專利名稱：聚氧乙烯脫水山梨醇酐單油酸酯作為制備溫?zé)嶂委熌[瘤增敏藥的用途及其制法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明揭示一種有增強(qiáng)溫?zé)嶂委熌[瘤作用的增敏藥——聚氧乙烯脫水山梨醇酐單油酸酯(即吐溫80)的用途及其制法，涉及藥品的制備方法。
溫?zé)岑煼ň哂羞x擇性抗腫瘤作用，其作用的獨(dú)特性以及與其它療法如化學(xué)療法、放射療法間的互補(bǔ)性和協(xié)同性，使之成為現(xiàn)代腫瘤治療的重要手段之一。臨床上，溫?zé)岢Ｅc化療藥物合并治療多種腫瘤，包括淺表、深部、原發(fā)或繼發(fā)性腫瘤，取得良好療效，逐步形成了溫?zé)峄瘜W(xué)療法這一新領(lǐng)域。但是，溫?zé)嶂委熌[瘤達(dá)到療效所需的臨界溫度范圍較高(42.5～43℃)，合并化療所用抗癌藥物毒性反應(yīng)通常較大，這些不足之處不同程度地影響了溫?zé)峄瘜W(xué)療法的應(yīng)用及其推廣。因此，尋找理想的溫?zé)釁f(xié)同藥物，降低溫?zé)崤R界溫度，提高療效，減少副作用，是促進(jìn)該療法推廣應(yīng)用的關(guān)鍵。國(guó)際上公認(rèn)的理想的溫?zé)釁f(xié)同藥物應(yīng)是常溫下無明顯細(xì)胞毒性，而在39～42℃范圍內(nèi)能明顯選擇性殺傷腫瘤細(xì)胞的藥物。
已有技術(shù)中聚氧乙烯脫水山梨醇酐單油酸脂(即吐溫80)，在美國(guó)藥典法定名為“polysorbas”，是山梨醇的一次和二次脫水產(chǎn)物，結(jié)構(gòu)式為
由于分子中有親水性聚氧乙烯基H(G2H4O)nO-大大增加了親水性，因而是非離子型水溶性表面活性劑。被列為無公害或低公害附加劑。近年來廣泛應(yīng)用在醫(yī)學(xué)、日化和食品工業(yè)，醫(yī)藥中作為注射劑及其他劑型中的增溶、乳化劑、分散劑，也可以作為藥用輔料。(中華人民共和國(guó)藥典，一九九五年版二部，P1039-1040，化學(xué)工業(yè)出版社和藥劑學(xué)，一九六五年二月第一版，P78-81，人民衛(wèi)生出版社)。這類表面活性劑口服相對(duì)無毒性，每天口服6克連續(xù)24天、有的服用達(dá)4年之久都沒有任何不良反應(yīng)。其半數(shù)致死量口服可達(dá)25g/kg、靜脈給藥為5800mg/kg。注射后的溶血作用小于其他助溶劑，0.1％的濃度無論在體內(nèi)或體外試驗(yàn)均不引起溶血。文獻(xiàn)報(bào)道上海大眾制藥廠的產(chǎn)品在濃度為0.2％時(shí)也不產(chǎn)生溶血，肌肉注射產(chǎn)生溶血作用的最大劑量比靜脈注射量大10倍，因而是一種安全、常用的藥物。
本發(fā)明目的在于提出一類新型理想溫?zé)釁f(xié)同增敏藥物，增強(qiáng)溫?zé)峥鼓[瘤效應(yīng)，降低溫?zé)嶂委熌[瘤的臨界溫度，能在39℃～41℃溫?zé)釙r(shí)即產(chǎn)生明顯的協(xié)同抗腫瘤效應(yīng)及其制備方法。
本發(fā)明的目的是通過下述技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的在常溫下吐溫80幾乎無毒性，可從靜脈給藥，使吐溫80具有增強(qiáng)溫?zé)釟[瘤細(xì)胞的效應(yīng)，降低溫?zé)嶙饔玫呐R界溫度，抑制腫瘤熱耐受性產(chǎn)生，與溫?zé)釁f(xié)同在39℃～41℃即能顯著抑制腫瘤生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移，對(duì)正常細(xì)胞無明顯影響，這與已知吐溫80的助溶劑作用不同，和已知的抗癌藥物與溫?zé)釁f(xié)同作用也不同，從而可以用來制備作為局部和全身溫?zé)嶂委熌[瘤增敏藥物，用于腫瘤的治療。
