本發(fā)明涉及熒光分子探針檢測，具體地說，涉及一種兩親性熒光分子探針在體外檢測牙菌斑生物膜中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

熒光分子探針檢測技術(shù)建立在光譜化學(xué)和光學(xué)波導(dǎo)與測量技術(shù)基礎(chǔ)上，選擇性的將分析對象的化學(xué)和結(jié)構(gòu)信息連續(xù)轉(zhuǎn)變?yōu)榉治鰞x器易測量的熒光信號的分子測量裝置。熒光分子探針會在不同的條件下表現(xiàn)出不同的熒光性質(zhì)，當處在特定條件下時，熒光分子探針熒光特性會發(fā)生變化，比如從無到有、從弱到強，或者激發(fā)波長改變、發(fā)射波長改變，人們可以從這些信息中獲取周圍環(huán)境的特征或者是環(huán)境中的某些特定信息。熒光分子探針具有設(shè)備簡單、操縱簡便、分析速度快以及靈敏度高等特點，并且生產(chǎn)成本低，檢測不需預(yù)處理，不受外界電磁場干擾。熒光分子探針通常是由識別基團和報告基團組成的，前者決定著探針的選擇性和特異性，后者決定著探針的靈敏度。

在口腔醫(yī)學(xué)研究中，人們常常需要檢測牙菌斑生物膜的覆蓋程度來判斷口腔健康情況，或者觀察牙菌斑生物膜菌種組成成分。然而現(xiàn)有的牙菌斑生物膜熒光分子探針具有檢測菌種單一、檢測步驟繁瑣、所需時間長等缺點，限制了其在口腔醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用，無法滿足一些科學(xué)研究的需求。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供一種兩親性熒光分子探針在制備體外檢測牙菌斑生物膜材料中的應(yīng)用，以及一種兩親性熒光分子探針快速、便捷的體外檢測牙菌斑生物膜的方法。該兩親性熒光分子探針可以特異性的標記牙菌斑生物膜，與牙菌斑生物膜結(jié)合后誘導(dǎo)發(fā)光基團發(fā)出熒光，顯示牙菌斑生物膜的覆蓋程度，是一種能夠檢測牙菌斑生物膜覆蓋程度的快速、便捷的方法。本發(fā)明提供了所述熒光分子探針的結(jié)構(gòu)特征及體外檢測牙菌斑生物膜的方法，檢測方法簡單易行、快速靈敏，成本較低，光學(xué)穩(wěn)定性良好。

為實現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：

第一方面，本發(fā)明提供一種兩親性熒光分子探針在制備體外檢測牙菌斑生物膜材料中的應(yīng)用，所述兩親性熒光分子探針包括親水多肽以及分別與親水多肽通過共價鍵連接的疏水烷基鏈和受限發(fā)光基團。

本發(fā)明應(yīng)用的熒光分子探針中，所述親水多肽可以通過靜電吸附的作用結(jié)合在牙菌斑生物膜的表面，導(dǎo)致發(fā)光基團受限，在激光照射下發(fā)射熒光，實現(xiàn)對牙菌斑生物膜的體外檢測。在該兩親性熒光分子探針中，親水多肽能夠提高探針在水溶液中的穩(wěn)定性和靶向性，疏水烷基鏈可以輔助熒光分子探針組裝成為納米粒子，受限發(fā)光基團只在受限的條件下發(fā)射熒光，因此是一種良好的可用于牙菌斑生物膜體外檢測的熒光分子探針。

進一步地，所述親水多肽為帶正電荷的四個氨基酸，優(yōu)選為四個精氨酸。帶正電荷的氨基酸可以吸附在帶負電的牙菌斑生物膜表面，并且能夠調(diào)節(jié)牙菌斑生物膜生存環(huán)境pH值。

進一步地，所述疏水烷基鏈為飽和脂肪酸。在對不同碳原子的飽和脂肪酸進行試驗比較后發(fā)現(xiàn)，16碳原子的棕櫚酸形成的納米粒子最為穩(wěn)定，因此優(yōu)選含有16個碳原子的棕櫚酸，用于輔助熒光分子探針組裝成為納米粒子。

