專利名稱：粘度降低的濃縮多肽制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及粘度降低的多肽制劑，以及該粘度降低的多肽制劑的制備方法和使用方法。
背景技術(shù)：
研究高度濃縮條件下的多肽和溶液行為對于我們對生物治療劑(biologicaltherapeutics)的穩(wěn)定性、安全性和有效性的理解是關(guān)鍵的。最近，提高多肽濃度對生物治療劑的穩(wěn)定性和安全性的影響已經(jīng)引起了生物技術(shù)工業(yè)以及食品和藥品局(FDA)的高度關(guān)注。生物治療劑的物理化學(xué)穩(wěn)定性可能僅僅受到增加的多肽濃度的負(fù)面影響?；瘜W(xué)不穩(wěn)定性通常遵循關(guān)于濃度的一級動力學(xué)；然而，物理不穩(wěn)定性可能導(dǎo)致復(fù)雜的高階過程。已經(jīng)顯示出增加的多肽濃度，如IgG濃度，將提高這些分子的自聯(lián)作用，導(dǎo)致增加的不理想的溶液特性，并且明顯影響了粘度和流變學(xué)行為。高濃度生物治療劑的皮下給藥給制藥科學(xué)家提出了不尋常的挑戰(zhàn)。對于高劑量方案，所需的多肽濃度常常大于100mg/mL，可能導(dǎo)致不理想的溶液特性、降低的穩(wěn)定性和/或降低的可制造性和遞送。這種制劑研發(fā)中的主要挑戰(zhàn)是它們的高粘度。發(fā)明簡述在此提供了一種液體制劑，其包含(a)含量大于約50mg/mL的多肽和(b)含量為制劑的約0.1%至約50% ν/ν的二甲基亞砜(DMSO)或二甲基乙酰胺(DMA)，其中與缺少DMSO或DMA的相同制劑相比，所述制劑具有降低的粘度。在此還提供了一種制備液體制劑的方法，所述液體制劑包含組合(a)含量大于約50mg/mL的多肽和(b)含量為制劑的約0. 至約50% ν/ν的二甲基亞砜(DMSO)或二甲基乙酰胺(DMA)，其中與缺少DMSO或DMA的相同制劑相比，包含多肽和DMSO或DMA組合的制劑具有降低的粘度。在此提供了包括容器的制品，所述容器含有液體制劑，所述液體制劑包含(a)含量大于約50mg/mL的多肽和(b)含量為制劑的約0. 至約50% ν/ν的二甲基亞砜(DMSO)或二甲基乙酰胺(DMA)，其中與缺少DMSO或DMA的相同制劑相比，所述制劑具有降低的粘度。此外，在此提供了使用液體制劑來治療疾病或失調(diào)的方法，包括將制劑給藥于需要的患者，所述液體制劑包含(a)含量大于約50mg/mL的多肽和(b)含量約為制劑的0. 1%至約50% ν/ν的二甲基亞砜(DMSO)或二甲基乙酰胺(DMA)，其中與缺少DMSO或DMA的相同制劑相比，所述制劑具有降低的粘度。在此還提供了將液體制劑遞送至需要的患者的方法，包括給藥制劑，所述液體制劑包含(a)含量大于約50mg/mL的多肽和(b)含量約0. 至約50% ν/ν制劑的二甲基亞砜(DMSO)或二甲基乙酰胺(DMA)，其中與缺少DMSO或DMA的相同制劑相比，制劑具有降低的粘度。在任一種制劑、方法和制造的商品的一些實(shí)施方案中，多肽能夠形成二級結(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)和/或四級結(jié)構(gòu)。在一些實(shí)施方案中，二級結(jié)構(gòu)是折疊。在任一種制劑、方法和制造的商品的一些實(shí)施方案中，多肽是疏水性的。在任一種制劑、方法和制造的商品的一些實(shí)施方案中，多肽為約100個氨基酸或更長。在任一種制劑、方法和制造的商品的一些實(shí)施方案中，多肽具有大于約5，000道爾頓的分子量。在任一種制劑、方法和制造的商品的一些實(shí)施方案中，多肽是治療性多肽。在任一種制劑、方法和制造的商品的一些實(shí)施方案中，多肽是抗體。在一些實(shí)施方案中，抗體是單克隆抗體。在一些實(shí)施方案中，單克隆抗體是嵌合抗體、人源化抗體或人抗體。在一些實(shí)施方案中，單克隆抗體是IgG單克隆抗體。在一些實(shí)施方案中，抗體是抗原結(jié)合片段。在一些實(shí)施方案中，抗原結(jié)合片段選自Fab片段、Fab，片段、F(ab，)2片段、scFv、Fv和雙抗體。在任一種制劑、方法和制造的商品的一些實(shí)施方案中，多肽包括這些參數(shù)中的一種或多種。在任一種制劑、方法和制造的商品的一些實(shí)施方案中，DMSO或DMA含量為約至約10% ν/ν制劑。在一些實(shí)施方案中，DMSO或DMA含量為約至約5% ν/ν制劑。在任一種制劑、方法和制造的商品的一些實(shí)施方案中，制劑進(jìn)一步包含組氨酸。在一些實(shí)施方案中，組氨酸含量為約IOmM至約lOOmM。在任一種制劑、方法和制造的商品的一些實(shí)施方案中，制劑進(jìn)一步包含精氨酸-HCl。在一些實(shí)施方案中，精氨酸-HCl含量為約50mM至約200mM。在任一種制劑、方法和制造的商品的一些實(shí)施方案中，多肽含量為約lOOmg/mL或更高。在一些實(shí)施方案中，多肽含量為約lOOmg/mL至約300mg/mL。在任一種制劑、方法和制造的商品的一些實(shí)施方案中，與缺少DMSO或DMA的相同制劑相比，粘度降低約1至約lOOOcP。在一些實(shí)施方案中，與缺少DMSO或DMA的相同制劑相比，粘度降低約5至約IOOcP。在任一種制劑、方法和制造的商品的一些實(shí)施方案中，與缺少DMSO或DMA的相同制劑相比，粘度降低約1. 2至約10倍。在一些實(shí)施方案中，與缺少DMSO或DMA的相同制劑相比，粘度降低約1.2至約5倍。在任一種制劑、方法和制造的商品的一些實(shí)施方案中，粘度為約50cP或更低。在一些實(shí)施方案中，粘度為約25cP或更低。在任一種制劑、方法和制造的商品的一些實(shí)施方案中，pH為約5至約8。在一些實(shí)施方案中，PH為約5至約6. 5。在任一種制劑、方法和制造的商品的一些實(shí)施方案中，DMSO或DMA為DMS0。在一些實(shí)施方案中，DMSO或DMA為DMA。在任一種制劑、方法和制造的商品的一些實(shí)施方案中，將制劑配制成通過注射來給藥。在一些實(shí)施方案中，將制劑配制成通過皮下注射來給藥。
在任一種制劑、方法和制造的商品的一些實(shí)施方案中，容器是注射器。在一些實(shí)施方案中，注射器進(jìn)一步包含在注射裝置內(nèi)。在一些實(shí)施方案中，注射裝置是自動注射器。附圖簡述


圖1顯示了在不同含量的DMSO或DMA的存在下，145mg/mL抗IFNa溶液的粘度。緩沖物質(zhì)和濃度為組氨酸氯化物05、50和75mM)，pH5. 4。圖2顯示了在10% v/v DMSO的存在(紅色圓圈)和不存在(黑色方塊)下，140mg/mL抗IFN a、25mM組氨酸氯化物溶液作為pH函數(shù)的濃度。圖3顯示了在不同含量的精氨酸氯化物和助溶劑的存在和不存在下，145mg/mL抗IFNa、25mM組氨酸氯化物，pH5. 4，的粘度。發(fā)明詳述I.制劑和制劑的制備方法在此提供了一種液體制劑，其包含(a)多肽和(b) 二甲基亞砜(DMSO)或二甲基乙酰胺(DMA)，其中與缺少(即，缺乏)DMSO或DMA的相同制劑相比，所述制劑具有降低的粘度。在此還提供了一種制備液體制劑的方法，所述液體制劑包含(a)多肽和(b) 二甲基亞砜(DMSO)或二甲基乙酰胺(DMA)，其中與缺少(即，缺乏)DMSO或DMA的相同制劑相比，所述制劑具有降低的粘度，所述方法包括組合多肽和DMSO或DMA。DMSO是具有分子式(CH3)2SO的化合物。DMSO是無色液體，并且是溶解極性和非極性化合物的重要極性非質(zhì)子溶劑，并且與大量的有機(jī)溶劑以及水混溶。DMA是具有分子式CH3C(O)N(CH3)2的有機(jī)化合物。DMA是無色的、水混溶的、高沸點(diǎn)液體，并且與大部分其他溶劑混溶，盡管在脂族烴中的溶解性差。在一些實(shí)施方案中，多肽制劑中的DMSO或DMA的含量為制劑的約 0. 至 2·5%，0· 至 5%，0· 至 7·5%，0· 至 10%，1% 至 2.5%，1%至5%，1%至7. 5%，1%至10%，1%至15%，1%至20%，1%至25%，1%至30%，1%至40%，或至50%中的任一個。在一些實(shí)施方案中，包含DMSO或DMA的多肽制劑的DMSO或 DMA 的含量為約 1%,1. 5%,2%,2. 5%,3%,3. 5%,4%,4. 5%, 5%,6%, 7%,8%,9%^；10%中的任一個。在一些實(shí)施方案中，DMSO或DMA為DMS0。在一些實(shí)施方案中，DMSO或DMA為DMA。在一些實(shí)施方案中，DMSO或DMA是DMSO和DMA的組合。在一些實(shí)施方案中，粘度是剪切粘度。剪切粘度是施加的壓力是剪切力時的粘度系數(shù)(適用于非牛頓型流體)。剪切粘度=剪切力/剪切速率。在一些實(shí)施方案中，與缺少(即，缺乏)DMSO或DMA的相同制劑相比，包含DMSO或DMA的多肽制劑的剪切粘度降低約IcP至IOOOcP，IcP至500cP, IcP至250cP, IcP至IOOcP，IcP 至 75cP，IcP 至 50cP，IcP 至 40cP，IcP 至 30cP，IcP 至 25cP，IcP 至 20cP，IcP 至 15cP，IcP至10cP，5cP至lOOcP，5cP至50cP，5cP至25cP，或5cP至15cP中的任一個。在一些實(shí)施方案中，與缺少(即，缺乏)DMSO或DMA的相同制劑相比，包含DMSO或DMA的多肽制劑的剪切粘度降低超過約 1cP，5cP，IOcP，15cP，20cP，25cP，50cP，IOOcP, 250cP, 500cP,或 IOOOcP 中的任一個。在一些實(shí)施方案中，與缺少(即，缺乏)DMSO或DMA的相同制劑相比，包含DMSO或 DMA 的多肽制劑的剪切粘度降低約 IcP，5cP，IOcP，15cP，20cP, 25cP，50cP, IOOcP, 250cP,500cP或IOOOcP中的任一個。在一些實(shí)施方案中，與缺少(即，缺乏)DMSO或DMA的相同制劑相比，包含DMSO或DMA的多肽制劑的粘度降低約1. 2倍至5倍，1. 2倍至10倍，1. 2倍至20倍，2倍至5倍，2倍至10倍，或2倍至20倍中的任一個。在一些實(shí)施方案中，與缺少(S卩，缺乏)DMSO或DMA的相同制劑相比，包含DMSO或DMA的多肽制劑的粘度降低超過約1. 2倍，2倍，3倍，4倍，5倍，6倍，7倍，8倍，9倍，10倍，15倍，20倍，25倍，或50倍中的任一個。在一些實(shí)施方案中，粘度是剪切粘度。在一些實(shí)施方案中，包含DMSO或DMA的多肽制劑的剪切粘度為約IOOcP或更低，75cP或更低，50cP或更低，25cP或更低，20cP或更低，15cP或更低，或IOcP或更低中的任一個。在一些實(shí)施方案中，包含DMSO或DMA的多肽制劑的剪切粘度為約5cP至30cP，IOcP至30cP, IOcP 至 25cP，或 15cP 至 25cP 中的任一個。在一些實(shí)施方案中，制劑中的多肽含量為約大于50mg/mL，75mg/mL，100mg/mL，110mg/mL,120mg/mL,130mg/mL,140mg/mL,150mg/mL,160mg/mL,170mg/mL,180mg/mL,190mg/mL, 200mg/mL, 250mg/mL,或300mg/mL中的任一個。制劑中的多肽含量為約50mg/mL至 300mg/mL，50mg/mL 至 200mg/mL，100mg/mL 至 300mg/mL，100mg/mL 至 200mg/mL，120mg/mL 至 300mg/mL，140mg/mL 至 300mg/mL，或 160mg/mL 至 300mg/mL 中的任一個。