吐溫80作為溫?zé)嶂委熌[瘤增敏藥的制備方法，其技術(shù)特征在于a．將吐溫80溶解于0.8～0.9％NaCl溶液中，配制成5～10％(重量/體積)濃度；b．再加CaCl2(1.0～1.5mM)、KCl(5.0～5.5mM)、MgSO4(0.5～0.8mM)及葡萄糖(1～5％)，用Na2HPO4/KH2PO4調(diào)節(jié)pH至7.2～7.4；c．經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾，8磅10分鐘高壓滅菌，待冷卻并使其完全溶解。
本發(fā)明的技術(shù)方案，通過實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果如下一．細(xì)胞學(xué)研究1．細(xì)胞培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞人胃癌細(xì)胞系(BGC-823)；正常細(xì)胞選用人胚肺成纖維細(xì)胞、人包皮成纖維細(xì)胞或正常人紅細(xì)胞。2．實(shí)驗(yàn)分組隨機(jī)分成以下各組吐溫80合并溫?zé)峤M(合并組)接種細(xì)胞培養(yǎng)后24小時(shí)加吐溫80，最終劑量為0.1％(重量/體積)。吐溫80作用24小時(shí)，于作用結(jié)束前，分別在高精度水浴箱中進(jìn)行39℃、41℃、43℃(±0.1℃)，作用20、60、100分鐘的溫?zé)崽幚?。換新培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。
加溫組加等容量的平衡液(Hanks)，加溫條件同合并組。
吐溫組加吐溫80條件同合并組，37℃中培養(yǎng)。
平衡液(Hanks)組加等容量的平衡液，37℃常溫培養(yǎng)。
絲裂霉索C(MMC)組方法和條件與上述各組一致，絲裂霉素C最終濃度為0.05μg/ml。
正常細(xì)胞組方法和條件與上述各組一致。3．觀察指標(biāo)A．克隆形成率在24孔培養(yǎng)板接種細(xì)胞，每孔100/ml，加熱溫度除上述外，另增加45℃組，作用時(shí)間增加40分及80分組。共培養(yǎng)10天后Giemsa染色，觀測(cè)克隆數(shù)、計(jì)算克隆形成率。根據(jù)曲線測(cè)定平均致死處理時(shí)間to及致死率k值(k=1/to)，繪制Arrhenius曲線，計(jì)算活化能的改變。
B．生長(zhǎng)曲線每小瓶?jī)?nèi)種入1×105/ml的細(xì)胞2ml，每日每組取3瓶(每瓶計(jì)數(shù)4次)計(jì)每毫升細(xì)胞數(shù)，取均值。連續(xù)觀察5天，繪制曲線。
C．細(xì)胞電泳率(EPM)用微量細(xì)胞電泳裝置及測(cè)定方法，測(cè)定溫度25℃±0.5℃,pH=7.2，電壓40V、毛細(xì)管長(zhǎng)4.5cm、細(xì)胞泳動(dòng)距離165μm、每組三瓶每瓶測(cè)三次取均值。
D．細(xì)胞膜流動(dòng)度用DPH(sigma公司產(chǎn)品)標(biāo)記細(xì)胞，日立851型熒光分光光度計(jì)測(cè)定，激發(fā)光波長(zhǎng)362nm，發(fā)射光波長(zhǎng)432nm，狹縫均為5nm，測(cè)定溫度37℃，加溫各組按相應(yīng)溫度測(cè)定。測(cè)出IVV、IHH、IVH和IHV熒光強(qiáng)度，求出熒光偏振度P和膜脂區(qū)微粘度η。
E．琥珀酸脫氫酶(SDH)的組化觀察將培養(yǎng)于蓋玻片上之細(xì)胞經(jīng)Nitro-BT法染色，顯微鏡觀察，并用MPV-Ⅲ顯微分光光度計(jì)掃描法作定量分析。λ為530nm、掃描半徑1.2μm、每組隨機(jī)取30個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞的消光值為SDH相對(duì)活性。
