前列腺特異性抗原同源異構(gòu)體化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)試劑盒及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種前列腺特異性抗原同源異構(gòu)體化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)試劑盒及其制備方法，前列腺特異性抗原同源異構(gòu)體化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)試劑盒包括：前列腺特異性抗原同源異構(gòu)體單克隆抗體包被的羧基化的磁微粒和抑制素單克隆抗體標(biāo)記的化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物。這種前列腺特異性抗原同源異構(gòu)體化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)試劑盒能夠以全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀為檢測(cè)工具，完成前列腺特異性抗原同源異構(gòu)體的檢測(cè)這種前列腺特異性抗原同源異構(gòu)體化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)試劑盒，經(jīng)過實(shí)驗(yàn)，其檢測(cè)靈敏度達(dá)到1pg/mL，相對(duì)于傳統(tǒng)的前列腺特異性抗原同源異構(gòu)體的檢測(cè)方法靈敏度至少提高了10倍，這種前列腺特異性抗原同源異構(gòu)體化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)精度較高。
【專利說明】
前列腺特異性抗原同源異構(gòu)體化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)試劑盒及其 制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及體外檢測(cè)領(lǐng)域，尤其涉及一種前列腺特異性抗原同源異構(gòu)體化學(xué)發(fā)光 免疫檢測(cè)試劑盒及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 前列腺癌已經(jīng)成為西方世界發(fā)病率最高的腫瘤之一，據(jù)估計(jì)，每年全球新患病的 前列腺癌患者有約914,000人，因?yàn)榍傲邢侔┒劳龅幕颊呒s為258,000人，近些年中國(guó)的 前列腺癌發(fā)病例在逐年攀升。早期發(fā)現(xiàn)前列腺癌對(duì)前列腺癌的治療十分重要，目前，前列腺 癌診斷的金標(biāo)準(zhǔn)仍舊是前列腺穿刺活檢。
[0003] 上世紀(jì)80年代末，人類發(fā)現(xiàn)了前列腺特異性抗原(Prostate-specific Antigen， PSA)是前列腺癌預(yù)測(cè)的重要標(biāo)志物。然而，在多年的運(yùn)用中，PSA的局限性也日益凸顯，特異 度較低的缺陷導(dǎo)致了臨床上過度穿刺、過度治療的發(fā)生，為病人造成了心理負(fù)擔(dān)，為社會(huì)造 成經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。因此，人們致力于尋找新的特異性腫瘤標(biāo)志物用于預(yù)測(cè)前列腺癌。近年來，隨 著分子生物學(xué)的飛速發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)了多種前列腺癌的腫瘤特異性標(biāo)志物，部分已應(yīng)用于 臨床，同時(shí)隨著人類基因組學(xué)的發(fā)展，人們相繼發(fā)現(xiàn)了前列腺癌風(fēng)險(xiǎn)基因，并期待將基因檢 測(cè)作為初步篩查前列腺癌高危人群的工具。
[0004]最近，一種被稱為前列腺特異性抗原同源異構(gòu)體(P2PSA)的PSA前體被發(fā)現(xiàn)，研究 證實(shí)P2PSA及其衍生指標(biāo)與前列腺癌在歐洲人群中有著顯著的關(guān)聯(lián)，對(duì)于臨床上預(yù)測(cè)前列 腺癌具有重要意義。
[0005] 目前臨床檢測(cè)p2PSA的常見方法有酶聯(lián)免疫吸附法、放射免疫分析法、酶促化學(xué)發(fā) 光法，但這些方法都存在著一些不足之處。
[0006] 一、酶聯(lián)免疫吸附法
[0007] 酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)被廣泛應(yīng)用，但該方法也存在著下述的不足之處：
