本發(fā)明涉及一種生物學領(lǐng)域，尤其是涉及一種用于循環(huán)中干細胞在體實時無損檢測及歸巢動力學研究方法與裝置。

背景技術(shù)：

自多莉羊誕生以來，干細胞與再生生物醫(yī)學研究領(lǐng)域不斷取得了重大技術(shù)突破，各類創(chuàng)新性研究成果連續(xù)多年被國際頂級學術(shù)期刊《科學》評選為了十大科學進展之一。干細胞基礎(chǔ)研究的突破更是引起了人們對干細胞技術(shù)實際應用的高度重視，尤其是山中伸彌與約翰·格登因在體細胞反向誘導成干細胞和細胞核重新編程所取得的重大成果而獲得2012年度的諾貝爾生理學或醫(yī)學獎，則進一步提升了干細胞技術(shù)及產(chǎn)業(yè)化對經(jīng)濟與社會發(fā)展的巨大影響力。干細胞技術(shù)不僅改造也傳統(tǒng)醫(yī)藥醫(yī)療產(chǎn)業(yè)，而且從研發(fā)到產(chǎn)業(yè)化形成了新的突破型高技術(shù)產(chǎn)業(yè)，干細胞產(chǎn)業(yè)成為了當前全球最具發(fā)展?jié)摿Φ膽?zhàn)略性新興產(chǎn)業(yè)。

1983年，Gallatin等在《自然》雜志上首次報道血源性淋巴細胞能選擇性地進入二級淋巴器官，這個過程他們用淋巴細胞“歸巢”進行定義。后來“歸巢”被逐漸用于形容細胞(特別是白細胞)趨向性遷移并定植到特定靶向組織的過程。近年來，隨著干細胞療法的興起，這個概念被引申至多種干細胞。許多研究表明，干細胞向損傷或缺血等組織的歸巢行為和所涉及的一系列分子與白細胞向炎性組織的歸巢機制十分相似。盡管白細胞向炎性組織的歸巢機制已經(jīng)比較清楚，干細胞向損傷或缺血組織的歸巢的具體機制至今仍尚不完全明確，缺乏評判歸巢效率及治療效率之間相關(guān)性的標準方法，包含輸注細胞數(shù)量、輸注部位、歸巢時的間隔時間、評估歸巢的方法、歸巢效率等。

由于某些干細胞具有能歸巢至特殊部位的特性，使其有可能成為特殊的藥物載體，靶向定位于特殊組織并發(fā)揮治療效用。而要擔載有細胞毒性的治療藥物，就必須得確定藥物的擔載量和藥效釋放時間，因此，確定干細胞輸注后的循環(huán)時間，干細胞在歸巢途中發(fā)生凋亡情況，研究干細胞循環(huán)時間及歸巢時間以確定出載藥篩選時長。

在檢測干細胞歸巢及趨向性研究方法上，目前主要的評估手段為放射性核素成像、熒光素酶報告基因系統(tǒng)結(jié)合小動物活體成像、近紅外熒光成像、核磁共振成像、組織切片結(jié)合免疫組化及熒光原位雜交技術(shù)。這些檢測技術(shù)都有各自的優(yōu)劣點，如成像技術(shù)雖然能直觀反映出細胞在活體組織內(nèi)的分布情況，但不能反映在血循環(huán)中的細胞變化過程，而傳統(tǒng)的流式細胞儀技術(shù)，雖然能監(jiān)測血液中細胞的樣本，但屬于侵襲的檢測，并且受限于血樣體積和檢測靈敏度，無法實現(xiàn)長時間的監(jiān)測干細胞在循環(huán)中的動力學變化過程。