在一些實(shí)施方案中，制劑中的多肽含量為約 50mg/mL，75mg/mL，100mg/mL, 110mg/mL, 120mg/mL, 130mg/mL,140mg/mL,150mg/mL,160mg/mL,170mg/mL,180mg/mL,190mg/mL,200mg/mL,250mg/mL 或300mg/mL中的任一個。在一些實(shí)施方案中，通過將具有所需純度的多肽與任選的可藥用載體、賦形劑或穩(wěn)定劑(Remington，s Pharmaceutical Sciences，第 I6 版，Osol，A.編輯，(1980))混合來制備多肽制劑，以凍干制劑或含水溶液的形式，用于存儲。如本文中所用的“載體”包括在所用的劑量和濃度下，對將要暴露于其的細(xì)胞或哺乳動物是無毒的可藥用載體、賦形劑或穩(wěn)定劑。常見的可藥用載體是含水PH緩沖溶液?？山邮艿妮d體、賦形劑或穩(wěn)定劑在所用的劑量和濃度下對接受者是無毒的，并且包括緩沖劑，如磷酸鹽、檸檬酸鹽和其他有機(jī)酸的緩沖劑；抗氧化劑，包括抗壞血酸和甲硫氨酸；防腐劑(如，十八烷基二甲基芐基氯化銨；氯化己烷雙銨；苯扎氯銨、芐索氯銨；苯酚、丁醇或芐醇；對羥基苯甲酸烷基酯，如對羥基苯甲酸甲酯或?qū)αu基苯甲酸丙酯；兒茶酚；間苯二酚；環(huán)己醇；3-戊醇；和m-甲酚)；低分子量(低于約10個殘基)多肽；蛋白質(zhì)，如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、組氨酸、精氨酸或賴氨酸；單糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，如EDTA ；糖類，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成鹽相反離子，如鈉；金屬絡(luò)合物(例如，Zn-蛋白質(zhì)絡(luò)合物)；和/或非離子表面活性劑，如TWEEN 、PLUR0NICS 或聚乙二醇(PEG)。在一些實(shí)施方案中，多肽制劑進(jìn)一步包含組氨酸。在一些實(shí)施方案中，組氨酸以約IOmM 至 lOOmM，25mM 至 lOOmM，50mM 至 lOOmM，IOmM 至 200mM，25mM 至 200mM，50mM 至 200mM，或IOOmM至200mM中任一個的含量存在于多肽制劑中。在一些實(shí)施方案中，多肽制劑進(jìn)一步包含精氨酸-HCl。在一些實(shí)施方案中，精氨酸-HCl的含量為約IOmM至lOOmM，25mM至IOOmM, 50mM 至 IOOmM, IOmM 至 200mM, 25mM 至 200mM, 50mM 至 200mM,或 IOOmM 至 200mM 中的任一個。在一些實(shí)施方案中，多肽制劑的pH為約5至8、5至7、5至6. 5、5至6，或5. 5至6中的任一個。
在一些實(shí)施方案中，多肽制劑中的多肽維持功能活性。用于體內(nèi)給藥的制劑必需是無菌的。這可以通過無菌過濾膜過濾來容易地實(shí)現(xiàn)。在此的制劑按照需要還可以含有超過一種的活性化合物，用于待治療的特定適應(yīng)癥，優(yōu)選具有不會彼此不利影響的互補(bǔ)活性的那些。例如，在一個制劑中，除了多肽以外，理想地包括其他多肽(例如，抗體)。替換地，或另外地，組合物可以進(jìn)一步包含化療劑、細(xì)胞毒劑、細(xì)胞因子、生長抑制劑、抗激素劑，和/或心臟保護(hù)劑。這樣的分子合適地以對預(yù)期目標(biāo)有效的含量組合存在。在此通過“約”對數(shù)值或參數(shù)的提及包括(并且描述)涉及該數(shù)值或參數(shù)本身的變化。例如，涉及“約X”的描述包括“X”的描述。如在此和所附權(quán)利要求中所用的，單數(shù)形式“一個(a) ”、“或(or) ”和“該(the)，， 包括復(fù)數(shù)指代物，除非文中另外清楚地指出。應(yīng)理解在此所述的本發(fā)明的各個方面和變化包括“由各個方面和變化組成”和/或“基本上由各個方面和變化組成”。II.多肽在此提供了用于任一種粘度降低的多肽制劑中的多肽，以及制備在此所述的粘度降低的多肽制劑的方法。(A)多肽的定義在此所用的術(shù)語“多肽”含義是超過50個氨基酸的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，多肽是抗體。如在此所用的“氨基酸”，包括天然產(chǎn)生的和非天然產(chǎn)生的。氨基酸包括類似物，如聚乙二醇化的、脂質(zhì)化的和/或結(jié)合毒素的類似物?！凹兓摹倍嚯?例如，抗體)含義是純度已經(jīng)提高的多肽，使得以比其存在于天然環(huán)境中和/或最初合成時和/或在實(shí)驗(yàn)室條件下擴(kuò)增時更純的形式存在。純度是相對術(shù)語，并且未必表示絕對純度。當(dāng)在此使用術(shù)語“標(biāo)記的表位”時，指的是包含與“標(biāo)記多肽”融合的多肽的嵌合多肽。標(biāo)記多肽具有足夠的殘基，來提供針對其可以形成抗體的表位，而且還足夠短，使得不會影響與其融合的多肽的活性。標(biāo)記多肽優(yōu)選還是相當(dāng)獨(dú)特的，使得抗體基本上不與其他表位交叉反應(yīng)。合適的標(biāo)記多肽通常具有至少六個氨基酸殘基，并且通常約8至50個氨基酸殘基(優(yōu)選，約10至20個氨基酸殘基)。對于在此的目的，“有活性的”或“活性”指的是保持天然或自然產(chǎn)生的多肽的生物和/或免疫活性的多肽形式，其中“生物”活性指的是由天然或自然產(chǎn)生的多肽引起的生物功能(抑制性的或刺激性的)，而不是指誘導(dǎo)產(chǎn)生針對天然或自然產(chǎn)生的多肽所具有的抗原表位的抗體的能力，而“免疫”活性指的是誘導(dǎo)產(chǎn)生針對天然或自然產(chǎn)生的多肽所具有的抗原表位的抗體的能力。在此所用的術(shù)語“拮抗劑”取其最寬的含義，并且包括部分或全部阻斷、抑制或中和天然多肽的生物活性的任何分子。以相似的方式，術(shù)語“激動劑”取其最寬的含義，并且包括模擬天然多肽的生物活性的任何分子。合適的激動劑或拮抗劑分子特別包括激動劑性或拮抗劑性抗體或抗體片段、天然多肽的片段或氨基酸序列變體等。鑒定多肽的激動劑或拮抗劑的方法可以包括將多肽接觸候選激動劑或拮抗劑分子，并且測量通常與多肽相關(guān)的一種或多種生物活性的可檢測變化?！把a(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性”或“CDC”指在補(bǔ)體的存在下，分子裂解靶標(biāo)的能力。補(bǔ)體激活通路通過補(bǔ)體系統(tǒng)的第一補(bǔ)體(Clq)與分子(例如，多肽(例如，抗體))的結(jié)合來啟動，所述分子與關(guān)聯(lián)抗原復(fù)合。為了評估補(bǔ)體激活，可以進(jìn)行CDC測定，例如，如Gazzano-Santoro 等，J. Immunol. Methods 202 :163(1996)中所述的?！敖Y(jié)合”目標(biāo)抗原(例如，腫瘤相關(guān)多肽抗原靶標(biāo))的多肽，是以足夠親和力結(jié)合抗原的多肽，使得多肽在表達(dá)抗原的靶標(biāo)細(xì)胞或組織中用作診斷和/或治療劑，并且沒有與其他多肽明顯發(fā)生交叉反應(yīng)。在這樣的實(shí)施方案中，多肽與“非靶標(biāo)”多肽的結(jié)合程度將低于多肽與其特定靶標(biāo)多肽結(jié)合的約10%，如通過熒光激活細(xì)胞分選(FACS)分析或放射免疫沉淀(RIA)所測定的。關(guān)于多肽與靶標(biāo)分子的結(jié)合，術(shù)語特定多肽或特定多肽目標(biāo)上的表位的“特異性結(jié)合”，或“特異性結(jié)合”特定多肽或特定多肽靶標(biāo)上的表位，或特定多肽或特定多肽靶標(biāo)上的表位是“特異性的”，含義是可測量的不同于非特異性相互作用的結(jié)合。例如，可以通過測定與對照分子的結(jié)合相比較的分子的結(jié)合來測量特異性結(jié)合，對照分子通常是不具有結(jié)合活性的相似結(jié)構(gòu)的分子。例如，可以通過與靶標(biāo)相似的對照分子(例如，過量的未標(biāo)記靶標(biāo))的競爭來測定特異性結(jié)合。在這種情況下，如果標(biāo)記靶標(biāo)與探針的結(jié)合受到過量未標(biāo)記靶標(biāo)競爭性地抑制，則表示特異性結(jié)合。如在此所用的術(shù)語特定多肽或特定多肽靶標(biāo)上的表位的“特異性結(jié)合”，或“特異性結(jié)合”特定多肽或特定多肽靶標(biāo)上的表位，或特定多肽或特定多肽靶標(biāo)上的表位是“特異性的”，例如，可以通過對靶標(biāo)具有至少約10_4M Kd的分子來呈現(xiàn)，或者，至少約10_5M，或者至少約10_6M，或者至少約10_7M，或者至少約10_8M，或者至少約10_9M，或者至少約10_1(IM，或者至少約10_"M，或者至少約10_12M，或者更高。在一個實(shí)施方案中，術(shù)語“特異性結(jié)合”指的是其中分子結(jié)合特定多肽或特定多肽上的表位而基本上沒有結(jié)合任何其他多肽或多肽表位的結(jié)合?！耙种颇[瘤細(xì)胞生長”的多肽或“生長抑制性”多肽是導(dǎo)致癌細(xì)胞可測量的生長抑制的多肽。在一個實(shí)施方案中，可以在細(xì)胞培養(yǎng)物中在約0. 1至約30μ g/ml或約0. 5nM至約200nM的多肽濃度下測量生長抑制，其中在腫瘤細(xì)胞暴露于多肽后1-10天測定生長抑制?？梢砸愿鞣N方式，如以下實(shí)驗(yàn)實(shí)施例部分所述的，來測定腫瘤細(xì)胞的體內(nèi)生長抑制。如果給藥約1 μ g/kg至約100mg/kg體重的多肽，在第一次給藥多肽的約5天至約3個月內(nèi)(優(yōu)選約5天至約30天內(nèi))導(dǎo)致腫瘤大小或腫瘤細(xì)胞增殖降低，則多肽是體內(nèi)生長抑制性的?！罢T導(dǎo)凋亡”的多肽是誘導(dǎo)程序性細(xì)胞死亡的多肽，如通過膜聯(lián)蛋白V的結(jié)合、DNA的片段化、細(xì)胞收縮、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膨脹、細(xì)胞片段化和/或膜囊(稱為凋亡小體)形成來測定。優(yōu)選，細(xì)胞是腫瘤細(xì)胞，例如，前列腺、乳房、卵巢、胃、子宮內(nèi)膜、肺、腎臟、結(jié)腸、膀胱細(xì)胞?？梢岳酶鞣N方法來評價與凋亡相關(guān)的細(xì)胞事件。例如，可以通過膜聯(lián)蛋白結(jié)合來測量磷脂酰絲氨酸(PQ遷移；可以通過DNA階梯法來評價DNA片段化；和可以通過亞雙倍體細(xì)胞的任何增加來評價與DNA片段化一起的核/染色質(zhì)縮合。優(yōu)選，誘導(dǎo)凋亡的多肽是膜聯(lián)蛋白結(jié)合測定中相對于未處理細(xì)胞導(dǎo)致約2至約50倍膜聯(lián)蛋白結(jié)合誘導(dǎo)的多肽，優(yōu)選約5至約50倍，最優(yōu)選約10至約50倍?！罢T導(dǎo)細(xì)胞死亡”的多肽是使得活細(xì)胞變成不能存活細(xì)胞的多肽。優(yōu)選，細(xì)胞是癌細(xì)胞，例如，乳房、卵巢、胃、子宮內(nèi)膜、唾液腺、肺、腎臟、結(jié)腸、甲狀腺、胰腺或膀胱細(xì)胞。可以在補(bǔ)體和免疫效應(yīng)細(xì)胞不存在下測定體外細(xì)胞死亡，以區(qū)分通過抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)或補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(CDC)誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。