一種β-腎上腺素受體激動(dòng)劑的檢測(cè)試紙及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種β?腎上腺素受體激動(dòng)劑的檢測(cè)試紙及其制備方法，具體涉及一種β?腎上腺素受體激動(dòng)劑的檢測(cè)試紙，其包括底板，所述底板具有第一端和第二端，并且沿所述第一端向第二端的方向，所述底板上依次組裝有樣品墊、膠體金墊、硝酸纖維素膜和吸水墊，其中，所述膠體金墊上含有膠體金標(biāo)記的鹽酸克侖特羅單克隆抗體，所述硝酸纖維素膜上進(jìn)一步形成有檢測(cè)線和對(duì)照線，所述檢測(cè)線由能與鹽酸克侖特羅單克隆抗體結(jié)合的CL?BSA劃膜制成，所述對(duì)照線由能與鹽酸克侖特羅單克隆抗體結(jié)合的羊抗鼠抗體劃膜制成。
【專利說明】
一種β-腎上腺素受體激動(dòng)劑的檢測(cè)試紙及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及檢測(cè)方法，具體涉及一種β-腎上腺素受體激動(dòng)劑的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]“瘦肉精”泛指一類具有相似結(jié)構(gòu)的β_腎上腺素受體激動(dòng)劑(簡(jiǎn)稱β_激動(dòng)劑，β-Adrenergic agonists)化合物。由于其能夠調(diào)節(jié)支氣管擴(kuò)張和平滑肌松弛，在臨床上常被用做平喘藥物，治療呼吸系統(tǒng)疾病。當(dāng)攝入量較大時(shí)對(duì)心血管系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)具有刺激作用，引起心悸、心慌、惡心、嘔吐、肌肉顫抖等臨床癥狀。攝入量過大，還會(huì)危及生命。自20世紀(jì)80年代早期，美國(guó)Cyanamid公司的實(shí)驗(yàn)證明飼喂β_激動(dòng)劑一鹽酸克倫特羅能夠調(diào)節(jié)動(dòng)物的生長(zhǎng)。在肉用動(dòng)物生產(chǎn)中，當(dāng)其應(yīng)用劑量達(dá)治療量的5?10倍時(shí)具有能量重分配(repartit1ning)作用，能促進(jìn)肌肉發(fā)育和脂肪分解，提高胴體瘦肉比率，促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)，降低飼養(yǎng)成本。但此類物質(zhì)會(huì)在動(dòng)物組織中殘留，尤以肝臟等內(nèi)臟器官殘留較高，當(dāng)人們食用了含“瘦肉精”殘留的動(dòng)物內(nèi)臟和肉品后，常造成急性或慢性食肉中毒，危害消費(fèi)者的健康安全。到目前為止沒有一個(gè)國(guó)家批準(zhǔn)β-激動(dòng)劑類藥物用于動(dòng)物生產(chǎn)之中，但長(zhǎng)期以來(lái)一直存在著非法使用，并造成嚴(yán)重的食物中毒事件。因此，在肉用動(dòng)物中應(yīng)用“瘦肉精” 一直是人們關(guān)注的焦點(diǎn)問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]為了解決上述問題，本發(fā)明一個(gè)方面提供了一種β_腎上腺素受體激動(dòng)劑的檢測(cè)試紙，其包括底板，所述底板具有第一端和第二端，并且沿所述第一端向第二端的方向，所述底板上依次組裝有樣品墊、膠體金墊、硝酸纖維素膜和吸水墊，
[0004]其中，所述膠體金墊上含有膠體金標(biāo)記的鹽酸克侖特羅單克隆抗體，
