基于鋱和適配體的丙溴磷熒光檢測方法，屬于分析化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

丙溴磷是一種中等毒性的非內(nèi)吸性廣譜有機磷殺蟲劑，具有觸殺和胃毒作用，對棉花、果樹、水稻、蔬菜等作物上的害蟲有很好的防治效果。使用量日漸增多,因在蔬菜上的使用而產(chǎn)生的污染不容忽視。雖然少量的丙溴磷殘留不會對人體造成立即的、直接的毒害,但是丙溴磷的分子結(jié)構(gòu)比較穩(wěn)定,在生物體內(nèi)很難被代謝分解、排泄,長期食用這種受污染的蔬菜可導(dǎo)致癌癥、不孕癥、內(nèi)分泌紊亂等疾病。大量進(jìn)食超標(biāo)蔬菜,會危害神經(jīng)中樞,以致痙攣而死。我國政府規(guī)定水果和蔬菜中丙溴磷的最大殘留劑量(MRL)分別為0.2和0.5mgkg^-1。

目前一般通過檢測蔬菜中農(nóng)藥的殘留來判斷蔬菜受農(nóng)藥污染的程度,所以對蔬菜中農(nóng)藥殘留量測定的研究報道較多,至今，用于檢測丙溴磷的方法多為氣相色譜分析法(GC)、高效液相色譜分析法(HPLC)，以及氣相色譜和液相色譜同質(zhì)譜聯(lián)用(HPLC-MS,GC-MS)。盡管這些方法是可靠、有效、實用的，但是它們多不夠簡便、快速、高效，并且費時、昂貴及需要專業(yè)的技術(shù)人員。本研究意在建立一種簡便、快速、特性性強、高效的丙溴磷殘留量檢測技術(shù),滿足執(zhí)法者和消費者的迫切需要。由于它的低費用、便于操作、反應(yīng)迅速、特別高的特異性，是一種很有前途的方法。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種基于熒光探針鋱離子建立非標(biāo)記核酸適配體傳感器檢測丙溴磷的方法,以快速、簡單、靈敏的檢測丙溴磷的殘留量。

技術(shù)問題：基于鋱和適配體的丙溴磷熒光檢測方法基于以下原理：

鋱離子在游離狀態(tài)下時幾乎沒有熒光，單鏈DNA(尤其是富含G的)有助于增強鋱的激發(fā)但雙鏈DNA不能，能量從單鏈DNA轉(zhuǎn)移到鋱使得熒光強度增加。在只有富含G的核苷酸單鏈上與鋱離子結(jié)合時，有很強的熒光效果；加入能夠與富含G的核苷酸單鏈上發(fā)生堿基互補的丙溴磷的核酸適配體時，它們之間會通過堿基間互補作用力發(fā)生結(jié)合，形成雙鏈結(jié)構(gòu)，再結(jié)合鋱離子，鋱離子的熒光強度會減弱；當(dāng)加入目標(biāo)物后，丙溴磷的適配體會優(yōu)先通過特異性識別作用，與目標(biāo)物形成特殊的二級結(jié)構(gòu)，從而釋放富含G的核苷酸單鏈上，此時釋放的核苷酸單鏈與鋱離子結(jié)合，又會使熒光強度恢復(fù)。本研究方法就是通過這種熒光強度的變化，可以實現(xiàn)對丙溴磷的特異性檢測。

本發(fā)明的技術(shù)方案：

包括以下步驟：反應(yīng)體系的建立；通過測定熒光光譜圖觀察適配體、幫助鏈、鋱離子以及丙溴磷體系的反應(yīng)；通過熒光探針鋱離子的非標(biāo)記核酸適配體傳感器檢測丙溴磷并進(jìn)行實際樣品的檢測。

(1)反應(yīng)體系的建立

設(shè)計了一條富含G且又能與丙溴磷核苷酸適配體堿基部分互補的發(fā)夾幫助鏈，首先是單獨的幫助鏈?zhǔn)覝貤l件下與鋱離子反應(yīng)14min，其次是先加入丙溴磷核苷酸適配體與其幫助鏈?zhǔn)覝貤l件下反應(yīng)16min，再加入鋱離子與其反應(yīng)。

利用RF-5301熒光分光光度儀測定以上反應(yīng)，熒光信號分別為F₀和F₁

(2)通過測定熒光光譜圖觀察適配體、幫助鏈、鋱離子以及丙溴磷體系的反應(yīng)

