一種檢測革蘭氏陰性菌信號分子的磁性分子印跡傳感器的制造方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種檢測革蘭氏陰性菌信號分子的磁性分子印跡傳感器，屬于致病菌 快速檢測技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 食品中的腸道致病菌，是引起人類食源性疾病的主要原因之一，是人類健康的一 大殺手。熟肉類食品、面包糕點，極易直接引起食源性疾病，而水產(chǎn)類食品，因受到水中各種 微生物的污染和侵襲，也是引起人類食源性疾病的一大隱患。食品中的腸道菌多屬于革蘭 氏陰性菌（Gram-negative)，最常見的有沙門菌、志賀菌、致瀉性大腸埃希菌、產(chǎn)氣夾膜桿菌 和副溶血性弧菌等。革蘭氏陰性菌，泛指革蘭氏染色反應(yīng)呈紅色的細(xì)菌。它們產(chǎn)生內(nèi)毒素， 靠內(nèi)毒素使人致病。
[0003] 而預(yù)防致病菌的危害，首要條件是能夠快速準(zhǔn)確地檢測出食品是否受產(chǎn)致病菌的 污染。目前，致病菌的檢測方法主要包括傳統(tǒng)的檢測方法、酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA)、PCR 及RT-PCR技術(shù)、DNA探針技術(shù)等。傳統(tǒng)的檢測方法包括增菌培養(yǎng)篩選及后續(xù)計數(shù)檢測、生 化反應(yīng)鑒定或血清學(xué)鑒定等環(huán)節(jié)，這些傳統(tǒng)方法技術(shù)成熟、準(zhǔn)確性高、所需設(shè)備簡單，但實 驗操作繁瑣，檢測周期長，準(zhǔn)備和收尾工作繁重、特異性不足、靈敏度低，而且需要專業(yè)操作 人員等。ELISA需要特殊的儀器設(shè)備，檢測步驟較為繁瑣、費用高、檢測時間長，且易出現(xiàn)假 陽性。多重PCR、實時熒光定量PCR的分子水平的檢測方法的發(fā)展雖然比傳統(tǒng)方法具有優(yōu)越 性，但所需儀器設(shè)備昂貴、檢測過程復(fù)雜、成本較高、對檢測環(huán)境和操作人員專業(yè)技術(shù)要求 較高、所使用的試劑對人體和環(huán)境均有較大的危害，且由于產(chǎn)毒基因的復(fù)雜性使此方法特 異性欠佳。DNA探針技術(shù)快速、靈敏度高，但是該技術(shù)存在一定的局限性：第一，經(jīng)過食物加 工已經(jīng)死亡的細(xì)菌或亞致死細(xì)菌，其DNA仍可能存在并被檢測到，但這并不表明一定有活 的致病微生物在；第二，有些致病菌引起的食物中毒是由于攝取了細(xì)菌產(chǎn)生的毒素所造成 的，因此針對毒素基因的DNA探針或PCR方法得到的陽性結(jié)果也只表示帶有這些基因序列 的致病微生物存在，存在潛在產(chǎn)毒可能性，但并不代表一定有活的細(xì)胞存在、或基因已被表 達(dá)、或已經(jīng)產(chǎn)生了毒素。
[0004] 因此建立一種有效、靈敏、快速、簡便、特異性高且經(jīng)濟(jì)的檢測方法是生產(chǎn)經(jīng)營企 業(yè)、質(zhì)控人員、進(jìn)出口檢商、政府管理部門的迫切需要和食品、環(huán)境安全的有力保障。
[0005] 本發(fā)明的磁性分子印跡電化學(xué)傳感器是將表面分子印跡技術(shù)、磁分離技術(shù)和電化 學(xué)傳感技術(shù)相結(jié)合而構(gòu)建的一類新型傳感器。細(xì)菌群體感應(yīng)（Quorumsensing，QS)是指 細(xì)菌之間通過產(chǎn)生、釋放并感知信號分子，從而進(jìn)行細(xì)菌信息交流的現(xiàn)象。革蘭氏陰性細(xì)菌 的群體感應(yīng)系統(tǒng)利用N-?；呓z氨酸內(nèi)醋（N-acyl-homoserinelactone，AHL)作為主要 信號分子誘導(dǎo)致病因子表達(dá)，造成細(xì)菌性病害。隨著對群體感應(yīng)系統(tǒng)系統(tǒng)研宄的深入，已經(jīng) 證實該信號系統(tǒng)在調(diào)控革蘭氏陰性菌各種毒力因子表達(dá)中起重要作用。