在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，為含I.OMKCl的2. 5mM的鐵氰化 鉀緩沖液。
[0023] 所述微分脈沖伏安法DPV的測(cè)試條件，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，為：電壓掃描 范圍為-0.IV到0. 65V，脈沖幅度為25mV，脈沖寬度為50ms，脈沖周期為500ms，電勢(shì)增量為 5mV，所有測(cè)試均在室溫下進(jìn)行。
[0024] 所述革蘭氏陰性細(xì)菌的群體信號(hào)分子標(biāo)準(zhǔn)品，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，為 C4-HSL。
[0025] 以C4-HSL標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，峰電流為縱坐標(biāo)，繪制峰電流與標(biāo)準(zhǔn)品濃度之間 的關(guān)系曲線。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示隨著C4-HSL標(biāo)準(zhǔn)品濃度的增加，其峰電流值降低。
[0026] 所述標(biāo)準(zhǔn)曲線，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，為：y=-0. 2417X+83. 808。C4-HSL 標(biāo)準(zhǔn)品濃度在2XKT9-L02Xl(T7m〇l/L范圍內(nèi)具有良好的線性相關(guān)，線性相關(guān)系數(shù)R2 = 0. 9941。所述待測(cè)樣品中信號(hào)分子濃度的最低檢測(cè)限可達(dá)到6XlOAiol/L。
[0027] 針對(duì)嗜水氣單胞菌（G-)、銅綠假單胞菌（G-)、鼠傷寒沙門氏菌（G-)、大腸桿菌 (G-)和金黃色葡萄球菌（G+)檢測(cè)，結(jié)果顯示，任何數(shù)量的沙門氏菌、大腸桿菌、金黃色葡萄 球菌的上清液用本發(fā)明的方法均無法檢出群體感應(yīng)信號(hào)分子，而在嗜水氣單胞菌和銅綠假 單胞菌的上清液中均可以檢出群體感應(yīng)信號(hào)分子。嗜水氣單胞菌（初始接種量IO3CFUAiL) 培養(yǎng)12h后可測(cè)得其群體感應(yīng)信號(hào)分子為10. 0nM/10ml上清液。銅綠假單胞菌（初始接種 量103CFU/mL)培養(yǎng)12h后可測(cè)得其群體感應(yīng)信號(hào)分子為18. 8nM/10ml上清液。這是由于 鼠傷寒沙門氏菌、大腸桿菌屬于革蘭氏陰性菌，具有檢測(cè)AHL信號(hào)分子的受體，可以感受其 它革蘭氏陰性菌的數(shù)量，但自身并不能產(chǎn)生AHL信號(hào)分子，故而檢測(cè)不到。而金黃色葡萄球 菌本身屬于革蘭氏陽性菌，故而檢測(cè)不到AHL信號(hào)分子。磁性分子印跡電化學(xué)傳感器顯示 了較好的特異性，僅能檢測(cè)出革蘭氏陰性菌，但是受到部分革蘭氏陰性菌自身不能產(chǎn)生群 體感應(yīng)信號(hào)分子的限制，本發(fā)明只能應(yīng)用在部分革蘭氏陰性菌的檢測(cè)中。正因此，也縮小了 待測(cè)樣品中可能污染革蘭氏陰性菌的種類，不失為一種快速的鑒別方法。
[0028] 本發(fā)明的磁性分子印跡電化學(xué)傳感器能夠用于檢測(cè)以下革蘭氏陰性菌：嗜水氣單 胞菌、銅綠假單胞菌等一些單胞菌及其它未知的革蘭氏陰性菌。
[0029] 本發(fā)明有如下的有益效果：
[0030] (1)能特異性地識(shí)別革蘭氏陰性菌群體感應(yīng)信號(hào)分子，并能保證檢測(cè)樣品為活細(xì) 菌產(chǎn)生且該菌具有產(chǎn)生毒力因子的能力的特點(diǎn)，這是因?yàn)槿后w感應(yīng)信號(hào)分子只能由活細(xì)菌 產(chǎn)生，當(dāng)群體感應(yīng)信號(hào)分子增加到一定濃度時(shí)，可啟動(dòng)菌體中相關(guān)基因的表達(dá)，調(diào)控細(xì)菌的 行為，如產(chǎn)生毒素、形成生物膜等）；
