一種基于唾液蛋白鑒別乳腺癌的凝集素芯片和試劑盒及其應(yīng)用
【專利摘要】一種基于唾液蛋白鑒別乳腺癌的凝集素芯片和試劑盒及其應(yīng)用，涉及一種用于甄別癌癥的凝集素芯片，具體涉及一種基于蛋白鑒別乳腺癌的凝集素芯片和試劑盒及其應(yīng)用。目的在于提供一種非損傷，通過唾液中糖鏈變化來鑒別乳腺癌的凝集素芯片和試劑盒及其應(yīng)用。該基于唾液蛋白鑒別乳腺癌的凝集素芯片，包括測試凝集素探針組，所述測試凝集素探針組至少包括PHA?E+L、LTL、BS?I、MAL?I、LCA、BPL、PTL?II、NPA、GSL?I的組合或者至少包括LTL、BS?I、MAL?I、LCA、BPL、NPA、GSL?I的組合。該凝集素芯片可以快速檢測出患者唾液樣品中差異性表達的糖蛋白糖鏈結(jié)構(gòu)，確定對應(yīng)的人群是否患有乳腺腫瘤，并確定是否為乳腺癌；此外，本發(fā)明中采用唾液作為待檢測物，其采集簡便易行，避免了現(xiàn)有通過血清采集樣本進行檢測存在的健康風(fēng)險。
【專利說明】
一種基于唾液蛋白鑒別乳腺癌的凝集素芯片和試劑盒及其 應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一種用于甄別癌癥的凝集素芯片，具體涉及一種基于蛋白鑒別乳腺癌 的凝集素芯片及其試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 乳腺癌是全球范圍內(nèi)最常見的一類惡性腫瘤，嚴(yán)重危害女性身心健康。近年來，我 國乳腺癌發(fā)病呈現(xiàn)明顯上升趨勢，IARC預(yù)計，我國女性乳腺癌患者于2030年可達234，000 例，且死亡率較2008年將增長47.94%，由于發(fā)病率的不斷攀升、發(fā)病年齡的年輕化以及發(fā)病 形式的多樣化，乳腺癌篩查、診斷和治療方面的進展一直備受關(guān)注。在歐美乳腺癌高發(fā)地 區(qū)，其死亡率的降低一定程度上得益于基于影像學(xué)檢測手段的女性高危人群普查，更多的 乳腺癌患者在發(fā)病早期被發(fā)現(xiàn)并得到及時有效的治療，但鉬靶乳腺X線攝影并非最為精準(zhǔn) 和經(jīng)濟的早期篩查方法，仍有約11%的患者無法被檢出，特別是乳腺密度較高的女性患者； 另一方面，我國人口基數(shù)龐大、地區(qū)差異明顯，采用更為無創(chuàng)、簡便、經(jīng)濟的方法進行早期篩 查和診斷將是我國乳腺癌防控的重點。
[0003] 隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，人們不僅可通過組織活檢對腫瘤進行診斷，還實現(xiàn)了 依據(jù)血清、尿液等體液中的生物指標(biāo)對疾病進行檢測、監(jiān)測和評估，使人們意識到采用更為 簡便的方法檢測疾病的可能性。唾液作為一種來源于口腔唾液腺體的外分泌液，包含多種 電解質(zhì)和蛋白成分，當(dāng)機體狀況出現(xiàn)變化時，唾液的流率和內(nèi)容成分的種類和濃度也會發(fā) 生改變。已有研究發(fā)現(xiàn)，同健康女性唾液相比，乳腺癌患者唾液中可檢測到不同濃度的 HER2，VEGF和EGF蛋白等具有乳腺癌診斷潛能的血清標(biāo)志物。同時，作為一種易采集、安全無 創(chuàng)的臨床樣本，唾液中疾病特異性的標(biāo)志物在頭頸癌、口腔癌、齲病、糖尿病、自身免疫性疾 病等領(lǐng)域也得到了廣泛關(guān)注和應(yīng)用。
