天然植物皂苷功效組分的篩選方法及用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明的天然植物皂苷功效組分的篩選方法及用途，屬于動(dòng)物營養(yǎng)與飼料科學(xué)領(lǐng)域。該發(fā)明可作為動(dòng)物營養(yǎng)及飼料科學(xué)研究的一種輔助方法，有利于縮短中樞調(diào)控用天然植物皂苷類用于飼料添加劑的研究周期。
【背景技術(shù)】
[0002]動(dòng)物生長是一個(gè)復(fù)雜的生物代謝過程，受基因型、激素、營養(yǎng)、環(huán)境等多方面的影響。這些因素對生長的影響作用都是通過直接或間接影響動(dòng)物內(nèi)分泌系統(tǒng)來實(shí)現(xiàn)的。人和動(dòng)物的生長是由促生長激素軸來調(diào)控的，促生長激素軸由生長激素釋放因子(GRF)、生長激素(GH)和胰島素樣生長因子(IGF)構(gòu)成。目前的研究表明，參與豬的生長中樞調(diào)控的非營養(yǎng)性飼料添加劑的種類很多，如銅、半胱胺(CS87)、苯二氮卓類化合物(F89)、腎上腺素能受體激動(dòng)劑(如鹽酸特倫克羅)、萊克多巴、大豆黃酮等。而由于食用安全的原因，苯二氮卓類化合物(F89)、鹽酸特倫克羅(瘦肉精)、萊克多巴等藥物被禁止用于豬等動(dòng)物生長的調(diào)控。已發(fā)現(xiàn)植物黃酮、皂甙等對動(dòng)物的生長有調(diào)節(jié)作用。因此進(jìn)一步篩選參與動(dòng)物中樞調(diào)控的天然活性成分具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。
[0003]—些天然植物中含有皂苷、多糖、黃酮等多種藥理成分，與動(dòng)物的的中樞神經(jīng)的興奮和抑制過程均有影響。如五加科植物多有改善大腦的興奮過程，也增加大腦皮層的內(nèi)抑制過程。1984年，Barenboim等首次從刺五加的根中提取出來刺五加苷B和E，隨后Takasugi等證明了刺五加皂苷B和E是刺五加的主要活性成分，目前已知刺五加苷B有抗疲勞作用，刺五加苷E有抗壓作用。
[0004]許多大分子物質(zhì)會受到血腦屏障制約而不能進(jìn)入腦內(nèi)，血腦屏障可以防止血液中的神經(jīng)毒素傷害中樞神經(jīng)系統(tǒng)，具有保護(hù)性作用；對于很多必須的水溶性物質(zhì)和神經(jīng)組織所需的代謝物具有比較低的被動(dòng)滲透性，從而保持腦組織內(nèi)環(huán)境的基本穩(wěn)定，對維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)正常生理狀態(tài)具有重要的生物學(xué)意義。
[0005]以往對于天然植物功效成分的作用及其飼料化另的研究，多是總結(jié)飼養(yǎng)試驗(yàn)等研究成果，如:申請?zhí)枮椤?01310296894”的專利“一種促進(jìn)豬生長及改善肉質(zhì)的中藥飼料添加劑”、申請?zhí)枮椤?01310609512”的專利“一種促進(jìn)豬生長的綠色飼料預(yù)混料”、申請?zhí)枮椤?01310002811”的專利“一種可促進(jìn)豬生長及降低豬肉膽固醇的復(fù)合飼料添加劑”等，這樣使研究的周期變長及其對調(diào)控機(jī)理的認(rèn)識受到限制。通過血腦屏障模型篩選參與動(dòng)物中樞調(diào)控的天然活性成分是較快捷徑的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是建立一種天然植物中對中樞調(diào)控發(fā)揮作用的皂苷組分篩選方法，縮短天然植物皂苷用于動(dòng)物生長促進(jìn)劑的研究周期。
[0007]天然植物皂苷功效組分的篩選方法，按照下述步驟進(jìn)行:(I)將已經(jīng)分離純化的豬腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)建立豬的離體血腦屏障模型，以細(xì)胞培養(yǎng)板為介質(zhì)，將內(nèi)皮細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)，然后通過滲漏試驗(yàn)來初步判斷模型的完整性。通過實(shí)時(shí)監(jiān)測共培養(yǎng)模型的跨膜電阻值，來進(jìn)一步確定模型的完整性。最后通過蘆丁通透性測試和熒光素鈉通透系數(shù)測定來評價(jià)共培養(yǎng)模型的功能。借助此模型研究刺五加皂苷B和E在血腦屏障模型的通透性。
[0008]天然植物皂苷功效組分的篩選方法的用途，用于篩選天然植物中對中樞調(diào)控發(fā)揮作用的皂苷組分。
[0009]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)