[0005]所述硝酸纖維素膜上進(jìn)一步形成有檢測(cè)線和對(duì)照線，所述檢測(cè)線由能與鹽酸克侖特羅單克隆抗體結(jié)合的CL-BSA劃膜制成，所述對(duì)照線由能與鹽酸克侖特羅單克隆抗體結(jié)合的羊抗鼠抗體劃膜制成。
[0006]其中，所述膠體金標(biāo)記的鹽酸克侖特羅單克隆抗體通過以下方法制得:
[0007]取100單位體積的雙蒸水煮沸然后加入I單位體積的I%氯金酸溶液，繼續(xù)煮沸1-lOmin，然后加入3單位體積的1%的檸檬酸三鈉，攪拌至液體顏色由灰色變成黑色再變成紫色，再煮沸至液體顏色變?yōu)榫萍t色，再加雙蒸水至100單位體積，獲得膠體金溶液;優(yōu)選地，所述膠體金溶液在520nm和535nm處的吸光值為0.8-1.0；
[0008]調(diào)節(jié)膠體金溶液的pH至8.2 ；在膠體金溶液中加入鹽酸克侖特羅單克隆抗體至鹽酸克侖特羅單克隆抗體的濃度為4_8yg/mL(6yg/mL)，混勻后加入10%PEG20000至PEG20000的濃度為1%，獲得純化前的膠體金標(biāo)記的鹽酸克侖特羅單克隆抗體；
[0009]將膠體金標(biāo)記的鹽酸克侖特羅單克隆抗體以2000r/min，4°C離心20min，棄去沉淀；
[0010]將上一步所得上清以10000r/min，4°C離心30min，棄去上清；
[0011]用0.05moI/L的TBS (內(nèi)含I % BSA，0.05 % NaN3)緩沖液溶解沉淀至純化前的原體積，重復(fù)前兩步的離心2?3次，將沉淀溶于I/1OTBS(內(nèi)含I % BSA，0.05 %NaN3)中至純化前原體積，4°C保存?zhèn)溆茫@得純化后的膠體金標(biāo)記的鹽酸克侖特羅單克隆抗體。
[0012]其中，所述膠體金墊是經(jīng)過是BSA、SDS和Tween-20處理過的，
[0013]優(yōu)選地，所述膠體金墊通過如下方法制得:
[0014]配制膠體金墊處理液:用pH7.4的PBS加入I %的BSA、0.5%的SDS、I %的Tween-20混勻后過濾；
[0015]把玻璃纖維膜放置于膠體金處理液中浸泡30min，37 °C烘干；
[0016]將膠體金標(biāo)記的鹽酸克侖特羅單克隆抗體以5yL/cm的噴量噴涂于經(jīng)處理液處理過的玻璃纖維素膜上，烘干；
[0017]其中，所述樣品墊是經(jīng)過是BSA、SDS和Tween-20處理過的，
[0018]優(yōu)選地，所述樣品墊通過如下方法制得:
[0019]配制樣品墊處理液:用pH7.4的PBS加入I %的BSA、0.5%的SDS、I %的Tween-20混勻后過濾；
[0020]把樣品墊放置于膠體金處理液中浸泡30min，37 °C烘干。
[0021]其中，設(shè)置檢測(cè)線和對(duì)照線的硝酸纖維素膜是將CL-BSA稀釋為lmg/mL，羊抗鼠二抗稀釋為2mg/mL，并分別以lyL/cm的劑量在硝酸纖維素膜上進(jìn)行劃膜，劃膜后烘干。
[0022]其中，硝酸纖維素膜選自Millipore M-135和玻璃纖維膜選自SB-08。
[0023]本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了前述的檢測(cè)試紙的制備方法，其包括如下步驟:
[0024]I)制備膠體金標(biāo)記的鹽酸克侖特羅單克隆抗體:
[0025]1-1)取100單位體積的雙蒸水煮沸然后加入I單位體積的I %氯金酸溶液，繼續(xù)煮沸Ι-lOmin，然后加入3單位體積的1%的檸檬酸三鈉，攪拌至液體顏色由灰色變成黑色再變成紫色，再煮沸至液體顏色變?yōu)榫萍t色，再加雙蒸水至100單位體積，獲得膠體金溶液;優(yōu)選地，所述膠體金溶液在520nm和535nm處的吸光值為0.8-1.0；