[0004] 糖生物學(xué)在癌癥相關(guān)研究中備受關(guān)注。細(xì)胞中，糖以單糖或寡聚糖的形式存在，寡 糖鏈既是糖復(fù)合物(糖蛋白、糖脂等）的重要組成部分，同時也發(fā)揮著重要的生物學(xué)功能。作 為一種翻譯后修飾，蛋白質(zhì)糖基化最為人們所了解，研究表明，70%的人類蛋白質(zhì)含有一個 或多個糖鏈，這些糖鏈由甘露糖、半乳糖及#_乙酰葡糖胺等十幾種單糖組成，經(jīng)不同糖基轉(zhuǎn) 移酶、糖苷酶及磺基轉(zhuǎn)移酶的催化以不同的連接方式可構(gòu)成龐大的糖鏈譜。相較于蛋白質(zhì) 和脂質(zhì)部分，糖鏈的改變往往是對機體狀態(tài)變化更靈敏的應(yīng)答，因此研究糖復(fù)合物糖基化 將有望提高標(biāo)志物的特異性與靈敏度，為癌癥早期發(fā)現(xiàn)、診斷、預(yù)后及耐藥性監(jiān)測提供新的 方法，而肝細(xì)胞癌中巖藻糖基化的甲胎蛋白（Alpha-fetoprotein, AFP)的臨床應(yīng)用是最成 功的案例。
[0005] 近十年間，大量文獻報道:未成熟的MUC型化糖鏈、Lewis糖抗原在乳腺癌癌細(xì)胞表 面被發(fā)現(xiàn)；乳腺癌患者血清中蛋白質(zhì)糖基化修飾存在差異，具體表現(xiàn)為增多的MUC型f糖 鏈、含多聚，乙酰乳糖胺(poly-LacNAc)結(jié)構(gòu)的糖鏈、分支型，糖鏈，減少的m-4GlcNAc等 分型和擁有LacdiNAc末端結(jié)構(gòu)的復(fù)雜型糖鏈，以及糖鏈巖藻糖基化、唾液酸化修飾增加 等;且這些糖基化的改變與某些臨床病理學(xué)參數(shù)(如腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等)存在相關(guān)性。 但以上研究均以組織或血清作為樣本，人們對唾液中蛋白質(zhì)糖基化水平的變化知之甚少， 且尚未被應(yīng)用于乳腺癌女性患者的早期篩查。凝集素是一類糖結(jié)合蛋白，其可識別不同的 糖鏈結(jié)構(gòu)并以多價形式與這些糖鏈特異性結(jié)合。通過將凝集素探針固定于經(jīng)環(huán)氧化修飾的 固體片基上制成凝集素芯片，憑借生物芯片便捷、快速和高通量的優(yōu)勢，人們便可獲得臨床 樣本中糖復(fù)合物糖基化相關(guān)信息，發(fā)現(xiàn)與疾病特異性相關(guān)的差異性表達的糖鏈。基于凝集 素芯片技術(shù)對健康女性、乳腺疾病包括乳腺癌患者唾液中蛋白質(zhì)糖基化進行分析，將有助 于構(gòu)建新的乳腺癌篩查、診斷方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種非損傷，通過唾液中糖鏈變化來鑒別乳腺癌的凝集素 芯片和試劑盒及其應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明提供一種基于唾液蛋白鑒別乳腺癌的凝集素芯片，包括測試凝集素探針 組，所述測試凝集素探針組至少包括 PHA-E+L、LTL、BS-I、MAL-I、LCA、BPL、PTL-II、NPA、GSL-I的組合或者至少包括111、83-1、獻1-1、"^、8?1、即4、631-1的組合。
[0008] 本發(fā)明還提供利用上述凝集素探針制備得到的試劑盒。
[0009] 進一步地，本發(fā)明還提供利用上述凝集素探針制備得到的試劑盒的應(yīng)用方法，選 定對照組，將待檢測樣本的凝集素芯片結(jié)果同對照組的凝集素芯片結(jié)果進行對比，得到每 種凝集素的Fold-change值，以Fold-change〉1 ? 5和 Fo ld_change〈0 ? 67作為選擇標(biāo)準(zhǔn)，F(xiàn)old-change〉1.5為上調(diào)糖鏈，F(xiàn)o ld_change〈0.67為下調(diào)糖鏈，篩選出表達上調(diào)和下調(diào)的糖鏈組 合。