結(jié)果1．克隆形成率溫?zé)岷喜⑼聹?0作用后，克隆形成率隨溫度、處理時(shí)間增加呈指數(shù)下降，Arrhenius曲線在39℃～45℃間無明顯折點(diǎn)，活化能下降為112kcal/mol，而加溫組的Arrhenius曲線上，在42℃左右有一折點(diǎn)，在此折點(diǎn)上、下的活化能分別為182kcal/mol和309kcal/mol，致死率k與溫度之間呈反應(yīng)速度論關(guān)系。41℃時(shí)，加溫組∶合并吐溫組∶合并MMC組的致死率比值為1∶5.2∶3.7，可見吐溫80使溫?zé)岬闹滤缆侍岣呒s5倍左右。在常溫下，MMC作用的克隆形成率與吐溫80相似(P＞0.05)。2．生長(zhǎng)曲線腫瘤細(xì)胞在常溫下種入后24小時(shí)進(jìn)入指數(shù)增生期并持續(xù)增長(zhǎng)，隨溫度升高、作用時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞的增長(zhǎng)受到漸進(jìn)性抑制，至43℃100分細(xì)胞受到嚴(yán)重抑制，作用后72小時(shí)細(xì)胞數(shù)仍不能恢復(fù)到種入水平。
吐溫80在37℃就顯示有輕度的抑制腫瘤細(xì)胞作用，與溫?zé)岷喜⒑?，抑制癌?xì)胞生長(zhǎng)作用明顯強(qiáng)于相應(yīng)加溫組，合并作用41℃100分效應(yīng)超過加溫43℃100分效應(yīng)，提高溫?zé)嶙饔眯?yīng)2℃左右，在同一溫度中也可明顯縮短作用時(shí)間。絲裂霉素C(MMC)在37℃時(shí)也有一定抑制癌細(xì)胞作用，與溫?zé)岬膮f(xié)同效應(yīng)明顯低于吐溫80，達(dá)43℃才有所顯示。吐溫80合并溫?zé)釋?duì)人胚肺成纖維細(xì)胞抑制效應(yīng)較弱。3．細(xì)胞電泳率(EPM)常溫下腫瘤細(xì)胞EPM明顯高于正常人包皮成纖維細(xì)胞，溫?zé)岷屯聹?0對(duì)腫瘤細(xì)胞的EPM影響均明顯大于正常細(xì)胞。加溫組隨溫度、時(shí)間增加，腫瘤細(xì)胞EPM明顯下降，43℃、60分以上各組下降更為顯著，且難恢復(fù)。吐溫80降低腫瘤細(xì)胞EPM作用明顯且持久。溫?zé)岷喜⑼聹?0對(duì)腫瘤細(xì)胞有明顯的協(xié)同效應(yīng)，合并41℃、100分即時(shí)組已接近加溫組43℃60分效應(yīng)(P＞0.05)，且恢復(fù)較慢。合并43℃各組96小時(shí)后仍恢復(fù)困難。正常細(xì)胞經(jīng)合并作用后各組也稍低于相應(yīng)各加溫組，但改變明顯小于腫瘤細(xì)胞，而且96小時(shí)后恢復(fù)也較明顯。4．細(xì)胞膜流動(dòng)性吐溫80合并溫?zé)釙r(shí)各組膜流動(dòng)性均較加溫組明顯增強(qiáng)，合并41℃60分組膜流動(dòng)性已達(dá)43℃100分加溫水平，各溫?zé)峤M均顯示加溫時(shí)間效應(yīng)，冷卻后各組有不同程度恢復(fù)，但合并41℃100分以上恢復(fù)較慢。吐溫80與溫?zé)岷喜?duì)正常細(xì)胞作用較腫瘤細(xì)胞弱，且易恢復(fù)。5．琥珀酸脫氫酶(SDH)形態(tài)學(xué)和SDH相對(duì)活性測(cè)定顯示，合并組作用后各組細(xì)胞內(nèi)SDH顆粒均較相應(yīng)加溫組明顯減少，協(xié)同效應(yīng)明顯，合并41℃20分作用已超過加溫組43℃100分效果，顯示有提高溫?zé)嶙饔?℃效應(yīng)。作用后48小時(shí)各組仍保持一定的協(xié)同效果，但協(xié)同效果以即時(shí)最為明顯。二．動(dòng)物學(xué)研究1．實(shí)驗(yàn)動(dòng)物雄性BALB/C小鼠(清潔級(jí))，由上海中科院動(dòng)物中心提供，用于建立荷瘤鼠模型。2．細(xì)胞培養(yǎng)B16小鼠黑色素瘤細(xì)胞(上海中科院細(xì)胞所提供)常規(guī)培養(yǎng)于含10％新生小牛血清、0.25mM Hepes、100μ/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中。