因此，可以使用熱滅活血清(即，在補(bǔ)體不存在下)并在免疫效應(yīng)細(xì)胞不存在下來進(jìn)行細(xì)胞死亡的測定。為了測定多肽是否能夠誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，如可以測定相對于未處理細(xì)胞的通過碘化丙啶(PI)、錐蟲藍(lán)或 7AAD的攝入來評價膜完整性的丟失(參見，Moore等，Cytotechnology 17 1-11 (1995))。(B)多肽在此提供了用于任一種粘度降低的多肽制劑中的多肽，以及制備粘度降低的多肽制劑的方法。在一些實(shí)施方案中，多肽是治療性多肽。治療性多肽可以抑制腫瘤細(xì)胞的生長、誘導(dǎo)凋亡和/或誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。在一些實(shí)施方案中，多肽是拮抗劑。在一些實(shí)施方案中，多肽是激動劑。在一些實(shí)施方案中，多肽是抗體。在一些實(shí)施方案中，多肽是大于約50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、 63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、 88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、 200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、 390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、 580,590,600或1，000個氨基酸中的任一個。在一些實(shí)施方案中，多肽具有大于約、000 道爾頓、10，000道爾頓、15，000道爾頓、25，000道爾頓、50，000道爾頓、75，000道爾頓、 100，000達(dá)爾頓、125，000道爾頓，或150，000道爾頓中任一個的分子量。多肽可以具有約 50，000道爾頓至200，000道爾頓或100，000道爾頓至200，000道爾頓的分子量。或者，在此所用的多肽具有約120，000道爾頓或約25，000道爾頓的分子量。在一些實(shí)施方案中，多肽能夠形成二級結(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)和/或四級結(jié)構(gòu)。在一些實(shí)施方案中，多肽包含二級結(jié)構(gòu)，其中二級結(jié)構(gòu)是α-螺旋。多肽可以包含低于約75%、50%、 40%、30%、25%、20%或10%的α-螺旋二級結(jié)構(gòu)。在一些實(shí)施方案中，多肽包含二級結(jié)構(gòu)，其中二級結(jié)構(gòu)是β-折疊。多肽可以包含大于約25%、50%、60%、70%、75%、80%或 90%的β-折疊二級結(jié)構(gòu)。在一些實(shí)施方案中，多肽具有低平均親水性。按照Ηορρ，Τ. P.和Woods，K. R. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78 (6)，3824-382 (1981)來限定親水性。親水性是涉及有利于與水的熱力學(xué)相互作用的特性。通過Hopp和Woods測定的單個氨基酸親水性值可以用于定量相對親水性。通常，對于帶電的和極性側(cè)鏈觀察到正的親水性值，而對非極性側(cè)鏈觀察到負(fù)值。 在一些實(shí)施方案中，多肽具有約-3至約1、-3至0、-2至1、-2至0、-1至1，或-1至0中任一個的平均親水性。在一些實(shí)施方案中，多肽是抗體，其中一個或多個CDR區(qū)具有低于約 0、-1、-2或-3中任一個的平均親水性。在一些實(shí)施方案中，至少約1、2、3、4、5或6個⑶R 區(qū)中的任一個具有低于約0、-1、-2或-3中任一個的平均親水性。在一些實(shí)施方案中，抗體六個⑶R的平均親水性低于約0、-1、-2或-3中的任一個。在一些實(shí)施方案中，多肽具有高疏水性。按照Kyte，J.和Doolittle，R. F.，J. Mol. Bio. 157,105-132(1982)來限定疏水性。當(dāng)存在驅(qū)使沒有與溶劑強(qiáng)烈相互作用的分子離開溶劑相的強(qiáng)烈溶劑-溶劑(水)相互作用時，表示是疏水性的?？梢酝ㄟ^水相和有機(jī)相之間的單個氨基酸的分配來測量疏水性。將該分配系數(shù)限定為相對于有機(jī)相中的摩爾分?jǐn)?shù)的水相中分子的摩爾分?jǐn)?shù)。通常，對于非極性側(cè)鏈觀察到正的疏水(hydropathy)值，對于極性和帶電的側(cè)鏈觀察到負(fù)疏水值。在一些實(shí)施方案中，多肽具有約2至_1、2至1、2至0，或1至-1中任一個的平均疏水性范圍。在一些實(shí)施方案中，多肽是抗體，其中CDR區(qū)具有高平均疏水性。在一些實(shí)施方案中，⑶R區(qū)具有大于約0、1或2中任一個的平均疏水性。在一些實(shí)施方案中，至少約1、2、3、4、5或6個⑶R區(qū)中任一個具有大于約0、1或2中任一個的平均疏水性。在一些實(shí)施方案中，抗體的六個CDR的平均疏水性大于約0、1或2中的任一個。在一些實(shí)施方案中，多肽具有幾個帶電氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)。電荷分布和異質(zhì)性可能是重要的。對于非極性側(cè)鏈觀察到電荷異質(zhì)性、正的疏水值，對于極性和帶電側(cè)鏈觀察到負(fù)疏水值。在一些實(shí)施方案中，多肽具有低于約40%、35%、30%、25%、20%、15%或10%中任一個的帶電氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)。在一些實(shí)施方案中，多肽是抗體，其中CDR區(qū)具有少量帶電氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)。在一些實(shí)施方案中，⑶R區(qū)具有低于約40 %、35 %、30 %、25 %、20 %、15 %或10%中任一個的帶電氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)。在一些制劑的實(shí)施方案中，多肽包括這些參數(shù)中的一個或多個。在一些實(shí)施方案中，多肽具有少量帶電氨基酸側(cè)鏈和高疏水性。在一些實(shí)施方案中，多肽具有少量帶電氨基酸側(cè)鏈和低平均親水性。在一些實(shí)施方案中，多肽具有高疏水性和低平均親水性。在一些實(shí)施方案中，多肽具有高疏水性、低平均親水性和少量帶電氨基酸側(cè)鏈。用于在此所述制劑和方法中的多肽實(shí)例包括哺乳動物多肽，如，例如，生長激素，包括人生長激素和牛生長激素；生長激素釋放因子；甲狀旁腺激素；促甲狀腺激素；脂蛋白；α -1-抗胰蛋白酶；胰島素A-鏈；胰島素B-鏈；胰島素原；促卵泡激素；降鈣素；促黃體激素；胰高血糖素；凝血因子，如因子VIIIC、因子IX、組織因子和von Willebrands因子；抗凝血因子，如蛋白C ；心鈉素；肺表面活性物質(zhì)；纖溶酶原激活劑，如尿激酶或組織型纖溶酶原激活劑(t-PA，例如，ActivaseTM、TNKase 、RrtevaseTM) ；bombazine ；凝血酶；腫瘤壞死因子-α和-β ；腦啡肽酶；RANTES(活性受調(diào)節(jié)的正常T細(xì)胞表達(dá)和分泌因子(regulatedon activation normally T-cell expressed and secreted))；人巨 1 細(xì)Ifi炎t生蛋白(MIP-1-α)；血清白蛋白，如人血清白蛋白；苗勒-抑制物質(zhì)；松弛素A-鏈；松弛素B-鏈；松弛素原(prorelaxin)；鼠促性腺激素-相關(guān)肽；DNase ；抑制素；激活素；血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)；激素或生長因子的受體；整聯(lián)蛋白；蛋白A或D;類風(fēng)濕因子；神經(jīng)營養(yǎng)因子，如骨衍生的神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)、神經(jīng)營養(yǎng)因子-3、-4、-5或-6 (NT_3、NT4、NT-5或NT-6)，或神經(jīng)生長因子，如NGF-β ；血小板衍生的生長因子(PDGF)；成纖維細(xì)胞生長因子，如aFGF和bFGF;表皮生長因子(EGF)；轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)，如TGF-α和TGF-β，包括TGF-β 1、TGF-β 2、TGF-β 3、TGF-β 4 或 TGF-β 5 ；胰島素樣生長因子-I 和-II (IGF-I 和 IGF-II)；des (1-3)-IGF-I (腦IGF-I)；胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白；CD蛋白，如CD3、CD4、CD8、CD19和⑶20 ；促紅細(xì)胞生成素(EPO)；血小板生成素(TPO)；骨誘導(dǎo)因子；免疫毒素；骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)；干擾素，如干擾素-α、-β和-γ集落刺激因子(CFS)，例如，M-CSF、GM-CSF和G-CSF ；白細(xì)胞間介素(IL)，例如，IL-I至IL-10 ；超氧化物歧化酶；T-細(xì)胞受體；表面膜蛋白；衰變加速因子(DAF)；病毒抗原，如，例如，AIDS包膜的一部分；轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白；歸巢受體；地址素；調(diào)節(jié)蛋白；免疫粘附素；抗體；和以上所示任一種多肽的生物活性片段或變體。(C)抗體
