專利名稱：酶促dna分子的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及核酸酶或催化活性(酶促)DNA分子，它們能夠切割其他核酸分子，尤其是RNA分子。本發(fā)明還涉及含有上述酶促DNA分子的組合物以及制備和使用所述酶和組合物的方法。
背景讓催化劑在它們的天然范圍之外仍能發(fā)揮活性或者使催化劑能催化非天然發(fā)生的反應(yīng)，這種需要導(dǎo)致“酶工程”技術(shù)的發(fā)展?！懊腹こ獭敝谐Ｓ玫姆椒ㄊ恰昂侠碓O(shè)計(jì)”方法，依靠對(duì)天然酶的理解來(lái)幫助構(gòu)建新酶。不幸的是，對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和化學(xué)領(lǐng)域的熟悉程度還不足以能夠設(shè)計(jì)出生產(chǎn)新生物催化劑的途徑。
近來(lái)，一種不同的方法已經(jīng)應(yīng)用于發(fā)展新催化劑。這種方法包括構(gòu)建一個(gè)異源的大分子庫(kù)并將體外篩選方法用于從庫(kù)中分離出能催化預(yù)期反應(yīng)的分子。從大分子庫(kù)中篩選催化劑不依賴對(duì)它們結(jié)構(gòu)和化學(xué)特性的全面了解。因此，該方法被戲稱為“無(wú)理設(shè)計(jì)”(Brenner et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，895381-5383，1992)。
迄今為止，在合理設(shè)計(jì)酶促活性RNA分子或核酶方面的大量努力還未設(shè)計(jì)出具有全新或催化功能得到根本改進(jìn)的分子。然而，通過(guò)一種我們稱為“引導(dǎo)的分子進(jìn)化”或“體外進(jìn)化”的方法把無(wú)理設(shè)計(jì)法投入應(yīng)用就帶來(lái)一種潛在的可能，即能夠生產(chǎn)出一種具有期望的功能性特征的分子，上述“引導(dǎo)的分子進(jìn)化”或“體外進(jìn)化”是仿效達(dá)爾文的自然進(jìn)化機(jī)制設(shè)計(jì)的。
這項(xiàng)技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用于溶液中的RNA分子(參考，例如，Mills et al，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，58217，1967；Green et al，Nature，347406，1990；Chowrira et al，Nature，354320，1991；Joyce，Gene，8283，1989；Beaudry et al，Science，257635-641，1992；Robertson et al，Nature，344467，1990)以及與吸附到一個(gè)固體載體上的配體結(jié)合的RNAs(Tuerk et al，Science，249505，1990；Ellington et al.Nature，346818，1990)，并獲得了不同程度的成功。另外，它還已經(jīng)應(yīng)用到被直接吸附到固體載體上的肽(Lam et al，Nature，35482，1991)；以及表達(dá)在病毒核衣殼蛋白中多肽表位(Scottet al，Science，249386，1990；Devlin et al，Science，249249，1990；Cwirla et al，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，876378，1990)。
從發(fā)現(xiàn)催化活性RNA(Kruger et al，Cell，31147-157，1982；Guerrier-Takada et al，Cell，35849-857，1983)至今已有十幾年。已知的天然生成的核酶的數(shù)目在不斷地增加((參見(jiàn)，RNA世界，Gesteland & Atkins(編著)，pp.239-269，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，NY(1993)；Pyle，Science，261709-714，1993；Symons，Curr.Opin.Struct.Biol.，4322-330，1994)，近年來(lái)，通過(guò)體外進(jìn)化方法得到的合成核酶使得該數(shù)目進(jìn)一步擴(kuò)增。(參見(jiàn)Joyce，Curr.Opin.Struct.Biol.，4331-336，1994；Breaker et al，Trends Biotech.，12268-275，1994；Chapman et al，Curr.Opin.Struct.Biol.，4618-622，1994)。
考慮到DNA含有許多與RNA相同的基團(tuán)，所以認(rèn)定DNA也具有酶促活性似乎是合理的。然而，除特定的病毒基因組和復(fù)制中間體外，即使排除了DNA采取復(fù)雜的二級(jí)及三級(jí)結(jié)構(gòu)，生物機(jī)體中幾乎所有DNA也都是以完整的雙鏈體存在的。因此，實(shí)際上還未發(fā)現(xiàn)DNA酶也就不足為奇了。
本發(fā)明出現(xiàn)之前，能夠切割核苷酸的催化活性DNA分子的設(shè)計(jì)、合成以及使用還未見(jiàn)公開(kāi)或報(bào)道。因此，此處公開(kāi)的發(fā)現(xiàn)和發(fā)明是十分重要的，因?yàn)樗鼈儚?qiáng)調(diào)了體外進(jìn)化作為效率日益提高的催化活性分子的一種設(shè)計(jì)手段的可能性，所述催化活性分子包括能切割其他核酸的酶促DNA分子，尤其是RNA。
發(fā)明概述本發(fā)明描述了一種能夠在特定切割位點(diǎn)切割底物核酸(NA)序列的合成或構(gòu)建的(即非天然生成的)催化活性(或酶促)DNA分子。本發(fā)明還提供了一種具有內(nèi)切核酸酶活性的酶促DNA分子。
一種優(yōu)選的催化活性DNA分子的內(nèi)切核酸酶活性，這種活性針對(duì)預(yù)先選定的底物核酸序列中被定義為切割位點(diǎn)的核苷酸序列具有特異性。該DNA分子具有第一和第二兩個(gè)底物結(jié)合區(qū)域，位于核心區(qū)域的兩側(cè)，其中所述的第一底物結(jié)合區(qū)域有一段序列與上述預(yù)先選定的底物核酸序列的第一部分互補(bǔ)，而所述第二底物結(jié)合區(qū)域有一段序列與上述預(yù)先選定的底物核酸序列的第二部分互補(bǔ)。核心區(qū)域有一段根據(jù)下列通式所述的序列(I.)T(莖)’AGC(莖)”Z，其中(莖)’和(莖)”都是具有以下特征的一種三聯(lián)核苷酸即當(dāng)(莖)’(莖)”雜交配對(duì)時(shí)形成的3個(gè)堿基對(duì)中至少包括2個(gè)GC對(duì)，其中Z＝WCGR或WCGAA，W＝A或T且R＝A或G。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，式I為SEQ ID NO 120(8-17)。
還提供了一種核心區(qū)域，其中含有一段下列通式代表的序列的(II.)RGGCTAGCXACAACGA(SEQ ID NO 122)，其中X＝T、C或A，R＝A或G。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，式I為SEQ ID NO121(10-23)。
在另一個(gè)實(shí)施例中，內(nèi)切核酸酶活性是針對(duì)底物核酸序列中被定義為切割位點(diǎn)的核苷酸序列的，該切割位點(diǎn)包括單鏈核酸的。在另一個(gè)優(yōu)選變化中，所述的切割位點(diǎn)是雙鏈核酸。同樣，底物核酸序列可能是單鏈、雙鏈、部分單鏈或部分雙鏈、成環(huán)或其任一組合。
在提供的另一個(gè)實(shí)施方案中，底物核酸序列包括一個(gè)或多個(gè)核苷類似物。在一個(gè)變化中，所述底物核酸序列是較大的分子的一部分或被吸附到較大分子上。
在各種實(shí)施方案中，這種較大的分子選自RNA、修飾后的RNA、DNA、修飾后的DNA、核苷酸類似物或其組合。在另一個(gè)實(shí)施例中，這種較大的分子包括由一種由核酸序列和非核酸序列形成的組合。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包括一個(gè)或多個(gè)核苷類似物的底物核酸序列。一個(gè)進(jìn)一步的變化中，提供的單鏈核酸包括RNA、DNA、修飾后的RNA、修飾后的DNA、一個(gè)或多個(gè)核苷類似物或其任一組合體。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，內(nèi)切核酸酶活性包括對(duì)切割位點(diǎn)上磷酸二酯鍵的水解切割。
