水分的排除，在反應動力學上也有利于反應向產(chǎn)物生成的方向進行，從而提高了反應效率。
2、該合成方法反應條件溫和，操作簡單，而且在無溶劑體系中進行，脂肪酶催化活性保持較好，酶制劑的回收和重復使用也較為容易。并且下游工程也不復雜。較溫和的反應條件也大大的減少了能耗，降低了生產(chǎn)成本。
3、失水山梨醇油酸酯由于采用生物技術(shù)——酶法催化生產(chǎn)，反應的特異性強，副產(chǎn)物少，產(chǎn)品具有較高的安全性，品質(zhì)和檔次比較高。
4、經(jīng)HPLC(高壓色相檢測)分析，產(chǎn)品成分較為單一，單酯含量較高，較化學合成產(chǎn)品提高近一倍。
利用本發(fā)明所合成的產(chǎn)品，其成分較為單一，純度較高，屬高品質(zhì)的生物制品，其各項質(zhì)量指標均達到國家標準，絕大多數(shù)指標優(yōu)于化學產(chǎn)品。本方法對于提升我國糖酯類表面活性劑產(chǎn)品的品質(zhì)，增加其使用的安全性和有效性具有積極的社會和經(jīng)濟效益。
本發(fā)明得到的產(chǎn)品可應用于醫(yī)藥、化妝品及食品工業(yè)中。
下面詳細描述
具體實施例方式實施例一49.2g(0.3mol)失水山梨醇和28.2g(0.1mol)油酸中加入80000u固定化假絲酵母脂肪酶，在-0.09Mpa減壓條件下，60℃振蕩(150r/min)反應48h，反應轉(zhuǎn)化率達96.4％，脂肪酶半衰期為921.4小時。經(jīng)有機溶劑提取，產(chǎn)品失水山梨醇油酸酯質(zhì)量符合國家標準GB 13481-92，其中單酯含量達到81％，色澤較同類產(chǎn)品明顯較淺。
實施例二32.8g(0.2mol)失水山梨醇和28.2g(0.1mol)油酸中加入80000u固定化假絲酵母脂肪酶，在-0.09Mpa減壓條件下，65℃振蕩(150r/min)反應48h，反應轉(zhuǎn)化率達95.6％。經(jīng)有機溶劑提取，產(chǎn)品失水山梨醇油酸酯質(zhì)量符合國家標準GB 13481-92，其中單酯含量達到78％，色澤較同類產(chǎn)品明顯較淺。
實施例三32.8g(0.2mol)失水山梨醇和28.2g(0.1mol)油酸中加入80000u固定化假絲酵母脂肪酶，在-0.09Mpa減壓條件下，55℃振蕩(150r/min)反應48h，反應轉(zhuǎn)化率達93.2％，經(jīng)有機溶劑提取，產(chǎn)品失水山梨醇油酸酯質(zhì)量符合國家標準GB 13481-92，其中單酯含量達到81％，色澤較同類產(chǎn)品明顯較淺。
實施例四49.2g(0.3mol)失水山梨醇和28.2g(0.1mol)油酸中加入80000u固定化米曲霉脂肪酶，在-0.09Mpa減壓條件下，60℃振蕩(150r/min)反應48h，反應轉(zhuǎn)化率達91.5％。經(jīng)有機溶劑提取，產(chǎn)品失水山梨醇油酸酯質(zhì)量符合國家標準GB 13481-92，色澤較同類產(chǎn)品明顯較淺。
實施例五49.2g(0.3mol)失水山梨醇和28.2g(0.1mol)油酸中加入80000u固定化華根霉(Rhizopus chinensis)脂肪酶，在-0.09Mpa減壓條件下，60℃振蕩(150r/min)反應48h，反應轉(zhuǎn)化率達90％。經(jīng)有機溶劑提取，產(chǎn)品失水山梨醇油酸酯質(zhì)量符合國家標準GB 13481-92，色澤較同類產(chǎn)品明顯較淺。
實施例六——失水山梨醇的制備固體山梨醇245g加入1.0％催化劑H3PO3，在N2保護下真空度0.09MPa、150～200℃反應2.0小時，得到產(chǎn)物206g，其羥值為1340mgKOH/g，色澤達Gardner值4。