[0008] (1)使用12 X 8型、6 X 8型、8 X 12型或整板型96孔專用微孔板作為抗原包被用具和 反應(yīng)容器，在使用時(shí)只能分成12批次、6批次、8批次或整板一次使用，無法進(jìn)行獨(dú)立的、單人 份的檢測(cè)；
[0009] (2)定量測(cè)定所用的試劑種類較多，每一種檢測(cè)試劑都要用試劑瓶來盛裝，并且每 使用一種試劑時(shí)都需要更換吸液嘴來分別加注到微孔板的微孔中，不但試劑瓶種類多，加 注試劑的操作也極為繁瑣；
[0010] (3)缺少對(duì)檢測(cè)信息的相應(yīng)標(biāo)注，只能通過查看試劑盒外包裝盒的標(biāo)識(shí)才能了解 或知悉檢測(cè)試劑的生產(chǎn)批號(hào)及有效期信息，而且所知悉的信息在檢測(cè)過程中不受控，具有 很大的隨意性；
[0011] (4)檢測(cè)試劑在檢測(cè)過程中處于開放的空間，容易引起各種試劑之間的交叉污染 而影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性；
[0012] (5)檢測(cè)過程多采用手工操作，試劑或樣本的加量不很精確，操作過程極為繁瑣和 復(fù)雜，容易發(fā)生操作差錯(cuò)，檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確度和精密度較差；
[0013] (6)在檢測(cè)項(xiàng)目成套試劑的數(shù)量配置及使用上均為項(xiàng)目數(shù)X48/96人份，如果需要 檢測(cè)10個(gè)項(xiàng)目，則試劑的配置及使用數(shù)須為10X48/96人份，如果只有一份樣本需要檢測(cè)10 個(gè)不同的項(xiàng)目，也需要配置10 X 48/96人份的試劑，存在著不夠經(jīng)濟(jì)合理的缺點(diǎn)。
[0014] 二、放射免疫分析法
[0015] 放射免疫分析方法放射性污染大、加樣步驟繁瑣、操作復(fù)雜、操作時(shí)間長(zhǎng)、測(cè)定結(jié) 果不穩(wěn)定、試劑保存時(shí)間短、試劑盒操作自動(dòng)化程度低、配套儀器價(jià)格昂貴等不足之處。
[0016] 二、化學(xué)發(fā)光法
[0017] 化學(xué)發(fā)光法按發(fā)光原理可分為直接化學(xué)發(fā)光和酶促化學(xué)發(fā)光。
[0018] 酶促化學(xué)發(fā)光主要有辣根過氧化物酶(HRP)和堿性磷酸酶兩種，但都有一定的局 限性，辣根過氧化物酶主要缺點(diǎn)為:魯米諾在沒有辣根過氧化物酶存在情況下，也會(huì)被H202 氧化自身發(fā)光，本底相對(duì)較高，影響信噪比，反應(yīng)動(dòng)力學(xué)復(fù)雜，影響因素多，結(jié)果不夠穩(wěn)定， 要得到靈敏度高且平臺(tái)期長(zhǎng)的底物不容易。堿性磷酸酶主要缺點(diǎn)為:底物達(dá)到平臺(tái)期的時(shí) 間長(zhǎng)，底物成本高，導(dǎo)致檢測(cè)成本高，患者負(fù)擔(dān)重。
[0019] 吖啶酯作為標(biāo)記物的直接化學(xué)發(fā)光相比酶促化學(xué)發(fā)光具有明細(xì)優(yōu)勢(shì)，主要表現(xiàn) 在:反應(yīng)不需要催化劑，只要堿性環(huán)境即可進(jìn)行，反應(yīng)迅速，背景發(fā)光低，信噪比高，干擾因 素少，試劑穩(wěn)定性好，可以兩點(diǎn)定標(biāo)，體系簡(jiǎn)單，激發(fā)液成本低，吖啶酯易與蛋白質(zhì)聯(lián)結(jié)，且 聯(lián)結(jié)后光子產(chǎn)率不減少。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0020] 基于此，有必要提供一種檢測(cè)靈敏度較高的前列腺特異性抗原同源異構(gòu)體化學(xué)發(fā) 光免疫檢測(cè)試劑盒及其制備方法。
[0021] 一種前列腺特異性抗原同源異構(gòu)體化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)試劑盒，包括:前列腺特異 性抗原同源異構(gòu)體單克隆抗體包被的羧基化的磁微粒和抑制素單克隆抗體標(biāo)記的化學(xué)發(fā) 光標(biāo)記物。
[0022] 所述前列腺特異性抗原同源異構(gòu)體單克隆抗體包被的羧基化的磁微粒中，所述前 列腺特異性抗原同源異構(gòu)體單克隆抗體與所述羧基化的磁微粒的比例為1:25~35。
[0023] 所述抑制素單克隆抗體標(biāo)記的化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物中，所述前列腺特異性抗原同源異 構(gòu)體單克隆抗體與所述化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物的比例為50:1~10。
