本發(fā)明涉及細(xì)胞分選領(lǐng)域，具體的說是涉及一種在微流控芯片上從生物液體樣本中進(jìn)行自動(dòng)分選循環(huán)腫瘤細(xì)胞的裝置及方法。

背景技術(shù)：

在生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域，經(jīng)常需要從較為復(fù)雜的樣品中，分選出特定的目標(biāo)細(xì)胞。如檢測、分選并計(jì)數(shù)癌癥患者血液中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞(ctc，circulatingtumorcell)的個(gè)數(shù)在在癌癥診斷與治療中顯得愈發(fā)重要。目前ctc檢測技術(shù)魚龍混雜，總體上就是利用和不利用標(biāo)記物兩大類，基于標(biāo)記物捕獲的通常包括抗體包被磁珠為基礎(chǔ)的陽性富集法和陰性富集法。此類屬于第一代ctc捕獲技術(shù)，代表為強(qiáng)生的cellsearch系統(tǒng)。但其技術(shù)缺陷在于抗體捕獲僅局限于對(duì)特異表達(dá)epcam上皮抗原的上皮來源ctc的捕獲，并且無法實(shí)現(xiàn)活細(xì)胞捕獲進(jìn)行后續(xù)基因檢測。陰性富集法通過cd45磁珠反向去除外周血中白細(xì)胞，該方法無法對(duì)大體積樣本中的微量ctc進(jìn)行富集檢測，以及存在磁珠的非特異性吸附問題。第一代技術(shù)過濾膜法只能捕獲大粒徑腫瘤細(xì)胞，漏檢小粒徑腫瘤細(xì)胞，而且捕獲的細(xì)胞沒有細(xì)胞活性，只能用于細(xì)胞計(jì)數(shù)、形態(tài)學(xué)、以及fish檢測。

微流控芯片被喻為21世紀(jì)生命科學(xué)的支撐技術(shù)，是便攜式生化分析儀器的技術(shù)核心。該技術(shù)是通過構(gòu)建微尺度的通道，將生物和化學(xué)等領(lǐng)域所涉及的樣品制備、生物與化學(xué)反應(yīng)分離與檢測等基本操作單元集成到一塊幾平方厘米的芯片上，用以完成不同的生物或化學(xué)反應(yīng)過程，能夠在短時(shí)間內(nèi)分析大量的生物分子，準(zhǔn)確獲取樣品中的大量信息，信息量是傳統(tǒng)檢測手段的成百上千倍。

在微流控芯片上對(duì)血液樣品中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行分選已有一些研究的報(bào)道，如利用介電泳、流體動(dòng)力、基于免疫磁珠和熒光分選法等。但該方法都存在不同程度的不足，如直流介電泳的方法需要施加較高的電場強(qiáng)度，極容易造成細(xì)胞裂解；基于免疫磁珠分離方法雖然提高了對(duì)特定抗原表達(dá)腫瘤細(xì)胞分離效率，但仍然局限于對(duì)腫瘤細(xì)胞抗原表位的識(shí)別，而循環(huán)腫瘤細(xì)胞異質(zhì)性決定了采用單一抗體或幾種抗體進(jìn)行基于抗原識(shí)別的捕獲方法，都存在對(duì)非抗原表達(dá)ctc的漏檢問題。而熒光分選的方法需要對(duì)細(xì)胞進(jìn)行熒光標(biāo)記，并且需要搭建復(fù)雜的光學(xué)檢測系統(tǒng)。

專利201410336948.4公開了一種循環(huán)腫瘤細(xì)胞分離pdms微流控芯片，包括儲(chǔ)液孔a至儲(chǔ)液孔f、檢測通道、主通道、第一、第二聚焦通道、樣品出口通道、目標(biāo)細(xì)胞收集通道、電磁分選通道；當(dāng)循環(huán)腫瘤細(xì)胞通過檢測通道時(shí)，產(chǎn)生的電壓信號(hào)被檢測到并被送至ni采集卡和處理終端，處理終端通過ni采集卡發(fā)出電壓信號(hào)，使電磁繼電器閉合，繼而使電磁微閥結(jié)構(gòu)壓迫其下方pdms層，使其發(fā)生形變，從而從儲(chǔ)液孔e排出一部分液體，推動(dòng)循環(huán)腫瘤細(xì)胞流入目標(biāo)細(xì)胞收集通道中。該芯片裝置需要電場和磁場裝置實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的分離。該芯片整體制備復(fù)雜、操作流程多且成本高。