[0010] 選定的對照組為采集健康人群或良性乳腺腫瘤患者的唾液，并對其處理和熒光標(biāo) 記后得到的凝集素芯片結(jié)果。
[0011] 當(dāng)以健康人群樣本為對照組，待測樣本的凝集素芯片與對照組對比，當(dāng)PHA-E+L上 調(diào)，LTL、NPA下調(diào)，同時83-1、1^1-1、^^、8?1、？孔-11、631-1無變化，則為良性乳腺腫瘤樣 本； 當(dāng)？骱4+1、85-1、1^^上調(diào)兒11、]\^1-1、8?1、？11-11、即4下調(diào)，同時651-1無變化，則為 乳腺癌I期樣本； 當(dāng)PHA-E+L、BS-I上調(diào)，LTL、MAL-I下調(diào)，同時1^^、8?1、卩!1-11、陬厶、651-1都無變化，則 為乳腺癌II期樣本。
[0012] 以良性乳腺纖維瘤樣本為對照組，將待測樣本的凝集素芯片與對照組對比，當(dāng) LTL、GSL-I無變化，BS-I、LCA上調(diào)，同時MAL-I、BPL、NPA下調(diào)，則為乳腺癌I期樣本； 當(dāng)LTL、MAL-I下調(diào)，同時83-1、^^、8?1、即4、631-1都無變化，則為乳腺癌11期樣本。
[0013] 上述方法中凝集素芯片的制備為現(xiàn)有常規(guī)方法，其步驟包括唾液采集，唾液蛋白 處理和熒光標(biāo)記，凝集素芯片及其數(shù)據(jù)分析，凝集素印記及其數(shù)據(jù)分析和唾液芯片及其數(shù) 據(jù)分析。
[0014] 本發(fā)明還提供上述凝集素探針在鑒別女性乳腺癌上的應(yīng)用。
[0015] 進一步地，本發(fā)明還提供上述試劑盒在鑒別女性乳腺癌上的應(yīng)用。
[0016] 本發(fā)明具有如下有益效果： 本發(fā)明將特定的凝集素探針固定于固體片基上，通過凝集素與女性唾液中糖蛋白糖鏈 特異性結(jié)合，可以快速檢測出患者唾液樣品中差異性表達的糖蛋白糖鏈結(jié)構(gòu)，確定對應(yīng)的 人群是否患有乳腺腫瘤，并確定是否為乳腺癌;此外，本發(fā)明中采用唾液作為待檢測物，其 采集簡便易行，避免了現(xiàn)有通過血清采集樣本進行檢測存在的健康風(fēng)險。
【附圖說明】
[0017] 圖1為凝集素芯片點樣陣列圖及應(yīng)用于糖蛋白糖鏈的熒光檢測圖，圖中A為凝集素 芯片點樣陣列圖，包括健康女性(HC)、良性乳腺腫瘤女性患者(B)、乳腺癌I期女性患者(BC-I)及乳腺癌II期女性患者(BC-II)混合唾液糖蛋白糖鏈熒光檢測結(jié)果圖； 圖2和圖3為HC、B、BC-I、BC-II混合唾液糖蛋白糖鏈熒光信號歸一化數(shù)據(jù)圖； 圖4為驗證結(jié)果圖，圖中A為凝集素 MAL-I的lectin blotting圖，B左側(cè)為唾液芯片矩 陣設(shè)計圖，中間為凝集素 LCA與唾液芯片結(jié)合的熒光檢測結(jié)果圖，右側(cè)為對應(yīng)HC、B、BC-I、 BC-II唾液結(jié)合強度比較。
【具體實施方式】
[0018] 下面通過給出的具體實施例對本發(fā)明做進一步說明，但不作為對本發(fā)明的限定。
[0019] 本發(fā)明從37種凝集素（如表1所示）中篩選用于甄別乳腺癌女性患者的凝集素探 針。
[0020] 表 1

本發(fā)明中使用的試劑材料包括：蛋白酶抑制劑，DMSO，Cy3、Cy5熒光染料，Sephadexg G-25柱，牛血清白蛋白（BSA)，玻璃片基，氧基硅烷試劑（GPTS)，Bradford試劑，PVDF膜， Tween-20,以及國產(chǎn)分析純常用試劑。