[0031] (2)利用磁電極吸附磁性納米分子印跡聚合物構(gòu)建具有高度選擇性的分子印跡電 化學(xué)傳感器，與常規(guī)的恒電位沉積法制備分子印跡電化學(xué)傳感器相比，具有電極再生性強(qiáng)、 可重復(fù)使用、實(shí)現(xiàn)快速分離、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)；
[0032] (3)磁性分子印跡電化學(xué)傳感器具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡(jiǎn)便、成本低廉等 特點(diǎn)，通過對(duì)信號(hào)分子的檢測(cè)實(shí)現(xiàn)對(duì)革蘭氏陰性菌的間接檢測(cè)，且準(zhǔn)確性較高；
[0033] (4)適用于食品工業(yè)和醫(yī)療行業(yè)等領(lǐng)域快速檢測(cè)出革蘭氏陰性菌，以有效地預(yù)防 革蘭氏陰性菌污染帶來的危害。
【附圖說明】
[0034] 圖1是磁性分子印跡電化學(xué)傳感器制備及使用示意圖；
[0035] 圖2是磁性分子印跡聚合物紅外表征圖；其中：(a)Fe3O4; (b)Fe304@Si02; (c) Fe3O4OSiO2-MIP; (d)Fe3O4OSiO2-NIP;
[0036] 圖3是磁性分子印跡聚合物電鏡表征圖；其中：透射電鏡：（a)Fe304; (b)Fe304@ SiO2; (c)Fe304@Si02-MIP;掃描電鏡：（d)Fe304; (e)Fe304@Si02; (f)Fe304@Si02-MIP;
[0037]圖4是磁性分子印跡電化學(xué)傳感器電化學(xué)性能研宄；其中：(A)裸電極（a)、吸附 磁珠的電極（b)、麗IP傳感器（c)、麗IP傳感器模板分子去除前（d)后（e)在I.OMKCl的 2. 5mM的鐵氰化鉀緩沖液中的循環(huán)伏安圖；(B)25nMC4-HSL通過麗IP吸附到電極表面產(chǎn)生 信號(hào)的微分脈沖伏安圖（a)、25nMC4-HSL通過MNIP吸附到電極表面產(chǎn)生信號(hào)的微分脈沖 伏安圖（b)、25nMC4-HSL吸附到裸電極表面產(chǎn)生信號(hào)的微分脈沖伏安圖（c)、裸電極產(chǎn)生 信號(hào)的微分脈沖伏安圖（d);
[0038] 圖5是磁性分子印跡電化學(xué)傳感器對(duì)不同濃度C4-HSL標(biāo)準(zhǔn)品的DPV響應(yīng)；其中： (a)OmM(b) 0? 025mM(c) 0? 05mM(d) 0?ImM(e) 0? 2mM(f) 0? 4mM(g) 0? 8mM(h)I. 6mM。
【具體實(shí)施方式】
[0039] 為了能夠更清楚地理解本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容，特舉以下實(shí)施例詳細(xì)說明，其目的僅 在于更好理解本發(fā)明的內(nèi)容而非限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0040] 實(shí)施例1磁性分子印跡電化學(xué)傳感器的制備
[0041] 磁性分子印跡電化學(xué)傳感器制備及使用示意圖如圖1所示。
[0042] 步驟一，磁性分子印跡聚合物的制備：通過溶劑熱法制備Fe3O4MNPs,通過Stober 法制備Fe3O4OSiO2，通過硅烷試劑KH550對(duì)"核-殼"型磁球表面進(jìn)行接枝氨基得到Fe3O4O SiO2-NH2。將模板分子呋喃酮：功能單體甲基丙烯酸：交聯(lián)劑二甲基丙烯酸乙二醇酯按照 摩爾比I:(1-8) :(10-30)的比例混合，加入適量乙腈中，超聲；按每毫摩爾模板分子，加入 100-300mg的Fe3O4IgSiO2-NHJIt性納米粒子，10-30mg的引發(fā)劑偶氮二異丁腈，超聲至均勻； 在隊(duì)氛圍下，60-80°C油浴反應(yīng)12-36h，反應(yīng)結(jié)束后，用外部磁場(chǎng)富集聚合的納米顆粒，用 甲醇/乙酸溶液洗至無模板分子檢測(cè)出來為止，真空干燥即得到Fe304@Si02-MIP。Fe3O4O SiO2-NIP除不加模板分子外，其余操作同上。得到的磁性分子印跡聚合物的紅外表征結(jié)果 如圖2所示。
