本發(fā)明涉及一種利用單分子熒光顯微術(shù)檢測過氧化氫含量的方法。本發(fā)明屬于生物傳感檢測領(lǐng)域。
背景技術(shù):
區(qū)別于傳統(tǒng)的光學(xué)成像,單分子檢測技術(shù)的出現(xiàn)將成像方式推新至新的階段:揭示隱藏在整體平均水平下分子的不均一性和其獨(dú)特的動(dòng)態(tài)過程。利用單分子熒光顯微術(shù),能夠發(fā)現(xiàn)分子間的差異及分子與其所處微納環(huán)境的相互作用,并且通過對單個(gè)分子的實(shí)時(shí)追蹤,可以得到單個(gè)分子實(shí)時(shí)的動(dòng)態(tài)變化?;诖朔椒ǎ喾N酶分子與無機(jī)納米催化劑的催化特性被解析(Science 1998,Nature Materials 2008等)。同時(shí)單分子熒光檢測方法具有極佳的信噪比、檢測靈敏度及極高的時(shí)間分辨率,因而也被應(yīng)用至核酸檢測方面(Nature Communication 2015)。
過氧化氫(H2O2)在調(diào)控細(xì)胞內(nèi)許多重要的生理進(jìn),在生命系統(tǒng)、宿主防御以及細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)起著的雙重作用,因而在最近的報(bào)道中被稱為是“必須的惡魔”。由于H2O2的重要功能,滴定,熒光測定,電化學(xué)方法等方法被用于開發(fā)新的H2O2檢測的策略。其中,電化學(xué)方法具有直接并且實(shí)時(shí)的檢測的優(yōu)點(diǎn),然而,傳統(tǒng)的電化學(xué)傳感方法很難提供細(xì)胞內(nèi)的空間信息及成像信息。一些對H2O2非常敏感的熒光分子也被用來作為細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外檢測的探針。但是這些熒光發(fā)色團(tuán)很容易被漂白,因此很難在生理環(huán)境中對H2O2含量的動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行長時(shí)間觀測。因此目前迫切需要一種靈敏、成像清晰、實(shí)時(shí)的檢測方法。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:
本發(fā)明針對現(xiàn)有檢測方案靈敏度、信噪比、成像方面存在的問題,提出利用利用單分子熒光顯微術(shù)結(jié)合核酶(DNAzyme)開發(fā)一種靈敏的檢測過氧化氫的方法。該方法可對檢測過程進(jìn)行實(shí)時(shí)成像追蹤,并可捕獲單個(gè)產(chǎn)物生成過程。
在本發(fā)明的技術(shù)方案中,采用核酶G-四聯(lián)體(G-quadruplex)固定在玻片上,追蹤其催化Amplex Red生成熒光產(chǎn)物試鹵靈的反應(yīng)進(jìn)行信號(hào)采集。
本發(fā)明的方法具體為:
一種基于單分子的檢測過氧化氫的方法,其特征在于,包括以下步驟:
(1)核酶結(jié)構(gòu)的生成
將一定比例的G-四聯(lián)體DNA與Cy 5、生物素雙修飾的固定鏈混合均勻,于95℃孵育10 min,緩慢降溫,使G-四聯(lián)體與固定鏈雜交并形成四聯(lián)體結(jié)構(gòu),得到復(fù)合物Ⅰ;
(2)核酶在玻片上固定
稀釋復(fù)合物Ⅰ至一定濃度后,與血晶素(hemin)以一定比例于25℃孵育一段時(shí)間,得到復(fù)合物Ⅱ;將復(fù)合物Ⅱ與鏈霉親和素修飾的玻片孵育一定時(shí)間后,緩沖液沖洗干凈過量復(fù)合物;
(3)利用單分子熒光顯微鏡追蹤監(jiān)測過程
在玻片上滴加100微升反應(yīng)液,反應(yīng)液包括一定濃度的過氧化氫及Amplex Red;采用單分子熒光顯微鏡實(shí)時(shí)觀測復(fù)合物Ⅱ催化無熒光Amplex Red 生成熒光產(chǎn)物試鹵靈(resorufin)的過程。