[0026]1-2)調(diào)節(jié)膠體金溶液的pH至8.2;
[0027]在膠體金溶液中加入鹽酸克侖特羅單克隆抗體至鹽酸克侖特羅單克隆抗體的濃度為4_8yg/mL(6yg/mL)，混勻后加入10%PEG20000至PEG20000的濃度為1%，獲得純化前的膠體金標(biāo)記的鹽酸克侖特羅單克隆抗體；
[0028]1-3)將膠體金標(biāo)記的鹽酸克侖特羅單克隆抗體以20001'/111；[11，4<€離心20111；[11，棄去沉淀；
[0029]1-4)將上一步所得上清以10000r/min，4°C離心30min，棄去上清；
[0030]1-5)用0.05moVL的TBS (內(nèi)含I % BSA，0.05%NaN3)緩沖液溶解沉淀至純化前的原體積，重復(fù)前兩步的離心2?3次，將沉淀溶于I/1OTBS(內(nèi)含I % BSA，0.05 %NaN3)中至純化前原體積，4°C保存?zhèn)溆?，獲得純化后的膠體金標(biāo)記的鹽酸克侖特羅單克隆抗體；
[0031]2)制備膠體金墊:
[0032]2-1)配制膠體金墊處理液:用pH7.4的PBS加入I %的BSA、0.5 %的SDS、I %的Tween-20混勾后過濾；
[0033 ] 2-2)把玻璃纖維膜放置于膠體金處理液中浸泡30min，37 V烘干；
[0034]2-3)將膠體金標(biāo)記的鹽酸克侖特羅單克隆抗體以5yL/cm的噴量噴涂于經(jīng)處理液處理過的玻璃纖維素膜上，烘干；
[0035]3)制備樣品墊:
[0036]3-1)配制樣品墊處理液:用？!17.4的？83加入1%的834、0.5%的303、1%的了￥6611-20混勻后過濾；
[0037]3-2)把樣品墊放置于膠體金處理液中浸泡30min，37 °C烘干；
[0038]4)制備設(shè)置檢測(cè)線和對(duì)照線的硝酸纖維素膜:
[0039]4-1)將CL-BSA稀釋為lmg/mL，羊抗鼠二抗稀釋為2mg/mL，并分別以lyL/cm的劑量在硝酸纖維素膜上劃膜，劃膜后烘干；
[0040]5)組裝:依次將樣品墊、膠體金墊、硝酸纖維膜和吸水墊粘貼在底板上即得。
[0041 ] 其中，CL-BAS是通過重氮化法方法獲得，具體為:
[0042]稱取CL于反應(yīng)瓶中，加入鹽酸(lmol/L)和雙蒸水?dāng)嚢枞芙?，?°C條件下向上述溶液滴加0.2mol/L的亞硝酸鈉溶液，用碘化鉀試紙測(cè)定至紫紅色為止，4°C低速攪拌Ih，即為A液；
[0043]稱取BSA，充分溶解于碳酸鹽緩沖液(p H 9.0)，即為B液；
[0044]把A液緩慢滴入B液，4°C反應(yīng)過夜；用磷酸鹽緩沖液透析，取上清為免疫抗原CL-BSA0
[0045]本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了前述的檢測(cè)試紙?jiān)跈z測(cè)沙丁胺醇、萊克多巴胺、鹽酸克倫特羅、西馬特羅、氯丙那林、妥布特羅、噴布特羅、硫酸特布他林及其類似物的應(yīng)用。
【附圖說明】
[0046]圖1.CL金標(biāo)抗體最適蛋白量測(cè)定，1-6抗體濃度分別為I，2，4，5，8，10yg/mL，另設(shè)空白對(duì)照。
[0047]圖2.瘦肉精膠體金試紙條對(duì)照線濃度的確定。
[0048]圖3鹽酸克倫特羅膠體金試紙條組裝示意圖。
[0049 ]圖4瘦肉精膠體金試紙條靈敏性實(shí)驗(yàn)。
[0050]圖5瘦肉精膠體金試紙條靈敏性實(shí)驗(yàn)結(jié)果。I鹽酸多巴胺丁胺;2重酒石酸去甲腎上腺素;3鹽酸多巴胺;4異丙腎上腺素;5沙丁胺醇;6萊克多巴胺;7鹽酸克倫特羅;8陰性對(duì)照生理鹽水