[0024] 所述羧基化的磁微粒的粒徑為0.05wii~lym。
[0025] 所述化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物為魯米諾、異魯米諾、三聯(lián)吡啶釕或吖啶酯。
[0026] 所述的前列腺特異性抗原同源異構(gòu)體化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)試劑盒，還包括化學(xué)發(fā)光 底物液，所述化學(xué)發(fā)光底物液包括A液和B液。
[0027] 所述A液為H202溶液，所述B液為NaOH溶液。
[0028]所述的前列腺特異性抗原同源異構(gòu)體化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)試劑盒，還包括前列腺特 異性抗原同源異構(gòu)體定標(biāo)品。
[0029]所述前列腺特異性抗原同源異構(gòu)體定標(biāo)品為濃度分別為0pg/mL、50pg/mL、200pg/ mL、500pg/mL、1000pg/mL和1600pg/mL的前列腺特異性抗原同源異構(gòu)體的溶液。
[0030] -種上述的前列腺特異性抗原同源異構(gòu)體化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)試劑盒的制備方法， 包括如下步驟：
[0031] 取羧基化的磁微粒的懸浮液，磁分離去上清后用MES緩沖液重懸，接著加入EDC水 溶液，活化羧基化的磁微粒的表面羧基，接著加入前列腺特異性抗原同源異構(gòu)體單克隆抗 體，室溫下混懸2h~10h，磁分離去除上清后用Tris緩沖液重懸，得到前列腺特異性抗原同 源異構(gòu)體單克隆抗體包被的羧基化的磁微粒;以及
[0032] 取前列腺特異性抗原同源異構(gòu)體單克隆抗體，加入碳酸鹽緩沖液后混勻，然后加 入化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物后混勻，室溫下避光反應(yīng)lh~2h后除雜，得到抑制素單克隆抗體標(biāo)記的 化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物。
[0033] 這種前列腺特異性抗原同源異構(gòu)體化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)試劑盒能夠以全自動(dòng)化學(xué) 發(fā)光免疫分析儀為檢測(cè)工具，完成前列腺特異性抗原同源異構(gòu)體的檢測(cè)這種前列腺特異性 抗原同源異構(gòu)體化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)試劑盒，經(jīng)過實(shí)驗(yàn)，其檢測(cè)靈敏度達(dá)到lpg/mL，相對(duì)于傳 統(tǒng)的前列腺特異性抗原同源異構(gòu)體的檢測(cè)方法靈敏度至少提高了 10倍，這種前列腺特異性 抗原同源異構(gòu)體化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)精度較高。
【附圖說明】
[0034]圖1為一實(shí)施方式的前列腺特異性抗原同源異構(gòu)體化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)試劑盒的制 備方法的流程圖；
[0035]圖2為實(shí)施例3得到的前列腺特異性抗原同源異構(gòu)體標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
【具體實(shí)施方式】
[0036] 為使本發(fā)明的上述目的、特征和優(yōu)點(diǎn)能夠更加明顯易懂，下面結(jié)合附圖和具體實(shí) 施例對(duì)本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】做詳細(xì)的說明。在下面的描述中闡述了很多具體細(xì)節(jié)以便于 充分理解本發(fā)明。但是本發(fā)明能夠以很多不同于在此描述的其它方式來實(shí)施，本領(lǐng)域技術(shù) 人員可以在不違背本發(fā)明內(nèi)涵的情況下做類似改進(jìn)，因此本發(fā)明不受下面公開的具體實(shí)施 的限制。
[0037] -實(shí)施方式的前列腺特異性抗原同源異構(gòu)體化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)試劑盒，包括:前 列腺特異性抗原同源異構(gòu)體單克隆抗體包被的羧基化的磁微粒和抑制素單克隆抗體標(biāo)記 的化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物。