所采用的緩沖液為本領(lǐng)域常規(guī)緩沖溶液,優(yōu)選的緩沖溶為含有pH=7.4、100 mM K Cl、10 mM 磷酸鹽緩沖液。
所采用的G-四聯(lián)體DNA為本領(lǐng)域常規(guī)的G-四聯(lián)體DNA序列,優(yōu)選的為DNA序列表中序列;所采用的G-四聯(lián)體DNA與固定鏈的比例可以為本領(lǐng)域常規(guī)的比例,優(yōu)選的比例為1:1。
所采用的稀釋復(fù)合物Ⅰ濃度至10-11-10-9 M,優(yōu)選的濃度為5×10-11 M;所采用的復(fù)合物Ⅰ與血晶素孵育比例可以為本領(lǐng)域常規(guī)的比例,優(yōu)選的比例為2:1。
所采用的復(fù)合物Ⅰ與血晶素孵育時(shí)間可以為本領(lǐng)域常規(guī)的時(shí)間,優(yōu)選的時(shí)間為20 min。
所采用的鏈霉親和素修飾的蓋玻片步驟參考2008年5月29日發(fā)表在Nature Methods第5期第6卷第507-516頁的題為A practical guide to single-molecule FRET的論文Supporting Online Information中的S6所記載的修飾方法;所采用的復(fù)合物Ⅱ與鏈霉親和素修飾的蓋玻片的孵育時(shí)間可以為本領(lǐng)域常規(guī)的時(shí)間,優(yōu)選的時(shí)間為10 min。
所采用的所采用的單分子熒光顯微鏡為本領(lǐng)域常規(guī)顯微鏡,優(yōu)選的為全內(nèi)反射熒光顯微鏡。所述的單分子熒光顯微鏡成像參數(shù)可以為本領(lǐng)域常規(guī)的參數(shù),較佳的647、561 nm激光控制在5 %左右,較佳的曝光時(shí)間控制在30-50 ms;所述的單分子熒光顯微鏡成像條件可以為本領(lǐng)域常規(guī)的條件,較佳的成像溫度控制在20 ℃左右,所述成像的濕度控制在50 %以下。
所采用的Amplex Red 濃度范圍控制在100-200 nM,優(yōu)選的濃度為100 nM。
數(shù)據(jù)采集時(shí),首先利用Cy 5熒光分子確定復(fù)合物Ⅱ的位置,而生產(chǎn)的熒光產(chǎn)物在561 nm激光激發(fā),當(dāng)二者可以共定位時(shí),采集熒光產(chǎn)物隨時(shí)間變化的曲線。
最低可檢測到100 pM的H2O2。
所采用的鏈霉親和素修飾的蓋玻片步驟參考2008年5月29日發(fā)表在Nature Methods第5期第6卷第507-516頁的題為A practical guide to single-molecule FRET的論文Supporting Online Information中的S6所記載的修飾方法。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于利用單分子熒光顯微術(shù)高靈敏、高時(shí)間分辨率的特點(diǎn),可以對檢測過程實(shí)時(shí)觀測成像??傻玫絾蝹€(gè)檢測單元催化生成單個(gè)熒光產(chǎn)物的信息。
附圖說明
圖1為實(shí)施案例1所生成的產(chǎn)物的熒光顯微鏡成像圖。
圖2為實(shí)施案例1中單個(gè)復(fù)合物Ⅱ生成產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度隨時(shí)間變化的實(shí)時(shí)曲線。圖3為實(shí)施案例2中單個(gè)復(fù)合物Ⅱ生成產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度隨時(shí)間變化的實(shí)時(shí)曲線。
圖4為實(shí)施案例3中單個(gè)復(fù)合物Ⅱ生成產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度隨時(shí)間變化的實(shí)時(shí)曲線。
具體實(shí)施方式