指數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞經(jīng)胰酶、EDTA消化，收集于1640培養(yǎng)基，所有實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞存活力均在95％以上。3．腫瘤生長(zhǎng)曲線于小鼠后足掌皮下接種5×105 B16細(xì)胞，10天后，足部腫瘤可達(dá)到平均0.5×0.5cm2大小。荷瘤鼠被隨機(jī)分為4組溫?zé)峤M(41℃、60分鐘水浴)；吐溫組；合并組；對(duì)照組。處理后隔日用游標(biāo)卡尺測(cè)量足部腫瘤三徑的變化，計(jì)算腫瘤體積大小，根據(jù)腫瘤體積的變化繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線。4．荷瘤鼠的死亡率建立小鼠腹腔B16腫瘤模型，接種后10天，如上所述，小鼠被隨機(jī)分為4組。處理后，小鼠在標(biāo)準(zhǔn)條件下繼續(xù)喂養(yǎng)10周，觀察小鼠的生存和死亡情況。5．肺部轉(zhuǎn)移瘤灶B16細(xì)胞預(yù)先分別經(jīng)吐溫80,41℃溫?zé)峒巴聹?0與溫?zé)岷喜⒆饔锰幚?，然后由尾靜脈接種4×105腫瘤細(xì)胞至每只小鼠，三周后，小鼠被引頸處死，解剖鏡下計(jì)算兩肺所形成的B16黑色素瘤灶數(shù)(＞0.1mm3)。
結(jié)果1．生長(zhǎng)曲線小鼠足部腫瘤的生長(zhǎng)曲線見

圖1，吐溫80與溫?zé)岷喜⒆饔?，腫瘤雖然也因加熱水腫一度增大，但隨著水腫在一周后消退，腫瘤的體積繼續(xù)減小，至作用后第三周，腫瘤體積僅為作用初期腫瘤大小的60％。大多數(shù)小鼠存活，其中8只小鼠腫瘤消失，僅在接種局部留有少許色素沉著。2．荷瘤鼠死亡率經(jīng)吐溫80和溫?zé)岷喜⒆饔煤螅∈笏劳雎拭黠@低于其它組(P＜0.05)。小鼠的平均存活時(shí)間比其它各組大大增加(見圖2)，其中9只(1/3)小鼠存活時(shí)間超過120天，被認(rèn)為獲得治愈。3．肺部轉(zhuǎn)移瘤灶吐溫80合并溫?zé)崮茱@著地減少荷瘤鼠肺部的轉(zhuǎn)移瘤灶(由192.11±92下降為16.78±16；P＜0.01)。
本發(fā)明的明顯特點(diǎn)是1．吐溫80可引起細(xì)胞質(zhì)膜系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和生物特性的改變，是一種細(xì)胞質(zhì)膜作用藥物。
2．吐溫80合并溫?zé)?39～41℃)能顯著抑制腫瘤細(xì)胞和小鼠黑色素瘤生，一些腫瘤甚至消失；延長(zhǎng)荷瘤鼠的生存時(shí)間和降低死亡率，對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移有十分明顯的抑制效應(yīng)，41℃達(dá)最佳協(xié)同效應(yīng)。
3．吐溫80與溫?zé)嵩隗w內(nèi)外均有明顯的協(xié)同抗腫瘤效應(yīng)，可使溫?zé)嶂委熌[瘤所需臨界溫度下降了關(guān)鍵的2℃(由43℃降為41℃)。為臨床進(jìn)行自身可控發(fā)熱治療腫瘤提供了依據(jù)。
4．吐溫80與41℃溫?zé)岬膮f(xié)同可抑制熱休克蛋白70的表達(dá)，從而阻礙熱耐受性產(chǎn)生；協(xié)同誘導(dǎo)細(xì)胞的程序性死亡和促進(jìn)免疫系統(tǒng)的激活。
5．吐溫80合并溫?zé)釋?duì)腫瘤組織、細(xì)胞有選擇性抑制作用。
6．制備方法操作簡(jiǎn)便，成本低，適合于工業(yè)化生產(chǎn)。
