專利名稱：黑根霉對人參皂苷的轉(zhuǎn)化作用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明公開了一種可使人參三醇組皂苷(ginsenosides)發(fā)生生物轉(zhuǎn)化的菌種黑 根霉(Rhizopus stolonifer)，通過HPLC系統(tǒng)檢測，結果顯示可使人參三醇組皂苷內(nèi)部的 部分單體皂苷發(fā)生轉(zhuǎn)化。屬于微生物在生物轉(zhuǎn)化領域中的應用。
背景技術：
黑根霉(見

圖1和圖2)Rhizopus stolonifer又稱為匍枝根霉，屬于接合菌綱 (Zygomycetes)毛霉目(Mucorales)接合菌亞門(Zygomycotina)真菌,多生于面包、饅頭和 富含淀粉質(zhì)的食物上，使食物腐爛變質(zhì)，本發(fā)明中所用黑根霉由長白山野生膠陀螺水浸液 上分離純化得到，由于真菌在微生物中具有種類多、次生代謝產(chǎn)物多、培養(yǎng)條件比較簡單等 特點，因此是發(fā)酵中藥的主要功能菌，但是用其進行人參三醇組皂苷的生物轉(zhuǎn)化方面的研 究一直未見報道。生物轉(zhuǎn)化具有優(yōu)良的化學、區(qū)域、立體選擇性，反應條件溫和，轉(zhuǎn)化效率高，副產(chǎn)物 少，產(chǎn)物接近天然，不會造成環(huán)境污染，能夠進行傳統(tǒng)有機合成難以進行的化學反應等特
點ο人參為五加科植物人參(Panax ginseng C. A. Mey.)的干燥根，人參皂苷被認為是 人參中的標志性成分，如何利用生物轉(zhuǎn)化法對人參皂苷進行結構改造一直是關注的焦點， 本研究用黑根霉對人參三醇組皂苷進行了轉(zhuǎn)化，并得到了 一些創(chuàng)新性的研究結果。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明公開了一種可使人參三醇組皂苷(ginsenosides)發(fā)生生物轉(zhuǎn)化的菌種黑 根霉(Rhizopus stolonifer)，通過HPLC系統(tǒng)檢測，結果顯示黑根霉可使人參三醇組皂苷 內(nèi)部的部分單體皂苷發(fā)生轉(zhuǎn)化。本發(fā)明黑根霉菌種的制備，可由下述方法制備獲得黑根霉菌種的制備長白山野生膠陀螺水浸液放置一周，挑取水液上的黑根霉，接 于PDA平面培養(yǎng)基上，pH自然，分離純化多次，直到獲得純凈的黑根霉菌種，轉(zhuǎn)移至PDA斜 面培養(yǎng)基上3天，置4°C冰箱中備用。(黑根霉由圖力古爾教授鑒定)人參皂苷發(fā)酵物的制備精確稱取人參三醇組皂苷0. 500士0.020g放入250mL 三角瓶中，每個培養(yǎng)瓶中放入IOOmL PD培養(yǎng)基，及時裝入滅菌鍋滅菌，在蒸汽壓力 11. 76X104Pa 12. 75X104Pa時保持30min，取出放置在超凈工作臺上，滅菌放涼后，接 入黑根霉Rhizopus stolonifer 3mmX 3mm的斜面培養(yǎng)基3塊，放進搖床，搖床溫度設定為 28°C，轉(zhuǎn)數(shù)125r/min，轉(zhuǎn)化時間7d后真空泵抽濾發(fā)酵液，濾液用水飽和正丁醇1 1萃取三 次，取上層正丁醇萃取液合并，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮合并液，并將濃縮液置水浴鍋上蒸干得到發(fā) 酵產(chǎn)物。人參三醇組皂苷發(fā)酵產(chǎn)物HPLC分析及制備精密稱取濃縮后的發(fā)酵產(chǎn)物20mg，用 甲醇超聲溶解并定容至50mL容量瓶中，取0. 5mL進一步采用HPLC分析制備，同時精密稱取人參皂苷混合物20mg，用甲醇超聲溶解并定容于50mL容量瓶中，取上述溶液0. 5mL進行 HPLC分析，將兩者的的色譜圖進行比較。表1人參三醇組皂苷發(fā)酵產(chǎn)物液相色譜反應條件
權利要求
黑根霉菌種的制備長白山野生膠陀螺水浸液放置一周，挑取水液上的黑根霉，接于PDA平面培養(yǎng)基上，pH自然，分離純化多次，直到獲得純凈的黑根霉菌種，轉(zhuǎn)移至PDA斜面培養(yǎng)基上3天，置4℃冰箱中備用。(黑根霉由圖力古爾教授鑒定)人參三醇組皂苷發(fā)酵產(chǎn)物的制備精確稱取人參三醇組皂苷0.500±0.020g放入250mL三角瓶中，每個培養(yǎng)瓶中放入100mL PD培養(yǎng)基，及時裝入滅菌鍋滅菌，在蒸汽壓力11.76×104Pa～12.75×104Pa時保持30min，取出放置在超凈工作臺上，滅菌放涼后，接入黑根霉Rhizopus stolonifer 3mm×3mm的斜面培養(yǎng)基3塊，放進搖床，搖床溫度設定為28℃，轉(zhuǎn)數(shù)125r/min，轉(zhuǎn)化時間7d后真空泵抽濾發(fā)酵液，濾液用水飽和正丁醇1∶1萃取三次，取上層正丁醇萃取液合并，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮合并液，并將濃縮液置水浴鍋上蒸干得到發(fā)酵產(chǎn)物。
2.人參三醇組皂苷和人參三醇組皂苷發(fā)酵產(chǎn)物進一步采用HPLC分析，對比黑根霉對 人參三醇組皂苷發(fā)酵前后在色譜峰上的變化。
3.根據(jù)權利要求2所述的人參皂苷發(fā)酵產(chǎn)物，其特征在于所說的人參三醇組皂苷發(fā)酵 產(chǎn)物色譜峰上有原人參三醇組皂苷中沒有的化合物和色譜峰值升高的化合物出現(xiàn)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種可使人參皂苷(ginsenosides)發(fā)生生物轉(zhuǎn)化的菌種黑根霉(Rhizopus stolonifer)，其發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)過HPLC系統(tǒng)分析，制備出原人參三醇組皂苷中色譜峰值降低的組分和其人參三醇組皂苷發(fā)酵產(chǎn)物中峰值升高的組分，經(jīng)分離鑒定人參三醇組皂苷中被轉(zhuǎn)化的物質(zhì)確定為人參皂苷Re，人參三醇組皂苷發(fā)酵產(chǎn)物中化合物1確定為人參皂苷Rh1，化合物2確定為人參皂苷Rg3，化合物3為人參皂苷Rg2。推測得出人參三醇組皂苷中的人參皂苷Re被黑根霉轉(zhuǎn)化為人參皂苷Rh1，或者人參皂苷Re先被轉(zhuǎn)化成人參皂苷Rg2之后又被轉(zhuǎn)化成人參皂Rh1，具體轉(zhuǎn)化途徑有待于進一步研究。
文檔編號C12P33/20GK101935681SQ20091006721
公開日2011年1月5日 申請日期2009年7月3日 優(yōu)先權日2009年7月3日
發(fā)明者包海鷹, 王春玲 申請人:包海鷹