進一步地，所述受限發(fā)光基團為受限誘導(dǎo)發(fā)光分子，優(yōu)選為四苯基乙烯分子，該分子具有分子轉(zhuǎn)動受限發(fā)光特性，且熒光穩(wěn)定不易淬滅，發(fā)光效率高等優(yōu)勢。

第二方面，本發(fā)明提供了一種體外檢測牙菌斑生物膜的材料或試劑盒，所述材料或試劑盒含有濃度為5～20μM的前述兩親性熒光分子探針。

經(jīng)試驗研究發(fā)現(xiàn)，當前述兩親性熒光分子探針的濃度在5～20μM之間時，其與牙菌斑生物膜樣本孵育后的熒光強度變化相對其他濃度更為顯著。

當以所述兩親性熒光分子探針與牙菌斑生物膜樣本孵育后的熒光強度變化作為優(yōu)先考慮因素時，可對所述兩親性熒光分子探針的濃度進一步進行優(yōu)選為8～12μM。在此基礎(chǔ)上，更為優(yōu)選的濃度為10μM。

本發(fā)明進一步提供應(yīng)用前述兩親性熒光分子探針進行牙菌斑生物膜體外檢測的方法，包括如下步驟：

(1)取牙菌斑生物膜進行富集培養(yǎng)；

在本發(fā)明的具體實施方式中，所述牙菌斑生物膜由北京大學(xué)口腔醫(yī)院醫(yī)生取自志愿者；

(2)取對數(shù)期菌液，去掉上清，重懸在三蒸水中，加入前述濃度的兩親性熒光分子探針，混勻，室溫孵育1min，檢測熒光強度變化。

當熒光強度明顯變亮?xí)r，表明檢測樣本中含有牙菌斑生物膜。

在符合本領(lǐng)域常識的基礎(chǔ)上，上述各優(yōu)選條件，可以相互組合，得到具體實施方式。

本發(fā)明的有益效果在于：

本發(fā)明選用的兩親性熒光分子探針，能夠快速、便捷的檢測牙菌斑生物膜，該熒光分子探針穩(wěn)定性強、特異性好，因此該種檢測方法一種良好的用于牙菌斑生物膜體外檢測的方法，可用于生物和醫(yī)學(xué)研究。

本發(fā)明提供了該兩親性熒光分子探針體外檢測牙菌斑生物膜的應(yīng)用，檢測方法簡單易行、快捷方便，不涉及復(fù)雜的操作和苛刻條件，成本較低，光學(xué)穩(wěn)定性好。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實施例2中所述熒光分子探針TR4在2μM濃度下與牙菌斑生物膜樣本和懸浮菌液孵育后的熒光強度變化圖(熒光分光光度計檢測)；其中：a為熒光分子探針TR4在2μM濃度下同四組牙菌斑生物膜樣本孵育后的熒光強度變化；b為熒光分子探針TR4在2μM濃度下同與濃度梯度為0％，2.5％，5％，7.5％，10％，12.5％，15％，17.5％，20％，22.5％，25％(以菌液占混合溶液體積比vol％表示)的懸浮菌液室溫下共孵育1min后的熒光強度變化。

圖2為本發(fā)明實施例2中熒光分子探針TR4在10μM和100μM濃度下分別與牙菌斑生物膜結(jié)合的效果(透射電子顯微鏡拍攝)。

圖3為本發(fā)明實施例2中熒光分子探針TR4在10μM濃度下與牙菌斑生物膜懸液孵育1min后檢測的效果(單光子激光共聚焦顯微鏡拍攝)。

具體實施方式

下面將結(jié)合實施例對本發(fā)明的優(yōu)選實施方式進行詳細說明。需要理解的是以下實施例的給出僅是為了起到說明的目的，并不是用于對本發(fā)明的范圍進行限制。本領(lǐng)域的技術(shù)人員在不背離本發(fā)明的宗旨和精神的情況下，可以對本發(fā)明進行各種修改和替換。