取3個2.0mL的離心管，編號為a,b,c，分別依次加入，a管(4μM幫助鏈50μL,10μM的鋱離子50μL,pH7.9的Tris-鹽酸緩沖液400μL),b管(4μM幫助鏈50μL,6μM核酸適配體50μL,10μM的鋱離子50μL,pH7.9的Tris-鹽酸緩沖液350μL),c管(4μM幫助鏈50μL,6μM核酸適配體50μL,10μM的鋱離子50μL,2μM的丙溴磷50μL,pH 7.9的Tris-鹽酸緩沖液300μL),在290nm的激發(fā)波長條件下測定熒光吸收光譜。

(3)建立基于鋱和適配體的丙溴磷熒光檢測方法

向含有6μM核酸適配體50μL,分別加入不同濃度的丙溴磷標(biāo)準(zhǔn)溶液,反應(yīng)16min后，加入4μM幫助鏈50μL，10μM的鋱離子50μL,pH 7.9的Tris-鹽酸緩沖液350μL的混合體系中，室溫條件下反應(yīng)14min，測定該體系的熒光信號強度，鋱離子的熒光信號強度將隨著丙溴磷濃度的不同而發(fā)生變化。根據(jù)F₁和F₂與丙溴磷的濃度建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。(F₁和F₂分別為加入丙溴磷之前和之后的熒光信號強度)

所用的丙溴磷標(biāo)準(zhǔn)品濃度依次為：1,2,4,6,8,10,12μM(終濃度分別為100,200,400,600,800,1000,1200nM)。本發(fā)明中，丙溴磷的檢出限為0.105μM，線性范圍為1-12nM。

(4)選擇性實驗的測定：

取6個2.0mL的離心管，依次編號為a～f，分別依次加入，a～f管(10μM鋱50μL,4μM幫助鏈50μL,4μM核酸適配體50μL,2μM待測物質(zhì)50μL,pH為7.9的磷酸鹽緩沖液350μL，待測物質(zhì)分別為(毒死蜱，樂果，辛硫磷，甲基對胺磷，敵敵畏，丙溴磷),在290nm的激發(fā)波長條件下測定熒光信號強度F₁和F₂，F(xiàn)₁和F₂分別為加入待測物質(zhì)之前和之后的熒光信號值

(5)實際樣品蘋果的檢測

稱取樣品5g(精確至0.01g),于100mL離心管中，加入20mL乙腈，均質(zhì)1min，4000r/min離心5min，將上清液轉(zhuǎn)入已知20g氯化鈉,50mL磷酸緩沖液的100mL具塞量筒內(nèi)，40℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，溶解在2mL娃哈哈純凈水中，進(jìn)行實驗。如權(quán)利要求3所述的測定丙溴磷的方法，加入不同濃度的丙溴磷標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測定。同時，將本實驗方法與國標(biāo)中的丙溴磷檢測方法進(jìn)行對照。

本發(fā)明的有益效果：

本實驗建立了一種對丙溴磷具有高選擇性，并且方便、簡單，適用于現(xiàn)場快速檢測的方法，可以推廣與使用。

附圖說明

圖1是不同體系的熒光光譜圖：4μM幫助鏈50μL,6μM核酸適配體50μL,10μM的鋱離子50μL,2μM的丙溴磷50μL。a鋱；b鋱+幫助鏈；c鋱+幫助鏈+核酸適配體；d鋱+幫助鏈+核酸適配體+丙溴磷

圖2是含有不同濃度的丙溴磷(1,2,4,6,8,10,12μM)的基于熒光探針鋱離子的非標(biāo)記核酸適配體傳感器體系的熒光光譜圖以及以該體系為參照的丙溴磷標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。a:幫助鏈+鋱；j:幫助鏈+鋱+核酸適配體；k:鋱

圖3是基于鋱和適配體的丙溴磷熒光檢測體系對不同種農(nóng)藥的熒光信號強度響應(yīng)圖譜：a～f管(10μM鋱離子50μL,4μM幫助鏈50μL,4μM核酸適配體50μL,2μM待測物質(zhì)50μL,pH為7.9的Tris-鹽酸緩沖液300μL，待測物質(zhì)分別為(毒死蜱，樂果，辛硫磷，甲基對胺磷，敵敵畏，丙溴磷)

圖4是實際樣品蘋果提取液中含有不同濃度的丙溴磷(1,2,4,6,8,10μM)的基于鋱和適配體的丙溴磷熒光檢測體系的熒光光譜圖以及以該體系為參照的實際樣品工作曲線圖。a:幫助鏈+鋱；j:幫助鏈+鋱+核酸適配體；k:鋱

具體實施方式

利用幫助鏈為探針檢測丙溴磷

材料/試劑：三氯化鋱購買于西格瑪奧德里奇試劑公司；三羥甲基氨基甲烷(Tris)購買于國藥集團(tuán)化藥有限責(zé)任公司；核苷酸鏈由生工生物(上海)試劑公司合成；