專利201410345305.6公開了一種雙螺旋微流控芯片，其包括紅細(xì)胞出口、白細(xì)胞出口、流體出口和細(xì)胞濾膜，根本上還是依賴于8微米孔徑過濾膜實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤細(xì)胞過濾分離，此類方法仍然會(huì)漏檢小粒徑腫瘤細(xì)胞。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的就是為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷而提供一種循環(huán)腫瘤細(xì)胞分離微流控芯片裝置及其使用方法。本發(fā)明基于循環(huán)腫瘤細(xì)胞和血細(xì)胞核質(zhì)比和表面電荷上的差異，在微流控芯片上采用流體力學(xué)實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品中循環(huán)腫瘤細(xì)胞的非抗體依賴的分離富集。

本發(fā)明的目的可以通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)：一種循環(huán)腫瘤細(xì)胞分離微流控芯片裝置，其特征在于，該裝置包括微流控芯片和芯片夾具，所述的微流控芯片包括芯片入口、單螺旋芯片、稀有細(xì)胞收集管道和白細(xì)胞出口，其中，所述稀有細(xì)胞收集管道包括兩根，分別連接內(nèi)側(cè)出口(13)和出口(14)；所述的單螺旋芯片由單螺旋型通道構(gòu)成，所述單螺旋型通道從圓形螺旋通道中心的芯片入口，經(jīng)半圓形起始通道，進(jìn)入螺旋形微流控通道，末端包含3個(gè)出口：分別收集不同粒徑大小稀有細(xì)胞的出口(13)和出口(14)，以及收集白細(xì)胞的廢液出口(15)；

所述的芯片夾具自動(dòng)對(duì)接微流控芯片的芯片入口、稀有細(xì)胞收集管道和廢液出口。

所述的內(nèi)側(cè)出口的寬度為110±50μm，出口的寬度為110±50μm，白細(xì)胞出口的寬度為700±100μm。

所述的ctc收集管道出口(13)和出口(14)均采用正電荷聚合物進(jìn)行表面涂層處理。

所述的正電荷聚合物為陽離子聚合物，包括聚乙烯亞胺、丙烯酰胺經(jīng)改性后的兩親性聚合物。

所述的單螺旋型通道為主通道，其寬度為500±100μm，高度為120±50μm，每個(gè)單一螺旋間距為500±100μm，完整螺旋數(shù)大于等于3。

所述的芯片夾具包括樣液管接頭、ctc收集管接頭和廢液收集管接頭；合上芯片夾具，所述的樣液管接頭與芯片入口對(duì)接，所述的不同粒徑ctc收集管接頭與所述出口(13)、(14)對(duì)接，所述白細(xì)胞收集管接頭與所述出口(15)對(duì)接，使微流控芯片的各出入口和外接導(dǎo)管連接，其中所述樣液管接頭另一端連接生物樣品，通過注射泵或者壓力泵裝置將生物樣品恒速注入芯片裝置，其流速為50-300ml/h。

將生物樣品恒速注入芯片裝置的流速優(yōu)選為60-200ml/h。

所述的流速更優(yōu)選為100ml/h，120ml/h或者150ml/h。

所述生物樣品為外周血、末梢血、胸腔積液、腹腔積液、腦脊液、骨髓液和/或尿液。

一種循環(huán)腫瘤細(xì)胞分離微流控芯片裝置的使用方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)將待測血樣采用紅細(xì)胞裂解液(該紅細(xì)胞裂解液為市售產(chǎn)品，如采用無錫納奧生物醫(yī)藥有限公司生產(chǎn)并銷售的裂解液)裂解處理后，加入pbs緩沖液，稀釋為進(jìn)樣樣本；

(2)通過配套注射泵或壓力泵裝置，將步驟(1)中進(jìn)樣樣本通過導(dǎo)管從芯片夾具的樣液管接頭注入微流控芯片的芯片入口，根據(jù)細(xì)胞核質(zhì)比和表面電荷的差異在單螺旋芯片內(nèi)實(shí)現(xiàn)循環(huán)腫瘤細(xì)胞的富集分離；

(3)富集分離出的不同粒徑ctc細(xì)胞從出口(13)、(14)流出，經(jīng)ctc收集管接頭及附帶導(dǎo)管導(dǎo)出并接入無菌離心管中，白細(xì)胞從外側(cè)白細(xì)胞出口流出經(jīng)白細(xì)胞收集管接頭及附帶導(dǎo)管導(dǎo)出。