[0038] 優(yōu)選的，前列腺特異性抗原同源異構(gòu)體單克隆抗體包被的羧基化的磁微粒中，前 列腺特異性抗原同源異構(gòu)體單克隆抗體與羧基化的磁微粒的比例為1:25~35。
[0039] 優(yōu)選的，抑制素單克隆抗體標(biāo)記的化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物中，前列腺特異性抗原同源異 構(gòu)體單克隆抗體與化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物的比例為50:1~10。
[0040]優(yōu)選的，羧基化的磁微粒的粒徑為0? 05wii~lym。
[0041]化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物可以為魯米諾、異魯米諾、三聯(lián)吡啶釕或吖啶酯。其中，化學(xué)發(fā)光 標(biāo)記物優(yōu)選為吖啶酯。
[0042]在其他的實(shí)施例中，上述前列腺特異性抗原同源異構(gòu)體化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)試劑盒 還包括化學(xué)發(fā)光底物液。
[0043] 化學(xué)發(fā)光底物液包括A液和B液。A液可以為H202溶液，B液可以為NaOH溶液。
[0044] 本實(shí)施例中，A液為濃度為0. lmol/L的H2〇2溶液，B液為濃度為0.25mol/L的NaOH溶 液。
[0045]在其他的實(shí)施例中，上述前列腺特異性抗原同源異構(gòu)體化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)試劑盒 還包括前列腺特異性抗原同源異構(gòu)體定標(biāo)品。
[0046]前列腺特異性抗原同源異構(gòu)體定標(biāo)品為濃度分別為0pg/mL、50pg/mL、200pg/mL、 500pg/mL、1000pg/mL和1600pg/mL的前列腺特異性抗原同源異構(gòu)體的溶液。
[0047] 具體的，前列腺特異性抗原同源異構(gòu)體定標(biāo)品可以采用標(biāo)準(zhǔn)品緩沖液將前列腺特 異性抗原同源異構(gòu)體配制成濃度分別為0pg/mL、50pg/mL、200pg/mL、500pg/mL、1000pg/mL 和1600pg/mL的前列腺特異性抗原同源異構(gòu)體的溶液。
[0048] 這種前列腺特異性抗原同源異構(gòu)體化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)試劑盒用于前列腺特異性 抗原同源異構(gòu)體檢測(cè)時(shí)，利用全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀對(duì)前列腺特異性抗原同源異構(gòu)體 定標(biāo)品進(jìn)行檢測(cè)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，內(nèi)置于電腦軟件;接著測(cè)試實(shí)際樣本，根據(jù)樣本發(fā)光值計(jì) 算樣本濃度;最后對(duì)前列腺特異性抗原同源異構(gòu)體全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)進(jìn)行性能 (靈敏度、線性、精密度、干擾性)的評(píng)價(jià)。
[0049] 這種前列腺特異性抗原同源異構(gòu)體化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)試劑盒能夠以全自動(dòng)化學(xué) 發(fā)光免疫分析儀為檢測(cè)工具，完成前列腺特異性抗原同源異構(gòu)體的檢測(cè)這種前列腺特異性 抗原同源異構(gòu)體化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)試劑盒，經(jīng)過實(shí)驗(yàn)，其檢測(cè)靈敏度達(dá)到lpg/mL，相對(duì)于傳 統(tǒng)的前列腺特異性抗原同源異構(gòu)體的檢測(cè)方法靈敏度至少提高了 10倍，這種前列腺特異性 抗原同源異構(gòu)體化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)精度較高。
[0050] 此外，這種前列腺特異性抗原同源異構(gòu)體化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)試劑盒還具有以下優(yōu) 占 .