在一些實(shí)施方案中，用于任一種粘度降低的多肽制劑的多肽和制備粘度降低的多肽制劑的方法中的多肽是抗體。本發(fā)明包含的抗體的分子靶標(biāo)包括⑶蛋白及其配體，如，但不限于(i)⑶3、⑶4、 CD8、CD19、CD20、CD22、CD34、CD40、CD79a (CD79a)和 CD79 β (CD79b) ； (ii)ErbB 受體家族的成員，如EGF受體、HER2、HER3或HER4受體；(iii)細(xì)胞粘附分子，如LFA-I、Macl、pl50， 95、VLA-4、ICAM-I、VCAM和ν/3整聯(lián)蛋白，包括其α或β亞基(例如，抗CDlla、抗CD-18 或抗CDllb抗體)；(iv)生長因子，如VEGF;IgE，血型抗原；flk2/flk3受體；肥胖(OB)受體；mpl受體；CTLA-4 ；蛋白C、BR3、c-met、組織因子7等；和(ν)細(xì)胞表面和跨膜腫瘤相關(guān)抗原(TAA)，如U. S.專利No. 7，521，541中所述的那些。本發(fā)明包括的其他示例性抗體包括選自但不限于以下的那些抗體，抗雌激素受體抗體、抗孕酮受體抗體、抗Ρ53抗體、抗HER-2/neu-抗體、抗EGFR抗體、抗組織蛋白酶D抗體、抗Bcl-2抗體、抗E-鈣粘蛋白抗體、抗CA125抗體、抗CA15-3抗體、抗CA19-9抗體、抗 c-erbB-2抗體、抗P-糖蛋白抗體、抗CEA抗體、抗視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白抗體、抗ras癌蛋白抗體、抗Lewis X抗體、抗Ki-67抗體、抗PCNA抗體、抗CD3抗體、抗CD4抗體、抗CD5抗體、 抗CD7抗體、抗CD8抗體、抗CD9/pM抗體、抗CDlO抗體、抗CDllc抗體、抗CD13抗體、抗 ⑶14抗體、抗⑶15抗體、抗⑶19抗體、抗⑶20抗體、抗⑶22抗體、抗⑶23抗體、抗⑶30 抗體、抗CD31抗體、抗CD33抗體、抗CD34抗體、抗CD35抗體、抗D38抗體、抗CD41抗體、抗 LCA/CD45抗體、抗CD45R0抗體、抗CD45RA抗體、抗CD39抗體、抗CD100抗體、抗CD95/Fas 抗體、抗CD99抗體、抗CD106抗體、抗泛素抗體、抗CD71抗體、抗c-myc抗體、抗細(xì)胞角蛋白抗體、抗波形蛋白抗體、抗HPV蛋白抗體、抗κ輕鏈抗體、抗λ輕鏈抗體、抗黑素體抗體、抗前列腺特異性抗原抗體、抗S-100抗體、抗tau抗原抗體、抗纖維蛋白抗體、抗角蛋白抗體和抗Tn-抗原抗體。(i)抗體的定義在此的術(shù)語“抗體”以最寬的含義來使用，并且特意涵蓋單克隆抗體、多克隆抗體、 從至少兩個完整抗體形成的多特異性抗體(例如，雙特異性抗體)和抗體片段，只要它們呈現(xiàn)出所需的生物活性。術(shù)語“免疫球蛋白”(Ig)在此與抗體可以互換使用?？贵w是天然產(chǎn)生的免疫球蛋白分子，其具有不同的結(jié)構(gòu)，全部都基于免疫球蛋白折疊。例如，IgG抗體具有兩條“重”鏈和兩條“輕”鏈，其通過二硫鍵形成功能性抗體。每條重鏈和輕鏈自身包含“恒定(C)”和“可變(V)”區(qū)。V區(qū)決定抗體的抗原結(jié)合特異性，而 C區(qū)提供結(jié)構(gòu)支持并在與免疫效應(yīng)物的非抗原特異性相互作用中起作用?？贵w或抗體的抗原結(jié)合片段的抗原結(jié)合特異性是抗體特異性地結(jié)合特定抗原的能力。通過V區(qū)的結(jié)構(gòu)特征來測定抗體的抗原結(jié)合特異性?？勺冃栽诳勺兘Y(jié)構(gòu)域的110 個氨基酸范圍中不是平均分布的。實(shí)際上，V區(qū)包含15-30個氨基酸的稱為框架區(qū)(FR)的相對不變的區(qū)段，其通過每個9-12個氨基酸長的稱為“高變區(qū)”的可變性非常大的較短區(qū)域隔開。天然重鏈和輕鏈的可變結(jié)構(gòu)域各自包含四個FR，大部分采用β-折疊構(gòu)象，通過三個高變區(qū)連接，其形成環(huán)狀連接，并且在一些情況中，形成折疊結(jié)構(gòu)的一部分。每條鏈中的高變區(qū)通過FR緊密連接在一起，并與另一條鏈的高變區(qū)負(fù)責(zé)形成抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)(參見，Kabat 等，Sequence ofProteins of Immunological Interest,第 5 版，Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991))。 iltg豐勾: 不直接涉及抗體與抗原的結(jié)合，但呈現(xiàn)出各種效應(yīng)物功能，如抗體在抗體依賴性細(xì)胞毒性(ADCC)中的參與。每個V區(qū)通常包含三個互補(bǔ)決定區(qū)(“⑶R”，各自含有“高變環(huán)”)和四個框架區(qū)?？贵w結(jié)合位點(diǎn)，是以實(shí)質(zhì)性的親和性結(jié)合特定所需抗原所需要的最小結(jié)構(gòu)單位，因此通常將包括三個CDR和至少三個，優(yōu)選四個散布于其中的框架區(qū)，以保持和呈現(xiàn)適當(dāng)構(gòu)象的CDR0典型的四鏈抗體具有由協(xié)作的V1^nt結(jié)構(gòu)域限定的抗原結(jié)合位點(diǎn)。特定的抗體，如駱駝和鯊魚抗體，缺少輕鏈，并且依靠僅由重鏈形成的結(jié)合位點(diǎn)?？梢灾苽鋯蝹€結(jié)構(gòu)域改造的免疫球蛋白，其中結(jié)合位點(diǎn)由單獨(dú)的重鏈或輕鏈形成，缺少Vh和\之間的協(xié)作。在整個說明書和權(quán)利要求中，除非另外指出，免疫球蛋白重鏈的恒定結(jié)構(gòu)域中的殘基編號是 Kabat 等，Sequences of Proteins of Immunological Interest,第 5 版,PublicHealth Service,NationalInstitutes of Health,Bethesda,Md. (1991)中的EU指數(shù)，在此特意引入作為參考。“Kabat中的EU指數(shù)”指的是人IgGlEU抗體的殘基編號。根據(jù)Kabat編號將V區(qū)中的殘基編號，除了特意指出順序或其他編號系統(tǒng)。術(shù)語“可變”指可變結(jié)構(gòu)域特定片段的序列在抗體之間廣泛不同的事實(shí)，并且用于每個特定抗體對其特定抗原的結(jié)合和特異性中。然而，可變性并不是平均分布在抗體的整個可變結(jié)構(gòu)域中。其集中于輕鏈和重鏈可變結(jié)構(gòu)域中的稱為高變區(qū)的三個區(qū)段中?？勺兘Y(jié)構(gòu)域中保守性更高的部分稱為框架區(qū)(FR)。天然重鏈和輕鏈的可變結(jié)構(gòu)域各自包含四個FR，大部分采用β -折疊構(gòu)象，通過三個高變區(qū)連接，其形成環(huán)狀連接，并且在一些情況中，形成折疊結(jié)構(gòu)的一部分。每個鏈中的高變區(qū)通過FR緊密連接在一起，并與另一條鏈的高變區(qū)負(fù)責(zé)形成抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)(參見，Kabat等，Sequence of Proteinsof Immunological Interest,第 5 版，Public Health Service, National Institutes ofHealth, Bethesda, Md. (1991))。恒定結(jié)構(gòu)域不直接涉及抗體與抗原的結(jié)合，但呈現(xiàn)出各種效應(yīng)物功能，如抗體在抗體依賴性細(xì)胞毒性(ADCC)中的參與。術(shù)語“高變區(qū)”用于本文中時指抗體的負(fù)責(zé)抗原結(jié)合的氨基酸殘基。高變區(qū)包含來自“互補(bǔ)決定區(qū)”或“CDR”的氨基酸殘基(例如，八中大約殘基M_34(L1)、50-56(L2)和89-97 (L3)周圍，以及 Vh 中大約殘基 31-35B(H1)、50-65(H2)和 95-102 (H3)周圍(Kabat 等，Seq uences of Proteins of Immunological Interest,第 5 版，PublicHealth Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD. (1991))和 / 或來自“超變環(huán)，，的那些殘基(例如，\中的殘基沈-32仏1)、50-52仏2)和91-96 (L3)的，以及Vh中的殘基沈_32 (Hl)、52A-55(H2)和 96-101(H3)(Chothia和 Lesk J. MoI. Biol. 196 :901-917 (1987))?！翱蚣堋被颉癋R”殘基是那些可變結(jié)構(gòu)域中非在此限定的高變區(qū)殘基的殘基。“抗體片段”包括完整抗體的一部分，優(yōu)選包含其抗原結(jié)合區(qū)?？贵w片段的實(shí)例包括Fab、Fab'、F(ab' ) 2和Fv片段；雙抗體；線性抗體；單鏈抗體分子；和由抗體片段形成的多特異性抗體?？贵w的木瓜蛋白酶消化產(chǎn)生了兩個相同的抗原結(jié)合片段(稱為“Fab”片段，各自具有單個抗原結(jié)合位點(diǎn))和殘留的“Fe”片段(該名稱反映出其容易結(jié)晶的能力)。胃蛋白酶處理產(chǎn)生F (ab ‘ ) 2片段，其具有兩個抗原-結(jié)合位點(diǎn)，并且仍然能夠交聯(lián)抗原?！癋v”是含有完整抗原識別和抗原結(jié)合位點(diǎn)的最小抗體片段。該片段由緊密、非共價連接的一條重鏈和一條輕鏈可變區(qū)結(jié)構(gòu)域的二聚體組成。在這種構(gòu)象中，每個可變結(jié)構(gòu)域的三個高變區(qū)相互作用，來限定二聚體表面上的抗原結(jié)合位點(diǎn)。共同地，六個高變區(qū)給予了抗體的抗原結(jié)合特異性。然而，即使單個可變結(jié)構(gòu)域(或只包含三個抗原特異性的高變區(qū)的一半Fv)也具有識別和結(jié)合抗原的能力，盡管親和力比完整結(jié)合位點(diǎn)的低。Fab片段還含有輕鏈的恒定結(jié)構(gòu)域和重鏈的第一個恒定結(jié)構(gòu)域(CHl)。Fab’片段不同于Fab片段，在重鏈CHl結(jié)構(gòu)域的羧基端添加了幾個殘基，包括一個或多個來自抗體鉸鏈區(qū)的半胱氨酸。Fab’-SH在此是用于指其中恒定結(jié)構(gòu)域的半胱氨酸殘基帶有至少一個游離硫醇的Fab’的名稱。F(ab’)2抗體片段最初是作為其間具有鉸鏈半胱氨酸的Fab’片段對產(chǎn)生的。抗體片段的其他化學(xué)偶聯(lián)物也是已知的。來自任何脊椎動物物種的抗體(免疫球蛋白)的“輕鏈”可以歸為兩種截然不同的類型中的一種，這兩種類型稱為卡帕(κ)和拉姆達(dá)(λ )，基于它們恒定結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列。根據(jù)重鏈恒定結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列，可以將抗體歸為不同的類別。完整的抗體存在五種主要的類別IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且這些中的幾種可以進(jìn)一步分成亞類(亞型)，例如，IgGU IgG2、IgG3、IgG4、IgA和IgA2。對應(yīng)于不同抗體類別的重鏈恒定結(jié)構(gòu)域各自稱為α、δ、ε、Y和μ。不同類別的免疫球蛋白的亞基結(jié)構(gòu)和三維構(gòu)象是公知的?！皢捂淔v”或“scFv”抗體片段包括抗體的Vh和\結(jié)構(gòu)域，其中這些結(jié)構(gòu)域存在于單個多肽鏈中。在一些實(shí)施方案中，F(xiàn)v多肽進(jìn)一步包含V1^nt結(jié)構(gòu)域之間的多肽連接物，其能夠使scFv形成抗原結(jié)合所需的結(jié)構(gòu)。對于scFv的綜述，參見Plilckthun，見 The Pharmacologyof Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg 禾口 Moore 編輯，Springer-Verlag, New York,pp.269-315(1994)。術(shù)語“雙抗體”指的是具有兩個抗原結(jié)合位點(diǎn)的小抗體片段，所述片段包含在相同多肽鏈(Vh-VJ中連接輕鏈可變區(qū)的重鏈可變區(qū)(Vh)。通過使用足夠短的接頭，使得相同鏈中的兩個結(jié)構(gòu)域之間不能配對，迫使結(jié)構(gòu)域與另一條鏈的互補(bǔ)結(jié)構(gòu)域配對，并形成兩個抗原結(jié)合位點(diǎn)。例如，在 EP404，097 ；W093/11161 ；和 Hollinger 等，Proc. Natl. Acad.Sci.USA,90 :6444-6448(1993)中，對雙抗體有更全面的描述。如在此所用的術(shù)語“單克隆抗體”指的是獲自基本上同類的抗體群的抗體，S卩，構(gòu)成所述群的單個抗體是相同的和/或結(jié)合相同的表位，除了在單克隆抗體的生產(chǎn)過程中可能出現(xiàn)的變體，這樣的變體通常少量存在。