在各種優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的催化活性DNA分子是全序列單鏈或部分單鏈。優(yōu)選地，這些催化活性DNA分子可以假定為各種與它們的催化活性相吻合的形狀。因此，在一個(gè)變化中，本發(fā)明的催化活性DNA分子包括一個(gè)或多個(gè)發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)。在另一個(gè)變化中，催化活性DNA分子可以假定為一個(gè)類似“錘頭”狀核酶的結(jié)構(gòu)。在另外的其他實(shí)施方案中，催化活性DNA分子可以假定為具有類似于嗜熱四膜蟲(chóng)核酶的構(gòu)象，例如源自I型內(nèi)含子的核酶。
類似地，無(wú)論底物分子的方向如何，本發(fā)明優(yōu)選的催化活性DNA分子都能表現(xiàn)出位點(diǎn)特異性的內(nèi)切核酸酶活性。因此，在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的酶促DNA分子能切割一個(gè)與該酶促分子分離的底物核酸序列——即未與該酶促DNA分子連接的底物核酸序列。在另—個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，酶促DNA分子能切割一個(gè)吸附的底物核酸序列——即它能完成一個(gè)類似于自身切割的反應(yīng)。
本發(fā)明還期望酶促DNA分子(催化活性DNA分子、脫氧核酶或DNAzyme)具有內(nèi)切核酸酶活性，由此該內(nèi)切核酸酶活性需要二價(jià)陽(yáng)離子的存在。在各種優(yōu)選的替代實(shí)施方案中，該二價(jià)陽(yáng)離子選自Pb2+、Mg2+、Mn2+、Zn2+、和Ca2+。另一個(gè)變化中，期望內(nèi)切核酸酶活性需要單價(jià)陽(yáng)離子的存在。在這種替代實(shí)施方案中，該單價(jià)陽(yáng)離子優(yōu)選Na+、K+。
在本發(fā)明的各種優(yōu)選實(shí)施例中，酶促DNA分子包括一段選自下列序列的核苷酸序列SEQ ID NO 3、SEQ ID NO 14、SEQ ID NO 15、SEQ IDNO 16、SEQ ID NO 17、SEQ ID NO 18、SEQ ID NO 19、SEQ ID NO 20、SEQ ID NO 21和SEQ ID NO 22。在其他優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的催化活性DNA分子包括一段選自下列序列的核苷酸序列SEQ ID NO 23、SEQ ID NO 24、SEQ ID NO 25、SEQ ID NO 26、SEQ ID NO 27、SEQ IDNO 28、SEQ ID NO 29、SEQ ID NO 30、SEQ ID NO 31、SEQ ID NO 32、SEQ ID NO 33、SEQ ID NO 34、SEQ ID NO 35、SEQ ID NO 36、SEQ IDNO 37、SEQ ID NO 38和SEQ ID NO 39。
另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案期望本發(fā)明的催化活性DNA分子包括一段選自SEQ ID NO 50和SEQ ID NO 51的核苷酸序列。另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的催化活性DNA分子包括一段選自SEQ ID NO 52～101的核苷酸序列。如此處公開(kāi)的一樣，本發(fā)明還提供了包含與本發(fā)明公開(kāi)序列基本相似的序列的催化活性DNA分子。因此，為了生成多種其他有用的酶促DNA分子，可以采用多種取代、缺失、插入、復(fù)制和其他突變方法來(lái)制備屬于公開(kāi)范圍內(nèi)的分子；只要所述分子表現(xiàn)出了此處描述的位點(diǎn)特異性的切割活性，那么它們就屬于本說(shuō)明書(shū)的范圍之內(nèi)。
在本發(fā)明的進(jìn)一步變化中，本發(fā)明的酶促DNA分子優(yōu)選具有約1μM或更小的底物結(jié)合親和力。另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的酶促DNA分子以小于約0.1μM的KD與底物結(jié)合。
本發(fā)明還公開(kāi)了具有有效轉(zhuǎn)換速度的酶促DNA分子。在一個(gè)實(shí)施方案，該轉(zhuǎn)換速度小于5hr-1；在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，該速度小于約2hr-1；在一個(gè)較優(yōu)選的實(shí)施方案中，該速度效率約1hr-1；在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，該轉(zhuǎn)換速度約0.6hr-1或更小。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的酶促DNA分子表現(xiàn)出有效的轉(zhuǎn)換速度，其中Kobs小于1min-1，優(yōu)選小于0.1min-1；較優(yōu)選小于0.01min-1；更優(yōu)選小于0.005min-1。在一個(gè)變化中，Kobs值約為0.002min-1或更小。
本發(fā)明還期望在實(shí)施方案中所公開(kāi)的DNA酶的催化速度得到充分的優(yōu)化。因此，在各種優(yōu)選實(shí)施方案中，因Mg2+存在而優(yōu)化的反應(yīng)的Km約為0.5～20mM，優(yōu)選約1～10mM，更優(yōu)選約2～5mM。
本發(fā)明還提供了這樣一個(gè)實(shí)施方案，其中定義為切割位點(diǎn)的核苷酸序列中包含至少1個(gè)核苷酸。在各種其他優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的催化活性DNA分子能識(shí)別和切割一段由2個(gè)或多個(gè)核苷酸組成的定義為切割位點(diǎn)的核苷酸序列。
在各種優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的酶促DNA分子包括一個(gè)保守的核心，以及位于核心兩側(cè)的一個(gè)或多個(gè)底物結(jié)合區(qū)域。在一個(gè)實(shí)施方案中，酶促DNA分子包括第一和第二兩個(gè)底物結(jié)合區(qū)域。在一個(gè)實(shí)施方案中，酶促DNA分子包括2個(gè)或多個(gè)底物結(jié)合區(qū)域。
如上所述，本發(fā)明優(yōu)選的催化活性DNA分子還可以包括一個(gè)保守的核心。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的保守核心包括1個(gè)或多個(gè)保守區(qū)域。在其他優(yōu)選的變化中，上述的保守區(qū)域包括一段選自下列序列的核苷酸序列CG；CGA；AGCG；AGCCG；CAGCGAT；CTTGTTT和CTTATTT(參見(jiàn)，例如圖3)。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的酶促DNA分子進(jìn)一步包括位于保守核心中保守區(qū)域之間的1個(gè)或多個(gè)可變或間隔核苷酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的酶促DNA分子進(jìn)一步包括位于保守核心和底物結(jié)合區(qū)域之間的1個(gè)或多個(gè)可變或間隔核苷酸。
在一個(gè)變化中，第一底物結(jié)合區(qū)域優(yōu)選包括一段選自下列序列的核苷酸序列CATCTCT；GCTCT；TTGCTTTTT；TGTCTTCTC；TTGCTGCT；GCCAGCTT(SEQ ID NO 40)；CTCTATTTCT(SEQ ID NO 41)；GTCGGCA；CATCTCTTC；及ACTTCT。在另一個(gè)優(yōu)選的變化中，第二底物結(jié)合區(qū)域包括一段選自下列序列的核苷酸序列TATGTGACGCTA(SEQ ID NO 42)；TATAGTCGTA(SEQ ID NO 43)；ATAGCGTATTA(SEQ ID NO 44)；ATAGTTACGTCAT(SEQ ID NO 45)；AATAGTGAAGTGTT(SEQ ID NO 46)；TATAGTGTA；ATAGTCGGT；ATAGGCCCGGT(SEQ ID NO 47)；AATAGTGAGGCTTG(SEQ ID NO 48)；及ATGNTG。