[0051] 1、選擇吖啶酯作為標(biāo)記材料，并應(yīng)用于化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)，該發(fā)光體系為直 接化學(xué)發(fā)光，與傳統(tǒng)的酶促化學(xué)發(fā)光相比，該反應(yīng)不需要酶的參與，更加節(jié)約成本；
[0052] 2、選用吖啶酯的化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)線性范圍寬，能達(dá)到lpg/mL~1000pg/mL， 而傳統(tǒng)的前列腺特異性抗原同源異構(gòu)體的檢測(cè)方法的檢線性范圍為10pg/mL~1000pg/mL; [0053] 3、吖啶酯化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)重復(fù)性高，批內(nèi)及批間差均在5%以內(nèi)，這是其它 化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)難以達(dá)到的；
[0054] 4、化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)已實(shí)現(xiàn)樣本的定量，通過內(nèi)置標(biāo)準(zhǔn)曲線到測(cè)試軟件，只 需測(cè)試樣本就可直接得到樣本的濃度值；
[0055] 5、化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)可以實(shí)現(xiàn)全自動(dòng)化，試劑及樣本的添加全有儀器完成， 操作更加簡(jiǎn)便，減少了人為的誤差。
[0056] 如圖1所示的上述前列腺特異性抗原同源異構(gòu)體化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)試劑盒的制備 方法，包括如下步驟：
[0057]羧基化的磁微粒的懸浮液，磁分離去上清后用MES緩沖液重懸，接著加入EDC水溶 液，活化羧基化的磁微粒的表面羧基，接著加入前列腺特異性抗原同源異構(gòu)體單克隆抗體， 室溫下混懸2h~10h，磁分離去除上清后用Tris緩沖液重懸，得到前列腺特異性抗原同源異 構(gòu)體單克隆抗體包被的羧基化的磁微粒。
[0058] MES(2-(N-嗎啡啉）乙磺酸)緩沖液的濃度為0.02M，pH為5.5。
[0059] Tris緩沖液的濃度為0.1M并且含有2%BSA，pH為8.0。
[0060] EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亞胺)水溶液的濃度為10mg/mL~20mg/ mL，EDC與羧基化的磁微粒的比例為0.05:0.1~1。
[0061 ]優(yōu)選的，前列腺特異性抗原同源異構(gòu)體單克隆抗體包被的羧基化的磁微粒中，前 列腺特異性抗原同源異構(gòu)體單克隆抗體與羧基化的磁微粒的比例為1:25~35。
[0062]優(yōu)選的，羧基化的磁微粒的粒徑為0? 05wii~lym。
[0063]取前列腺特異性抗原同源異構(gòu)體單克隆抗體，加入碳酸鹽緩沖液后混勻，然后加 入化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物后混勻，室溫下避光反應(yīng)lh~2h后除雜，得到抑制素單克隆抗體標(biāo)記的 化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物。
[0064] 碳酸鹽緩沖液濃度為0 ? 1M，pH為9 ? 0~9 ? 5，
[0065] 除雜的操作為離心脫鹽柱脫鹽，具體操作為:先分別用純凈水及TBS緩沖液(40mM Tris-HCl，0.5%BSA，1 %NaCl，pH 8.0)處理離心脫鹽柱，最后加入得到的前列腺特異性抗 原同源異構(gòu)體單克隆抗體包被的羧基化的磁微粒的溶液，最后收集離心管中的液體。
[0066] 優(yōu)選的，抑制素單克隆抗體標(biāo)記的化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物中，前列腺特異性抗原同源異 構(gòu)體單克隆抗體與化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物的比例為50:1~10。
[0067]化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物可以為魯米諾、異魯米諾、三聯(lián)吡啶釕或吖啶酯。其中，化學(xué)發(fā)光 標(biāo)記物優(yōu)選為吖啶酯。