與通常包括針對不同決定簇(表位)的不同抗體的多克隆抗體制劑相反，每個單克隆抗體針對抗原上的單個決定簇。除了它們的特異性以外，單克隆抗體的優(yōu)勢還在于它們通常未被其他的免疫球蛋白污染。修飾詞“單克隆”表示從基本上同類的抗體群中獲得的抗體的特征，但不視為需要通過任何特定的方法來生產(chǎn)抗體。例如，可以通過首先由Kohler等，Nature 256 :495 (197 所述的雜交瘤方法來制得根據(jù)在此提供的方法中所用的單克隆抗體，或可以通過重組DNA方法來制得(參見，例如，U.S.專利 No. 4，816，567)。還可以使用例如 Clackson 等，Nature352 :624-6 (1991)和Marks等，J. Mol. Biol. 222 :581-597(1991)中所述的技術(shù)，從噬菌體抗體文庫中分離出“單克隆抗體”。在此的單克隆抗體特意包括“嵌合”抗體(免疫球蛋白)，其中重鏈和/或輕鏈的一部分與源自特定物種或?qū)儆谔囟贵w類別或亞類的抗體中的相應(yīng)序列相同或同源，同時鏈的剩余部分與源自另一個物種或?qū)儆诹硪环N抗體類別或亞類的抗體中的相應(yīng)序列，以及這些抗體的片段相同或同源，只要它們呈現(xiàn)出所需的生物學(xué)活性(U.S.專利No. 4，816，567; 和 Morrison 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 :6851-6855 (1984))。在此的目標(biāo)嵌合抗體包括“靈長類化”抗體，其包含源自非人靈長類(例如，舊世界猴(Old World Monkey)，如狒狒、 恒河猴或食蟹猴)的可變結(jié)構(gòu)域抗原結(jié)合序列和人恒定區(qū)序列(US專利No. 5，693，780)。非人(例如，鼠)抗體的“人源化”形式是含有源自非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗體。對于大部分而言，人源化抗體是人免疫球蛋白(受體抗體)，其中受體的高變區(qū)殘基被來自非人物種(如，小鼠、大鼠、兔或非人靈長類)高變區(qū)(供體抗體)的具有所需特異性、親和力和能力的殘基替換。在一些情況下，人免疫球蛋白的框架區(qū)(FR)殘基被相應(yīng)的非人的殘基替換。此外，人源化抗體可以包括在受體抗體或供體抗體中未發(fā)現(xiàn)的殘基。進(jìn)行這些修飾以進(jìn)一步改進(jìn)抗體性能。通常，人源化抗體將包含基本上所有的至少一個，通常兩個可變結(jié)構(gòu)域，其中所有的或基本上所有的超變環(huán)對應(yīng)于非人免疫球蛋白的那些，而所有的或基本上所有的FR是人免疫球蛋白序列的那些，除了以上所述的FR取代以外。人源化抗體還將任選包含至少一部分的免疫球蛋白恒定區(qū)，通常是人免疫球蛋白的。關(guān)于進(jìn)一步的細(xì)節(jié)，參見 Jones 等，Nature321 :522-525(1986) ；Reichmann 等，Nature 332 323-329 (1988)；和 Presta，Curr. Op. Struct. Biol. 2 :593-596 (1992)。對于在此的目的，“完整的抗體”是包含重鏈和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域以及Fc區(qū)的抗體。 恒定結(jié)構(gòu)域可以是天然序列恒定結(jié)構(gòu)域(例如，人天然序列恒定結(jié)構(gòu)域)或其氨基酸序列變體。優(yōu)選，完整的抗體具有一種或多種效應(yīng)物功能?！疤烊豢贵w”通常是約150，000道爾頓的雜四聚糖蛋白，由兩個相同的輕(L)鏈和兩個相同的重(H)鏈組成。每個輕鏈通過一個共價二硫鍵連接重鏈，而二硫鍵的數(shù)量在不同免疫球蛋白亞型的重鏈中是不同的。每條重鏈和輕鏈還規(guī)則地間隔有鏈內(nèi)二硫鍵。每條重鏈在一端具有可變結(jié)構(gòu)域(Vh)，接著是許多恒定結(jié)構(gòu)域。每條輕鏈在一端具有可變結(jié)構(gòu)域(\)，在其另一端具有恒定結(jié)構(gòu)域；輕鏈的恒定結(jié)構(gòu)域與重鏈的第一個恒定結(jié)構(gòu)域?qū)R， 并且輕鏈可變結(jié)構(gòu)域與重鏈的可變結(jié)構(gòu)域?qū)R。認(rèn)為特定的氨基酸殘基形成了輕鏈和重鏈可變結(jié)構(gòu)域之間的接觸面?！奥懵犊贵w”是沒有結(jié)合異源分子(如，細(xì)胞毒素部分或放射性同位素標(biāo)記)的抗體(如在此限定的)。在一些實(shí)施方案中，抗體“效應(yīng)物功能”指的是由抗體的Fc區(qū)(天然序列Fc區(qū)或氨基酸序列變體Fc區(qū))引起的那些生物活性，并且隨著抗體同種型而不同。抗體效應(yīng)物功能的實(shí)例包括Clq結(jié)合和補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性；Fc受體結(jié)合；抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)；噬菌作用；細(xì)胞表面受體的下調(diào)?！翱贵w依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性”和“ADCC”指的是細(xì)胞介導(dǎo)的反應(yīng)，其中表達(dá) Fc受體(FcR)的非特異性細(xì)胞毒細(xì)胞(例如，自然殺傷(NK)細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞)識別靶標(biāo)細(xì)胞上結(jié)合的抗體，并且隨后引起靶標(biāo)細(xì)胞的裂解。用于介導(dǎo)ADCC的主要細(xì)胞，NK細(xì)胞，只表達(dá)Fc y RIII，而單核細(xì)胞表達(dá)Fc y RI,Fc γ RII和Fc γ RIII。造血細(xì)胞上的 FcR 表達(dá)概括于 Ravetch 和 Kinet, Annu. Rev. Immuno 19 :457-92 (1991)的第 464 頁的表 3中。為了測定目標(biāo)分子的ADCC活性，可以進(jìn)行體外ADCC測定，如US專利No. 5，500，362 或5，821，337中所述的。對于這樣的測定，有用的效應(yīng)細(xì)胞包括外周血單核細(xì)胞(PBMC)和自然殺傷(NK)細(xì)胞。替換地，或另外地，可以在體內(nèi)測定目標(biāo)分子的ADCC活性，例如，在動物模型中測定，如Clynes等中公開的，PNAS(USA)95 :652-656(1998)。“人效應(yīng)細(xì)胞”是表達(dá)一種或多種FcR并且執(zhí)行效應(yīng)物功能的白細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞至少表達(dá)Fc YRIII并且進(jìn)行ADCC效應(yīng)物功能。介導(dǎo)ADCC的人白細(xì)胞的實(shí)例包括外周血單核細(xì)胞(PBMC)、自然殺傷(NK)細(xì)胞、單核細(xì)胞、細(xì)胞毒性T細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞；優(yōu)選PBMC和NK細(xì)胞。術(shù)語“Fe受體”或“FcR”用于描述結(jié)合抗體Fc區(qū)的受體。在一些實(shí)施方案中，F(xiàn)cR是天然序列人FcR。此外，優(yōu)選的FcR是結(jié)合IgG抗體的(Y受體)并且包括Fc γ RI、Fc γ RII和Fc γ RIII亞類的受體，包括這些受體的等位基因變體，或者這些受體的剪接形式。FcyRII受體包括Fc γ RIIA( “激活受體”)^P Fc y RIIB ( “抑制受體”)，其具有相似的氨基酸序列，主要在其細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域不同。激活受體Fc γ RIIA在其細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域中含有基于免疫受體酪氨酸的激活基序(ITAM)。抑制受體Fc γ RIIB在其細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域中含有基于免疫受體酪氨酸的抑制基序(ITIM)。(參見，Da e ron, Annu. Rev. Immunol. 15 203-234(1997))。FcR 綜述于 Ravetch 禾Π Kinet, Annu. Rev. Immunol 9 :457-92(1991)；Capel 等，Immunomethods 4:25—34(1994)；禾口 de Haas 等，J. Lab. Clin. Med. 126 330-41 (1995)。其他FcR，包括將來鑒定的那些，包括于在此的術(shù)語“FcR”中。術(shù)語還包括新生兒受體，F(xiàn)cfoi，其負(fù)責(zé)將母親的IgG轉(zhuǎn)移至胎兒中(Guyer等，J. Immunol. 117 :587(1976)和 Kim 等，J. Immunol. 24 :249 (1994))。(ii)多克隆抗體在一些實(shí)施方案中，抗體是多克隆抗體。多克隆抗體優(yōu)選在動物中通過多次皮下(SC)或腹膜內(nèi)(ip)注射相關(guān)抗原和佐劑來產(chǎn)生。使用雙功能劑或衍化劑，例如，馬來酰亞胺苯甲酰硫代琥珀酰亞胺酯(maleimidobenzoyl sulfosuccinimide ester)(通過半胱氨酸殘基結(jié)合)、N-羥基琥珀酰亞胺(通過賴氨酸殘基)、戊二醛、琥珀酐，SOCl2、或R1N = C=NR，其中R和R1是不同的烷基，將相關(guān)抗原與在待免疫的物種中致免疫的多肽結(jié)合可能是有用的，所述多肽例如為匙孔血藍(lán)蛋白、血清白蛋白、牛甲狀腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制劑。通過混合例如IOOyg或5yg多肽或綴合物(各自用于兔子或小鼠)和3體積的弗氏完全佐劑并在多個部位皮內(nèi)注射溶液，使動物相對抗原、致免疫綴合物或衍生物而得到免疫。一個月后，用弗氏完全佐劑中的1/5至1/10最初量的肽或綴合物通過多個部位的皮下注射來強(qiáng)化動物。7至14天后，將動物放血，并且測定血清的抗體滴定度。強(qiáng)化動物直至滴定度達(dá)到平臺期。在一些實(shí)施方案中，用相同抗原但結(jié)合不同多肽和/或通過不同交聯(lián)劑綴合的綴合物來強(qiáng)化動物。還可以在重組細(xì)胞培養(yǎng)物中作為多肽融合物來制得綴合物。此外，聚集劑，如明礬，可以合適地用于增強(qiáng)免疫應(yīng)答。(iii)單克隆抗體在一些實(shí)施方案中，抗體是單克隆抗體。單克隆抗體獲自基本上同類的抗體群，即，構(gòu)成群的單個抗體是相同的和/或結(jié)合相同的表位，除了在單克隆抗體的生產(chǎn)過程中可能產(chǎn)生的變體，這樣的變體通常少量存在。因此，修飾詞“單克隆”表示抗體的特征不是無聯(lián)系的或多克隆抗體的混合物。例如，可以使用首先由Kohler等，Nature 256 :495(1975)所述的雜交瘤方法來制得單克隆抗體，或可以通過重組DNA方法來制得(U.S.專利No. 4，816，567)。