[0051 ]圖6瘦肉精膠體金試紙條靈敏性實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
[0052]圖7瘦肉精膠體金試紙條靈敏性實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
[0053 ]圖8瘦肉精膠體金試紙條保存期實(shí)驗(yàn)。
【具體實(shí)施方式】
[0054]本發(fā)明所用所有試劑均為分析純，其中氯金酸、碳酸鉀購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司；鹽酸克侖特羅(CL)單抗、羊抗鼠抗體、單面膠PVC板、玻璃纖維膜、硝酸纖維素膜(NC膜)購(gòu)自上海金標(biāo)生物科技有限公司；紫外分光光度計(jì)購(gòu)自Amersham公司；高速冷凍離心機(jī)購(gòu)自Sigma公司;膠體金點(diǎn)樣系統(tǒng)(噴涂機(jī)、切條機(jī)、手動(dòng)貼膜機(jī))購(gòu)自B1 Dot公司。
[0055]實(shí)施例1膠體金溶液的制備
[0056]取10mL雙蒸水煮沸然后加入ImL氯金酸溶液(I % )，繼續(xù)煮沸3min，然后加入I %的檸檬酸三鈉3mL，轉(zhuǎn)至磁力攪拌器中加入轉(zhuǎn)子攪拌2min，此時(shí)顏色由灰色變成黑色再變成紫色，再放到電爐上煮沸6min，顏色變?yōu)榫萍t色，再加水至原體積，裝膠體金溶液的瓶子要用錫箔紙包好避光4°C保存。
[0057]實(shí)施例2膠體金質(zhì)量鑒定
[0058]配制好的膠體金溶液用紫外分光光度計(jì)測(cè)波長(zhǎng)在520nm和535nm處的吸光值，吸光值在0.8-1.0之間較好。
[0059]實(shí)施例3最適蛋白量及pH值的確定。
[0060](1)ρΗ 的確定
[0061 ] 以0.2mol/L的K2CO3或0.lmol/L的HCl溶液調(diào)膠體金溶液的pH至8.2。
[0062](2)最適蛋白量的確定
[0063]將鹽酸克侖特羅單克隆抗體逐級(jí)稀釋(I，2，4，5，8，10yg/mL，另設(shè)空白對(duì)照)，各取10yL加入一系列裝有ImL膠體金的離心管中，混勻后反應(yīng)5min，再每管分別加入10yL10%的NaCl溶液，作用2h觀察顏色變化(圖1)?？瞻坠芗皢慰沟鞍琢坎蛔阋苑€(wěn)定金溶膠的各孔呈現(xiàn)由紅變藍(lán)的聚沉現(xiàn)象，而單抗蛋白量達(dá)到或超過最低穩(wěn)定量的各管仍保持紅色不變。選擇其中含蛋白量最低的紅色管即為ImL膠體金所需的鹽酸克侖特羅單克隆抗體蛋白量，在此基礎(chǔ)上加量20%為標(biāo)記的最適蛋白量，最終鹽酸克侖特羅單克隆抗體濃度約為6μg/mL0
[0064]實(shí)施例4鹽酸克侖特羅單克隆抗體的膠體金標(biāo)記
[0065]根據(jù)用以標(biāo)記的膠體金總量計(jì)算出所需鹽酸克侖特羅單克隆抗體的總量，加入鹽酸克侖特羅單克隆抗體混勻后加入10%PEG20000至終濃度為1%，獲得純化前的膠體金標(biāo)記的鹽酸克侖特羅單克隆抗體，4°C過夜后純化。
[0066]實(shí)施例5膠體金標(biāo)記的鹽酸克侖特羅單克隆抗體的純化
[0067](I)將膠體金標(biāo)記的鹽酸克侖特羅單克隆抗體以2000r/min，4°C離心20min，棄去沉淀。
[0068](2)將步驟(I)所得上清以10000r/min，4°C離心30min，棄去上清。