[0068] 得到的前列腺特異性抗原同源異構(gòu)體單克隆抗體包被的羧基化的磁微粒和抑制 素單克隆抗體標(biāo)記的化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物組合即可得到上述前列腺特異性抗原同源異構(gòu)體化 學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)試劑盒。
[0069] 這種前列腺特異性抗原同源異構(gòu)體化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)試劑盒在使用時(shí)，還需要化 學(xué)發(fā)光底物液和前列腺特異性抗原同源異構(gòu)體定標(biāo)品。
[0070] 化學(xué)發(fā)光底物液和前列腺特異性抗原同源異構(gòu)體定標(biāo)品可以自行配制得到。
[0071] 化學(xué)發(fā)光底物液包括A液和B液。A液可以為H2〇2溶液，B液可以為NaOH溶液。
[0072] 本實(shí)施例中，A液為濃度為0. lmol/L的H2〇2溶液，B液為濃度為0.25mol/L的NaOH溶 液。
[0073]具體的，前列腺特異性抗原同源異構(gòu)體定標(biāo)品可以采用標(biāo)準(zhǔn)品緩沖液將前列腺特 異性抗原同源異構(gòu)體配制成濃度分別為0pg/mL、50pg/mL、200pg/mL、500pg/mL、1000pg/mL 和1600pg/mL的前列腺特異性抗原同源異構(gòu)體的溶液。
[0074] 這種前列腺特異性抗原同源異構(gòu)體化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)試劑盒的制備方法簡(jiǎn)單方 便，制得的前列腺特異性抗原同源異構(gòu)體化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)靈敏度較高，具 有良好的應(yīng)用前景。
[0075] 以下為具體實(shí)施例。
[0076] 實(shí)施例1:前列腺特異性抗原同源異構(gòu)體化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)試劑盒的制備
[0077] (1)前列腺特異性抗原同源異構(gòu)體單克隆抗體包被的羧基化的磁微粒的制備：
[0078] 取含有50mg粒徑為0.05iim~lym的羧基化的磁微粒(MagnaBind?，貨號(hào)21353)懸浮 液，磁分離去上清，用0 ? 02M，pH為5 ? 5MES緩沖液重懸，加入lmL新配置的10mg/mL的EDC水溶 液，活化磁珠表面羧基，加入4mg前列腺特異性抗原同源異構(gòu)體單克隆抗體(biorbyt，貨號(hào) orb48780)，室溫下混懸6h，磁分離，去除上清，用含2 %BSA的0.1M，pH為8.0的Tris緩沖液重 懸到lmg/mL，得到前列腺特異性抗原同源異構(gòu)體單克隆抗體包被的羧基化的磁微粒，每瓶 5mL分裝保存于4°C備用。
[0079] (2)抑制素單克隆抗體標(biāo)記的吖啶酯的制備：
[0080] 取50yL濃度為25mg/mL的前列腺特異性抗原同源異構(gòu)體單克隆抗體，加入150yL濃 度為0. lM、pH為9.0~9.5的碳酸鹽緩沖液，混勻，然后加入1.5yL濃度為5mg/mL的吖啶酯溶 液混勻，室溫下避光反應(yīng)，1.5h后取出，用2mL的zeba離心脫鹽柱脫鹽處理，脫鹽過程中首先 分別用純凈水及TBS緩沖液進(jìn)行處理，最后加入得到的抑制素單克隆抗體標(biāo)記的吖啶酯溶 液，收集離心管中的液體至保存管得到抑制素單克隆抗體標(biāo)記的吖啶酯，每瓶5mL分裝保存 于4°C備用。
[0081] (3)前列腺特異性抗原同源異構(gòu)體定標(biāo)品的制備：
[0082] 用標(biāo)準(zhǔn)品緩沖液(40mM Tris-HCl，0.5%BSA，l%NaCl，pH 8.0)將前列腺特異性抗 原同源異構(gòu)體配置成濃度為〇?〖/11^、50卩〖/111]^、200卩〖/111]^、500卩〖/111]^、1000卩〖/111]^和1600卩區(qū)/ mL，每瓶0.5mL分裝凍干，4 °C保存?zhèn)溆谩?br>[0083]實(shí)施例2:前列腺特異性抗原同源異構(gòu)體化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)方法 [0084]以全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀(YHL0,貨號(hào)iFlash3000)為檢測(cè)工具，方法學(xué)模式 為雙抗體夾心法，即儀器依次加入50yL的樣品、50yL的前列腺特異性抗原同源異構(gòu)體單克 隆抗體包被的羧基化的磁微粒以及50yL的前列腺特異性抗原同源異構(gòu)體處理液，反應(yīng) 20min后，再加50此的前列腺特異性抗原同源異構(gòu)體包被的吖啶酯，反應(yīng)20min后，進(jìn)行磁分 離，儀器將反應(yīng)混合物送入暗室，依次加入發(fā)光底物A液(H 2〇2)及B液(NaOH)進(jìn)行發(fā)光反應(yīng)， 最后記錄發(fā)光值。