[0021 ] 采用的設(shè)備包括:超速冷凍離心機5804R:德國Eppendorf公司；微量核酸蛋白測定 儀：德國Implen公司；芯片點樣儀：博奧晶芯SmartArrayer48點樣儀；生物芯片掃描儀 4000B:美國Axon公司；芯片雜交箱HL-2000:美國UVP公司。Immobi lon-P半干轉(zhuǎn)膜儀:美國GE 公司。
[0022] 1.研究人群和全唾液采集 選取118名唾液提供者均為無其它疾病的中年女性，且一周之內(nèi)沒有服用任何藥物，其 中包括確診的乳腺癌I期患者30例，乳腺癌II期患者30例，良性乳腺纖維瘤患者28例，健康 志愿者30例，如表2所示，由于唾液糖蛋白糖鏈與提供者年齡具有相關(guān)性，因此四組唾液提 供者年齡均相互匹配，全唾液采集在志愿者進食3小時后進行，經(jīng)生理鹽水漱口后采集唾液 至少1 mL并立即置于冰上，加入蛋白酶抑制劑(每毫升唾液加入liiL)防止蛋白質(zhì)降解。
[0023]表 2
2.唾液蛋白處理和熒光標(biāo)記 收集到的全唾液經(jīng)12 000 rpm 4°C離心10 min后收集上清液，再經(jīng)0.22mi孔徑的濾膜 過濾掉上清唾液中的細(xì)菌和其他微生物。為了減小個體差異并歸一化個體樣本，唾液樣本 按照表2分組各取100此混合。取定量后混合樣本（內(nèi)含蛋白質(zhì)100yg)用Cy3熒光染料標(biāo)記 后用Sephadex G-25除鹽柱純化，收集到的熒光標(biāo)記后的唾液蛋白用于凝集素芯片孵育。未 標(biāo)記的個例樣本從中抽樣各15例用于唾液芯片的點制。
[0024] 3.凝集素芯片及其數(shù)據(jù)分析 凝集素芯片的制備，Cy3熒光標(biāo)記的樣本蛋白與凝集素芯片的孵育步驟及凝集素芯片 數(shù)據(jù)獲取與歸一化分析與專利申請?zhí)枮?01110021447.3發(fā)明專利描述的凝集素芯片和數(shù) 據(jù)分析過程一致。
[0025] 4.凝集素印記及其數(shù)據(jù)分析 采用Bradford法測量四組唾液混合樣本中蛋白質(zhì)濃度，并取含6yg蛋白的樣本同5 X加 樣緩沖液混合，沸水加熱5min使其完全變性。配制3%的濃縮膠及10%聚丙烯酰胺分離膠進行 蛋白質(zhì)電泳。完成電泳后的凝膠采用銀染方法進行染色，一方面檢測四組唾液中蛋白水平 變化情況，另一方面檢測蛋白質(zhì)濃度檢測是否準(zhǔn)確，保證一致的上樣量。另取30yg蛋白質(zhì)進 行SDS-PAGE電泳，后采用半干轉(zhuǎn)儀將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，經(jīng)過Carbo-free試劑封閉PVDF膜 lh后，加入Cy5熒光標(biāo)記的凝集素至終濃度2 yg/mL，4 °C避光震蕩過夜。孵育結(jié)束后用TTBS 清洗膜兩次，每次10 min，然后在Storm 840凝膠成像系統(tǒng)中設(shè)置PMT為800,紅色熒光通道 (635nm激發(fā)波長/650LP發(fā)射波長）下掃描圖像，圖像利用ImageJ軟件測量凝集素-蛋白條 帶灰度值。
[0026] 5.唾液芯片及其數(shù)據(jù)分析 唾液芯片的設(shè)計參見圖3B，唾液芯片由個例唾液樣本點制而成，樣本根據(jù)HC、B、BC-I和 BC-II分成四組，各15例，個例唾液蛋白溶于點樣緩沖液(0.5 mg/mL BSA溶于lxroS，pH 7.4)中至終濃度1 mg/mL，并用芯片點樣儀點制于環(huán)氧化修飾的玻片上。唾液芯片的布局圖 顯示在圖3中B部分，每個樣本區(qū)內(nèi)重復(fù)三次，每張片基兩個重復(fù)區(qū)，點好的片基在50%濕度 中孵育過夜，然后37 °C真空干燥3 h固定，固定好的芯片可4 °C避光密封保存?zhèn)溆?。