在本發(fā)明的各種實(shí)施方案中，底物結(jié)合區(qū)域的長(zhǎng)度是可變的。因此，例如，底物結(jié)合區(qū)域可以包括1個(gè)到多個(gè)核苷酸。然而，應(yīng)該理解的是，底物結(jié)合區(qū)域長(zhǎng)度約3～25個(gè)核苷酸，優(yōu)選約3～15個(gè)核苷酸，更優(yōu)選3～10個(gè)核苷酸，這些長(zhǎng)度的底物結(jié)合區(qū)域都是具體優(yōu)選的。在各種實(shí)施方案中，底物結(jié)合區(qū)域中的單個(gè)核苷酸與底物分子中的核苷酸之間能形成互補(bǔ)堿基對(duì)；在其他實(shí)施方案中，形成的是非互補(bǔ)堿基對(duì)?；パa(bǔ)堿基對(duì)和非互補(bǔ)堿基對(duì)的混合物也在本發(fā)明公開(kāi)的實(shí)施方案的范圍之內(nèi)。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的催化活性DNA分子可以進(jìn)一步包含一個(gè)第三底物結(jié)合區(qū)域。在一些優(yōu)選實(shí)施方案中，第三底物結(jié)合區(qū)域包括一段選自下列序列的核苷酸序列TGTT、TGTTA和TGTTAG。本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，酶促DNA分子進(jìn)一步包括位于1個(gè)或多個(gè)底物結(jié)合區(qū)域之間的可變或“間隔”區(qū)域。
在另一個(gè)公開(kāi)的實(shí)施方案中，本發(fā)明期望一個(gè)與其他DNA分子及寡核苷酸分離的、純化后的、合成酶促DNA分子，該酶促DNA分子具有內(nèi)切核酸酶活性，其中所述的內(nèi)切核酸酶活性針對(duì)底物序列中一段被定義為切割位點(diǎn)的核苷酸序列具有特異性，這段序列中包括有單鏈或雙鏈核酸。在一個(gè)變化中，公開(kāi)了一個(gè)具有內(nèi)切核酸酶活性的合成(或構(gòu)建)的酶促DNA分子，其中所述的內(nèi)切核酸酶活性針對(duì)底物核酸序列中一段被定義為切割位點(diǎn)的核苷酸序列具有特異性，這段序列基本上由單鏈區(qū)域或雙鏈區(qū)域組成。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種包括有催化活性的脫氧核糖核苷聚合物的酶促DNA分子，這種活性能水解含核酸底物產(chǎn)生底物切割產(chǎn)物。在一個(gè)變化中，水解反應(yīng)以點(diǎn)-特異性的方式發(fā)生。如上所述，該聚合物可以是單鏈、雙鏈或二者的某一組合。
本發(fā)明進(jìn)一步期望底物中包括一段核酸序列。在各種實(shí)施方案中，核酸序列底物包括RNA、修飾后的RNA、DNA、修飾后的DNA、1個(gè)或多個(gè)核苷類似物或其中任一個(gè)的組合體。一個(gè)實(shí)施方案期望底物包括一段單鏈節(jié)段；而另一個(gè)實(shí)施方案期望底物是雙鏈的。
本發(fā)明還期望一個(gè)包括脫氧核糖核苷聚合物的酶促DNA分子，該脫氧核糖核苷聚合物能水解含核酸的底物產(chǎn)生切割產(chǎn)物因而具有催化活性。在一個(gè)變化中，酶促DNA分子與底物之間具有有效的結(jié)合親和力，而對(duì)與切割產(chǎn)物之間卻缺乏有效的結(jié)合親和力。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明公開(kāi)了一種非天然生成的酶促DNA分子，其中包括一段定義為保守核心的核酸序列，保守核心的兩側(cè)排列著識(shí)別區(qū)、可變區(qū)和間隔區(qū)。因此，在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，該核酸序列定義為緊鄰或緊靠該分子的5’端的是第一可變區(qū)，從此開(kāi)始往3’端方向依次為第一識(shí)別區(qū)、第一間隔區(qū)、第一保守區(qū)、第二間隔區(qū)、第二保守區(qū)、第二識(shí)別區(qū)和第二可變區(qū)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，該核酸序列優(yōu)選定義為緊鄰或緊靠該分子的5’端的是第一可變區(qū)，從此開(kāi)始往3’端方向依次為，第一識(shí)別區(qū)、第一間隔區(qū)、第一保守區(qū)、第二間隔區(qū)、第二保守區(qū)、第二識(shí)別區(qū)、第二可變區(qū)和第三識(shí)別區(qū)。
在上述實(shí)施方案的一個(gè)變化中，該分子包括一個(gè)保守的核心區(qū)，其兩側(cè)是兩個(gè)底物結(jié)合區(qū)；在另一個(gè)變化中，保守的核心區(qū)包括1個(gè)或多個(gè)保守區(qū)域。在其他優(yōu)選的實(shí)施方案中，保守的核心區(qū)中進(jìn)一步包括1個(gè)或多個(gè)可變或間隔核苷酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的酶促DNA分子進(jìn)一步包括1個(gè)或多個(gè)間隔區(qū)。
本發(fā)明進(jìn)一步期望各種組合物。例如，其中包括一個(gè)上述公開(kāi)和此處期望的酶促DNA分子的組合物。在一個(gè)替代實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的組合物包括2個(gè)或多個(gè)上述的酶促分子，其中每個(gè)酶促分子各能切割一個(gè)底物中的不同的序列。在另一個(gè)變化中，組合物包括2個(gè)或多個(gè)上述的酶促分子，其中每個(gè)酶促分子都能識(shí)別一個(gè)不同的底物。在各種實(shí)施方案中，還優(yōu)選的是組合物中包括1個(gè)單價(jià)或二價(jià)陽(yáng)離子。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了生產(chǎn)、篩選和分離本發(fā)明的酶促DNA分子的方法。在一個(gè)變化中，一種篩選能在特定位點(diǎn)切割一段核酸序列(例如，RNA)的酶促分子的方法包括下列步驟(a)得到假定酶促DNA分子的一個(gè)群體——該序列是天然生成或合成的——而且優(yōu)選它們是單鏈DNA分子；(b)將含核苷酸的底物序列與上述DNA分子混合形成混合物；(c)在預(yù)定的條件下，保持混合物充足的一段時(shí)間，使得上述群體中的DNA分子能夠切割底物從而產(chǎn)生底物切割序列；(d)把上述群體中的DNA分子與底物序列和底物切割序列分開(kāi)；(e)從上述DNA分子的群體中分離出能在特定位點(diǎn)切割底物核酸序列(例如，RNA)的DNA分子。
在上述方法的一種進(jìn)一步的變化中，能在特定位點(diǎn)切割底物核酸序列的DNA分子用一種固定試劑標(biāo)記。在一個(gè)實(shí)施例中，該試劑包括生物素。
在上述方法的另一種變化中，從篩選一段序列開(kāi)始——例如，一段預(yù)定的“目標(biāo)”核酸序列——即希望能被為此而構(gòu)建的酶促DNA切割的序列。因此，在一個(gè)實(shí)施方案，通過(guò)把預(yù)選(預(yù)定)的“目標(biāo)”序列吸附或“標(biāo)記”到一段含有1段或多段隨機(jī)序列或節(jié)段的脫氧核糖核酸序列上，從而生成一定數(shù)目的能在特定位點(diǎn)切割底物核酸序列的DNA分子。在一個(gè)變化中，上述隨機(jī)序列長(zhǎng)約40個(gè)核苷酸；在另一個(gè)變化中，上述隨機(jī)序列長(zhǎng)約50個(gè)核苷酸。長(zhǎng)約1～40核苷酸、40～50核苷酸和50～100個(gè)核苷酸的隨機(jī)序列也在本發(fā)明所期望的范圍之內(nèi)。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，用于生產(chǎn)酶促DNA分子群體的核苷酸序列選自SEQ ID NO 4、23、50和51。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述“目標(biāo)”或“底物”核酸序列包括一段由1個(gè)或多個(gè)核糖核苷酸組成的序列——參見(jiàn)，例如，SEQ ID NO 4和SEQ ID NO 23的相應(yīng)部分，以及SEQID NO 49。本發(fā)明還期望，一個(gè)有用的“目標(biāo)”或“底物”核酸序列可以包括DNA、RNA或其組合。