以下通過具體的實(shí)施例對本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步描述。以下的實(shí)施例是對本發(fā)明的進(jìn)一步說明,而不限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1
鏈霉親和素修飾玻片:玻片依次放入10 % Alconox溶液、丙酮、piranha溶液(濃硫酸:30% H2O2=3:1)、1 M K OH溶液中超聲30 min后每一步超聲后需超純水洗凈,氮?dú)獯蹈?。火焰燈灼燒玻片(幾秒即可),以去除玻片上殘留的熒光有機(jī)分子。將玻片放入新鮮配置的含有1 % 硅烷化試劑(APTES)的無水乙醇溶液中,震蕩孵育1 hr,隨后玻片用乙醇徹底洗滌并用超純水沖洗,N2 吹干備用。0.2 mg 生物素修飾的聚乙二醇(biotin-PEG)及8 mg 聚乙二醇(mPEG)溶解于新鮮配置的0.1 M 碳酸氫納 (Na HCO3,pH 8.5)溶液中,隨后將混合液孵育在玻片上過夜(濕盒中)。將玻片用超純水徹底清洗,N2吹干。將0.2 mg/mL的連酶親和素滴加在生物素修飾的玻片上,在濕盒中孵育10 min后,用超純水徹底沖洗干凈,N2吹干待用。
將1 μM G-四聯(lián)體DNA與雙修飾的固定鏈DNA以1:1比例混合均勻,于95 ℃水浴10 min,緩慢降溫,使G-四聯(lián)體與固定鏈雜交并形成四聯(lián)體結(jié)構(gòu),得到復(fù)合物Ⅰ。
將50 μL復(fù)合物Ⅰ稀釋至100 pM,與50 pM血晶素(hemin)以2:1的比例混合均勻,25 ℃孵育20 min,得到復(fù)合物Ⅱ。鏈霉親和素修飾的玻片上貼上圍欄后,構(gòu)建樣品池,之將100 μL復(fù)合物Ⅱ滴加在樣品池中,25 ℃孵育10 min后(注意避光),緩沖液沖洗干凈過量復(fù)合物。
將玻片置于顯微鏡操作臺(tái)上,滴加100 μL反應(yīng)液(100 nM Amplex Red,1 μM H2O2),調(diào)整單分子熒光顯微鏡參數(shù),647、561 nm激光控制在5%左右,曝光時(shí)間控制在30 ms,實(shí)時(shí)觀測復(fù)合物Ⅱ催化無熒光Amplex Red 生成熒光產(chǎn)物試鹵靈(resorufin)的過程。
圖1為實(shí)施案例1所生成的產(chǎn)物的熒光顯微鏡成像圖。由圖中可得,當(dāng)含有H2O2的反應(yīng)液加入樣品池后,可觀測到原本干凈的界面上出現(xiàn)多個(gè)熒光亮點(diǎn),表明有產(chǎn)物生成。具體數(shù)據(jù)采集方法見發(fā)明內(nèi)容。圖2為實(shí)施案例1中單個(gè)復(fù)合物Ⅱ生成產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度隨時(shí)間變化的實(shí)時(shí)曲線。由圖中可得,在此條件下,單個(gè)復(fù)合物Ⅱ生成產(chǎn)物的平均速率為1.13 s-1。
實(shí)施例2
鏈霉親和素修飾玻片:玻片依次放入10 % Alconox溶液、丙酮、piranha溶液(濃硫酸:30% H2O2=3:1)、1 M K OH溶液中超聲30 min后每一步超聲后需超純水洗凈,氮?dú)獯蹈??;鹧鏌糇茻F◣酌爰纯桑?,以去除玻片上殘留的熒光有機(jī)分子。將玻片放入新鮮配置的含有1 % 硅烷化試劑(APTES)的無水乙醇溶液中,震蕩孵育1 hr,隨后玻片用乙醇徹底洗滌并用超純水沖洗,N2吹干備用。0.2 mg 生物素修飾的聚乙二醇(biotin-PEG)及8 mg 聚乙二醇(mPEG)溶解于新鮮配置的0.1 M 碳酸氫納 (Na HCO3,pH 8.5)溶液中,隨后將混合液孵育在玻片上過夜(濕盒中)。將玻片用超純水徹底清洗,N2吹干。將0.2 mg/mL的連酶親和素滴加在生物素修飾的玻片上,在濕盒中孵育10 min后,用超純水徹底沖洗干凈,N2吹干待用。
將1 μM G-四聯(lián)體DNA與雙修飾的固定鏈DNA以1:1比例混合均勻,于95 ℃水浴10 min,緩慢降溫,使G-四聯(lián)體與固定鏈雜交并形成四聯(lián)體結(jié)構(gòu),得到復(fù)合物Ⅰ。