在雜交瘤方法中，按照在此所述的，將小鼠或其他合適的宿主動物(如倉鼠)進(jìn)行免疫，以得到產(chǎn)生或能夠產(chǎn)生將特異性結(jié)合用于免疫的多肽的抗體的淋巴細(xì)胞?；蛘?， 可以在體外免疫淋巴細(xì)胞。然后使用合適的融合劑，如聚乙二醇，將淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì) Ififfi^n , (Goding,Monoclonal Antibodies principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press，1986))。將由此制得的雜交瘤細(xì)胞在合適的培養(yǎng)基中接種并生長，所述培養(yǎng)基優(yōu)選含有一種或多種抑制未融合的、親本雜交瘤細(xì)胞生長或存活的物質(zhì)。例如，如果親本雜交瘤細(xì)胞缺乏次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HGPRT或HPRT)，則用于雜交瘤的培養(yǎng)基通常將包括次黃嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶核苷(HAT培養(yǎng)基)，這些物質(zhì)阻止HGPRT-缺陷細(xì)胞的生長。在一些實(shí)施方案中，骨髓瘤細(xì)胞是有效融合，支持選定的抗體產(chǎn)生細(xì)胞穩(wěn)定地高水平生產(chǎn)抗體，并且對如HAT培養(yǎng)基這樣的培養(yǎng)基敏感的那些細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，在這些細(xì)胞中，骨髓瘤細(xì)胞系是鼠骨髓瘤系，如源自從&ilk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California USA獲得的M0PC-21和MPC-ll 鼠腫瘤以及從AmericanType Culture Collection, Rockville,Maryland USA獲得的 SP-2 或X-63-Ag8_653 細(xì)胞的那些。 對于人單克隆抗體的生產(chǎn)，人骨髓瘤和鼠-人雜骨髓瘤細(xì)胞系也已經(jīng)得到了描述(Kozbor， J. Immunol. 133 :3001(1984) ；Brodeur 等，Monoclonal Antibody Production Techniques andApplications，pp.51-63(Marcel Dekker, Inc.，New York，1987))。測定其中雜交瘤細(xì)胞生長的培養(yǎng)基中針對抗原的單克隆抗體的產(chǎn)生。在一些實(shí)施方案中，通過免疫沉淀或通過體外結(jié)合測定，如放射性免疫測定(RIA)或酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)，來測定雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的單克隆抗體的結(jié)合特異性。例如，可以通過Munson 等，Anal. Biochem. 107 :220(1980)的 Scatchard 分析來測定單克隆抗體的結(jié)合親和力。鑒定出產(chǎn)生所需特異性、親和力和/或活性的抗體的雜交瘤細(xì)胞后，可以通過有限稀釋方法來對克隆進(jìn)行亞克隆，并通過標(biāo)準(zhǔn)方法來生長(Goding，Monoclonal Antibodies :Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986))。用于該目的的合適培養(yǎng)基包括，例如，D-MEM或RPMI-1640培養(yǎng)基。此外，雜交瘤細(xì)胞可以作為動物中的腹水腫瘤在體內(nèi)生長。通過常規(guī)的免疫球蛋白純化方法，如，例如，多肽A-瓊脂糖、羥磷灰石色譜、凝膠電泳、滲析或親和色譜，從培養(yǎng)基、腹水流體或血清中合適地分離出由亞克隆分泌的單克隆抗體。使用常規(guī)方法(例如，通過使用能夠特異性結(jié)合編碼鼠抗體的重鏈和輕鏈的基因的寡核苷酸探針)，可以容易地將編碼單克隆抗體的DNA進(jìn)行分離和測序。在一些實(shí)施方案中，雜交瘤細(xì)胞作為這些DNA的來源。一旦得到分離，可以將DNA置于表達(dá)載體中，然后將表達(dá)載體轉(zhuǎn)染至宿主細(xì)胞中，如大腸桿菌細(xì)胞、猿COS細(xì)胞、中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO)，或沒有另外產(chǎn)生免疫球蛋白多肽的骨髓瘤細(xì)胞，以獲得重組宿主細(xì)胞中單克隆抗體的合成。 關(guān)于編碼抗體的DNA在細(xì)菌中重組表達(dá)的綜述性論文包括Skerra等，Curr. Opinion in Immunol. 5 :256-262(1993)和 Pluckthun, Immunol. Revs.，130 :151—188 (1992)。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，可以從抗體噬菌體文庫中分離抗體或抗體片段，抗體噬菌體文庫是使用McCafferty等，Nature 348 =552-554(1990)中所述的技術(shù)來產(chǎn)生的。Clackson 等，Nature 352 :624-628(1991)和 Marks 等，J. Mol. Biol. 222 :581-597(1991)各自描述了使用噬菌體文庫的鼠和人抗體的分離。隨后的出版物描述了通過鏈改組產(chǎn)生高親和力(nM范圍)人抗體(Marks等，Bio/Technology 10 :779-783 (1992))，以及組合感染和體內(nèi)重組，作為構(gòu)建非常大的噬菌體文庫的策略(Waterhouse等，Nuc. Acids. Res. 21 2265-2266 (1993))。因此，這些技術(shù)是用于分離單克隆抗體的傳統(tǒng)單克隆抗體雜交瘤技術(shù)的可行替換方案。還可以將DNA進(jìn)行修飾，例如，通過將人重鏈和輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域的編碼序列替代同源鼠序列(U. S.專利 No. 4，816，567 ；Morrison 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 6851 (1984))，或通過將免疫球蛋白編碼序列共價連接非免疫球蛋白多肽的全部或部分編碼序列。通常，將這樣的非免疫球蛋白多肽取代抗體的恒定結(jié)構(gòu)域，或取代抗體的一個抗原結(jié)合位點(diǎn)的可變結(jié)構(gòu)域，以形成嵌合二價抗體，所述嵌合二價抗體包含一個對抗原具有特異性的抗原結(jié)合位點(diǎn)和另一個對不同抗原具有特異性的抗原結(jié)合位點(diǎn)。(iv)人源化抗體在一些實(shí)施方案中，抗體是人源化抗體。現(xiàn)有技術(shù)中已經(jīng)描述了用于將非人抗體人源化的方法。在一些實(shí)施方案中，人源化抗體具有一個或多個從非人來源引入其中的氨基酸殘基。這些非人氨基酸殘基常常被稱為“輸入”殘基，其通常取自“輸入”可變結(jié)構(gòu)域?？梢曰旧习凑?Winter 和同事的方法(Jones 等，Nature 321 :522-525(1986) ；Riechann等，Nature 332:323-327(1988) ；Verhoeyen 等，Science 239 1534-1536 (1988))，通過用高變區(qū)序列替代相應(yīng)的人抗體序列，來進(jìn)行人源化。因此，這樣的“人源化”抗體是嵌合抗體(U.S.專利No. 4，816，567)，其中實(shí)質(zhì)上少于完整的人可變結(jié)構(gòu)域已經(jīng)被相應(yīng)的來自非人物種的序列替代。實(shí)際上，人源化抗體通常是其中一些高變區(qū)殘基和可能一些FR殘基被來自嚙齒動物抗體中相似位點(diǎn)的殘基替代的人抗體。制備人源化抗體中所用的人可變結(jié)構(gòu)域的選擇，包括輕鏈和重鏈可變結(jié)構(gòu)域，對于降低抗原性是非常重要的。根據(jù)所謂的“最佳適配”方法，相對已知的人可變結(jié)構(gòu)域序列的完整文庫篩選嚙齒動物抗體的可變結(jié)構(gòu)域的序列。然后將最接近嚙齒動物的人序列接受為用于人源化抗體的人框架區(qū)(FR) (Sims等，J. Immunol. 151 =2296(1993) ；Chothia等，J. Mol. Biol. 196 :901 (1987))。另一種方法使用源自輕鏈或重鏈可變區(qū)的特定亞組的所有人抗體的共有序列的特定框架區(qū)。相同的框架區(qū)可以用于幾種不同的人源化抗體(Carter等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 :4825 (1992) ；Presta 等，J. Immunol. 151 :2623 (1993))。更重要的是人源化的抗體保持對抗原的高親和力和其他有利的生物特性。為了實(shí)現(xiàn)該目的，在方法的一些實(shí)施方案中，通過使用親本和人源化序列的三維模型分析親本序列和各種概念性人源化產(chǎn)品的方法來制備人源化抗體。三維免疫球蛋白模型通常是可獲得的，并且是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的?？梢垣@得說明并展示選定的候選免疫球蛋白序列大概的三維構(gòu)象結(jié)構(gòu)的計(jì)算機(jī)程序。這些展示的觀察使得可以分析殘基在候選免疫球蛋白序列的功能中可能的作用，即，分析影響候選免疫球蛋白結(jié)合其抗原的能力的殘基。這樣，可以從受體和輸入序列中選擇并組合FR殘基，使得可以獲得所需的抗體特征，如對靶標(biāo)抗原提高的親和力。通常，高變區(qū)殘基直接并且最主要地涉及影響抗原結(jié)合。(ν)人抗體