下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

下述實施例中使用的水試劑采用密理博公司的Milli-Q三蒸水(18.2MΩ·cm，Millipore System Inc)。

實施例1 兩親性熒光分子探針的制備

合成TR4的具體實驗步驟如下：

采用CLEAR Amide多肽合成樹脂，利用Fmoc化學(xué)的固相肽合成方法，依次連接精氨酸，精氨酸，精氨酸，精氨酸，賴氨酸(Fmoc-Lys(MTT)-OH)。在3％的三氟乙酸條件下脫去賴氨酸(Fmoc-Lys(MTT)-OH)的側(cè)鏈保護基MTT，采用縮合試劑HATU和DIEA將棕櫚酸連接到賴氨酸的側(cè)鏈。在20％的哌啶條件下脫出Fmoc基團，采用縮合試劑HATU和DIEA將TPE-COOH連接到賴氨酸的N末端。用三氟乙酸切割多肽，冷乙醚沉淀，收集TR4粗品之后高效液相色譜法純化，凍干，得到最終產(chǎn)物探針。

實施例2

本實施例以牙菌斑生物膜樣本的采集和富集培養(yǎng)為例，說明牙菌斑生物膜樣本的采集、富集培養(yǎng)以及預(yù)處理方法。牙菌斑生物膜樣本由北京大學(xué)口腔醫(yī)院醫(yī)生取自四名志愿者，每位志愿者的樣本為一組，根據(jù)志愿者編號分別標記為A組，B組，C組，D組。樣本的菌種培養(yǎng)方法為將樣本加入含1000mL培養(yǎng)基的錐形瓶中并置于恒溫搖床中富集培養(yǎng)12h。搖床設(shè)定為恒溫37℃，速度200rpm。

所述培養(yǎng)基的配方為：牛肉膏，蛋白胨和氯化鈉，購自美國Sigma Aldrich公司。配制方法為：取牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化鈉5g溶于1000mL三蒸水中，調(diào)節(jié)pH至7.0，120℃高壓蒸汽滅菌20min。

兩親性熒光分子探針TR4對牙菌斑生物膜樣本的體外檢測實驗，具體實驗步驟如下：

1、熒光強度檢測：

TR4熒光強度檢測：配置體積為250μL的2μM TR4水溶液，超聲20min使其充分分散。熒光光譜儀測定TR4水溶液在激發(fā)光波長330nm、發(fā)射波長范圍350-650nm的熒光強度。

TR4和牙菌斑生物膜結(jié)合后的熒光強度檢測：選取經(jīng)過富集培養(yǎng)12h的四組菌種各1mL，5000rpm離心3min，去除培養(yǎng)基，水洗三次，重新分散在1mL水中待用。

四組樣本A組，B組，C組，D組，分別取菌液50μL，加入200μL濃度為2μM的TR4水溶液中，輕搖混勻，孵育1min。熒光光譜儀測定各組溶液在激發(fā)光波長330nm、發(fā)射波長范圍350-650nm的熒光強度。

菌液濃度對TR4熒光強度的影響：為了研究菌液濃度對TR4熒光強度的影響，配置11組濃度為2μM、體積為150μL的TR4水溶液，分別向每組TR4水溶液中加入菌液0μL，5μL，10μL，15μL，20μL，25μL，30μL，35μL，40μL，45μL，50μL，最后加入三蒸水將各組樣品體積調(diào)至200μL，輕搖混勻，室溫下共孵育1min。熒光光譜儀測定各組溶液在激發(fā)光波長330nm、發(fā)射波長范圍350-650nm的熒光強度。結(jié)果如圖1所示。