本發(fā)明還期望上述方法，其中所述的分離步驟進(jìn)一步包括把標(biāo)記過(guò)的DNA分子暴露于一個(gè)其上連接有抗生物素蛋白的固體表面，從而使該標(biāo)記過(guò)的DNA分子吸附到該固體表面上。如上所述，底物可以是RNA、DNA、二者的組合或者一種包括核酸序列的分子。
本發(fā)明還期望一種在特定切割位點(diǎn)特異地切割底物核酸序列的方法，其中包括下列步驟(a)提供一種能在特定切割位點(diǎn)切割底物核酸序列的酶促DNA分子；以及(b)讓酶促DNA分子和底物核酸序列接觸從而導(dǎo)致在切割位點(diǎn)對(duì)核酸序列進(jìn)行特異性的切割。在一個(gè)變化中，所述的酶促DNA分子是非天然生成的(或合成的)DNA分子。在另一個(gè)變化中，所述的DNA分子是單鏈。
在上述方法的另一個(gè)變化中，所述底物包括一個(gè)核酸分子。在各種實(shí)施方案中，所述的底物核酸包括RNA、DNA、修飾后的DNA、1個(gè)或多個(gè)核苷酸類似物或其任一的組合體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述的特異性切割是由酶促DNA分子的內(nèi)切核酸酶活性引起的。反應(yīng)條件的改變——例如，pH值、溫度、陽(yáng)離子百分比、酶的百分比、底物百分比以及產(chǎn)物百分比的調(diào)整——也是此處所期望的。
本發(fā)明還提供了一種切割磷酸二酯鍵的方法，其中包括(a)將能在特定切割位點(diǎn)切割底物核酸序列的酶促DNA分子與含磷酸二酯鍵的底物混合形成反應(yīng)混合物；以及(b)在預(yù)定的條件下保持混合物，讓酶促DNA分子切割磷酸二酯鍵以導(dǎo)致底物的切割，從而產(chǎn)生一定數(shù)目的底物產(chǎn)物。在一個(gè)實(shí)施方案中，酶促DNA分子能以位點(diǎn)特異性的方式切割磷酸二酯鍵。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括(c)把上述產(chǎn)物與催化活性DNA分子分開(kāi)；以及(d)向酶促DNA分子補(bǔ)入底物形成新的反應(yīng)混合物。
本發(fā)明還提供了構(gòu)建能切割磷酸二酯鍵的酶促DNA分子的方法。一種典型的方法包括下列步驟(a)得到一個(gè)單鏈DNA分子的群體；(b)向上述群體中導(dǎo)入遺傳學(xué)的變化從而生成一個(gè)變異的群體；(c)從上述變異群體中篩選出符合預(yù)定篩選標(biāo)準(zhǔn)的個(gè)體；(d)把篩選出的個(gè)體和上述變異群體的其余部分分開(kāi)；以及(e)擴(kuò)增上述篩選出的個(gè)體。
附圖簡(jiǎn)述

圖1給出了用于分離能夠切割目標(biāo)RNA磷酸酯的DNAs的選擇擴(kuò)增方案。如圖所示，通過(guò)PCR擴(kuò)增含50個(gè)隨機(jī)核苷酸(在該分子頂部用“50N”標(biāo)示)的雙鏈DNA，使用的引物5’端經(jīng)過(guò)生物素化，3’末端以腺嘌呤核糖核苷酸(rA)結(jié)尾。(生物素標(biāo)記物用1個(gè)被圓圈包圍的字母“B”表示)利用Taq DNA聚合酶延伸這種引物，得到含單個(gè)嵌入核糖核苷酸的DNA產(chǎn)物。把得到雙鏈DNA固定到一種鏈霉親和素基質(zhì)上，用0.2N NaOH洗脫出未被生物素化的DNA鏈。用緩沖液將柱重新平衡后，用加有1mM PbOAc的同一溶液洗滌該柱。具有Pb2+依賴性自身切割性能的DNAs被從柱上釋放出來(lái)，收集洗脫液，用PCR擴(kuò)增。然后用PCR產(chǎn)物啟動(dòng)下面選擇性擴(kuò)增循環(huán)。
圖2中給出的是Pb2+存在的條件下，DNA起始庫(kù)(G0)以及第1輪到第5輪選擇(G1～G5)后得到的群體的自身切割活性。符號(hào)Pre代表含108個(gè)核苷酸的前體DNA(SEQ ID NO 4)；Clv代表含28個(gè)核苷酸的5，切割產(chǎn)物(SEQ ID NO 5)；M代表引物3a(SEQ ID NO 6)，其長(zhǎng)度相當(dāng)于5’切割產(chǎn)物。
圖3給出的是從5輪選擇后得到的群體中分離的單個(gè)突變體的序列對(duì)比。頂部給出的是固定的底物結(jié)構(gòu)域，其中含有一個(gè)目標(biāo)核糖腺苷酸，該目標(biāo)核糖腺苷酸在圖中用倒三角形標(biāo)出。用豎框框起來(lái)的部分是共同參與了推定的堿基配對(duì)相互作用的底物核苷酸。將與50個(gè)初始隨機(jī)核苷酸對(duì)應(yīng)的序列與底物結(jié)構(gòu)域進(jìn)行反向平行比較。所有這些突變體3’末端都是一個(gè)固定序列5’-CGGTAAGCTTGGCAC-3’(未標(biāo)出；SEQ ID NO 1)。在圖的左右兩邊指示出的是位于初始隨機(jī)區(qū)域中被推定與底物之間形成堿基對(duì)的核苷酸；每個(gè)顯示出的序列中被單獨(dú)框起來(lái)的部分是酶促DNA分子的推定堿基配對(duì)(或底物結(jié)合)結(jié)構(gòu)域。居中的兩個(gè)大框中給出的是保守區(qū)域。
圖4A和4B給出了一個(gè)分子間反應(yīng)中RNA磷酸酯的DNA-催化切割，該反應(yīng)以催化轉(zhuǎn)換開(kāi)始。圖4A是19聚體底物(3’-TCACTATrAGGAAGAGATGG-5’，SEQ ID NO 2)和38聚體DNA酶(5’-ACACATCTCTGAAGTAGCGCCGCCGTATAGTGACGCTA-3’，SEQ ID NO 3)之間形成的復(fù)合物的簡(jiǎn)圖。底物中包括單個(gè)腺嘌呤核糖核苷酸(”rA”，緊靠箭頭)，其兩側(cè)是脫氧核糖核苷酸。合成DNA酶是圖3中給出的最常發(fā)生的突變體的38核苷酸部分。位于推定催化結(jié)構(gòu)域中的高度保守核苷酸被“框了起來(lái)”。如圖所示，一個(gè)保守區(qū)域是“AGCG”，而另一個(gè)保守區(qū)域是“CG”(按5’-3’的方向閱讀)。
圖4B給出的是用于測(cè)定下列反應(yīng)的Km(負(fù)斜率)和Vmax(y軸截距)的Eadie-Hoftstee曲線在與體外選擇相同的條件下，DNA催化切割[5’-32P]標(biāo)記的底物。測(cè)定反應(yīng)的初始速度，該反應(yīng)中包括5nM DNA以及0.125μM、0.5μM、1μM、2μM或4μM底物。
圖5給出的是表現(xiàn)選擇的催化活性DNAs的4個(gè)家族的特異性內(nèi)切核糖核酸酶活性的聚丙烯酰胺凝膠照片。Pb2+依賴性家族分子的選擇以并排的方式重復(fù)出現(xiàn)作為對(duì)照(第1組)。第2組中，使用的陽(yáng)離子是Zn2+；第3組中，陽(yáng)離子為Mn2+；第4組中，陽(yáng)離子為Mg2+；凝膠上第5部分的位置處只有單獨(dú)的切割產(chǎn)物作為對(duì)照。
如圖所示，上述的4個(gè)組中每組都有3個(gè)泳道。在每組的3個(gè)泳道中，第1泳道顯示的是在不含金屬陽(yáng)離子條件下選擇的無(wú)活性群體，第2泳道顯示的是金屬陽(yáng)離子存在條件下觀察到的活性，第3泳道顯示的無(wú)活性的起始庫(kù)(GO)。
圖6A和6B分別提供的是一個(gè)“原始”催化活性DNA分子和用本發(fā)明公開(kāi)的選擇擴(kuò)增方法得到的幾個(gè)催化活性DNA分子中的一個(gè)的二級(jí)結(jié)構(gòu)的圖象。圖6A給出的是來(lái)自起始庫(kù)的示范分子，該分子表現(xiàn)出了SEQ IDNO 23代表的分子的總體構(gòu)象。如圖所示，各種互補(bǔ)核苷酸位于隨機(jī)區(qū)域(N40)的旁側(cè)。圖6B圖中顯示的是一個(gè)通過(guò)此處公開(kāi)的方法產(chǎn)生的Mg2+依賴性催化活性DNA分子(或“DNAzymes”)。圖6A和6B中，箭頭指示出的是底物核酸中核糖核苷酸的位置。
圖7給出的是基本上按照下面實(shí)施例5中描述的方法進(jìn)行10輪體外選擇擴(kuò)增的結(jié)果中的一部分。如圖所示，有兩個(gè)位點(diǎn)和兩個(gè)催化劑家族表現(xiàn)出對(duì)目標(biāo)序列的最有效的切割。切割條件基本上同圖7中的顯示，就是，10mM Mg2+、pH7.5和37℃；圖中顯示的是反應(yīng)進(jìn)行2小時(shí)后收集的數(shù)據(jù)。相對(duì)于代次數(shù)目(此處為0～10)繪制出切割率(％)。垂直柱表示的是能夠在指定位點(diǎn)切割底物中目標(biāo)序列的催化活性DNA分子的數(shù)目/普遍性(prevalence)，其中條紋柱顯示的是在G↓UAACUAGAGAU處的切割，空白(無(wú)陰影)柱顯示的是在GUAACUA↓GAGAU處的切割。