為了克服現(xiàn)有檢測手段的不足，實現(xiàn)對循環(huán)中的干細胞進行在體、實時、動態(tài)監(jiān)測，對干細胞在循環(huán)中的動力學變化進行定量分析，本發(fā)明設(shè)計了一種用于循環(huán)中干細胞在體實時無損檢測及歸巢動力學研究方法與裝置，該裝置利用動物血管或人體的血管中自然流動的血流，作為傳統(tǒng)流式細胞儀的液流系統(tǒng)，激光聚焦于血管上構(gòu)成檢測平面，當帶有熒光標記或自發(fā)熒光的干細胞通過檢測窗口時，收到激光的激發(fā)后的熒光信號就會被共焦的熒光信號檢測器所采集到，再通過信號放大收集到計算機中，進行數(shù)據(jù)記錄和處理。該技術(shù)具有非侵入性、高靈敏度、能在不影響受檢個體生理狀態(tài)的情況下進行長時程動態(tài)監(jiān)測循環(huán)中受檢物質(zhì)的變化情況。這是一種非侵入式的檢測技術(shù)，避免了傳統(tǒng)流式細胞儀需要頻繁采樣和樣本處理過程，對活體樣本檢測而言較少干擾樣本的生理狀態(tài)，可以高靈敏度的長時動態(tài)檢測等優(yōu)點。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的就是為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷而提供一種在體、實時、動態(tài)監(jiān)測，對干細胞在循環(huán)中的動力學變化進行定量分析的用于循環(huán)中干細胞在體實時無損檢測及歸巢動力學研究方法與裝置。

本發(fā)明的目的可以通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)：一種用于循環(huán)中干細胞在體實時無損檢測及歸巢動力學研究裝置，其特征在于，包括：激發(fā)光系統(tǒng)、激光聚焦系統(tǒng)、檢測平面、檢測窗口、照明系統(tǒng)、成像系統(tǒng)、熒光信號檢測系統(tǒng)、信號放大系統(tǒng)、數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)；所述的激發(fā)光系統(tǒng)通過激光聚焦系統(tǒng)聚焦于血管上構(gòu)成檢測平面，所述的檢測平面上設(shè)有檢測窗口，檢測窗口上方設(shè)有照明系統(tǒng)，所述的照明系統(tǒng)照射到待測部位時，待測部分在成像系統(tǒng)中成像；所述的熒光信號檢測系統(tǒng)采集檢測窗口處的信號，并通過信號放大系統(tǒng)輸送到數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，進行數(shù)據(jù)記錄和處理。

所述的激發(fā)光系統(tǒng)包含多種激光波長，該激光波長在紫外波段和/或可見光波段，不同的激光波段對應不同的熒光染料，激光波長的選擇根據(jù)不同情況選用不同的染料。

所述的激光聚焦系統(tǒng)是透鏡或者其它聚焦器件；用于將激發(fā)光系統(tǒng)發(fā)出的激光聚焦于檢測平面上。

所述的檢測窗口用來固定動物或人體的待測血管，動物或人體的待測血管根據(jù)實驗需要而定。檢測窗口包括玻璃板等；檢測窗口是用來放置動物或者人體的待測血管，激發(fā)光從檢測窗口射出，通過檢測窗口對待測血管內(nèi)的干細胞進行照射，玻璃板是檢測血管和激光出射口之間的一個隔板，避免血管和激光出射口直接接觸。

所述的照明系統(tǒng)與檢測平面垂直，照明系統(tǒng)照射到待測動物或人體的待測部位時，待測部分會在成像系統(tǒng)中成像。光學照明系統(tǒng)包括由波長為520-550nm，中心波長為530nm的光電二極管等。

所述的成像系統(tǒng)為成像設(shè)備，包括CCD；用來固定待測動物或人體的血管以及實時觀測血管內(nèi)熒光標記的干細胞。

所述的熒光信號檢測系統(tǒng)、信號放大系統(tǒng)、數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)為常規(guī)市售產(chǎn)品。