實施例七16.4g(0.1mol)失水山梨醇和28.2g(0.1mol)油酸中加入80000u固定化假絲酵母脂酶，在-0.09Mpa減壓條件下，60℃振蕩(150r/min)反應72h，反應轉(zhuǎn)化率達97.0％。經(jīng)有機溶劑提取，產(chǎn)品失水山梨醇油酸酯質(zhì)量符合國家標準GB 13481-92，其中單酯含量達到78％，色澤較同類產(chǎn)品明顯較淺。
實施例八164g(1.0mol)失水山梨醇和28.2g(0.1mol)油酸中加入80000u固定化假絲酵母脂肪酶，在-0.09Mpa減壓條件下，65℃振蕩(150r/min)反應48h，反應轉(zhuǎn)化率達93％。經(jīng)有機溶劑提取，產(chǎn)品失水山梨醇油酸酯質(zhì)量符合國家標準GB 13481-92，其中單酯含量達到81％，色澤較同類產(chǎn)品明顯較淺。
實施例九49.2g(0.3mol)失水山梨醇和28.2g(0.1mol)油酸中加入25000u固定化假絲酵母脂肪酶，在-0.09Mpa減壓條件下，60℃振蕩(150r/min)反應70h，反應轉(zhuǎn)化率達93.0％，經(jīng)有機溶劑提取，產(chǎn)品失水山梨醇油酸酯質(zhì)量符合國家標準GB 13481-92，其中單酯含量達到80％，色澤較同類產(chǎn)品明顯較淺。
實施例十49.2g(0.3mol)失水山梨醇和28.2g(0.1mol)油酸中加入50000u固定化米曲霉脂肪酶，在-0.09Mpa減壓條件下，60℃振蕩(150r/min)反應48h，反應轉(zhuǎn)化率達92.5％。經(jīng)有機溶劑提取，產(chǎn)品失水山梨醇油酸酯質(zhì)量符合國家標準GB 13481-92，其中單酯含量達到81％，色澤較同類產(chǎn)品明顯較淺。
實施例十一49.2g(0.3mol)失水山梨醇和28.2g(0.1mol)油酸中加入100000u固定化華根霉(Rhizopus chinensis)脂肪酶，在-0.09Mpa減壓條件下，60℃振蕩(150r/min)反應48h，反應轉(zhuǎn)化率達96.2％。經(jīng)有機溶劑提取，產(chǎn)品失水山梨醇油酸酯質(zhì)量符合國家標準GB 13481-92，其中單酯含量達到82％，色澤較同類產(chǎn)品明顯較淺。
實施例十二49.2g(0.3mol)失水山梨醇和28.2g(0.1mol)油酸中加入80000u固定化華根霉(Rhizopus chinensis)脂肪酶，在-0.09Mpa減壓條件下，50℃振蕩(150r/min)反應70h，反應轉(zhuǎn)化率達94％。經(jīng)有機溶劑提取，產(chǎn)品失水山梨醇油酸酯質(zhì)量符合國家標準GB 13481-92，色澤較同類產(chǎn)品明顯較淺。
實施例十三49.2g(0.3mol)失水山梨醇和28.2g(0.1mol)油酸中加入80000u固定化華根霉(Rhizopus chinensis)脂肪酶，在-0.09Mpa減壓條件下，70℃振蕩(150r/min)反應48h，反應轉(zhuǎn)化率達94％。經(jīng)有機溶劑提取，產(chǎn)品失水山梨醇油酸酯質(zhì)量符合國家標準GB 13481-92，色澤較同類產(chǎn)品明顯較淺。
實施例十四49.2g(0.3mol)失水山梨醇和28.2g(0.1mol)油酸中加入80000u固定化華根霉(Rhizopus chinensis)脂肪酶，在-0.09Mpa減壓條件下，60℃振蕩(150r/min)反應72h，反應轉(zhuǎn)化率達93.1％。經(jīng)有機溶劑提取，產(chǎn)品失水山梨醇油酸酯質(zhì)量符合國家標準GB 13481-92，其中單酯含量達到81％，色澤較同類產(chǎn)品明顯較淺。
權(quán)利要求