圖8給出的是本發(fā)明的兩個(gè)催化活性DNA分子——克隆8-17和10-23的核苷酸序列、切割位點(diǎn)以及轉(zhuǎn)換速度。反應(yīng)條件如圖所示，也就是，10mM Mg2+、pH7.5和37℃。左邊是鑒定為克隆8-17的DNAzyme，箭頭指示的是RNA底物的切割位點(diǎn)。底物序列(5’-GGAAAAAGUAACUAGAGAUGGAAG-3’)——與DNAzyme分離(即給出的是分子間切割)——如圖標(biāo)記。類似地，右邊顯示的是此處鑒定為克隆10-23的DNAzyme，箭頭指示的是RNA底物的切割位點(diǎn)。再次列出底物序列。酶8-17的轉(zhuǎn)換速度為約0.6hr-1；酶10-23的轉(zhuǎn)換速度為約1hr-1。圓點(diǎn)(·)表示的是非互補(bǔ)的配對(duì)，而豎線(|)表示的是互補(bǔ)配對(duì)。
圖9進(jìn)一步給出了本發(fā)明的兩個(gè)催化活性DNA分子——克隆8-17和10-23的核苷酸序列、切割位點(diǎn)和轉(zhuǎn)換速度。反應(yīng)條件如圖所示，也就是，10mM Mg2+、pH7.5和37℃。與圖8中相同，左邊給出的是鑒定為克隆8-17的DNAzyme，箭頭指示的是RNA底物的切割位點(diǎn)。底物序列(5’-GGAAAAAGUAACUAGAGAUGGAAG-3’)——與DNAzyme分離(即給出的是分子間切割)——如圖標(biāo)記。類似地，右邊顯示的是此處鑒定為克隆10-23的DNAzyme，箭頭指示的是RNA底物的切割位點(diǎn)。再次給出了底物序列。酶8-17的Kobs值為約0.002min-1；酶10-23的Kobs值為約0.01min-1。圓點(diǎn)(·)表示的是非互補(bǔ)的配對(duì)，而豎線(|)表示的是互補(bǔ)配對(duì)。
圖10是表示催化活性基序8-17和10-23組成的簡(jiǎn)圖。通過(guò)非特異的互補(bǔ)核苷酸(水平線)之間的互補(bǔ)性的Watson-Crick堿基對(duì)，DNA酶(下面的鏈)和RNA底物(上面的鏈)結(jié)合在一起。箭頭指示出的是切割發(fā)生的位置，其中R＝A或G，Y＝U或C。
圖11給出的是DNA酶10-23在多次轉(zhuǎn)換情況下的催化活性，具體描述見(jiàn)實(shí)施例6。用反應(yīng)起初10％的階段測(cè)定反應(yīng)初速度，其中使用的底物濃度是固定的(0.004nM)，底物濃度是變化的(0.02～4nM)。用體外轉(zhuǎn)錄制備與HIV-1gag/聚合酶mRNA對(duì)應(yīng)的17聚體RNA底物。反應(yīng)條件2mM MgCl2、150mM NaCl、pH7.5、37℃。給出了來(lái)自兩個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)，這些數(shù)據(jù)滿足Michaelis-Menten方程v＝kcat[E]/(Km+[S])。
圖12A和12B包括的兩個(gè)板面中給出了本發(fā)明的DNA酶中底物結(jié)合臂長(zhǎng)度變化的影響，具體描述見(jiàn)實(shí)施例6。如圖所示，對(duì)于第一和第二底物結(jié)合區(qū)域(臂)來(lái)說(shuō)，互補(bǔ)的底物結(jié)合區(qū)域的長(zhǎng)度范圍為4～13個(gè)核苷酸，測(cè)定催化活性并用kcat(min-1)和Km(納摩爾[nM])表示出來(lái)。
圖13給出了對(duì)DNA酶的核苷酸殘基進(jìn)行修飾的影響，具體描述見(jiàn)實(shí)施例6。37℃下將DNA溫育在含10％熱滅活后的胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，比較未經(jīng)修飾的DNA(空心圓)、倒轉(zhuǎn)的胸腺嘧啶(實(shí)心圓)、在每條臂上各有5個(gè)2’-O-甲基(空心正方形)、核心中含5個(gè)P＝S殘基(空心三角形)以及在每條臂上各有3個(gè)P＝S殘基(實(shí)心三角形)。
詳述A.定義如此處使用的一樣，“脫氧核酶”一詞用于描述一種具有酶功能的含DNA核酸。在本說(shuō)明書(shū)中，盡管具有內(nèi)切脫氧核糖核酸酶活性的脫氧核酶是特別優(yōu)選的，但是“脫氧核酶”一詞可以包括內(nèi)切核糖核酸酶和內(nèi)切脫氧核糖核酸酶。此處能夠和脫氧核酶互換使用的其他詞是“酶促DNA分子”、“DNAzyme”或“催化活性DNA分子”，無(wú)論這些分子是通過(guò)合成制備的或者是來(lái)自有機(jī)體或其他來(lái)源，它們都應(yīng)該被理解為包括其酶促活性部分。
“酶促分子”一詞還包括在底物結(jié)合區(qū)與特定寡核苷酸目標(biāo)或底物形成互補(bǔ)的DNA分子；這樣的分子還具有酶促活性，這種活性有助于特異地切割寡核苷酸底物。在另一種形式中闡明的，酶促分子能以分子間的方式切割寡核苷酸底物。這種互補(bǔ)特性能使酶促DNA分子與底物寡核苷酸充分地雜交，從而在底物上發(fā)生分子間的切割。盡管100％的互補(bǔ)是優(yōu)選的，但是75-100％的互補(bǔ)也是有效的，也是本發(fā)明所期望的。
替代地，本發(fā)明的酶促DNA分子可以描述為具有核酸酶或核糖核酸酶活性。此處這些詞都可以互換使用。
盡管根據(jù)本發(fā)明的酶促DNA分子是特別優(yōu)選的一類酶促活性分子，但是此處使用的“酶促核酸”一詞可以包括酶促RNA分子或酶促DNA分子、酶促RNA-DNA聚合體、及其具有酶促活性的部分或衍生物。
此處使用的“內(nèi)切脫氧核糖核酸酶”一詞是指一種能切割主要由DNA組成的底物的酶。此處使用的“內(nèi)切核糖核酸酶”一詞是指一種能切割主要由RNA組成的底物的酶。
盡管知道罕見(jiàn)的A、T、C和G(以及U)的類似物可能有時(shí)會(huì)參與堿基的配對(duì)，但是正如此處使用的那樣，“堿基對(duì)”(bp)一詞通常是用來(lái)描述腺嘌呤(A)和胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U)之間的配對(duì)，或者胞嘧啶(C)和鳥(niǎo)嘌呤(G)之間的配對(duì)。當(dāng)DNA或RNA采取雙鏈構(gòu)型時(shí)，通常配對(duì)的核苷酸在此也可以被稱為“互補(bǔ)堿基對(duì)”。
通?！盎パa(bǔ)核苷酸序列”是指，DNA或RNA的單鏈分子或節(jié)段中的一段核苷酸序列與另一條寡核苷酸單鏈的序列充分地互補(bǔ)從而通過(guò)氫鍵特異性地雜合在一起。
“核苷酸”通常是指DNA或RNA的單體單元，它由一個(gè)糖殘基(sugarmoiety)(戊糖)、一個(gè)磷酸基和一個(gè)含氮雜環(huán)堿基組成。堿基通過(guò)糖苷碳原子(戊糖的1’碳原子)與糖殘基連接在一起，堿基和糖的結(jié)合體稱為“核苷”。當(dāng)核苷中含有一個(gè)結(jié)合到戊糖的3’或5’位上的磷酸基時(shí)，該核苷就成為核苷酸。一段任意連接的核苷酸序列在此典型地稱為“堿基序列”或“核苷酸序列”，以及其他的同義詞，在此用一個(gè)通式來(lái)表示，除另有特別說(shuō)明外，該通式按照從左到右的方向，即習(xí)慣上的從5’端到3’端的方向。
“核苷酸類似物”通常是指結(jié)構(gòu)上有別于A、T、C、G或U但相似程度足以在核酸分子中替代這些常見(jiàn)核苷酸的嘌呤或嘧啶。在此使用，“核苷酸類似物”包括變化的堿基、不同的或“罕見(jiàn)”的糖(即除“常見(jiàn)”戊糖之外的的糖)，或二者的結(jié)合。下面C.部分中給出了一系列堿基改變了的典型類似物。
“寡核苷酸或多核苷酸”通常是指單鏈或雙鏈的核苷酸聚合體。在此使用，“寡核苷酸”及其同義詞包括所有的核酸。典型意義上，“寡核苷酸”是指一個(gè)由線型的核糖核酸鏈組成的核酸分子。確切的大小取決于許多的因素，接下來(lái)還取決于最終的使用條件，這一點(diǎn)是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。