下面結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述實(shí)施例1吐溫80作為增敏藥的制備，取CaCl2150mg先溶于100ml的0.8％生理鹽水中；另稱取350mg KCl、120mgMgSO4、葡萄糖10g溶解于800ml的0.8％生理鹽水中；將CaCl2溶液緩緩倒入后者中，用Na2HPO4/KH2PO4調(diào)節(jié)pH至7.2，并添加0.8％生理鹽水至1000ml，此液作為溶劑。稱取吐溫80，配成5％(重量/體積)溶液，用0.45μm微孔醋酸纖維濾膜過濾后，8磅10分鐘高壓滅菌，待冷卻并使其完全溶解。
在臨床上作為腫瘤全身治療，抽取5％增敏藥200ml靜脈滴注，15分鐘后進(jìn)行熱療儀體外加熱(或藥物誘導(dǎo)病人發(fā)熱)，體溫在40.5℃～41℃，維持1小時(shí)，每周治療一次，4周為一療程。
實(shí)施例2吐溫80作為增敏藥的制備，取CaCl2150mg先溶于l00ml的0.8％生理鹽水中；另稱取350mg KCl、120mgMgSO4、葡萄糖10g溶解于800ml的0.8％生理鹽水中；將CaCl2溶液緩緩倒入后者中，用Na2HPO4/KH2PO4調(diào)節(jié)pH至7.2，并添加0.8％生理鹽水至1000ml，此液作為溶劑。稱取吐溫80，配成10％(重量/體積)溶液，用0.45μm微孔醋酸纖維濾膜過濾后，8磅10分鐘高壓滅菌，待冷卻并使其完全溶解。
在臨床上作為腫瘤局部治療，抽取10％增敏藥500ml進(jìn)行膀胱灌流，同時(shí)進(jìn)行熱療儀體外加熱，體溫在41.5℃，維持1小時(shí)，每周治療二次，4周為一療程。
權(quán)利要求
1．聚氧乙烯脫水山梨醇酐單油酸酯作為制備溫?zé)嶂委熌[瘤增敏藥的用途，聚氧乙烯脫水山梨醇酐單油酸酯商品名為吐溫80，美國(guó)藥典法定名稱是“Polysorbas”，它的結(jié)構(gòu)式為
本用途的特征在于吐溫80具有增強(qiáng)溫?zé)釟[瘤細(xì)胞的效應(yīng)，降低溫?zé)嶙饔玫呐R界溫度，抑制腫瘤熱耐受性產(chǎn)生，與溫?zé)釁f(xié)同在39℃～41℃即能顯著抑制腫瘤生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移，對(duì)正常細(xì)胞無明顯影響，這與已知吐溫80的助溶劑作用不同，和已知的抗癌藥物與溫?zé)釁f(xié)同作用也不同，從而可以用來制備作為局部和全身溫?zé)嶂委熌[瘤增敏藥物用于腫瘤的治療。
2．如權(quán)利要求1所述的吐溫80作為溫?zé)嶂委熌[瘤增敏藥的制備方法，其特征在于a．將吐溫80溶解于0.8～0.9％NaCl溶液中，配制成5～10％(重量/體積)濃度；b．再加CaCl2(1.0～1.5mM)、KCl(5.0～5.5mM)、MgSO4(0.5～0.8mM)及葡萄糖(1～5％)，用Na2HPO4/KH2PO4調(diào)節(jié)pH至7.2～7.4；c．經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾，8磅10分鐘高壓滅菌，待冷卻并使其完全溶解。
全文摘要
本發(fā)明是一種對(duì)溫?zé)嶂委熌[瘤有增強(qiáng)作用的藥物——聚氧乙烯脫水山梨醇酐單油酸酯的用途及其制法,它具有降低溫?zé)嶂委熌[瘤的臨界溫度,抑制腫瘤熱耐受性產(chǎn)生,提高溫?zé)峥鼓[瘤作用的特點(diǎn),并且不同于其它溫?zé)釁f(xié)同藥物,能在39℃～41℃溫?zé)釙r(shí)即產(chǎn)生明顯的協(xié)同抗腫瘤效應(yīng),對(duì)正常細(xì)胞組織無明顯毒副作用,其制造工藝亦具有成本低、操作簡(jiǎn)便,適宜大規(guī)模生產(chǎn)等特點(diǎn)。
文檔編號(hào)A61K31/74GK1207293SQ9811100
公開日1999年2月10日 申請(qǐng)日期1998年8月14日 優(yōu)先權(quán)日1998年8月14日
發(fā)明者楊虎川, 楊耀琴, 陶惠紅 申請(qǐng)人:上海鐵道大學(xué)