進行驗 證實驗時，芯片首先在封閉緩沖液中常溫封閉lh，后經(jīng)1 X PBST和1 X PBS洗液各清洗兩次， 每次5min，離心甩干，Cy3標(biāo)記的凝集素用以檢測這些唾液樣本中凝集素特異識別的糖鏈結(jié) 構(gòu)表達水平，甩干后的唾液芯片同配好的含Cy3標(biāo)記凝集素的孵育緩沖液在芯片雜交箱內(nèi)4 rpm孵育3h，1 X PBST和1 X roS各清洗兩次，每次10min，離心甩干，通過芯片掃描儀設(shè)置光電 倍增管70%和激光強度100%，在532 nm波長處掃描芯片圖像，圖像經(jīng)Genepix 3.0軟件分析 獲取原始數(shù)據(jù)，原始數(shù)據(jù)中小于兩倍背景標(biāo)準(zhǔn)偏差的值去掉，每張芯片上每個樣本六個重 復(fù)點的有效值再取平均值(AS)，每組平均值表示為組內(nèi)每個樣本平均值(AS)的均值(AG)± 標(biāo)準(zhǔn)偏差（SDG)，任意兩組間借助SPSS statistics 19軟件進行單因素方差分析(one-way AN0VA)或秩和檢驗尋找顯著差異，參見圖3中B部分。
[0027] 6.結(jié)果分析 (1)早期乳腺女性患者、良性乳腺纖維瘤患者同健康女性唾液糖蛋白糖基化的比較 利用凝集素芯片分別對健康女性、纖維瘤女性患者及早期（I期、II期)乳腺癌女性患 者唾液樣本進行檢測，通過專業(yè)軟件獲取芯片數(shù)據(jù)并歸一化處理后，首先將三組患乳腺疾 病患者的芯片結(jié)果與健康組結(jié)果進行比較，即每個凝集素對應(yīng)的歸一化后NFI在B組和BC組 分別比HC得到Fold-change值，我們將Fold-change > 1.5和Fold-change〈 0.67作為乳腺 疾病患者相較于健康女性在唾液中上調(diào)和下調(diào)表達的糖鏈。
[0028]結(jié)果發(fā)現(xiàn)，有2種凝集素識別的糖鏈在HC中同B，BC-I，BC-II女性患者唾液相比差 異性表達（見表3和圖1B、圖2和圖3)，其中PHA-E+L識別的Bisecting GlcNAc，bi_antennary A^glycansAri-和tetra-antennary complex-type A^glycan在HC組唾液中表達量低于 患有乳腺疾病的女性唾液中的表達量，相反，LTL識別的Fucal-2Gaim_4GlcNAc，F(xiàn)ucal-3 (Gal01_4) GlcNAc和anti-H blood group specificity糖鏈結(jié)構(gòu)在三個患病組唾液中均 表達減少。
[0029] 凝集素 BS-I識別的a-Gal，a-GalNAc，Gala-l，3Gal糖鏈在早期乳腺癌患者唾液中 比健康女性唾液中高表達，但良性乳腺疾病患者唾液則與健康女性唾液無明顯差異，相反 的是，MAL-I 識別的 6&10-1，461〇嫩(：，513<12-3631，63101-361〇嫩(3和513<12-3在早期癌癥患 者唾液中表達量遠低于患良性乳腺疾病和健康女性，而后兩組間無顯著性差異。
[0030] LCA識別的〇-0-]\^11^1^€[-1，6610嫩(3和€[-0-61(3結(jié)構(gòu)在只在隊-1組唾液中與正常 組唾液相較高表達，其余兩個患病組均與健康組無明顯差別。而BPL識別的Gaim_3GalNAc 和Terminal GalNAc，以及PTL-II識別的Gal，blood group H和T-antigen只在BC-I組唾液 中低表達，其余兩個患病組則與健康組無顯著差異。此外NPA識別的High-Mannose，Manal-6Man結(jié)構(gòu)在B組和BC-I組唾液中較HC組低表達，但在BC-II組唾液中與HC組無差異。