在此使用的，“生理?xiàng)l件”是指模仿哺乳動(dòng)物體內(nèi)，特別是人體內(nèi)的條件建立的反應(yīng)條件。溫度、陽(yáng)離子的獲得程度以及pH范圍等變量的變化情況會(huì)在下面做更詳細(xì)地描述，“生理?xiàng)l件”通常包括35～40℃的溫度范圍，特別優(yōu)選37℃；7.0～8.0的pH范圍，特別優(yōu)選7.5；以及進(jìn)一步包括陽(yáng)離子的獲得程度，優(yōu)選二價(jià)陽(yáng)離子和/或單價(jià)陽(yáng)離子，濃度為約2～15mM的Mg2+以及0～1.0mM的Na+是特別優(yōu)選的。任選地，此處使用的“生理?xiàng)l件”可以包括游離的核苷輔因子的存在。如上所述，優(yōu)選的條件將在下面做更詳細(xì)地描述。
B.酶促DNA分子在各種實(shí)施方案中，本發(fā)明的酶促DNA分子中可能結(jié)合有包括添加、缺失或取代在內(nèi)的一種或多種修飾或突變。在替代的技術(shù)方案中，可以用產(chǎn)生隨機(jī)或特異突變或修飾的方法來(lái)產(chǎn)生這些突變或修飾。例如，這些突變可以是改變長(zhǎng)度，或改變核苷酸序列、環(huán)、間區(qū)或識(shí)別序列(或結(jié)構(gòu)域)。一個(gè)具有催化活性的酶促DNA分子中的一個(gè)或多個(gè)突變可以與第二個(gè)具有催化活性的酶促DNA分子中的突變結(jié)合從而產(chǎn)生一種把這兩個(gè)分子的突變都包括在內(nèi)的新的酶促DNA分子。
在其他的優(yōu)選實(shí)施方案中，可以利用為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的各種方法將隨機(jī)突變引入到本發(fā)明的酶促DNA分子中。例如，Cadwell等人在PCR方法及應(yīng)用，228-33，1992一書(shū)中描述的方法特別優(yōu)選用于本發(fā)明，下面的實(shí)施例中對(duì)其作了一些修改。(還參見(jiàn)Cadwell，et al，PCR方法及應(yīng)用，3(Suppl.)S136-S140，1994)根據(jù)這種修飾后的PCR方法，可以將隨機(jī)點(diǎn)突變導(dǎo)入克隆基因中。
例如，上述方法已經(jīng)用于誘變核酶的編碼基因，序列分析測(cè)定的結(jié)果表明每個(gè)位置上的突變機(jī)率為0.66％±0.13％(置信區(qū)間為95％)，并且在堿基取代的類型上未發(fā)現(xiàn)任何強(qiáng)偏嗜。這使得可以在本發(fā)明的酶促DNA分子的任一位置上導(dǎo)入隨機(jī)突變。
Joyce等人在Nucleic Acids Res.，17711-722，1989一文中公開(kāi)了另一種導(dǎo)入特定或隨機(jī)突變的方法。后面的這種方法包括切割雙鏈DNA中的模板(編碼)鏈，重構(gòu)該模板鏈的同時(shí)將誘變的寡核苷酸包括進(jìn)來(lái)，然后轉(zhuǎn)錄這種部分錯(cuò)配的模板。這使得通過(guò)在選定位置包括含有已知或隨機(jī)核苷酸的寡核苷酸，從而在所述分子中的任一位置上導(dǎo)入特定的或隨機(jī)的突變。
根據(jù)分子的類型和功能的不同，本發(fā)明的酶促DNA分子可以相應(yīng)地具有不同的長(zhǎng)度和折疊類型。例如，盡管為了避免因分子本身太長(zhǎng)或難以操作使其治療作用受到限制，而優(yōu)選長(zhǎng)度不超過(guò)250個(gè)核苷酸，但是酶促DNA分子可以長(zhǎng)約15～約400個(gè)或更多個(gè)核苷酸。在各種優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的酶促DNA分子至少長(zhǎng)約20個(gè)核苷酸，有效的分子長(zhǎng)度可能超過(guò)100個(gè)核苷酸，但優(yōu)選的分子的長(zhǎng)度通常不多于100個(gè)核苷酸。
在各種治療應(yīng)用中，本發(fā)明的酶促DNA分子包括脫氧核酶的酶促活性部分。在各種實(shí)施方案中，本發(fā)明的酶促DNA分子優(yōu)選包括不多于200個(gè)核苷酸。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明的脫氧核酶包括不超過(guò)100個(gè)核苷酸。還有其他優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的脫氧核酶的長(zhǎng)度為約20～75個(gè)核苷酸，更優(yōu)選約20～65個(gè)核苷酸。其他優(yōu)選的酶促DNA分子長(zhǎng)約10～50個(gè)核苷酸。
其他應(yīng)用中，酶促DNA分子可能采取與“錘頭”核酶類似的構(gòu)型。這種酶促DNA分子的長(zhǎng)度優(yōu)選不超過(guò)約75～100個(gè)核苷酸，特別優(yōu)選長(zhǎng)約20～50個(gè)核苷酸。
通常，如果一個(gè)人要合成一個(gè)用于本發(fā)明的分子，那么酶促核酸分子越長(zhǎng)，則合成的難度越大。本領(lǐng)域的技術(shù)人員當(dāng)然能體會(huì)到此類合成的限制。然而無(wú)論怎樣，這種更長(zhǎng)的分子仍然屬于本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
還應(yīng)該理解的是，本發(fā)明的酶促DNA分子可以包括脫氧核酶的酶促活性部分或者可以包括一種有一處或多處突變的脫氧核酶，例如，帶有一段或多段堿基配對(duì)序列，或者間隔區(qū)缺失或經(jīng)過(guò)修飾，只要這些缺失、添加或修飾不會(huì)反過(guò)來(lái)影響該分子的酶促活性。
典型地，本發(fā)明的酶促DNA分子的識(shí)別結(jié)構(gòu)域包括位于催化結(jié)構(gòu)域兩側(cè)的兩段核酸序列，并且典型地包含一段至少約3～約30個(gè)堿基的序列，優(yōu)選約6～約15個(gè)堿基，這些堿基能夠與底物核酸中的一段互補(bǔ)的堿基雜交，這就賦予了酶促DNA分子高度的序列特異性。通過(guò)眾所周知的方法對(duì)識(shí)別位點(diǎn)進(jìn)行修飾或突變可以改變酶促核酸分子的序列特異性。(見(jiàn)Joyce et al，Nucleic Acids Res.，17711-712，1989.)本發(fā)明的酶促核酸分子還包括具有變化了的識(shí)別位點(diǎn)或識(shí)別結(jié)構(gòu)域的分子。在各種實(shí)施方案中，這些變化了的識(shí)別結(jié)構(gòu)域賦予包括這種識(shí)別結(jié)構(gòu)域的酶促核酸分子獨(dú)一無(wú)二的序列特異性。識(shí)別結(jié)構(gòu)域中的確切核苷酸可以決定發(fā)生切割的堿基序列。底物核酸的切割發(fā)生在識(shí)別結(jié)構(gòu)域中。這種切割在底物切割序列上留下一個(gè)2’、3’或2’，3’-環(huán)狀磷酸基，在最初緊靠原始底物中底物切割序列3’端的核苷酸上留下一個(gè)5’羥基。通過(guò)改變出現(xiàn)在識(shí)別序列(內(nèi)部指導(dǎo)序列)中的堿基，可以將切割重新定向到一個(gè)所選擇的位點(diǎn)上。見(jiàn)Murphy et al，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，869218-9222，1989。
而且，加入多胺有助于促進(jìn)酶促DNA分子和它的底物之間的識(shí)別和結(jié)合。有效的多胺的實(shí)例包括亞精胺、腐胺或精胺。在具體實(shí)施方案中，亞精胺的有效濃度約為1mM，但是約0.1mM～約10mM濃度范圍也是有作用的。
在各種替代的實(shí)施方案中，本發(fā)明的酶促DNA分子具有增強(qiáng)了的或優(yōu)化了的切割核酸底物能力，優(yōu)選切割RNA底物的能力。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員理解的那樣，通常，酶催化反應(yīng)的速度隨底物和酶濃度的改變而改變，在高的底物或酶濃度時(shí)這種速度達(dá)到水平不再升高。把這些效應(yīng)考慮進(jìn)去，就可以用下列定義該反應(yīng)的術(shù)語(yǔ)來(lái)描述酶催化反應(yīng)動(dòng)力學(xué)。
在酶促DNA分子作用下，標(biāo)記過(guò)的RNA底物的量會(huì)發(fā)生變化，用這種切割反應(yīng)可以測(cè)定出本發(fā)明的酶促DNA分子的增強(qiáng)了的或優(yōu)化了的切割RNA底物的能力。通常用催化速度(kcat)與米氏常數(shù)(KM)的比值定義切割底物的能力。符號(hào)kcat代表當(dāng)?shù)孜镞_(dá)到一個(gè)飽和值的時(shí)候酶反應(yīng)的最大速度。KM表示當(dāng)酶反應(yīng)速度達(dá)到最大反應(yīng)速度一半時(shí)的底物濃度。