步驟(1)所述的pbs緩沖液與待測血樣的體積比為10～30:1。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明生物樣本在通過微流控芯片時(shí)，利用流體在螺旋流道中的慣性效應(yīng)和dean流作用，將腫瘤細(xì)胞和其它細(xì)胞聚焦在距離入口中心原點(diǎn)不同的位置，不同核質(zhì)比和表面電荷的腫瘤細(xì)胞和白細(xì)胞，在流體力學(xué)作用下，匯聚成不同位置的平行線，在本發(fā)明限定的流速范圍內(nèi)，細(xì)胞會(huì)因其核質(zhì)比和電荷的差異，承受不同的流體力，不同細(xì)胞在管道內(nèi)形成空間上的差異排列，最終從不同的出口流出。其中，大部分的白細(xì)胞在匯聚成線后進(jìn)入血細(xì)胞流道，大部分腫瘤細(xì)胞則通過結(jié)構(gòu)流道中的電荷吸附作用分別進(jìn)入ctc流道。采用上述螺旋流道慣性分選技術(shù)結(jié)構(gòu)與電荷吸附技術(shù)集成的微流控芯片，克服了已有循環(huán)腫瘤細(xì)胞分離方法的集成度低、捕獲率低等缺陷，實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤細(xì)胞非抗體依賴的循環(huán)腫瘤細(xì)胞快速高通量分離；另外，本系統(tǒng)的芯片結(jié)構(gòu)簡單、加工方便，具有操作簡單、自動(dòng)化程度高等優(yōu)，可用于稀有細(xì)胞生物學(xué)研究、疾病早期診斷與治療等領(lǐng)域。

附圖說明

圖1為本發(fā)明的微流控芯片結(jié)構(gòu)圖；

圖2為本發(fā)明的芯片夾具開啟結(jié)構(gòu)圖；

圖3為本發(fā)明芯片夾具閉合結(jié)構(gòu)圖；

圖4為本發(fā)明的微流控芯片對(duì)細(xì)胞分離的模擬示意圖；

圖5為利用本發(fā)明微流控裝置對(duì)添加到正常血液中的gfp轉(zhuǎn)染的mgc803細(xì)胞富集效果圖(每樣本中加入300個(gè)mgc803細(xì)胞，分選后計(jì)數(shù)回收的mgc803細(xì)胞)；

圖6為具體實(shí)施例1分離出的外周血中循環(huán)腫瘤細(xì)胞免疫熒光染色圖；

圖7為具體實(shí)施例2分離出的胸積液中分離出的循環(huán)腫瘤細(xì)胞giemsa染色形態(tài)圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。

實(shí)施例

一種循環(huán)腫瘤細(xì)胞分離微流控芯片裝置，該裝置包括微流控芯片1和芯片夾具2。

如圖1所述，所述的微流控芯片1包括芯片入口11、單螺旋芯片12、稀有細(xì)胞收集管道和白細(xì)胞出口15，其中，所述稀有細(xì)胞收集管道包括兩根，分別連接內(nèi)側(cè)出口13和出口14；所述的單螺旋芯片12由單螺旋型通道構(gòu)成，所述單螺旋型通道從圓形螺旋通道中心的芯片入口11，經(jīng)半圓形起始通道，進(jìn)入螺旋形微流控通道，末端包含3個(gè)出口：分別收集不同粒徑大小稀有細(xì)胞的內(nèi)側(cè)出口13和出口14，以及收集白細(xì)胞的外側(cè)白細(xì)胞出口15；其中，所述的內(nèi)側(cè)出口13的寬度為110±50μm，出口14的寬度為110±50μm，白細(xì)胞出口15的寬度為700±100μm。所述的單螺旋型通道為主通道，其寬度為500±100μm，高度為120±50μm，每個(gè)單一螺旋間距為500±100μm，完整螺旋數(shù)大于等于3，在本實(shí)施例中為5個(gè)完整螺旋。

所述的內(nèi)側(cè)出口13和出口14均采用正電荷聚合物聚乙烯亞胺進(jìn)行表面涂層處理。該處理方法為常規(guī)的液體涂覆法，即采用一定體積的聚合物溶液通過注射器注入出口進(jìn)行自然涂布方法。

如圖2～3所示，所述的芯片夾具2包括樣液管接頭21、ctc收集管接頭22、23和白細(xì)胞收集管接頭24；合上芯片夾具2，所述的樣液管接頭21與芯片入口11對(duì)接，所述的ctc收集管接頭22、23分別與所述出口13、14對(duì)接，所述的白細(xì)胞收集管接頭24與所述白細(xì)胞出口15對(duì)接，使微流控芯片1的各出入口和外接導(dǎo)管自動(dòng)對(duì)接，其中所述樣液管接頭21另一端連接生物樣品，通過注射泵或者壓力泵裝置將生物樣品恒速注入芯片裝置，其流速可以為50-300ml/h。

所述生物樣品為外周血、末梢血、胸腔積液、腹腔積液、腦脊液、骨髓液和/或尿液。

下面選取外周血為生物樣品，采用上述循環(huán)腫瘤細(xì)胞分離微流控芯片裝置分離血液中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞，包括以下步驟：