[0031] (2)早期乳腺女性患者同良性乳腺纖維瘤女性患者唾液糖蛋白糖基化的比較 將兩組早期乳腺癌患者混合唾液的芯片結(jié)果與良性乳腺疾病組結(jié)果進行比較，即每個 凝集素對應(yīng)的歸一化后NFI在BC-I組和BC-II組分別比B組得到Fold-change值，我們將 Fold-change > 1.5和Fold-change〈 0.67作為早期乳腺癌女性患者相較于良性乳腺疾病 女性患者在唾液中上調(diào)和下調(diào)表達的糖鏈。
[0032]結(jié)果發(fā)現(xiàn)，有5種凝集素識別的糖鏈在BC-I組中同B組女性患者唾液相比差異性表 達(見表3和圖1B、圖2和圖3)，與B組唾液相比，其中BS-I識別的a-Gal，a-GalNAc，Gala-l， 3Gal糖鏈和LCA識別的〇-0-]\&111^1^€[-1，6610嫩(3和€[-0-61(3結(jié)構(gòu)在隊-1組唾液中有小幅度 的表達上調(diào)。同時 MAL-I 識別的 6&10-1，4610嫩(：，513<12-3631，63101-3610嫩(3和513<12-3和 BPL識別的Gaim_3GalNAc和Terminal GalNAc糖鏈在BC-I組唾液中表達量顯著降低，而NPA 識別的糖鏈有小幅度的表達下調(diào)。
[0033]另有2種凝集素識別的糖鏈在BC-II組中與B組患者唾液中表達量顯著性降低，分 別是 MAL-I 識別的 6&10-1，461〇嫩(：，513<12-3631，63101-361〇嫩(3和513<12-3糖鏈結(jié)構(gòu)和1孔 識別的Fucal-2Gal01-4GlcNAc，F(xiàn)ucal-3(Gal01_4) GlcNAc和 anti-H blood group specificity 糖鏈。
[0034] 此外，經(jīng)過Fo 1 d change值比較和統(tǒng)計學(xué)檢驗，GSL-1識別的糖鏈在任意兩組唾液 樣本間表達無差異，且在所有凝集素芯片中熒光信號歸一化值穩(wěn)定在0.2-0.3之間，屬于較 高信號水平，因此可用GSL-I作為本發(fā)明中的內(nèi)參凝集素。
[0035]表3四組混合唾液糖蛋白糖型的表達比較
aSignal intensities obtained for 9 repeated blocks in three repeated slides were normalized and averaged, and the ratios of HC vs B, BC~I, BC-II (B/BC-I, B/BC-II and BC-I/BC-II) were calculated. HC: healthy control; B: patients with benign breast diseases; BC-I: patients with I stage breast cancer; BC-II: patients with II stage breast cancer. V, negative signal; -, no significant difference; ^<0.05 ;材/XO.Ol; ^KO.OOl. 7.凝集素芯片結(jié)果驗證 為進一步驗證凝集素芯片的結(jié)果，選擇特異性的凝集素分別進行凝集素印跡和唾液芯 片實驗，以凝集素 MAL-I為例，將Cy5焚光標(biāo)記的MAL-I同轉(zhuǎn)膜后的四組唾液蛋白孵育，經(jīng)掃 描儀掃描并測量其熒光條帶灰度(見圖4中B部分），另以LCA為例，將Cy3熒光標(biāo)記的凝集素 LCA與點制好的血清芯片孵育，經(jīng)掃描儀掃描(見圖4中B部分)和Genepix 3.0軟件分析芯片 數(shù)據(jù)，結(jié)果顯示，MAL-I與HC組和B組唾液中分子量在15-25KDa的蛋白結(jié)合信號高于其與 