1.脂肪酶非水相中生物轉(zhuǎn)化失水山梨醇單油酸酯的方這其特征是a、加料將底物脂肪酸——油酸與底物脂肪醇——失水山梨醇按摩爾濃度比1∶1～10的比例加入到酶反應器中，再加入500～2000u/克的失水山梨醇的脂肪酶后開始反應；b、反應在60±10℃，真空度低于-0.05Mpa的減壓條件下，旋轉(zhuǎn)攪拌反應48～72小時，至底物的摩爾轉(zhuǎn)化率達平衡狀態(tài)；c、分離反應結(jié)束后，將n倍體積的有機溶劑分m次加入到反應器中，每次振蕩2小時，過濾得到含有有機溶劑的反應產(chǎn)物的溶液；d、蒸餾收集前述溶液，于真空度-0.05～0.07Mpa的條件下減壓蒸餾，除去有機溶劑，得到失水山梨醇單油酸酯。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是所用的油酸為經(jīng)過純化的油酸，純度大于99％，所用的脂肪酶為根霉(Rhizopus)脂肪酶，固定化假絲酵母(Candida)脂肪酶，米曲霉(Aspergillus)脂肪酶。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是所用的失水山梨醇為山梨醇經(jīng)加熱脫水，得到失水山梨醇，其醚化度為1～1.2；具體制取方法為70％山梨醇或固體山梨醇在酸性催化劑或堿性催化劑存在條件下，在溫度為150～230℃、真空狀態(tài)、通氮氣保護下反應1～3小時，分子內(nèi)脫去1摩爾水即為失水山梨醇，失水山梨醇的羥值在1150～1400毫克氫氧化鉀/克之間，色澤較深時用脫色劑脫色，使其色澤達到要求的黑曾值。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征是所用的脫色劑為雙氧水或活性炭。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是在加料工序a中，反應器中的反應體系為無溶劑體系，底物脂肪酸與底物脂肪醇的摩爾濃度比為1∶3。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是在反應工序b中，溫度為60℃，真空度低于-0.09Mpa。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是在分離工序c中分離出的脂肪酶，經(jīng)有機溶劑和緩沖液洗滌后，再次用于催化反應。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是在蒸餾工序d中蒸發(fā)出的有機溶劑經(jīng)過冷凝、除水處理后，回收使用。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是提取所用的有機溶劑為正己烷或正庚烷。
10.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征是酸性催化劑為對甲苯磺酸、甲基磺酸、磷酸，所述堿性催化劑為氫氧化鈉、氫氧化鉀。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物化工,具體地說是一種利用微生物脂肪酶在非水相體系中轉(zhuǎn)化合成糖酯類表面活性劑——失水山梨醇油酸酯的方法。利用適宜的條件,在非水相中催化合成該糖酯類表面活性劑,以取代目前工業(yè)生產(chǎn)中使用的化學催化劑在高溫條件下催化合成的工藝方法。該方法具有反應條件溫和,節(jié)約能耗;反應特異性強,可致敏、致癌的有毒害副產(chǎn)物少;非水相中進行酶促酯化反應效率更高等特點。
文檔編號C12P7/64GK1308129SQ0013652
公開日2001年8月15日 申請日期2000年12月28日 優(yōu)先權(quán)日2000年12月28日
發(fā)明者徐巖, 王棟, 倪永全, 穆曉清 申請人:無錫輕工大學