一種采用所述的用于循環(huán)中干細胞在體實時無損檢測及歸巢動力學研究裝置進行研究的方法，其特征在于，包括以下步驟：利用動物血管或人體血管中自然流動的血流，作為傳統(tǒng)流式細胞儀的液流系統(tǒng)，激發(fā)光系統(tǒng)通過激光聚焦系統(tǒng)聚焦于血管上構(gòu)成檢測平面，當帶有熒光標記或自發(fā)熒光的干細胞通過檢測窗口時，受到激光的激發(fā)后的熒光信號就會被共焦的熒光信號檢測系統(tǒng)所采集到，再通過信號放大系統(tǒng)收集到數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，進行數(shù)據(jù)記錄和處理，照明系統(tǒng)與檢測平面垂直，照明系統(tǒng)照射到待測動物或人體的待測部位時，待測部分會在成像系統(tǒng)中成像，成像系統(tǒng)用來固定待測動物或人體的血管以及實時觀測血管內(nèi)熒光標記的干細胞，實現(xiàn)長時間的監(jiān)測干細胞在動物或人體循環(huán)中的動力學變化過程，監(jiān)測干細胞在循環(huán)系統(tǒng)中的歸巢動力學。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點：

1、該方法這是一種非侵入式的檢測技術(shù)，避免了傳統(tǒng)流式細胞儀需要頻繁采樣和樣本處理過程，對活體樣本檢測而言較少干擾樣本的生理狀態(tài)，可以高靈敏度的長時動態(tài)檢測。

2、該方法可以對循環(huán)中的干細胞進行實時監(jiān)測，能實時監(jiān)測循環(huán)中干細胞數(shù)量變化，評估轉(zhuǎn)移進程，評價治療效果。

3、該方法能有效確定干細胞輸注后的循環(huán)時間，干細胞在歸巢途中發(fā)生凋亡情況，方便研究干細胞循環(huán)時間及歸巢時間。

4、該方法用途廣泛：可廣泛應用于免疫學、血液學、腫瘤學、細胞生物學、細胞遺傳學、生物化學等臨床醫(yī)學和基礎(chǔ)醫(yī)學研究領(lǐng)域。

附圖說明

圖1為本發(fā)明裝置示意圖；

圖2為在體流式細胞儀(M1，M2，M3：為反射鏡；顯微鏡鏡頭為0.6A，40倍物鏡；DM1、DM 2為雙色分光鏡；AL1、AL 2、AL 3、AL 4為消色差透鏡；CL為柱透鏡；MS為機械狹縫；F1、F2為濾光片，PMT為光電倍增管，用來將光信號轉(zhuǎn)換成電信號)；

圖3為活體流式細胞儀檢測尾靜脈注射DiD標記的MSC在皮下瘤小鼠中的循環(huán)時間為10天，絕大部分MSC從循環(huán)中消失時仍有極少量的DiD陽性信號存在于循環(huán)中；

圖4為典型的反彈峰出現(xiàn)在40小時；

圖5A為在體流式細胞儀檢測尾靜脈注射DiD標記的MSC在原位瘤小鼠模型中的循環(huán)時間為8天，絕大部分MSC從循環(huán)中消失時仍有極少量的DiD陽性信號存在于循環(huán)中；