例如，本發(fā)明中KM和kcat值可以通過(guò)底物濃度[S]大于酶促DNA分子濃度[E]的實(shí)驗(yàn)來(lái)測(cè)定。對(duì)應(yīng)于一定底物濃度范圍的反應(yīng)初速度可以從初始的直線階段估算出來(lái)，該階段通常為反應(yīng)的前5％或更短部分。數(shù)據(jù)點(diǎn)通過(guò)最小二乘法都適合于下列方程給出的理論曲線v＝-KM(v0/[S]+Vmax)。因此，用反應(yīng)初速度v0和底物濃度[S]就能測(cè)定出kcat和KM。
在各種替代的實(shí)施方案中，本發(fā)明的酶促DNA分子具有增強(qiáng)了的或優(yōu)化了的切割核酸底物的能力，優(yōu)選切割RNA底物的能力。在優(yōu)選實(shí)施方案中，酶促DNA分子的增強(qiáng)了的或優(yōu)化了的切割RNA底物的能力表現(xiàn)出能使反應(yīng)速度比未經(jīng)催化的速度快10～109倍。在更優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的酶促DNA分子能夠以比原始反應(yīng)類型快約103～107倍的速度切割RNA底物。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，增強(qiáng)了的或優(yōu)化了的切割RNA底物的能力表現(xiàn)為反應(yīng)速度比原始反應(yīng)類型快104～106倍。本領(lǐng)域技術(shù)人員能體會(huì)到，酶促DNA分子的這種增強(qiáng)了的或優(yōu)化了的切割核酸底物的能力會(huì)隨著本發(fā)明體外進(jìn)化法中的篩選限制(selectionconstraints)的變化而變化。
下面實(shí)施例1～3中進(jìn)一步描述修飾本發(fā)明的脫氧核酶，其他酶促DNA分子以及核酸酶的各種優(yōu)選方法。
C.核苷酸類似物如上所述，此處使用的“核苷酸類似物”一詞通常是指結(jié)構(gòu)上有別于A、T、C、G或U但相似程度足以在核酸分子中替代這些“正常”核苷酸的嘌呤或嘧啶。如此處使用的那樣，“核苷酸類似物”包括改變了的堿基、不同的(或罕見(jiàn)的)糖、改變了的磷酸骨架或這些變體的任一組合。本發(fā)明中有用的核苷酸類似物的實(shí)例包括下表中列出的那些核苷酸類似物，列出的這些類似物中的大部分都屬于37CFR§1.822的條件下認(rèn)定的修飾后的堿基(在此引入作為參考)。
表1核苷酸類似物縮寫(xiě) 描述ac4c 4-乙酰胞苷chm5u5-(羧基羥基甲基)尿苷cm 2’-O-甲基胞苷cmnm5s2u 5-羧甲基氨甲基-2-硫尿苷d 二氫尿嘧啶核苷f(shuō)m 2’-O-甲基假尿嘧啶核苷galq β，D-半乳糖基queosinegm 2’-O-甲基鳥(niǎo)苷I 次黃嘌呤核苷i6aN6-異戊烯腺苷mla1-甲基腺苷mlf1-甲基假尿嘧啶核苷mlg1-甲基鳥(niǎo)苷ml11-甲基次黃嘌呤苷m22g 2，2-二甲基鳥(niǎo)苷m2a2-甲基腺苷m2g2-甲基鳥(niǎo)苷m3c3-甲基胞苷m5c5-甲基胞苷m6aN6-甲基腺苷m7g7-甲基鳥(niǎo)苷mam5u 5-甲基氨甲基尿苷mam5s2u5-甲氧基氨甲基-2-硫尿核苷manq β，D-甘露糖基甲基尿苷mcm5s2u5-甲氧基羧基甲基尿苷mo5u 5-甲氧基尿苷ms2i6a 2-甲硫基-N6-異戊烯腺苷ms2t6a N-((9-β-D-呋喃核糖基-2-甲硫嘌呤-6-基)氨甲?；?蘇氨酸mt6a N-((9-β-D-呋喃核糖基嘌呤-6-基)N-甲基-氨甲?；?蘇氨酸mv 尿苷-5-氧乙酸甲酯o5u尿苷-5-氧乙酸(v)osyw wybutoxosinep 假尿苷q queosines2c2-巰基胞苷s2t5-甲基-2-硫尿核苷s2u2-硫尿核苷s4u4-硫尿核苷t 5-甲基尿苷t6aN-((9-β-D-呋喃核糖基嘌呤-6-基)氨甲?；?蘇氨酸t(yī)m 2’-O-甲基-5-甲基尿苷um 2’-O-甲基尿苷yw wybutosinex 3-(3-氨基-3-羧丙基)尿苷，(acp3)uaraU β，D-阿拉伯糖基araT β，D-阿拉伯糖基其他有用的類似物包括公開(kāi)于國(guó)際申請(qǐng)WO92/20823中的類似物(該申請(qǐng)公開(kāi)的內(nèi)容在此引入作為參考)或者根據(jù)本發(fā)明公開(kāi)的方法制備的類似物。根據(jù)本發(fā)明公開(kāi)的內(nèi)容，DeMesmaeker et al，Angew.Chem.Iht.Ed.Engl.，33226-229，1994；DeMesmaeker et al，Synlett 733-736(Oct.1993)；Nielsen et al，Science，2541497-1500，1991；Idziak et al，和Tetrahedron Letters，345417-5420，1993這些文獻(xiàn)中描述的類似物也是有用的，上述公開(kāi)內(nèi)容在此引入作為參考。
D.構(gòu)建酶促DNA分子的方法本發(fā)明還提供了一種生產(chǎn)具有預(yù)定活性的核酸分子。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述核酸分子是一個(gè)酶促DNA分子。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述活性是一種催化活性。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了合成隨后能被“構(gòu)建”成催化特定或預(yù)定反應(yīng)的酶促DNA分子的方法。此處描述了合成制備酶促DNA分子的方法；見(jiàn)，例如，下面的實(shí)施例1～3。在其他實(shí)施方案中，可以將本發(fā)明的酶促DNA分子構(gòu)建成能結(jié)合小分子或配體的形式，例如結(jié)合三磷酸腺苷(ATP)的形式(參見(jiàn)Sassanfar等，Nature，364550-553，1993。)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明期望，一個(gè)酶促DNA分子群體經(jīng)誘變處理產(chǎn)生一個(gè)突變酶促DNA分子的不同群體(替代地可以將其稱為“脫氧核酶”或“DNAzymes”)。隨后，將具有預(yù)期特性的酶促DNA分子從群體中篩選并且/或者分離出來(lái)，然后對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)增。
替代地，可以通過(guò)改變酶促DNA分子識(shí)別結(jié)構(gòu)域的長(zhǎng)度來(lái)將突變導(dǎo)入酶促DNA分子中。酶促DNA分子的識(shí)別結(jié)構(gòu)域與底物核酸序列中的互補(bǔ)堿基序列有關(guān)。改變識(shí)別結(jié)構(gòu)域長(zhǎng)度的方法是本領(lǐng)域的已知方法，包括PCR，例如；下面實(shí)施例中進(jìn)一步描述了有用的技術(shù)。
改變酶促DNA分子識(shí)別結(jié)構(gòu)域的長(zhǎng)度可以對(duì)該酶促DNA分子的結(jié)合特異性產(chǎn)生預(yù)期的影響。例如，識(shí)別結(jié)構(gòu)域長(zhǎng)度的增加可以增強(qiáng)酶促DNA分子和底物中寡核苷酸的互補(bǔ)堿基序列之間的結(jié)合特異性，或者可以增強(qiáng)識(shí)別雜合底物中的特定序列的能力。另外，識(shí)別結(jié)構(gòu)域長(zhǎng)度的增加還可以增強(qiáng)該結(jié)構(gòu)域結(jié)合底物的親和力。在各種實(shí)施方案中，酶促DNA分子中的這些改變了的識(shí)別結(jié)構(gòu)域能夠增強(qiáng)該酶促DNA分子與其底物間結(jié)合的特異性和親和力。
近來(lái)，引起注意的是一些寡核苷酸能結(jié)合具有互補(bǔ)序列的寡核苷酸之外的分子。這些寡核苷酸通常被稱為“aptamers”。例如，Ellington等人描述的能結(jié)合各種有機(jī)顏料的RNA分子(Nature，346818-822，1990)，Bock等人描述的結(jié)合人凝血酶的單鏈DNA分子(Nature，355564-566，1992)。同樣，Jellinek等人描述了能夠結(jié)合堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的RNA配體(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，9011227-11231，1993)。因此，此處進(jìn)一步期望，用本發(fā)明公開(kāi)的方法可以構(gòu)建本發(fā)明的具有催化活性的DNA酶使其表現(xiàn)出與多種典型的與aptamers相關(guān)的性能。