[0069](3)用0.05mo VL的TBS(內(nèi)含I %BSA，0.05 %NaN3)緩沖液溶解沉淀至純化前的原體積，重復(fù)步驟(I)和(2)離心2?3次，將沉淀溶于純化前原體積的1/10TBS(內(nèi)含I %BSA，
0.05% NaN3)中，4 °C保存?zhèn)溆?，獲得純化后的膠體金標(biāo)記的鹽酸克侖特羅單克隆抗體。
[0070]實(shí)施例6膠體金墊和樣品墊的優(yōu)化處理
[0071 ] (I)配制膠體金墊和樣品墊處理液:用pH7.4的PBS加入I %的BSA、0.5%的SDS、I %的Tween-20用漩渦振蕩器混勻后過濾備用。
[0072 ] (2)把玻璃纖維膜和樣品墊放置于處理液中浸泡30min，37 V烘干，備用。
[0073]實(shí)施例7玻璃纖維膜的選擇
[0074]選擇國(guó)產(chǎn)玻璃纖維膜SB-08、SB-06經(jīng)上述優(yōu)化處理后作為金標(biāo)抗體結(jié)合墊，包被等量的金標(biāo)抗體，干燥后與硝酸纖維素包被膜裝配成試紙條，加水，觀察層析速度及膠體金墊對(duì)金標(biāo)抗體的結(jié)合強(qiáng)度，SB-08的層析速度及膠體金墊對(duì)金標(biāo)抗體的結(jié)合強(qiáng)度都要好于SB-06，最終選擇SB-08用做膠體金墊。
[0075]實(shí)施例8金標(biāo)抗體噴膜
[0076]取優(yōu)化處理過的玻璃纖維膜，由噴涂機(jī)將確定為最佳稀釋度的金標(biāo)單抗液按5yL/cm的噴量噴涂于其上，然后置37 °C干燥箱烘干，加干燥劑封口，置4°C冰箱備用。
[0077]實(shí)施例9NC膜的選擇
[0078]選擇Millipore M-135和Sartorius CN-140硝酸纖維素膜作為層析膜，用噴膜儀將2mg/mL的鹽酸克侖特羅單克隆抗體和2mg/mL的羊抗鼠抗體分別包被到NC膜上，兩線相距5mm，然后與結(jié)合有金標(biāo)抗體的SB-08玻璃纖維膜組裝成試紙條，以水為樣品液進(jìn)行檢測(cè)，比較兩種膜的層析速度、相同時(shí)間內(nèi)膜上檢測(cè)線的顯色情況及膜的背景底色，Millipore M-135層析速度適中，出線較好，最終選擇Mi I lipore M-135。
[0079]實(shí)施列1CL-BSA的制備
[0080]根據(jù)重氮化法合成CL-BSA，具體方法如下:稱取3mg的CL于反應(yīng)瓶中，加入Im L鹽酸(lmol/L)和500yL的雙蒸水?dāng)嚢枞芙?，?°C條件下向上述溶液滴加0.2mol/L的亞硝酸鈉溶液(間隔20s，每次滴加20yL)，用碘化鉀試紙測(cè)定至紫紅色為止，4°C低速攪拌lh，即為A液。
[0081 ] 稱取1mg BSA，充分溶解于1.5m L的碳酸鹽緩沖液(p H 9.0)，即為B液。
[0082I把A液緩慢滴入B液，4°C反應(yīng)過夜；用磷酸鹽緩沖液透析，每6?8h換液一次，透析3d；5 000r/min離心5min，取上清為免疫抗原CL-BSA，分裝于1.5m L離心管，_20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0083]實(shí)施例11檢測(cè)線(T)和對(duì)照線(C)濃度的選擇
[0084](I)對(duì)照線
[0085]把羊抗鼠抗體分別稀釋成0.5、1、2、3、4、5mg/mL6個(gè)濃度梯度，每個(gè)條標(biāo)IyL稀釋好的抗體，滴入水后，發(fā)現(xiàn)1、2mg/mL出線較快，其中2mg/mL出線顏色較明顯(圖2)。對(duì)照線的濃度選擇2mg/mL。
[0086](2)檢測(cè)線