圖5B為在第40小時左右出現(xiàn)反彈峰；

圖6為在體流式細胞儀檢測尾靜脈注射DiD標記的MSC在肺轉(zhuǎn)移癌小鼠模型中的循環(huán)時間為7天，無明顯的反彈峰。

具體實施方式

下面結(jié)合附圖和具體實施例對本發(fā)明進行詳細說明。

實施例

如圖1所示，一種用于循環(huán)中干細胞在體實時無損檢測及歸巢動力學研究裝置，包括：激發(fā)光系統(tǒng)A、激光聚焦系統(tǒng)B、檢測平面C、檢測窗口D、照明系統(tǒng)E、成像系統(tǒng)F、熒光信號檢測系統(tǒng)G、信號放大系統(tǒng)H、數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)L；所述的激發(fā)光系統(tǒng)A通過激光聚焦系統(tǒng)B聚焦于血管上構(gòu)成檢測平面C，所述的檢測平面C上設(shè)有檢測窗口D，檢測窗口D上方設(shè)有照明系統(tǒng)E，所述的照明系統(tǒng)E照射到待測部位時，待測部分在成像系統(tǒng)F中成像；所述的熒光信號檢測系統(tǒng)G采集檢測窗口D處的信號，并通過信號放大系統(tǒng)H輸送到數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)L，進行數(shù)據(jù)記錄和處理。

按照以上措施制作了一臺樣機在體流式細胞儀該樣機的，原理如圖2所示：其中：

1、激發(fā)光系統(tǒng)A：用633nm光纖激光器發(fā)出紅色激光束對三氟甲磺酸鹽染料(DiD)染色的細胞進行激發(fā)，激光經(jīng)過中性密度濾光片NDF控制發(fā)射功率后，經(jīng)雙色分光鏡DM1反射柱透鏡CL，經(jīng)柱透鏡壓縮后至機械狹縫MS限制光束大小，截取位于高斯分布中心的激光，形成較為均勻的光束。再經(jīng)消色差透鏡AL1進行消色差后經(jīng)反射鏡M2反射后進入物鏡(0.6A，40倍)聚焦系統(tǒng)，在樣品聚焦平面(成檢測平面C)上生成一個5×72μm的長方形檢測窗口D，檢測窗口D內(nèi)聚焦深度為50μm/。

2、成像系統(tǒng)F：光學照明系統(tǒng)E由波長為520-550nm，中心波長為530nm光電二極管LED提供，該波段的光容易被血液吸收，形成對比度強成像較為清晰的圖像，同時與638nm的激發(fā)波段及664nm波長的發(fā)射光均無重疊，相互影響較小。照明光束照射至樣本平面后，投射過的部分被物鏡(0.6A，40倍)采集，形成平行光被雙色分光鏡DM3反射經(jīng)濾光片F(xiàn)1慮光后通過消色差透鏡AL2進行消色差處理后至CCD前方的消色差透鏡AL2最終聚焦到CCD感光元件上。通過移動三維載物臺，使樣本在顯示區(qū)域成清晰的像。激發(fā)光路發(fā)出的線性光斑覆蓋相應成像平面，使其光斑長軸覆蓋完血管直徑，并垂直于血流方向，當血液流過光斑聚焦平面時能全被光斑平面覆蓋并激發(fā)，當血流中熒光標記過的細胞流經(jīng)光斑平面時被有效激發(fā)，并發(fā)射出相應波長的熒光，通過熒光信號檢測系統(tǒng)G搜集信號；

3、熒光信號檢測系統(tǒng)G：當熒光標記的樣本被特定波長的激光激發(fā)后，發(fā)出相應波長的熒光，通過同一物鏡采集，穿過雙色分光鏡DM2，經(jīng)過雙色分光鏡DM2反射到檢測光路，透過帶通濾光片F(xiàn)2、消色差透鏡AL4及MS后被光電倍增管接收；

4、信號采集及處理：當熒光信號被PMT檢測后經(jīng)微電流放大器(信號放大系統(tǒng)H)放大，再由5千赫茲信號模擬/數(shù)字信號轉(zhuǎn)換為數(shù)字信號，傳入計算機，應用Measure Foundry軟件進行觀察記錄(即數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)L)。