方法：取兩個2mL離心管分別標(biāo)號為a,b，其中a管加入10μM鋱50μL,4μM幫助鏈50μL,pH 7.9的Tris-鹽酸緩沖液400μL，用渦旋儀充分震蕩14min；b管加入4μM幫助鏈50μL,6μM核酸適配體50μL,充分震蕩16min，再加入pH 7.9的Tris-鹽酸緩沖液350μL，10μM鋱50μL，混合溶液在室溫下反應(yīng)14min后，用熒光分光光度計其熒光值，比較兩次記錄的熒光曲線。

結(jié)果：a,b倆管的熒光信號強度F₀和F₁可以發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)₁小于于F₀，由此說明，富含G的幫助鏈能夠顯著增強鋱的熒光強度；核酸適配體與環(huán)狀幫助鏈發(fā)生堿基配對結(jié)合，形成一個雙鏈結(jié)構(gòu)，從而使鋱的熒光強度下降。

由于實驗所用的體系受到幫助鏈以及適配體鏈長度的影響，所以需要研究幫助鏈和適配體鏈長度對反應(yīng)體系的影響

材料/試劑：不同鏈長度的幫助鏈和核酸適配體：由生工生物(上海)試劑公司合成；

方法：取7個2.0mL的離心管，編號為a～g，分別加入：a管(10μM鋱50μL,4μM幫助鏈1號50μL,pH 7.9的Tris-鹽酸緩沖液400μL),b管(10μM鋱50μL,4μM幫助鏈2號50μL,pH 7.9的Tris-鹽酸緩沖液400μL),c管(10μM鋱50μL,4μM幫助鏈3號50μL,,pH 7.9的Tris-鹽酸緩沖液400μL),d管(10μM鋱50μL,4μM幫助鏈4號50μL,pH 7.9的Tris-鹽酸緩沖液400μL),e管(10μM鋱50μL,4μM幫助鏈5號50μL,pH 7.9的Tris-鹽酸緩沖液400μL),f管(10μM鋱50μL,4μM幫助鏈6號50μL,pH 7.9的Tris-鹽酸緩沖液400μL),g管(10μM鋱50μL,4μM幫助鏈7號50μL,pH 7.9的Tris-鹽酸緩沖液400μL),分別在室溫條件下渦旋14分鐘，測其熒光強度。

結(jié)果：實驗發(fā)現(xiàn)，幫助鏈6可以作為最優(yōu)的鏈

方法：取8個2.0mL的離心管，編號為a～h，分別加入：a管(10μM鋱50μL,4μM幫助鏈650μL,pH 7.9的Tris-鹽酸緩沖液400μL),b管(10μM鋱50μL,4μM幫助鏈6號50μL,6μM核酸適配體1號50μL,pH 7.9的Tris-鹽酸緩沖液350μL),c管(10μM鋱50μL,4μM幫助鏈6號50μL,6μM核酸適配體2號50μL,pH 7.9的Tris-鹽酸緩沖液350μL),d管(10μM鋱50μL,4μM幫助鏈6號50μL,6μM核酸適配體3號50μL,pH 7.9的Tris-鹽酸緩沖液350μL),e管(10μM鋱50μL,4μM幫助鏈6號50μL,6μM核酸適配體4號50μL,pH 7.9的Tris-鹽酸緩沖液350μL),f管(10μM鋱50μL,4μM幫助鏈6號50μL,6μM核酸適配體5號50μL,pH 7.9的Tris-鹽酸緩沖液350μL),g管(10μM鋱50μL,4μM幫助鏈6號50μL,6μM核酸適配體6號50μL,pH 7.9的Tris-鹽酸緩沖液350μL)，h管(10μM鋱50μL,4μM幫助鏈6號50μL,6μM核酸適配體7號50μL,pH7.9的Tris-鹽酸緩沖液350μL)，b-h管先Help DNA與適配體室溫條件下渦旋16分鐘，然后a-h管室溫條件下渦旋14分鐘，測其熒光光譜。

結(jié)果：實驗發(fā)現(xiàn)，丙溴磷核酸適配體5號可以作為最優(yōu)的適配體

除鏈的長度外，幫助鏈6號和核酸適配體5號的濃度對實驗也有一定的影響。

方法：取10個2.0mL的離心管，編號為a-g，都加入10μM鋱50μL，pH 7.9的Tris-鹽酸緩沖液400μL，依次分別加入幫助鏈6(1,2,3,4,5,6,7,8,9,10μM)，測熒光值。

結(jié)果：實驗發(fā)現(xiàn)，幫助鏈6號的濃度為4μM最優(yōu)