BC-I組和BC-II組唾液中對應(yīng)分子量的蛋白質(zhì)的結(jié)合信號，總灰度值測量結(jié)果同樣表明HC 組和B組印跡總灰度值高于早期乳腺癌患者組，與凝集素芯片結(jié)果一致，LCA的唾液芯片結(jié) 果表明，該凝集素同與15例BC-I患者唾液糖鏈的結(jié)合顯著性高于其與15例HC女性唾液及15 例B組唾液樣本中糖鏈的結(jié)合強度(見圖4中B部分），經(jīng)單因素方差分析發(fā)現(xiàn)P值小于0.05， 其余凝集素探針驗證參照此方法，結(jié)果均顯示與凝集素芯片結(jié)果相符，證明這些凝集素可 以作為探針通過對唾液中的糖蛋白糖鏈的檢測從健康女性中篩選出患有良性乳腺腫瘤和 早期乳腺癌的女性。
[0036] 8.凝集素探針組的確定 通過上述結(jié)果分析，若以健康女性唾液作為對照標(biāo)準(zhǔn)，用于篩選早期乳腺疾病患者唾 液的凝集素探針表達結(jié)果參見表4。
[0037]表4用于從健康女性中篩選良性、早期惡性乳腺腫瘤患者的凝集素探針
若以良性乳腺腫瘤女性患者唾液作為對照標(biāo)準(zhǔn)，用于篩選乳腺腫瘤患者唾液(特別是 乳腺癌病理分期I的患者唾液)的凝集素探針表達結(jié)果參見表5。
[0038]表5用于從良性乳腺纖維瘤女性患者中篩選早期乳腺患者的凝集素探針
以上內(nèi)容是結(jié)合具體的實施方式對本發(fā)明所做的進一步詳細(xì)說明，不能認(rèn)定本發(fā)明的 具體實施只局限于這些說明。對于本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本 發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干簡單推演或替換，都應(yīng)當(dāng)視為屬于本發(fā)明的保護范圍。
【主權(quán)項】
1. 一種基于唾液蛋白鑒別乳腺癌的凝集素芯片，包括測試凝集素探針組，其特征在于： 所述測試凝集素探針組至少包括 PHA-E+L、LTL、BS-I、MAL-I、LCA、BPL、PTL-II、NPA、GSL-U9 組合或者至少包括LTUBS-I、獻1^-1、1^^、8?1^、即4、631^-1的組合。2. -種利用權(quán)利要求1所述凝集素探針制備得到的試劑盒。3. -種根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒的應(yīng)用方法，其特征在于:選定對照組，將待檢測 樣本的凝集素芯片結(jié)果同對照組的凝集素芯片結(jié)果進行對比，得到每種凝集素的Fold-change值，以Fold_change>l · 5和Fold_change〈0 · 67作為選擇標(biāo)準(zhǔn)，F(xiàn)old_change>l · 5為上 調(diào)糖鏈，F(xiàn)old-Change〈0.67為下調(diào)糖鏈，篩選出表達上調(diào)和下調(diào)的糖鏈組合。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒的應(yīng)用方法，其特征在于:選定的對照組為采集健康人 群或良性乳腺腫瘤患者的唾液，并對其處理和熒光標(biāo)記得到的凝集素芯片結(jié)果。5. -種權(quán)利要求1所述凝集素探針在鑒別女性乳腺癌上的應(yīng)用。6. -種權(quán)利要求2所述試劑盒在鑒別女性乳腺癌上的應(yīng)用。
【文檔編號】G01N33/68GK105929162SQ201610315822
【公開日】2016年9月7日
【申請日】2016年5月13日
【發(fā)明人】李錚, 劉夏薇, 于漢杰, 鐘耀剛, 舒健, 陽佳君
【申請人】西北大學(xué)