[0085] 實(shí)施例3:前列腺特異性抗原同源異構(gòu)體化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)試劑盒性能評(píng)價(jià)
[0086] 采用實(shí)施例2中的方法對(duì)前列腺特異性抗原同源異構(gòu)體定標(biāo)品進(jìn)行檢測(cè)，得到繪 制標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2所示。
[0087] 接著對(duì)接著測(cè)試實(shí)際樣本，根據(jù)樣本發(fā)光值計(jì)算樣本濃度。
[0088]靈敏度的檢測(cè)：
[0089]參照CLSI EP17-A文件推薦實(shí)驗(yàn)方案，計(jì)算前列腺特異性抗原同源異構(gòu)體化學(xué)發(fā) 光免疫檢測(cè)試劑盒的靈敏度，求得的靈敏度為lpg/mL。
[0090]線性的檢測(cè)：
[0091 ]對(duì)濃度為 5(^8/111]^、20(^8/111]^、50(^8/111]^、100(^8/111]^、160(^8/1111^標(biāo)準(zhǔn)品做線性分 析，計(jì)算線性相關(guān)系數(shù)，r = 0.9996,另外，該試劑盒對(duì)前列腺特異性抗原同源異構(gòu)體樣品檢 測(cè)的線性范圍為lpg/ml~1000pg/mL。
[0092] 精密度測(cè)定：
[0093]取濃度為10pg/mL及100pg/mL兩個(gè)前列腺特異性抗原同源異構(gòu)體樣品，每個(gè)樣本 每個(gè)濃度各做3個(gè)平行，用三批試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算試劑盒批內(nèi)及批間差，結(jié)果表明該試 劑盒批內(nèi)及批間差均小于5%。
[0094] 干擾性實(shí)驗(yàn)：
[0095] 取混合血清分別添加干擾物包括:結(jié)合膽紅素、游離膽紅素、血紅蛋白、抗壞血酸、 甘油酯，添加比例按照1:20進(jìn)行，分別測(cè)定混合血清及添加了各種干擾物后混合血清的測(cè) 值，計(jì)算二者之間的偏差，以±10%為可接受范圍。結(jié)果表明，干擾性均達(dá)到NCCLS的文件標(biāo) 準(zhǔn)，可用于臨床實(shí)驗(yàn)室前列腺特異性抗原同源異構(gòu)體狀況的準(zhǔn)確評(píng)估。
[0096] 實(shí)施例4、前列腺特異性抗原同源異構(gòu)體化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)試劑盒的對(duì)比實(shí)驗(yàn)
[0097] 分別用化學(xué)發(fā)光檢測(cè)方法和傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫吸附法對(duì)濃度為50pg/mL、200pg/mL、 500pg/mL、1000pg/mL、1600pg/mL的前列腺特異性抗原同源異構(gòu)體樣品做檢測(cè)，兩種方法檢 測(cè)靈敏度相比，數(shù)據(jù)如下表所示：
[0100] 由上表可以看出，化學(xué)發(fā)光檢測(cè)方法的靈敏度較酶聯(lián)免疫吸附法提高了約10倍。
[0101] 以上所述實(shí)施例僅表達(dá)了本發(fā)明的幾種實(shí)施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并 不能因此而理解為對(duì)本發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員 來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保 護(hù)范圍。因此，本發(fā)明專利的保護(hù)范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種前列腺特異性抗原同源異構(gòu)體化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)試劑盒，其特征在于，包括:前 列腺特異性抗原同源異構(gòu)體單克隆抗體包被的羧基化的磁微粒和抑制素單克隆抗體標(biāo)記 的化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的前列腺特異性抗原同源異構(gòu)體化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)試劑盒，其 特征在于，所述前列腺特異性抗原同源異構(gòu)體單克隆抗體包被的羧基化的磁微粒中，所述 前列腺特異性抗原同源異構(gòu)體單克隆抗體與所述羧基化的磁微粒的比例為1:25~35。