將50 μL復(fù)合物Ⅰ稀釋至100 pM,與50 pM血晶素(hemin)以2:1的比例混合均勻,25 ℃孵育20 min,得到復(fù)合物Ⅱ。鏈霉親和素修飾的玻片上貼上圍欄后,構(gòu)建樣品池,之將100 μL復(fù)合物Ⅱ滴加在樣品池中,25 ℃孵育10 min后(注意避光),緩沖液沖洗干凈過量復(fù)合物。
將玻片置于顯微鏡操作臺(tái)上,滴加100 μL反應(yīng)液(100 nM Amplex Red,10 nM H2O2),調(diào)整單分子熒光顯微鏡參數(shù),647、561 nm激光控制在5%左右,曝光時(shí)間控制在30 ms,實(shí)時(shí)觀測復(fù)合物Ⅱ催化無熒光Amplex Red 生成熒光產(chǎn)物試鹵靈(resorufin)的過程。
圖2為實(shí)施案例1中單個(gè)復(fù)合物Ⅱ生成產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度隨時(shí)間變化的實(shí)時(shí)曲線。由圖中可得,在此條件下,單個(gè)復(fù)合物Ⅱ生成產(chǎn)物的平均速率為0.14 s-1。
實(shí)施例3
鏈霉親和素修飾玻片:玻片依次放入10 % Alconox溶液、丙酮、piranha溶液(濃硫酸:30% H2O2=3:1)、1 M K OH溶液中超聲30 min后每一步超聲后需超純水洗凈,氮?dú)獯蹈??;鹧鏌糇茻F◣酌爰纯桑匀コF蠚埩舻臒晒庥袡C(jī)分子。將玻片放入新鮮配置的含有1 % 硅烷化試劑(APTES)的無水乙醇溶液中,震蕩孵育1 hr,隨后玻片用乙醇徹底洗滌并用超純水沖洗,N2吹干備用。0.2 mg 生物素修飾的聚乙二醇(biotin-PEG)及8 mg 聚乙二醇(mPEG)溶解于新鮮配置的0.1 M 碳酸氫納 (Na HCO3,pH 8.5)溶液中,隨后將混合液孵育在玻片上過夜(濕盒中)。將玻片用超純水徹底清洗,N2吹干。將0.2 mg/mL的連酶親和素滴加在生物素修飾的玻片上,在濕盒中孵育10 min后,用超純水徹底沖洗干凈,N2吹干待用。
將1 μM G-四聯(lián)體DNA與雙修飾的固定鏈DNA以1:1比例混合均勻,于95℃水浴10 min,緩慢降溫,使G-四聯(lián)體與固定鏈雜交并形成四聯(lián)體結(jié)構(gòu),得到復(fù)合物Ⅰ。
將50 μL復(fù)合物Ⅰ稀釋至100 pM,與50 pM血晶素(hemin)以2:1的比例混合均勻,25 ℃孵育20 min,得到復(fù)合物Ⅱ。鏈霉親和素修飾的玻片上貼上圍欄后,構(gòu)建樣品池,之將100 μL復(fù)合物Ⅱ滴加在樣品池中,25 ℃孵育10 min后(注意避光),緩沖液沖洗干凈過量復(fù)合物。
將玻片置于顯微鏡操作臺(tái)上,滴加100 μL反應(yīng)液(100 nM Amplex Red,1 nM H2O2),調(diào)整單分子熒光顯微鏡參數(shù),647、561 nm激光控制在5%左右,曝光時(shí)間控制在30 ms,實(shí)時(shí)觀測復(fù)合物Ⅱ催化無熒光Amplex Red 生成熒光產(chǎn)物試鹵靈(resorufin)的過程。
圖2為實(shí)施案例1中單個(gè)復(fù)合物Ⅱ生成產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度隨時(shí)間變化的實(shí)時(shí)曲線。由圖中可得,在此條件下,單個(gè)復(fù)合物Ⅱ生成產(chǎn)物的平均速率為0.05 s-1。
<110> 上海納米技術(shù)及應(yīng)用國家工程研究中心有限公司
<120> 一種基于單分子的檢測過氧化氫的方法
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<221>misc feature
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<223>3'端生物素修飾,5'端cy 5修飾
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