[0087]把CL-BSA分別稀釋成0.lmg/mL、0.25mg/mL、0.5mg/mL、lmg/mL、1.5mg/mL、2mg/mL共5個(gè)濃度，每個(gè)條左邊標(biāo)IyL稀釋好的抗體，右邊對(duì)照線都是標(biāo)羊抗鼠抗體2mg、IyL，滴入水后，0.lmg/mL，0.25mg/mL，0.5mg/mL出線顏色較淺，lmg/mL，I.5mg/mL，2mg/mL出線顏色較明顯，檢測(cè)線的濃度選擇lmg/mL。
[0088]實(shí)施例12CL-BSA和羊抗鼠二抗包被硝酸纖維素膜
[0089]CL-BSA稀釋成lmg/mL，羊抗鼠二抗稀釋成2mg/mL，用機(jī)器以lyL/cm劃膜，劃膜后37°C烘干，加入干燥劑，熱合封口，置4°C冰箱備用，獲得包被有檢測(cè)線和質(zhì)控線的硝酸纖維素膜。
[0090]實(shí)施例13免疫層析試紙條的組裝
[0091]按圖3所示，依次將樣品墊、膠體金墊、硝酸纖維素膜(其上包被有檢測(cè)線和質(zhì)控線)和吸水墊粘貼在PVC底板(支持物)上，用切刀切成3mm寬的條帶即可用于檢測(cè)。
[0092]實(shí)施例14試紙條的性能測(cè)定
[0093](I)靈敏性實(shí)驗(yàn)
[0094]將5011^/1111^的鹽酸克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)品用？133配制成500呢/1111^、501^/1111^、101^/1]11^、51^/1^、31^/1111^、21^/1]11^、11^/1111^、01^/1111^，分別吸取8(^1^滴入做好的金標(biāo)試紙條中，8min內(nèi)觀察結(jié)果，當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)品濃度彡3ng/mL，呈現(xiàn)明顯的陽(yáng)性結(jié)果(圖4)。
[0095](2)特異性實(shí)驗(yàn)
[0096]取8個(gè)組裝好的試紙條，分別加入100ng/mL、80yL的鹽酸多巴胺丁胺、重酒石酸去甲腎上腺素、鹽酸多巴胺、異丙腎上腺素、沙丁胺醇、萊克多巴胺、鹽酸克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)品，設(shè)生理鹽水為陰性對(duì)照(圖5)。結(jié)果顯示只有沙丁胺醇、萊克多巴胺、鹽酸克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)品三種不出線。再取7個(gè)組裝好的試紙條，分別加入100ng/mL、80yL的西馬特羅、氯丙那林、妥布特羅、噴布特羅、硫酸特布他林、鹽酸克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)品，設(shè)生理鹽水為陰性對(duì)照(圖6)。結(jié)果顯示只有對(duì)照出線。說明本試紙條可檢出瘦肉精下屬的沙丁胺醇、萊克多巴胺、鹽酸克倫特羅、西馬特羅、氯丙那林、妥布特羅、噴布特羅、硫酸特布他林8類標(biāo)準(zhǔn)品。將兩次特異性實(shí)驗(yàn)所用標(biāo)準(zhǔn)品再次滴加到本試紙條，重復(fù)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)結(jié)果與上述一致(圖7)。(1鹽酸多巴胺丁胺；2重酒石酸去甲腎上腺素；3鹽酸多巴胺;4異丙腎上腺素；5沙丁胺醇;6萊克多巴胺；7鹽酸克倫特羅;8陰性對(duì)照生理鹽水)
[0097]實(shí)施例15保存期實(shí)驗(yàn)