(1)將待測血樣采用紅細(xì)胞裂解液(無錫納奧生物醫(yī)藥有限公司)裂解處理后，加入15mlpbs緩沖液，稀釋為進(jìn)樣樣本；

(2)將微流控芯片1和芯片夾具2組裝后，與外接樣液管、以及富集產(chǎn)物的外管、中管、內(nèi)管，如圖4所示，以及配套導(dǎo)管、注射泵或壓力泵裝置組裝在一起；

(3)啟動(dòng)儀器，將步驟(1)中進(jìn)樣樣本通過導(dǎo)管從芯片夾具2的樣液管接頭21按照流速120ml/h注入微流控芯片1的芯片入口11，根據(jù)細(xì)胞核質(zhì)比和表面電荷的差異在單螺旋芯片12內(nèi)實(shí)現(xiàn)循環(huán)腫瘤細(xì)胞的富集分離；富集分離出的ctc細(xì)胞從出口13、14流出，經(jīng)ctc收集管接頭22、23及附帶導(dǎo)管導(dǎo)出并接入5ml無菌離心管(內(nèi)管)中，白細(xì)胞從外側(cè)白細(xì)胞出口15流出經(jīng)白細(xì)胞收集管接頭24及附帶導(dǎo)管導(dǎo)出收集于外管中(如圖4所示)。

(4)將經(jīng)微流控分離的循環(huán)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行甩片，制作樣本載玻片。4％多聚甲醛固定，用0.25％tritonx-100(pbs配制)對(duì)細(xì)胞透化處理10分鐘，pbs漂洗3遍，5min/遍；2％bsa封閉30min，pbs漂洗3遍，5min/遍；加入epcam(1：200，pbs配制)，暗室孵育2小時(shí)，pbs漂洗3遍，5min/遍；加入ck-18(1：400，pbs配制)，暗室孵育2小時(shí)；pbs漂洗三遍，每次5min；加入cd45(1：200，pbs配制)，暗室孵育30min，pbs漂洗3遍，5min/遍；加入0.5ug/mldapi(pbs配制)染色10分鐘，pbs漂洗3遍，5min/遍；加入20ul封片劑封片；通過熒光顯微鏡觀察。

經(jīng)本發(fā)明的微流控裝置分選的腫瘤細(xì)胞，在顯微鏡下可觀察到完整的細(xì)胞形態(tài)，如圖6免疫熒光染色顯示epcam陽性的細(xì)胞數(shù)量為5個(gè)，細(xì)胞核質(zhì)比大于0.8。

如圖5所示，不同進(jìn)樣速度對(duì)于微流控芯片分離腫瘤細(xì)胞捕獲效率結(jié)果(gfp陽性mgc803細(xì)胞起始添加量為300個(gè))，結(jié)果表明：在1.0ml/min、1.5ml/min、2.0ml/min進(jìn)樣速度下納米微流控芯片的平均富集率各為57.7％、66.3％、75.2％。

實(shí)施例2

微流控裝置分離胸腔積液中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞，裝置與實(shí)施例1相同，方法如下：

(1)胸腔積液樣本被來回輕柔顛倒，使之混勻；用pbs將胸腔積液稀釋100倍，用30ml的注射器吸??；然后注射器整體固定于儀器配套恒流泵上，注射器出口與微流控芯片裝置的接口相連，胸腔積液泵入的流速為130ml/h。

(2)富集分離液從富集分離出口流出并接入5ml無菌離心管中。

(3)將經(jīng)微流控分離的循環(huán)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行甩片，制作樣本載玻片。4％多聚甲醛固定，進(jìn)行g(shù)iemsa染色，顯微鏡下觀察拍照，如圖7所示，分離出的腫瘤細(xì)胞顯示典型核大、核質(zhì)比高、粒徑大的細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)。

實(shí)施例3

所述的內(nèi)側(cè)出口13和出口14均采用正電荷聚合物丙烯酰胺進(jìn)行表面涂層處理。通過注射泵或者壓力泵裝置將生物樣品恒速注入芯片裝置，其流速為50ml/h。所述的pbs緩沖液與待測血樣的體積比為10:1。其余同實(shí)施例1。

實(shí)施例4

所述的內(nèi)側(cè)出口13和出口14均采用正電荷聚合物丙烯酰胺進(jìn)行表面涂層處理。通過注射泵或者壓力泵裝置將生物樣品恒速注入芯片裝置，其流速為300ml/h。所述的pbs緩沖液與待測血樣的體積比為30:1。其余同實(shí)施例1。

以上所述實(shí)施方式僅僅是對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式進(jìn)行描述，并非對(duì)本發(fā)明的范圍進(jìn)行限定，在不脫離本發(fā)明設(shè)計(jì)精神的前提下，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作出的各種變形和改進(jìn)，均應(yīng)落入本發(fā)明的權(quán)利要求書確定的保護(hù)范圍內(nèi)。