在一些實(shí)施方案中，抗體是人抗體。作為人源化的備選方案，可以制備人抗體。例如，現(xiàn)在可以生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物(如，小鼠)，它經(jīng)過免疫能夠在缺乏內(nèi)源性免疫球蛋白生成的情況下產(chǎn)生全套人抗體。例如，已描述了在嵌合的和種系突變的小鼠中，抗體重鏈連接區(qū) (Jh)基因的純合缺失導(dǎo)致內(nèi)源性抗體生成的完全抑制。將人種系免疫球蛋白基因陣列轉(zhuǎn)移到此種系突變小鼠中，將導(dǎo)致在抗原攻擊的情況下產(chǎn)生人抗體。參見，例如，Jakobovits等， Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90 :2551 (1993) Jakobovits 等，Nature, 362 :255-258(1993)； Bruggemann 等，Year inlmmuno.，7 :33(1993)；以及 U. S.專利 5，591，669 ；5，589，369 ；和 5，545，807?；蛘?，可以使用噬菌體展示技術(shù)(McCafferty等，Nature 348:552-553(1990))， 從未免疫供體的免疫球蛋白可變(V)結(jié)構(gòu)域基因庫，在體外產(chǎn)生人類抗體和抗體片段。依據(jù)該技術(shù)，抗體V結(jié)構(gòu)域基因在讀碼框內(nèi)克隆至絲狀噬菌體(如M13或fd)的主要或次要衣殼蛋白基因中，并且在噬茵體顆粒的表面上展示為功能性抗體片段。因?yàn)榻z狀顆粒包含噬菌體基因組的單鏈DNA拷貝，基于抗體的功能特性進(jìn)行的選擇也導(dǎo)致對編碼顯示這些特性的抗體的基因進(jìn)行選擇。因此，噬菌體模仿了 B細(xì)胞的部分特點(diǎn)。噬菌體展示可以以多種形式進(jìn)行；這些綜述參見,例如,Johnson, Kevin S.和Chiswell，David J.，Current Opinion inStructural Biology 3 :564-571 (1993)?？梢允褂肰基因節(jié)段的幾個來源來進(jìn)行噬菌體展示。Clackson等，Nature，352 =624-628(1991)從免疫小鼠脾臟來源的V基因的小隨機(jī)組合文庫中分離出多樣化陣列的抗噁唑酮抗體?？梢詷?gòu)建來自未免疫的人供體的V 基因庫，并且可以基本上按照Marks等，J. MoI. Biol. 222 :581-597 (1991)或Griffith等， EMB0J. 12 :725-734(1993)所述的技術(shù)，分離針對不同抗原(包括自身抗原)的抗體。還可以參見 US 專利 No. 5，565，332 和 5，573，905。還可以通過體外活化的B細(xì)胞產(chǎn)生人抗體(參見US專利No. 5, 567,610和 5，229，275)。(vi)抗體片段在一些實(shí)施方案中，抗體是抗體片段。已經(jīng)研發(fā)了多種用于生產(chǎn)抗體片段的技術(shù)。 傳統(tǒng)上，通過蛋白水解完整的抗體來衍生這些片段(參見，例如，Morimoto等，Journal of Biochemical and Biophysical Methods24 :107-117 (1992)禾口 Brennan 等，Science,229 81 (1985)) 0然而，現(xiàn)在可以通過重組宿主細(xì)胞直接生產(chǎn)這些片段。例如，從以上所述的抗體噬菌體文庫分離抗體片段?；蛘撸梢詮拇竽c桿菌中直接回收Fab’-SH片段，并進(jìn)行化學(xué)偶聯(lián)，以形成 F (ab' )2 片段(Carter 等，Bio/TechnologylO 163-167 (1992))。根據(jù)另一種方法，可以從重組宿主細(xì)胞培養(yǎng)物中直接分離F(ab' )2片段。其它產(chǎn)生抗體片段的技術(shù)對本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。在其它實(shí)施方案中，選擇的抗體是單鏈Fv片段(scFv)。參見W 93/16185 ；US專利No. 5，571，894 ；和US專利No. 5，587，458?？贵w片段也可以是“線性抗體”，例如，如在US專利5，641，870中所述的。此類線性抗體片段可以是單特異性或雙特異性的。在一些實(shí)施方案中，提供了在此所述的抗體的片段。在一些實(shí)施方案中，抗體片段是抗原結(jié)合片段。(vii)雙特異性抗體在一些實(shí)施方案中，抗體是雙特異性抗體。雙特異性抗體是對至少兩個不同表位具有結(jié)合特異性的抗體。示例性雙特異性抗體可以結(jié)合兩個不同表位?；蛘撸p特異性抗體結(jié)合臂可以與結(jié)合白細(xì)胞上的觸發(fā)分子的臂相結(jié)合，所述觸發(fā)分子例如為T-細(xì)胞受體分子(例如，CD2 或 CD3)，或 IgG 的 Fc 受體(Fe Y R)，如 Fc γ RI (CD64), FcyRII (CD32)和FcyRIII (CD16)，使得將細(xì)胞防御機(jī)制集中于細(xì)胞?？梢詫㈦p特異性抗體制成全長抗體或抗體片段(例如，F(xiàn)(ab，)2雙特異性抗體)。用于制備雙特異性抗體的方法是本領(lǐng)域已知的。全長雙特異性抗體的傳統(tǒng)生產(chǎn)是基于兩個免疫球蛋白重鏈-輕鏈對的共同表達(dá)，其中兩條鏈具有不同的特異性(Millstein等，Nature 305 =537-539 (1983)) 0由于免疫球蛋白重鏈和輕鏈的隨機(jī)種類，這些雜交瘤(quadromas)產(chǎn)生可能的10種不同抗體分子的混合物，其中只有一種具有正確的雙特異性結(jié)構(gòu)。通常通過親和色譜步驟來進(jìn)行的正確分子的純化是相當(dāng)麻煩的，并且產(chǎn)物產(chǎn)量低。相似的方法公開于冊93/08擬9 和 Traunecker 等，EMBO J.，10 :3655-3659(1991)中。根據(jù)不同的方法，將具有所需結(jié)合特異性(抗體-抗原結(jié)合位點(diǎn))的抗體可變結(jié)構(gòu)域與免疫球蛋白恒定結(jié)構(gòu)域序列融合。在一些實(shí)施方案中，融合是與免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)進(jìn)行的，包括鉸鏈的至少一部分、CH2和CH3區(qū)。在一些實(shí)施方案中，含有輕鏈結(jié)合必需位點(diǎn)的第一個重鏈恒定區(qū)(CHl)存在于至少一個融合體中。將編碼免疫球蛋白重鏈融合體和視情況而定的免疫球蛋白輕鏈的DNA插入分開的表達(dá)載體中，并且共同轉(zhuǎn)染至合適的宿主生物體中。這在構(gòu)建時使用不同比例的三個多肽鏈的實(shí)施方案中，在調(diào)節(jié)三個多肽片段的相互比例中提供了很大的彈性以提供最佳產(chǎn)量。然而，當(dāng)至少兩個相等比例的多肽鏈的表達(dá)導(dǎo)致高產(chǎn)量時或比例不是特別重要時，可以將兩個或所有三個多肽鏈的編碼序列插入一個表達(dá)載體中。在該方法的一些實(shí)施方案中，雙特異性抗體由在一個臂中具有第一種結(jié)合特異性的雜合免疫球蛋白重鏈和在另一個臂中雜合免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(提供第二種結(jié)合特異性)組成。發(fā)現(xiàn)了這種不對稱結(jié)構(gòu)有助于將所需的雙特異性化合物從不需要的免疫球蛋白鏈組合物中分離出來，因?yàn)橹挥幸话氲碾p特異性分子中存在免疫球蛋白輕鏈提供了一種容易做到的分離方法。該方法公開于W094/04690中。對于產(chǎn)生雙特異性抗體的更多詳細(xì)內(nèi)容，參見，例如，Suresh 等，Methods in Enzymologyl21 :210 (1986)。根據(jù)US專利No. 5，731，168中所述的另一種方法，可以將抗體分子對之間的接觸面進(jìn)行改造，以最大化從重組細(xì)胞培養(yǎng)物中收集的雜二聚體的百分比。在一些實(shí)施方案中，接觸面包括抗體恒定結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)域的至少一部分。在這種方法中，用較大側(cè)鏈(例如，酪氨酸或色氨酸)替代來自第一個抗體分子的接觸面的一個或多個小氨基酸側(cè)鏈。通過用較小側(cè)鏈(例如，丙氨酸或蘇氨酸)替代大的氨基酸側(cè)鏈，在第二個抗體分子的接觸面上形成與該較大側(cè)鏈相同或相似大小的補(bǔ)償性“空腔”。這提供了一種提高雜二聚體超過其他不需要的終產(chǎn)物(如，同型二聚體)的產(chǎn)量的機(jī)制。雙特異性抗體包括交聯(lián)或“雜偶聯(lián)(heteroconjugate)”抗體。例如，雜偶聯(lián)物中的抗體之一可以結(jié)合抗生物素蛋白，另一個結(jié)合生物素。例如，已經(jīng)提出了這樣的抗體可以將免疫系統(tǒng)細(xì)胞靶向不需要的細(xì)胞(US專利No. 4，676，980)，以及用于治療HIV感染(W091/00360、W092/200373和EP03089)?？梢允褂萌魏纬Ｒ?guī)的交聯(lián)方法來制得雜偶聯(lián)抗體。合適的交聯(lián)劑是本領(lǐng)域公知的，并且公開于US專利No. 4，676，980中，連同公開了多種交聯(lián)技術(shù)。
在文獻(xiàn)中也已經(jīng)描述了從抗體片段產(chǎn)生雙特異性抗體的技術(shù)。例如，可以使用化學(xué)連接來制備雙特異性抗體。Brerman等，Science 229 =81(1985)描述了一種方法，其中將完整的抗體通過蛋白水解分裂產(chǎn)生F(ab’)2片段。在二硫醇絡(luò)合劑亞砷酸鈉的存在下將這些片段還原，以穩(wěn)定鄰近的二硫醇并防止分子間二硫化物的形成。然后將所產(chǎn)生的Fab’片段轉(zhuǎn)化成硫代硝基苯甲酸鹽(TNB)衍生物。然后通過用巰基乙胺還原將Fab’ -TNB衍生物之一重新轉(zhuǎn)化成Fab’ -硫醇，并與等摩爾量的另一個Fab’ -TNB衍生物混合，以形成雙特異性抗體。將產(chǎn)生的雙特異性抗體用作酶選擇性固定的試劑。用于從重組細(xì)胞培養(yǎng)物中直接制備和分離雙特異性抗體片段的各種技術(shù)也已經(jīng)得到了描述。例如，已經(jīng)使用亮氨酸拉鏈生產(chǎn)了雙特異性抗體。Kostelny等， J. Immunol. 148(5) 1547-1553 (1992)。通過基因融合，將來自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉鏈肽連接兩個不同抗體的Fab’部分。在鉸鏈區(qū)還原抗體同型二聚體，以形成單體，然后再氧化形成抗體雜二聚體。這種方法也可以用于生產(chǎn)抗體同型二聚體。由Hollinger等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 =6444-6448(1993)描述的“雙抗體”技術(shù)已經(jīng)提供了一種用于制備雙特異性抗體片段的替換機(jī)制。片段包含通過接頭連接輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(VJ的重鏈可變結(jié)構(gòu)域(Vh)，所述接頭足夠短，使得相同鏈上的兩個結(jié)構(gòu)域之間不能配對。因此，迫使一個片段的Vh和\結(jié)構(gòu)域與另一個片段的互補(bǔ)\和Vh結(jié)構(gòu)域配對，由此形成兩個抗原結(jié)合位點(diǎn)。另一種通過使用單鏈Fv(sFv) 二聚體來制備雙特異性抗體片段的策略也已經(jīng)得到了報道。參見 Gruber 等，J. Immunol. 152 :5368 (1994)?？紤]了超過兩價的抗體。例如，可以制備三特異性抗體。Tutt等，J. Immunol. 147 60(1991)。(viii)多價抗體在一些實(shí)施方案中，抗體是多價抗體。通過表達(dá)抗體結(jié)合的抗原的細(xì)胞，多價抗體可以比二價抗體更快地得到內(nèi)在化(和/或分解代謝)。在此提供的抗體可以是具有三個或多個抗原結(jié)合位點(diǎn)(例如，四價抗體)的多價抗體(其是除了 IgM類別以外的其他類別)， 其可以通過編碼抗體多肽鏈的核酸的重組表達(dá)來容易地產(chǎn)生。多價抗體可以包含二聚結(jié)構(gòu)域和三個或多個抗原結(jié)合位點(diǎn)。優(yōu)選的二聚結(jié)構(gòu)域包含F(xiàn)c區(qū)或鉸鏈區(qū)(或由Fc區(qū)或鉸鏈區(qū)組成)。在這種情況中，抗體將包含F(xiàn)c區(qū)和Fc區(qū)氨基端的三個或多個抗原結(jié)合位點(diǎn)。在此優(yōu)選的多價抗體包含三個至約八個，但優(yōu)選四個抗原結(jié)合位點(diǎn)(或由三個至約八個，優(yōu)選四個抗原結(jié)合位點(diǎn)組成)。多價抗體包含至少一個多肽鏈(并且優(yōu)選兩個多肽鏈)，其中多肽鏈包含兩個或多個可變結(jié)構(gòu)域。例如，多肽鏈可以包含VDl-(Xl)n-VD2-(X》n-Fc，其中 VDl是第一個可變結(jié)構(gòu)域，VD2是第二個可變結(jié)構(gòu)域，F(xiàn)c是Fc區(qū)的一個多肽鏈，Xl和X2表示氨基酸或多肽，并且η是O或1。