[0010]1、建立了一種簡便的篩選動(dòng)物中樞調(diào)控的非營養(yǎng)性生長促進(jìn)劑的方法
[0011]2、降低了實(shí)驗(yàn)的成本和可操作性的難度
[0012]3、極大地縮短了研究的周期
【附圖說明】
[0013]圖1為星形膠質(zhì)細(xì)胞和微血管內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)示意圖，
[0014]圖2為刺五加皂苷B在體外BBB模型中不同時(shí)間點(diǎn)的通透率。
【具體實(shí)施方式】
[0015]實(shí)施例1
[0016]1.離體血腦屏障共培養(yǎng)模型的建立用.25%胰酶將符合試驗(yàn)要求的豬星形膠質(zhì)細(xì)胞消化下來，然后離心，留底部沉淀，用培養(yǎng)用完全培養(yǎng)基重懸底部沉淀，調(diào)整細(xì)胞密度，以4X 15接種于處理過的Transwell培養(yǎng)板的底部，然后將其倒置于無菌燒杯中，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3小時(shí)，然后取出按正常位置放置于24空培養(yǎng)版中，培養(yǎng)小室和培養(yǎng)池中均加入足量的培養(yǎng)液，培養(yǎng)箱中正常培養(yǎng)，一周后，接種豬腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞。
[0017]將消化下來的純化的腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞以5X 15密度接種于涂布有鼠尾膠的Transwell培養(yǎng)板的上面，在供池內(nèi)加入完全培養(yǎng)基，然后每隔兩天換液一次。直至到達(dá)試驗(yàn)所需狀態(tài)為止。同時(shí)設(shè)立對照組，只接種腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞組、只接種星形膠質(zhì)細(xì)胞組和空白組。
[0018]2.以刺五加為例檢測模型對不同皂苷組分的通透性:
[0019]將上述構(gòu)建好的體外血腦屏障模型進(jìn)行挑選，試漏試驗(yàn)顯示陽性的用來進(jìn)行通透性試驗(yàn)。向供池中加入刺五加皂苷B和刺五加皂苷E各1ml，每種試劑分為五個(gè)濃度梯度，分別為20、30、40、50、60、70mg/L。受體池中分別加入2ml的培養(yǎng)基，然后在第4、8、12、16、20、24、28h時(shí)候分別從受體池中吸取200ul濾液，4°C保存?zhèn)溆?，待所有樣品收集完畢進(jìn)行分析處理。向?yàn)V液中分別加2倍體積的甲醇，超聲處理20min,后離心1min (5000r, 4°C )，取上清液，做LC/MS分析。結(jié)果表明:大量的刺五加皂苷B通過體外血腦屏障模型，24h通透率為(58.24±1.32) %，刺五加皂苷E在濾液中未檢測到。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.天然植物皂苷功效組分的篩選方法，按照下述步驟進(jìn)行:(I)將已經(jīng)分離純化的豬腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)建立豬的離體血腦屏障模型，以細(xì)胞培養(yǎng)板為介質(zhì)，將內(nèi)皮細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)，然后通過滲漏試驗(yàn)來初步判斷模型的完整性。通過實(shí)時(shí)監(jiān)測共培養(yǎng)模型的跨膜電阻值，來進(jìn)一步確定模型的完整性。最后通過蘆丁通透性測試和熒光素鈉通透系數(shù)測定來評價(jià)共培養(yǎng)模型的功能。借助此模型研究刺五加皂苷B和E在血腦屏障模型的通透性。2.天然植物皂苷功效組分的篩選方法的用途，用于篩選天然植物中對中樞調(diào)控發(fā)揮作用的皂苷組分。
【專利摘要】本發(fā)明公開了天然植物皂苷功效組分的篩選方法及用途，屬于動(dòng)物營養(yǎng)與飼料科學(xué)領(lǐng)域。采用離體血腦屏障模型，通過模型的通透性試驗(yàn)篩選進(jìn)入中樞的天然植物皂苷的功效組份，作為動(dòng)物營養(yǎng)及飼料科學(xué)研究的一種輔助方法，有利于縮短中樞調(diào)控用天然植物皂苷類用于飼料添加劑的研究周期。
【IPC分類】C12Q1/02
【公開號】CN105200111
【申請?zhí)枴緾N201510561547
【發(fā)明人】楊連玉, 車東升, 楊文艷, 孔志偉, 董曉慶, 王軍, 張?zhí)燔? 趙春雨
【申請人】吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)
【公開日】2015年12月30日
【申請日】2015年8月31日