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的前列腺特異性抗原同源異構(gòu)體化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)試劑盒，其 特征在于，所述抑制素單克隆抗體標(biāo)記的化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物中，所述前列腺特異性抗原同源 異構(gòu)體單克隆抗體與所述化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物的比例為50:1~10。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的前列腺特異性抗原同源異構(gòu)體化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)試劑盒，其 特征在于，所述羧基化的磁微粒的粒徑為0.05μηι~Ιμπι。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的前列腺特異性抗原同源異構(gòu)體化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)試劑盒，其 特征在于，所述化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物為魯米諾、異魯米諾、三聯(lián)吡啶釕或吖啶酯。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的前列腺特異性抗原同源異構(gòu)體化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)試劑盒，其 特征在于，還包括化學(xué)發(fā)光底物液，所述化學(xué)發(fā)光底物液包括A液和B液。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的前列腺特異性抗原同源異構(gòu)體化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)試劑盒，其 特征在于，所述A液為H2O 2溶液，所述B液為NaOH溶液。8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的前列腺特異性抗原同源異構(gòu)體化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)試劑盒，其 特征在于，還包括前列腺特異性抗原同源異構(gòu)體定標(biāo)品。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的前列腺特異性抗原同源異構(gòu)體化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)試劑盒，其 特征在于，所述前列腺特異性抗原同源異構(gòu)體定標(biāo)品為濃度分別為0pg/mL、50pg/mL、 200pg/mL、500pg/mL、1000pg/mL和1600pg/mL的前列腺特異性抗原同源異構(gòu)體的溶液。10. -種根據(jù)權(quán)利要求1~9中任一項(xiàng)所述的前列腺特異性抗原同源異構(gòu)體化學(xué)發(fā)光免 疫檢測(cè)試劑盒的制備方法，其特征在于，包括如下步驟： 取羧基化的磁微粒的懸浮液，磁分離去上清后用MES緩沖液重懸，接著加入EDC水溶液， 活化羧基化的磁微粒的表面羧基，接著加入前列腺特異性抗原同源異構(gòu)體單克隆抗體，室 溫下混懸2h~10h，磁分離去除上清后用Tris緩沖液重懸，得到前列腺特異性抗原同源異構(gòu) 體單克隆抗體包被的羧基化的磁微粒;以及 取前列腺特異性抗原同源異構(gòu)體單克隆抗體，加入碳酸鹽緩沖液后混勻，然后加入化 學(xué)發(fā)光標(biāo)記物后混勻，室溫下避光反應(yīng)Ih~2h后除雜，得到抑制素單克隆抗體標(biāo)記的化學(xué) 發(fā)光標(biāo)記物。
【文檔編號(hào)】G01N33/577GK105929151SQ201610505968
【公開日】2016年9月7日
【申請(qǐng)日】2016年6月30日
【發(fā)明人】段桂開, 錢純亙, 夏福臻, 王剛, 祝亮
【申請(qǐng)人】深圳市亞輝龍生物科技股份有限公司