[0043] 由圖2(a)可以看出，在434,、582、和628CHT1出現(xiàn)了Fe-0的振動(dòng)帶，3420CHT1出現(xiàn) 了Fe-OH鍵，證明成功合成Fe3O4。由圖2(b)可以看出，在1098CHT1出現(xiàn)了Si-0-Si的 非對(duì)稱振動(dòng)吸收峰，證明成功在Fe3O4表面包覆SiO2。由圖2(c)和（d)可以看出，在4000- 400CHT1范圍內(nèi)出現(xiàn)一下吸收峰：-0H，-CH(在3600 - 3000CHT1范圍內(nèi)），-C= 0(接近 1700CHT1)，這些吸收峰說明MIP和NIP成功接枝到？6304郎102-見1 2表面。
[0044] 此外，得到的磁性分子印跡聚合物的照片如圖3所示。由圖3可以看出，與烷基化 Fe3O4 (圖3e)相比Fe3O4IgSiO2-MIP(圖3f)表面發(fā)生了明顯變化，出現(xiàn)顆粒狀的結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步 說明了聚合反應(yīng)的成功。
[0045] 步驟二，將適量磁性分子印跡聚合物微球Fe3O4IiSiO2-MIP加入到待測(cè)樣本溶液中， 室溫下吸附，然后將預(yù)處理后的磁性玻碳電極插入到上述溶液中，通過磁吸附作用，實(shí)現(xiàn)磁 性分子印跡聚合物在磁性電極表面的固定，得到檢測(cè)革蘭氏陰性菌群體感應(yīng)信號(hào)分子的磁 性分子印跡電化學(xué)傳感器。
[0046] 實(shí)施例2磁性分子印跡電化學(xué)傳感器的電化學(xué)性能研宄
[0047] 本實(shí)驗(yàn)在1.0 M KCl的2. 5mM的鐵氰化鉀緩沖液中對(duì)磁性分子印跡電化學(xué)傳感器 進(jìn)行了性能研宄，結(jié)果如圖4所示。
[0048] 步驟一，由于分子印跡聚合物微球Fe3O4IgSiO2-MIP(簡(jiǎn)稱MMIP)為非導(dǎo)電性材料， 且呋喃酮及AHL為非電活性物質(zhì)，所以選用鐵氰化鉀-亞鐵氰化鉀作為底液和電極之間的 探針來表征磁性分子印跡電化學(xué)傳感器的電化學(xué)性能。麗IP經(jīng)過洗脫后，留下的印跡孔 穴可為探針離子提供傳質(zhì)通道，當(dāng)電極置于C4-HSL溶液中進(jìn)行吸附時(shí)，由于印跡孔穴對(duì) C4-HSL的特異性識(shí)別，C4-HSL進(jìn)入印跡孔穴中，從而阻礙了底液和玻碳電極表面之間的電 子傳質(zhì)過程，導(dǎo)致電流相應(yīng)信號(hào)發(fā)生相應(yīng)的改變，通過以上變化可以得出鐵氰化鉀-亞鐵 氰化鉀在傳感器上的電流響應(yīng)信號(hào)與C4-HSL濃度之間的關(guān)系。
[0049] 圖4 (A)是裸電極和改性后電極在I.OMKCl的2. 5mM的鐵氰化鉀緩沖液中的循環(huán) 伏安圖，并用氧化還原峰來評(píng)價(jià)此過程。圖中曲線a和曲線b分別為裸電極和吸附磁珠的 電極在鐵氰化鉀緩沖液中的循環(huán)伏安曲線，曲線b的峰電流稍低于曲線a，說明Fe3O4本身 為導(dǎo)電性材料；曲線c是吸附模板分子洗脫前的MMIP的電極在鐵氰化鉀緩沖液中的循環(huán)伏 安曲線，這一變化過程是由于吸附在電極表面的Fe3O4包覆了分子印跡膜從而增大了探針 離子在電極表面上的氧化還原反應(yīng)的難度，因此，曲線b的峰電流直接降低到曲線c;d是電 極吸附模板分子洗脫后的麗IP在鐵氰化鉀緩沖液中的循環(huán)伏安曲線，該過程是將模板分 子（呋喃酮）從印跡膜上洗脫下來，所形成的印跡孔穴為探針離子提供大量的傳質(zhì)通道，使 曲線d的峰電流明顯大于曲線c的峰電流；曲線e是重吸附后的循環(huán)伏安曲線，即洗脫模板 分子后的傳感器對(duì)C4-HSL進(jìn)行重新吸附的過程，C4-HSL進(jìn)入分子印跡膜上的印跡孔穴，堵 塞了傳質(zhì)通道使得峰電流降低并接近曲線