當用另外一種波長的激光(488)激發(fā)時，原理類似，此時會用到反射鏡M1、M3以及濾光片F(xiàn)3、消色差透AL3。

經(jīng)過一系列實驗驗證證明：該方法是一種非侵入式的檢測技術(shù)，該裝置不僅可以用于動物在體的各類干細胞實時檢測、歸巢動力學研究，能有效確定干細胞輸注后的循環(huán)時間，干細胞在歸巢途中發(fā)生凋亡情況，方便研究干細胞循環(huán)時間及歸巢時間。同時可以對人體循環(huán)中的干細胞進行實時監(jiān)測，能實時監(jiān)測循環(huán)中干細胞數(shù)量變化，有效確定干細胞輸注后的循環(huán)時間，干細胞在歸巢途中發(fā)生凋亡情況，評估轉(zhuǎn)移進程，評價治療效果。

下面列舉一個熒光染料標記間充質(zhì)干細胞(MSC)在腫瘤模型體內(nèi)歸巢特性研究的實驗進行簡單說明：

間充質(zhì)干細胞(MSC)在腫瘤模型體內(nèi)歸巢特性研究采用Balb/c小鼠為MSC細胞來源，用先天免疫缺陷的Balb/c nude裸鼠構(gòu)建腫瘤模型。

1、DiD-MSC細胞在皮下瘤小鼠模型中歸巢時間

皮下瘤構(gòu)建成功以后，將DiD標記后的MSC細胞通過尾靜脈緩慢注射入小鼠體內(nèi)，立即放置入到樣機的樣本平臺開始檢測。連續(xù)監(jiān)測一個小時的數(shù)據(jù)，以每十分鐘為一次小的節(jié)點，最后將所有數(shù)據(jù)匯總后，統(tǒng)計平均每分鐘檢測到的DiD信號數(shù)目，代表著循環(huán)中MSC的細胞數(shù)量變化趨勢，取了6只模型小鼠為每個時間點的平行樣本。結(jié)果如圖3所示，DiD標記的MSC在皮下瘤小鼠中在循環(huán)中數(shù)量變化呈一定波動變化趨勢，在剛注入循環(huán)的2小時內(nèi)細胞數(shù)量平穩(wěn)維持在4個/分鐘，在4-8小時后循環(huán)中細胞數(shù)量出現(xiàn)上升到12小時出現(xiàn)下降，在第14小時和40小時及60小時出現(xiàn)了比較明顯的回升，而10天以后信號逐漸從循環(huán)中消失(圖3)。圖4為典型的在40小時和66小時出現(xiàn)的反彈峰情況，在第十天以后仍然有極少量的紅色DiD信號存在于外周血循環(huán)中。

2.DiD-MSC細胞在原位瘤小鼠模型中歸巢時間

原位腫瘤模型在接種四周以后通過尾靜脈注射DiD標記的MSC細胞，經(jīng)過樣機連續(xù)檢測在不同時間段循環(huán)中的DiD信號如圖5所示：每分鐘MSC細胞數(shù)在循環(huán)中呈逐漸減少趨勢(圖5A)，在第四十小時出現(xiàn)了細胞數(shù)目的反彈，而每分鐘DiD信號數(shù)目在第八天后趨近于零。圖5B為典型的DiD信號在30-48小時出現(xiàn)反彈峰的情況。

3.DiD-MSC細胞在肺轉(zhuǎn)移癌小鼠模型中歸巢時間

肺轉(zhuǎn)移癌在接種四周后，用樣機連續(xù)監(jiān)測通過尾靜脈注射DiD標記的MSC細胞，測得MSC在循環(huán)中清除曲線及循環(huán)時間如圖6所示，每分鐘MSC細胞數(shù)在循環(huán)中呈逐漸減少趨勢(圖6)，在循環(huán)中第四小時出現(xiàn)了數(shù)量增多，兩小時后循環(huán)中DiD信號數(shù)量陡降，并在第七天從循環(huán)中清除。

實施例2

所述的激發(fā)光系統(tǒng)A包含多種激光波長，該激光波長在紫外波段和/或可見光波段，不同的激光波段對應不同的熒光染料，激光波長的選擇根據(jù)不同情況選用不同的染料。在本實施例中選用紫外光波長，染料對應選用丹磺酰氯等。