近年來更有研宄 提示密度感知系統(tǒng)本身就可能是一種毒力因子，并且可以直接作用于宿主細(xì)胞，抑制宿主 免疫反應(yīng)，從而導(dǎo)致機(jī)體更易于被感染。因此利用檢測信號分子達(dá)到間接檢測致病菌的目 的，使得對致病菌的檢測更加準(zhǔn)確無誤。由于信號分子的濃度極低，一般手段無法檢測出 來。目前國內(nèi)外檢測信號分子AHL的方法通常有4種：①理化手段，主要通過高效液相色譜 (HPLC)、氣質(zhì)聯(lián)用（GC-MS)技術(shù)檢測純化來自液體培養(yǎng)基的標(biāo)本，該方法除能定量外還能 鑒定AHL的性質(zhì)；②利用傳感菌的生物學(xué)方法，S卩AHL產(chǎn)生菌誘導(dǎo)細(xì)菌生物感應(yīng)器產(chǎn)生特征 性的表型變化來檢測AHL的存在，如紫色的產(chǎn)生和0 -半乳糖苷酶的大量表達(dá)等。但不同的 細(xì)菌生物感應(yīng)器對不同酰基側(cè)鏈長度的AHL敏感性不同，例如根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens)對酰基側(cè)鏈C-3羰基取代的AHL敏感性最強(qiáng)，而紫色桿菌（Chromobacterium violaceum)對短鏈的C-3沒有取代基的AHL比較敏感，由此可見一種細(xì)菌生物感應(yīng)器不能 檢測所有的AHL分子。其次，報告菌的檢測靈敏度還受報告菌本身狀態(tài)的影響；③結(jié)合物 理化學(xué)手段和生物發(fā)光的薄層層析；④利用免疫學(xué)方法，合成AHL半抗原衍生物和全抗原， 制備AHL相應(yīng)抗體，建立AHL免疫檢測新方法。不同細(xì)菌產(chǎn)生不同的AHL信號分子（包括 C4-HSL、C6-HSL、C10-HSL、C12-HSL、C14-HSL等），但它們具有共同的典型特征，即含有保守 的高絲氨酸內(nèi)酯環(huán)，因此可用其結(jié)構(gòu)類似物呋喃酮制備分子印跡聚合物。分子印跡聚合物 作為一種具有較高富集分離能力和特異性識別能力的材料，本發(fā)明將其應(yīng)用于革蘭氏陰性 菌群體感應(yīng)信號分子檢測中，不僅檢測速度比較快，并且檢測結(jié)果的準(zhǔn)確度也比較高，結(jié)合 電化學(xué)還可提高檢測的靈敏度。
[0006] 與傳統(tǒng)的分子印跡電化學(xué)傳感器相比，本發(fā)明的新型磁性分子印跡電化學(xué)傳感器 通過引入磁電極和磁性納米材料，輕松解決了電極的再生性問題，十分適合于構(gòu)建電化學(xué) 傳感器。本發(fā)明的磁性分子印跡電化學(xué)傳感器，用于檢測革蘭氏陰性菌群體感應(yīng)信號分子， 具有樣品處容易、所用儀器設(shè)備簡單的優(yōu)點，而且磁性分離的力量大、效率高，特別適合大 規(guī)模操作。本發(fā)明的傳感器可應(yīng)用于革蘭氏陰性菌群體感應(yīng)信號分子的檢測，從而達(dá)到間 接檢測革蘭氏陰性菌的目的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)存在的上述不足，將表面分子印跡技術(shù)、磁分離技術(shù)和電化 學(xué)傳感技術(shù)相結(jié)合而構(gòu)建一類新型磁性分子印跡電化學(xué)傳感器。本發(fā)明提供了一種檢測革 蘭氏陰性菌群體感應(yīng)信號分子的磁性分子印跡電化學(xué)傳感器及其制備方法與應(yīng)用。具體是 基于印跡聚合物MIPs的印跡空穴位點對目標(biāo)分子具有專一的吸附識別特性，用于檢測革 蘭氏陰性菌群體感應(yīng)信號分子的磁性分子印跡電化學(xué)傳感器及其制備方法。