方法：取10個2.0mL的離心管，編號為a-g，都加入10μM鋱50μL，4μM幫助鏈650μL,pH 7.9的Tris-鹽酸緩沖液350μL，依次分別加入核酸適配體(1,2,3,4,5,6,7,8,9,10μM)，測熒光值。

結(jié)果：實驗發(fā)現(xiàn)，丙溴磷核酸適配體5號的濃度為6μM最優(yōu)

該方法用于丙溴磷檢測：

材料/試劑：丙溴磷購自西格瑪奧德里奇試劑公司；蘋果購自于當(dāng)?shù)夭耸袌?/p>

方法：

(1)建立基于基于鋱和適配體的丙溴磷熒光檢測方法

向含有6μM核酸適配體50μL,分別加入不同濃度的丙溴磷標(biāo)準(zhǔn)溶液,反應(yīng)16min后，加入4μM幫助鏈50μL，10μM的鋱離子50μL,pH 7.9的Tris-鹽酸緩沖液350μL的混合體系中，室溫條件下反應(yīng)14min，，測定該體系的熒光信號強度，鋱的熒光信號強度將隨著丙溴磷濃度的不同而發(fā)生變化。根據(jù)F₁和F₂與丙溴磷的濃度建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。(F₁和F₂分別為加入丙溴磷之前和之后的熒光信號強度)

(2)所用的丙溴磷標(biāo)準(zhǔn)品濃度依次為：1,2,4,6,8,10,12μM，通過測定熒光信號強度F₁和F₂，根據(jù)F₁和F₂與啶蟲脒的濃度建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。F₁為加入目標(biāo)物丙溴磷之前的熒光信號值，F(xiàn)₂為加入目標(biāo)物丙溴磷之后的熒光信號值。

(3)實際樣品蘋果的檢測

稱取樣品5g(精確至0.01g),于100mL離心管中，加入20mL乙腈，均質(zhì)1min，4000r/min離心5min，將上清液轉(zhuǎn)入已知20g氯化鈉,50mL磷酸緩沖液的100mL具塞量筒內(nèi)，40℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，溶解在2mL娃哈哈純凈水中，進(jìn)行實驗。如權(quán)利要求4所述的方法，加入不同濃度的丙溴磷標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測定。同時，將本實驗方法與國標(biāo)中的丙溴磷檢測方法進(jìn)行對照。

(4)實驗體系的驗證：選擇性實驗的測定：

取6個2.0mL的離心管，依次編號為a～f，分別依次加入，a～f管(10μM鋱50μL,4μM幫助鏈50μL,4μM核酸適配體50μL,2μM待測物質(zhì)50μL,pH為7.9的Tris-鹽酸緩沖液350μL，待測物質(zhì)分別為(毒死蜱，樂果，辛硫磷，甲基對胺磷，敵敵畏，丙溴磷),在290nm的激發(fā)波長條件下測定熒光信號強度F₁和F₂，F(xiàn)₁和F₂分別為加入待測物質(zhì)之前和之后的熒光信號值。

結(jié)果：根據(jù)F₁和F₂與丙溴磷的濃度建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，丙溴磷的檢出限為0.105μM，線性范圍為1-12nM。本實驗方法和國標(biāo)氣質(zhì)方法檢測丙溴磷的加標(biāo)回收試驗結(jié)果見下表

SEQUENCE LISTING

<110> 吉林大學(xué)

<120> 一種基于鋱和適配體的丙溴磷熒光檢測方法

<160> 14

<210> 1

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

acccgtcgct aagaactagc ggagggt 27

<210> 2

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

acccgtcgct aagaactagc ggagggtggg t 31

<210> 3

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

acccgtcgct aagaactagc ggagggtggg tgggt 35

<210> 4

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

acccgtcgct aagaactagc ggagggtggg tgggtgggt 39

<210> 5

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

acccgtcgct aagaactagc ggagggtggg tgggtgggtg ggt 43

<210> 6

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

acccgtcgct aagaactagc ggagggtggg tgggtgggtg ggtgggt 47

<210> 7

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

acccgtcgct aagaactagc ggagggtggg tgggtgggtg ggtgggtggg t 51

<210> 8

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

tgggcagcga ttcttgatcg ccaccca 27

<210> 9

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

tgggcagcga ttcttgatcg ccacccaccc a 31

<210> 10

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

tgggcagcga ttcttgatcg ccacccaccc accca 35

<210> 11

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

tgggcagcga ttcttgatcg ccacccaccc acccaccca 39

<210> 12

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

tgggcagcga ttcttgatcg ccacccaccc acccacccac cca 43

<210> 13

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

tgggcagcga ttcttgatcg ccacccaccc acccacccac ccaccca 47

<210> 14

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

tgggcagcga ttcttgatcg ccacccaccc acccacccac ccacccaccc a 51