例如，多肽鏈可以包含=VH-CHl-柔性接頭-VH-CHl-Fc 區(qū)鏈；或VH-CHl-VH-CHl-Fc區(qū)鏈。在此的多價抗體優(yōu)選進(jìn)一步包含至少兩個(并且優(yōu)選四個)輕鏈可變結(jié)構(gòu)域多肽。在此的多價抗體，例如，可以包含約兩個至約八個輕鏈可變結(jié)構(gòu)域多肽。在此考慮的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域多肽包含輕鏈可變結(jié)構(gòu)域和任選進(jìn)一步包含CL結(jié)構(gòu)域。(ix)其他抗體修飾關(guān)于效應(yīng)物功能，對在此提供的抗體進(jìn)行修飾是理想的，例如，使得增強(qiáng)抗體的抗原依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)和/或補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(⑶C)?？梢酝ㄟ^在抗體的&區(qū)引入一個或多個氨基酸取代來實(shí)現(xiàn)此目的。替換地或另外地，可以在Fc區(qū)中引入半胱氨酸殘基，由此使得在該區(qū)域中形成鏈間二硫鍵。因此產(chǎn)生的同型二聚抗體具有提高的內(nèi)在化能力和/或提高的補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞殺滅和抗體依賴性細(xì)胞毒性(ADCC)。參見Caron等，J. Exp. Med. 176 :1191-1195(1992)和 Shopes, B. J.，Immunol. 148 :2918-2922 (1992)。還可以使用雜雙功能(heterobifimctional)交聯(lián)劑來制備具有增強(qiáng)的抗腫瘤活性的同型二聚抗體，如Wolff等，Cancer Research 53:2560-2565(1993)中所述的?；蛘?，可以將抗體改造，其具有雙重Fc區(qū)并由此可以具有增強(qiáng)的補(bǔ)體介導(dǎo)的裂解和ADCC能力。參見Stevenson 等，Anti-Cancer DrugDesign 3:219-230(1989)。為了提高抗體的血清半衰期，可以在抗體中進(jìn)行氨基酸改變，如US2006/0067930中所述的，在此將其全部引入作為參考。(D)多肽變體和修飾在此所述的多肽(包括抗體)的氨基酸序列修飾可以用于粘度降低的多肽制劑和制備粘度降低的多肽制劑的方法中。(ii)變體多肽“多肽變體”含義是如在此限定的與多肽的全長天然序列、缺少信號肽的多肽序列、具有或不具有信號肽的多肽的胞外結(jié)構(gòu)域具有至少約80%氨基酸序列同一性的多肽，優(yōu)選活性多肽。這樣的多肽變體包括，例如，其中在全長天然氨基酸序列的N或C-端添加或刪除一個或多個氨基酸殘基的多肽。通常，TAT多肽變體將具有與全長天然序列多肽序列、缺少信號肽的多肽序列、具有或不具有信號肽的多肽的胞外結(jié)構(gòu)域至少約80%氨基酸序列同一性，或者至少約85%、90 %、95%、96 %、97%、98 %或99%中任一個的氨基酸序列同一性。任選，與天然多肽序列相比，變體多肽將具有不超過一個的保守氨基酸序列取代，或者與天然多肽序列相比，不超過約2、3、4、5、6、7、8、9或10個中任一個的保守氨基酸取代。例如，與全長天然多肽比較時，變體多肽可以在N-端或C-端截斷，或可以缺少內(nèi)部殘基。特定的變體多肽可以缺少對于所需生物活性不是必需的氨基酸殘基。可以通過多種常規(guī)技術(shù)中的任一種來制備這些具有截斷、刪除和插入的變體多肽。可以化學(xué)合成所需的變體多肽。另一種合適的技術(shù)涉及通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，分離和擴(kuò)增編碼所需變體多肽的核酸片段。在PCR中，在5’和3’引物中，使用限定所需核酸片段末端的寡核苷酸。優(yōu)選，變體多肽與在此公開的天然多肽共享至少一種生物和/或免疫活性。氨基酸序列插入包括氨基-和/或羧基-端融合，長度范圍從一個殘基至含有上百或更多殘基的多肽，以及單個或多個氨基酸殘基的序列內(nèi)插入。末端插入的實(shí)例包括具有N-端甲硫氨?；鶜埢目贵w或與細(xì)胞毒性多肽融合的抗體?？贵w分子的其他插入變體包括抗體的N-或C-端與酶或提高抗體血清半衰期的多肽融合的融合體。例如，提高多肽的結(jié)合親和力和/或其他生物特性是理想的。通過將合適的核苷酸變化引入抗體核酸中，或通過肽合成，來制備多肽的氨基酸序列變體。這樣的修飾包括，例如，從多肽的氨基酸序列內(nèi)刪除殘基，和/或?qū)埢迦攵嚯牡陌被嵝蛄袃?nèi)和/或取代多肽的氨基酸序列內(nèi)的殘基?？梢赃M(jìn)行刪除、插入和取代的任意組合來獲得最終構(gòu)建體，只要最終構(gòu)建體具有所需的特征。氨基酸變化還可以改變多肽(例如，抗體)的翻譯后加工，如改變糖基化位點(diǎn)的數(shù)量或位置。通過將多肽序列與同源的已知多肽分子相比較并且最小化高同源性區(qū)域中氨基酸序列改變的數(shù)量，可以找到?jīng)Q定哪個氨基酸殘基可以插入、取代或刪除而沒有不利地影響所需活性的指導(dǎo)。鑒定對于誘變是優(yōu)選位置的多肽(例如，抗體)的特定殘基或區(qū)域的有用方法稱為“丙氨酸掃描誘變”，如 Cuningham 和 Wells，Science244 1081-1085 (1989)所述的。在此，鑒定殘基或靶標(biāo)殘基組(例如，帶電荷的殘基，如Arg、Asp、His、Lys和Glu)并由中性或負(fù)電荷的氨基酸替代(最優(yōu)選丙氨酸或聚丙氨酸)，以影響氨基酸與抗原的相互作用。然后通過在取代位點(diǎn)或?yàn)榱巳〈稽c(diǎn)引入更多的或其他變體，來提煉證明對取代功能靈敏性的那些氨基酸位置。因此，盡管預(yù)定了為了引入氨基酸序列變化的位點(diǎn)，但突變性質(zhì)本身不需要預(yù)定。例如，為了分析給定位點(diǎn)的突變的性能，在靶標(biāo)密碼子或區(qū)域進(jìn)行丙氨酸掃描或隨機(jī)誘變，并且篩選表達(dá)的抗體變體的所需活性。另一種類型的變體是氨基酸取代變體。這些變體在抗體分子中具有至少一個被不同殘基替代的氨基酸殘基。對于取代誘變最感興趣的位點(diǎn)包括高變區(qū)，但也考慮了 FR改變。在以下表1中的標(biāo)題“優(yōu)選取代”下顯示了保守性取代。如果這樣的取代導(dǎo)致生物活性改變，則引入表1中稱為“示例性取代”或以下參照氨基酸類別進(jìn)一步描述的更實(shí)質(zhì)性的改變，并且篩選產(chǎn)物。表 1.
權(quán)利要求
1.一種液體制劑，其包含(a)含量大于約50mg/mL的多肽和(b)含量為制劑的約0. 1%至約50% ν/ν的二甲基亞砜(DMSO)或二甲基乙酰胺(DMA)，其中與缺少DMSO或DMA的相同制劑相比，該制劑具有降低的粘度。
2.權(quán)利要求1的制劑，其中多肽能夠形成二級結(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)和/或四級結(jié)構(gòu)。
3.權(quán)利要求2的制劑，其中多肽能夠形成二級結(jié)構(gòu)。
4.權(quán)利要求3的制劑，其中二級結(jié)構(gòu)是β-折疊。
5.權(quán)利要求1的制劑，其中多肽是疏水性的。
6.權(quán)利要求2的制劑，其中多肽為約100個氨基酸或更大。
7.權(quán)利要求1的制劑，其中多肽具有大于約5，000道爾頓的分子量。
8.權(quán)利要求1的制劑，其中多肽是治療性多肽。
9.權(quán)利要求1的制劑，其中多肽是抗體。
10.權(quán)利要求9的制劑，其中抗體是單克隆抗體。
11.權(quán)利要求10的制劑，其中單克隆抗體是嵌合抗體、人源化抗體或人抗體。
12.權(quán)利要求10的制劑，其中單克隆抗體是IgG單克隆抗體。
13.權(quán)利要求9的制劑，其中抗體是抗原結(jié)合片段。
14.權(quán)利要求13的制劑，其中抗原結(jié)合片段選自Fab片段、Fab’片段、F(ab，)2片段、scFv、Fv和雙抗體。
15.權(quán)利要求1的制劑，其中DMSO或DMA的含量為制劑的約至約10%ν/ν。
16.權(quán)利要求15的制劑，其中DMSO或DMA的含量為制劑的約至約5%ν/ν。
17.權(quán)利要求1的制劑，其中制劑進(jìn)一步包含組氨酸。
18.權(quán)利要求17的制劑，其中組氨酸的含量為約IOmM至約100mM。
19.權(quán)利要求1的制劑，其中制劑進(jìn)一步包含精氨酸-HCl。
20.權(quán)利要求19的制劑，其中精氨酸-HCl的含量為約50mM至約200mM。
21.權(quán)利要求1的制劑，其中多肽的含量為約lOOmg/mL或更高。
22.權(quán)利要求21的制劑，其中多肽的含量為約lOOmg/mL至約300mg/mL。
23.權(quán)利要求1的制劑，其中與缺少DMSO或DMA的相同制劑相比，粘度降低約1至約IOOOcP。
24.權(quán)利要求23的制劑，其中與缺少DMSO或DMA的相同制劑相比，粘度降低約5至約IOOcPo
25.權(quán)利要求1的制劑，其中與缺少DMSO或DMA的相同制劑相比，粘度降低約1.2至約10倍。
26.權(quán)利要求25的制劑，其中與缺少DMSO或DMA的相同制劑相比，粘度降低約1.2至約5倍。
27.權(quán)利要求1的制劑，其中粘度為約50cP或更低。
28.權(quán)利要求27的制劑，其中粘度為約25cP或更低。
29.權(quán)利要求1的制劑，其中pH為約5至約8。
30.權(quán)利要求四的制劑，其中pH為約5至約6.5。
31.權(quán)利要求1的制劑，其中DMSO或DMA為DMS0。
32.權(quán)利要求1的制劑，其中DMSO或DMA為DMA。
33.權(quán)利要求1的制劑，其中將制劑配制成通過注射來給藥。
34.權(quán)利要求33的制劑，其中將制劑配制成通過皮下注射來給藥。
35.一種制備權(quán)利要求1的制劑的方法，包括將多肽和DMSO或DMA組合。
36.一種包含容器的制品，所述容器含有權(quán)利要求1的制劑。
37.權(quán)利要求36的制品，其中容器是注射器。
38.權(quán)利要求37的制品，其中注射器進(jìn)一步包含在注射裝置內(nèi)。
39.權(quán)利要求38的制品，其中注射裝置是自動注射器。
40.一種使用權(quán)利要求8的制劑來治療疾病或失調(diào)的方法，包括將制劑給藥于需要的受試者。
41.權(quán)利要求40的方法，其中通過注射來給藥制劑。
42.權(quán)利要求41的方法，其中通過皮下注射來給藥制劑。
43.一種將權(quán)利要求1的制劑遞送給需要的受試者的方法，包括給藥制劑。
44.權(quán)利要求43的方法，其中通過注射來給藥制劑。
45.權(quán)利要求44的方法，其中通過皮下注射來給藥制劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及粘度降低的多肽制劑以及粘度降低的多肽制劑的制備方法和使用方法。
文檔編號A01N25/26GK102573459SQ201080044500
公開日2012年7月11日 申請日期2010年8月3日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月4日
發(fā)明者J·Y·王, S·馬丁-莫, T·卡梅爾澤爾 申請人:弗·哈夫曼-拉羅切有限公司