[0098]制備的試紙條封口后取3批，各取100條，與干燥劑一起置37°C培養(yǎng)箱中，每隔I周分別取出2條。保存5個(gè)月后試紙條滴入水和CL標(biāo)準(zhǔn)品5-10min后，C線和T線都很明顯(圖8)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種β-腎上腺素受體激動(dòng)劑的檢測(cè)試紙，其包括底板，所述底板具有第一端和第二端，并且沿所述第一端向第二端的方向，所述底板上依次組裝有樣品墊、膠體金墊、硝酸纖維素膜和吸水墊， 其中，所述膠體金墊上含有膠體金標(biāo)記的鹽酸克侖特羅單克隆抗體， 所述硝酸纖維素膜上進(jìn)一步形成有檢測(cè)線和對(duì)照線，所述檢測(cè)線由能與鹽酸克侖特羅單克隆抗體結(jié)合的CL-BSA劃膜制成，所述對(duì)照線由能與鹽酸克侖特羅單克隆抗體結(jié)合的羊抗鼠抗體劃膜制成。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)試紙，其中，所述膠體金標(biāo)記的鹽酸克侖特羅單克隆抗體通過以下方法制得: 取100單位體積的雙蒸水煮沸然后加入I單位體積的I %氯金酸溶液，繼續(xù)煮沸1-lOmin，然后加入3單位體積的1%的檸檬酸三鈉，攪拌至液體顏色由灰色變成黑色再變成紫色，再煮沸至液體顏色變?yōu)榫萍t色，再加雙蒸水至100單位體積，獲得膠體金溶液;優(yōu)選地，所述膠體金溶液在520nm和535nm處的吸光值為0.8-1.0； 調(diào)節(jié)膠體金溶液的PH至8.2;在膠體金溶液中加入鹽酸克侖特羅單克隆抗體至鹽酸克侖特羅單克隆抗體的濃度為4_8yg/mL(6yg/mL)，混勻后加入10%PEG20000至PEG20000的濃度為1%，獲得純化前的膠體金標(biāo)記的鹽酸克侖特羅單克隆抗體； 將膠體金標(biāo)記的鹽酸克侖特羅單克隆抗體以2000r/min，4°C離心20min，棄去沉淀； 將上一步所得上清以10000r/min，4°C離心30min，棄去上清； 用0.05moI/L的TBS(內(nèi)含I % BSA，0.05 % NaN3)緩沖液溶解沉淀至純化前的原體積，重復(fù)前兩步的離心2?3次，將沉淀溶于1/10TBS(內(nèi)含l%BSA，0.05%NaN3)中至純化前原體積，4°(:保存?zhèn)溆茫@得純化后的膠體金標(biāo)記的鹽酸克侖特羅單克隆抗體。3.根據(jù)權(quán)利要求1-2任一項(xiàng)所述的檢測(cè)試紙，其中，所述膠體金墊是經(jīng)過是BSA、SDS和Tween-20處理過的， 優(yōu)選地，所述膠體金墊通過如下方法制得: 配制膠體金墊處理液:用PH7.4的PBS加入I %的BSA、0.5%的SDS、I %的Tween-20混勻后過濾； 把玻璃纖維膜放置于膠體金處理液中浸泡30min，37°C烘干； 將膠體金標(biāo)記的鹽酸克侖特羅單克隆抗體以SyL/cm的噴量噴涂于經(jīng)處理液處理過的玻璃纖維素膜上，烘干；4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的檢測(cè)試紙，其中，所述樣品墊是經(jīng)過是BSA、SDS和Tween-20處理過的， 優(yōu)選地，所述樣品墊通過如下方法制得: 配制樣品墊處理液:用PH7.4的PBS加入I %的BSA、0.5%的SDS、I %的Tween-20混勻后過濾； 把樣品墊放置于膠體金處理液中浸泡30min ,37 °C烘干。5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的檢測(cè)試紙，其中，設(shè)置檢測(cè)線和對(duì)照線的硝酸纖維素膜是將CL-BSA稀釋為lmg/mL，羊抗鼠二抗稀釋為2mg/mL，并分別以IyL/cm的劑量在硝酸纖維素膜上進(jìn)行劃膜，劃膜后烘干。