[0008] 本發(fā)明的第一個目的是提供一種檢測革蘭氏陰性菌信號分子的磁性分子印跡傳 感器的制備方法，包括：（1)以呋喃酮為模板分子，制備出"核-殼"結(jié)構(gòu)的多功能磁性分子 印跡聚合物微球Fe3O4IgSiO2-MIP; (2)將適量所述磁性分子印跡聚合物微球Fe3O4IgSiO2-MIP 加入到樣本溶液中，室溫下吸附；（3)將磁性玻碳電極插入到步驟2的溶液中，吸附，然后通 過磁吸附作用，實現(xiàn)磁性分子印跡聚合物在磁性電極表面的固定，即得到磁性分子印跡電 化學(xué)傳感器。
[0009] 所述Fe3O4IgSiO2-MIP的制備，在本發(fā)明的一種實施方式中，是以呋喃酮為模板分 子、Fe3O4MNPs為內(nèi)核、SiO2外為殼，在得到的"核-殼"型磁球Fe304@Si02表面嫁接氨基NH2， 并在氨基化的核殼型磁球Fe3O4OSiO2-NH2的表面進(jìn)行聚合。
[0010] 所述Fe3O4MNPs,在本發(fā)明的一種實施方式中，通過溶劑熱法制備。
[0011] 所述Fe3O4OSiO2，在本發(fā)明的一種實施方式中，通過Stober法制備。
[0012] 所述Fe3O4OSiO2-NH2，在本發(fā)明的一種實施方式中，通過硅烷試劑KH550對 "核-殼"型磁球表面進(jìn)行接枝氨基。
[0013] 所述Fe3O4IgSiO2-MIP的制備，在本發(fā)明的一種實施方式中，包括：⑴將模板分 子呋喃酮：功能單體甲基丙烯酸：交聯(lián)劑二甲基丙烯酸乙二醇酯按照摩爾比I:(1-8): (10-30)的比例混合，加入適量乙腈中，超聲；（2)按每毫摩爾模板分子，加入100-300mg的 Fe3O4OSiO2-NH2磁性納米粒子，10-30mg的引發(fā)劑偶氮二異丁腈，超聲至均勾；（3)在N2氛圍 下，60-80°C油浴反應(yīng)12-36h，反應(yīng)結(jié)束后，用外部磁場富集聚合的納米顆粒，用甲醇/乙酸 溶液洗至無模板分子檢測出來為止，干燥即得到Fe304@Si02-MIP。Fe3O4IgSiO2-NIP除不加模 板分子外，其余操作同上。
[0014] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述步驟2中，室溫下吸附是吸附5-10min。
[0015] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述步驟3中插入磁性玻碳電極的吸附是吸附 I-IOmin0
[0016] 所述制備方法，在本發(fā)明的一種實施方式中，還包括將傳感器從溶液中拿出，洗滌 以去除電極表面物理性吸附物質(zhì)。
[0017] 本發(fā)明的第二個目的是提供一種所述方法得到的用于檢測革蘭氏陰性菌信號分 子的磁性分子印跡傳感器。
[0018] 本發(fā)明的第三個目的是提供一種利用所述磁性分子印跡傳感器的應(yīng)用。
[0019] 所述應(yīng)用，是用來檢測革蘭氏陰性菌群體感應(yīng)信號分子。
[0020] 所述應(yīng)用，在本發(fā)明的一種實施方式中，是：（1)使用所述磁性分子印跡聚合物微 球Fe3O4OSiO2-MIP對含有不同濃度的革蘭氏陰性細(xì)菌的群體信號分子標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)行吸 附得到磁性分子印跡電化學(xué)傳感器，采用微分脈沖伏安法（DPV)測定電流，得到革蘭氏陰 性細(xì)菌的群體信號分子濃度與電流值的標(biāo)準(zhǔn)曲線；(2)將適量所述分子印跡聚合物微球 Fe3O4IgSiO2-MIP加入到待測樣本中，吸附得到待測樣本的磁性分子印跡電化學(xué)傳感器，采用 微分脈沖伏安法（DPV)測定電流，再根據(jù)步驟1得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線，定量待測樣本中革蘭氏陰 性菌群體感應(yīng)信號分子濃度，實現(xiàn)對革蘭氏陰性菌的間接檢測。
[0021] 所述測定電流，在本發(fā)明的一種實施方式中，是將磁性分子印跡電化學(xué)傳感器置 于電解池底液中，設(shè)定適宜的掃描參數(shù)，進(jìn)行循環(huán)伏安法（CV)和/或微分脈沖伏安法（DPV) 測定。
[0022] 所述電解池底液，