結(jié)果顯示：濃度為2μM的TR4溶液分別同四組牙菌斑生物膜樣本共孵育后的熒光強度，與單純TR4的對照組相比有明顯的熒光增強，說明TR4探針與牙菌斑生物膜相互作用會引起熒光強度顯著升高。四組樣本之間的熒光強度也存在差異性，這可能是樣本間牙菌斑生物膜濃度的差別導(dǎo)致的。TR4(2μM)的熒光強度隨牙菌斑生物膜濃度(以菌液占混合溶液體積比vol％表示：0％，2.5％，5％，7.5％，10％，12.5％，15％，17.5％，20％，22.5％，25％)增大而增強，證明在一定濃度范圍內(nèi)TR4分子熒光強度和牙菌斑生物膜濃度呈正相關(guān)。

2、透射電子顯微鏡樣品制備及觀察：

取經(jīng)過富集培養(yǎng)12h的菌種1mL，5000rpm離心3min，去除培養(yǎng)基，水洗三次，重新分散在1mL水中待用。

TR4樣品制備：配置濃度分別為10μM和100μM的TR4水溶液，吸取10μL滴于鍍碳支持膜上，室溫干燥。

牙菌斑生物膜樣品制備：吸取經(jīng)過處理的50μL菌液，加入100μL三蒸水稀釋，輕搖使其充分混合后吸取10μL滴于鍍碳支持膜上，室溫干燥。

牙菌斑生物膜和TR4共孵育的樣品制備：吸取經(jīng)過處理的50μL菌液，分別加入100μL濃度為10μM和100μM的TR4水溶液中，輕搖使其充分混合，吸取10μL混合溶液滴于鍍碳支持膜上，室溫干燥。

樣品觀察：采用120kV透射電子顯微鏡進行樣品的觀察和拍照。

來自不同志愿者的四組樣本分別進行樣品制備和觀察，共有四對(牙菌斑生物膜/TR4孵育牙菌斑生物膜)結(jié)果，文中顯示的為具有代表性的一組。結(jié)果如圖2所示。TR4分子在濃度較大時(100μM)會自組裝為納米粒子，而濃度為10μM時無法自組裝為納米粒子，但與牙菌斑生物膜結(jié)合后，可以在牙菌斑生物膜的表面形成納米粒子。

結(jié)果顯示：TR4分子能夠以納米粒子的形式粘附在牙菌斑生物膜表面。

3、共聚焦顯微鏡樣品制備及觀察：

每組取經(jīng)過富集培養(yǎng)12h的菌種1mL，5000rpm離心3min，去除培養(yǎng)基，水洗三次，重新分散在1mL水中待用。

牙菌斑生物膜溶液作為對照組，牙菌斑生物膜同TR4共孵育的混合溶液作為實驗組。來自不同志愿者的四組樣本分別進行樣品制備和觀察，共有四對(實驗組/對照組)結(jié)果，文中顯示的為具有代表性的一組。

對照組樣品制備：吸取經(jīng)過處理的100μL菌液，加入200μL三蒸水中，輕搖混勻，吸取200μL牙菌斑生物膜溶液滴于載玻片上，蓋上蓋玻片后用于共聚焦顯微鏡觀察。

實驗組樣品制備：吸取經(jīng)過處理的100μL菌液，加入200μL濃度10μM的TR4溶液中，輕搖使其充分混合，吸取200μL混合溶液滴于載玻片上，蓋上蓋玻片后用于共聚焦顯微鏡觀察。

樣品觀察：采用LSM710共聚焦顯微鏡觀察并拍照(TR4激發(fā)光波長405nm，發(fā)射光接收波長范圍425-550nm)。結(jié)果如圖3所示。

結(jié)果顯示：當將牙菌斑生物膜和TR4(10μM)共孵育(1min)后，通過熒光共聚焦顯微鏡可以觀察到明顯的藍色熒光，且與顯微鏡明場視野中的牙菌斑生物膜發(fā)生很好的共定位現(xiàn)象，說明TR4可有效的結(jié)合牙菌斑生物膜并通過熒光的形式使其可視化。

實施例3

本實施例與實施例2的差別在于將檢測試劑換為牙菌斑原位指示劑，檢測實施例2中的牙菌斑生物膜樣本。

以本實施例檢測的結(jié)果與熒光分子探針TR4檢測的結(jié)果相似。

雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進，均屬于本發(fā)明要求保護的范圍。