6.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的檢測(cè)試紙，其中，硝酸纖維素膜選自MiIliporeM-135，且玻璃纖維膜選自SB-08。7.權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述的檢測(cè)試紙的制備方法，其包括如下步驟: 1)制備膠體金標(biāo)記的鹽酸克侖特羅單克隆抗體: 1-1)取100單位體積的雙蒸水煮沸然后加入I單位體積的I %氯金酸溶液，繼續(xù)煮沸1-lOmin，然后加入3單位體積的1%的檸檬酸三鈉，攪拌至液體顏色由灰色變成黑色再變成紫色，再煮沸至液體顏色變?yōu)榫萍t色，再加雙蒸水至100單位體積，獲得膠體金溶液;優(yōu)選地，所述膠體金溶液在520nm和535nm處的吸光值為0.8-1.0； 1-2)調(diào)節(jié)膠體金溶液的pH至8.2; 在膠體金溶液中加入鹽酸克侖特羅單克隆抗體至鹽酸克侖特羅單克隆抗體的濃度為4-8yg/mL(6yg/mL)，混勻后加入10%PEG20000至PEG20000的濃度為1%，獲得純化前的膠體金標(biāo)記的鹽酸克侖特羅單克隆抗體； 1-3)將膠體金標(biāo)記的鹽酸克侖特羅單克隆抗體以20001'/111；[11，4<€離心20111；[11，棄去沉淀； 1-4)將上一步所得上清以10000r/min，4°C離心30min，棄去上清； 1-5)用0.05mo 1/L的TBS(內(nèi)含I % BSA，0.05 %NaN3)緩沖液溶解沉淀至純化前的原體積，重復(fù)前兩步的離心2?3次，將沉淀溶于I/1OTBS(內(nèi)含I % BSA，0.05 %NaN3)中至純化前原體積，4°C保存?zhèn)溆?，獲得純化后的膠體金標(biāo)記的鹽酸克侖特羅單克隆抗體； 2)制備膠體金墊: 2-1)配制膠體金墊處理液:用pH7.4的PBS加入I %的BSA、0.5%的SDS、I %的Tween-20混勻后過濾； 2-2)把玻璃纖維膜放置于膠體金處理液中浸泡30min，37 °C烘干； 2-3)將膠體金標(biāo)記的鹽酸克侖特羅單克隆抗體以5yL/cm的噴量噴涂于經(jīng)處理液處理過的玻璃纖維素膜上，烘干； 3)制備樣品塾: 3-1)配制樣品墊處理液:用pH7.4的PBS加入I %的BSA、0.5%的SDS、I %的Tween-20混勻后過濾； 3-2)把樣品墊放置于膠體金處理液中浸泡30min，37°C烘干； 4)制備設(shè)置檢測(cè)線和對(duì)照線的硝酸纖維素膜: 4-1)將CL-BSA稀釋為lmg/mL，羊抗鼠二抗稀釋為2mg/mL，并分別以lyL/cm的劑量在硝酸纖維素膜上劃膜，劃膜后烘干； 5)組裝:依次將樣品墊、膠體金墊、硝酸纖維膜和吸水墊粘貼在底板上即得。8.權(quán)利要求1-7所述的檢測(cè)試紙?jiān)跈z測(cè)沙丁胺醇、萊克多巴胺、鹽酸克倫特羅、西馬特羅、氯丙那林、妥布特羅、噴布特羅、硫酸特布他林及其類似物的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】G01N33/577GK105929167SQ201610281189
【公開日】2016年9月7日
【申請(qǐng)日】2016年4月29日
【發(fā)明人】李俊, 黃保華, 時(shí)建立, 彭喆, 朱曉琳, 王金寶, 徐紹建, 吳曉燕, 張玲玲, 鄭書軒, 王莉莉
【申請(qǐng)人】山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所