因此，本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該理解，本發(fā)明的酶促DNA分子能夠在任何一段核苷酸序列上被改變，例如識(shí)別結(jié)構(gòu)域，通過(guò)此處公開(kāi)的包括PCR和3SR(自動(dòng)維持序列擴(kuò)增見(jiàn)下面實(shí)施例1)的各種方法。例如，用包括附加核苷酸的引物能夠在酶促DNA分子的5’端添加上附加的核苷酸。
通過(guò)使用定點(diǎn)誘變等方法，還可以更隨機(jī)的方式制備或構(gòu)建本發(fā)明的酶促DNA分子。例如，基本上可以按照Morinaga et al，Biotechnology，2636，1984，中描述的方法進(jìn)行定點(diǎn)誘變，該方法按照本發(fā)明的描述改進(jìn)后可以應(yīng)用于脫氧核酶。下面實(shí)施例中將進(jìn)一步描述用于構(gòu)建酶促DNA分子的方法。
在一個(gè)公開(kāi)的實(shí)施方案中，本發(fā)明的酶促DNA分子包括一個(gè)保守的核心及其兩側(cè)的兩個(gè)底物結(jié)合(或識(shí)別)結(jié)構(gòu)域或序列，這些結(jié)構(gòu)域或序列和底物之間通過(guò)堿基配對(duì)相互作用。在各種實(shí)施方案中，保守核心包括一個(gè)或多個(gè)保守結(jié)構(gòu)域或序列。在另一個(gè)變化中，酶促DNA分子進(jìn)一步包括位于參與堿基配對(duì)的區(qū)域(或序列)之間的“間隔”區(qū)(序列)。還有另一個(gè)變化中，保守核心被一個(gè)或多個(gè)保守程度小得多的可變或“間隔”核苷酸在各種間隔上“間斷”開(kāi)。
在各種實(shí)施方案中，酶促DNA分子的群體由至少兩種不同類型的脫氧核酶分子組成。例如，在一個(gè)變化中，這些分子具有不同的序列。在另一個(gè)變化中，這些脫氧核酶是一種具有一段能限定出識(shí)別結(jié)構(gòu)域的核酸序列的核酸分子，限定出的結(jié)構(gòu)域與該核苷酸序列5’末端相鄰或相靠。在各種替代方案中，本發(fā)明的酶促DNA分子進(jìn)一步包括一個(gè)或多個(gè)位于識(shí)別結(jié)構(gòu)域3’端的間隔區(qū)，一個(gè)或多個(gè)位于識(shí)別結(jié)構(gòu)域和/或間隔區(qū)3’端的環(huán)。在另一些變化中，本發(fā)明的脫氧核酶可以包括一個(gè)或多個(gè)能與同一分子的其他區(qū)域雜交的區(qū)域。本發(fā)明其他部分描述了根據(jù)本發(fā)明公開(kāi)的方法生產(chǎn)的具有其他特征的酶促DNA分子。
其他實(shí)施方案中，誘變條件包括將特定的或隨機(jī)的核苷酸替代物導(dǎo)入到酶促DNA分子中的條件。典型的誘變條件的實(shí)例包括在本說(shuō)明書(shū)中其他部分描述的條件以及Joyce et al，Nucl.Acids.Res.，17711-722，1989；Joyce，Gene，8283-87，1989；和Beaudry et al，Science，257635-41，1992這些文獻(xiàn)中描述的方法。
還有其他實(shí)施方案中，本發(fā)明的突變酶促核酸分子的變化群體中包括至少兩個(gè)核苷酸序列不完全相同的核酸分子。在其他變化中，然后根據(jù)完成預(yù)定活性的能力，將具有預(yù)定活性的酶促DNA分子或其他酶促核酸從上述的變化群體中篩選出來(lái)。在各種實(shí)施方案中，預(yù)定活性包括，但不限于，增強(qiáng)了的催化活性、減小了的KM、增強(qiáng)了的底物結(jié)合能力、改變了的底物特異性等。
可以被認(rèn)為是酶各方面性能的其他參數(shù)包括催化活性或催化能力、底物結(jié)合能力、酶轉(zhuǎn)換速度、酶對(duì)反饋機(jī)制的敏感性等。在某些情況下，底物特異性可以被當(dāng)作是酶性能的一個(gè)方面，具體地說(shuō)是，在酶能識(shí)別和結(jié)合兩個(gè)或多個(gè)競(jìng)爭(zhēng)性底物的情況下，其中的每個(gè)競(jìng)爭(zhēng)性底物都可以影響該酶與其他底物相互作用的性能。
此處使用的底物特異性可以指本發(fā)明的酶促核酸分子對(duì)一種具體底物的特異性，例如只包括核糖核苷酸的底物、只包括脫氧核糖核苷酸的底物或者二者的組合。底物分子也可以包括某些核苷酸類似物。在各種實(shí)施方案中，優(yōu)選地，本發(fā)明的酶促核酸分子可以結(jié)合到雜合或非雜合底物的特定區(qū)域上。
此處確定的術(shù)語(yǔ)或參數(shù)“底物特異性”也可以包括序列特異性；即本發(fā)明的酶促核酸分子可以“識(shí)別”和結(jié)合到一種具有一段特定核酸序列的核酸底物上。例如，如果本發(fā)明的酶促核酸分子的底物識(shí)別結(jié)構(gòu)域只結(jié)合具有一連串的一個(gè)或兩個(gè)核糖核苷酸(例如，rA)的底物分子，那么不識(shí)別或結(jié)合缺乏這些序列的核酸底物分子。
關(guān)于篩選的方法，在各種實(shí)施方案中，篩選包括任何一種用物理學(xué)手段從突變酶促核酸的變化群體中把具有預(yù)定活性的突變酶促核酸分離出來(lái)。通常，篩選包括根據(jù)大小進(jìn)行分離，根據(jù)有無(wú)催化活性進(jìn)行分離，或者通過(guò)突變核酸與另一種核酸、多肽或或其他溶解于溶液中或吸附在固體基質(zhì)上的分子的雜交來(lái)進(jìn)行分離。
在各種實(shí)施方案中，所述預(yù)定活性能將其本身的效力賦予具有這種活性的突變酶促核酸。例如，預(yù)定活性可以是酶促DNA分子活性，這種活性能使具有這種活性的突變酶促核酸與其底物通過(guò)共價(jià)鍵連接在一起。然后通過(guò)共價(jià)鍵的效力將該突變酶促核酸篩選出來(lái)。
其他實(shí)施方案中，篩選具有預(yù)定活性的突變酶促核酸包括突變酶促核酸的擴(kuò)增(見(jiàn)Joyce，Gene，8283-87，1989；Beaudry et al，Science，257635-41，1992)。實(shí)施例部分將描述對(duì)具有預(yù)定特性或活性的酶促核酸分子的篩選。
E.組合物本發(fā)明還提供了含有一種或多種類型或群體的本發(fā)明的酶促DNA分子的組合物；例如，不同類型或群體可以識(shí)別并切割不同的核苷酸序列。組合物可以進(jìn)一步包括一種含核糖核酸的底物。如此處討論的那樣，根據(jù)本發(fā)明組合物可以進(jìn)一步包括鉛離子、鎂離子或其他二價(jià)或單價(jià)陽(yáng)離子。
優(yōu)選地，酶促DNA分子的濃度為約0.05μM～約2μM。典型地，酶促DNA分子與底物之間的濃度比為約1∶5～約1∶50。更優(yōu)選地，酶促DNA分子存在于該組合物中的濃度為約0.1μM～約1μM。還有更優(yōu)選地，組合物中含酶促DNA分子的濃度為約0.1μM～約0.5μM。優(yōu)選地，組合物中底物濃度為約0.5μM～約1000μM。
本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解，含核酸底物有多種來(lái)源，其中包括自然發(fā)生和合成途徑。合適的底物來(lái)源包括，但不限于，各種病毒和反轉(zhuǎn)錄病毒，包括HIV-1、HIV-2、HTLV-I和HTLV-II。
其他合適的底物包括，但不限于，包含下列病毒的或由下列病毒產(chǎn)生的病毒劑和反轉(zhuǎn)錄病毒劑小RNA病毒、嗜肝病毒科病毒(例如，HBV、HCV)、乳頭瘤病毒(例如，HPV)、伽馬皰疹病毒科病毒(例如，EB病毒)、淋巴隱病毒(lymphocryptoviruses)、白血病病毒(例如，HTLV-I和HTLV-II)、黃病毒、披膜病毒、皰疹病毒(包括阿爾法皰疹病毒和貝塔皰疹病毒)、巨細(xì)胞病毒(CMV)、流感病毒以及引起免疫缺陷病和綜合征的病毒和反轉(zhuǎn)錄病毒(例如，HIV-1和HIV-2)。此外，合適的底物包括感染非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物和其他動(dòng)物的病毒或反轉(zhuǎn)錄病毒，所述病毒包括但不限于，猿免疫缺陷病毒、貓免疫缺陷病毒以及牛白血病病毒。
如上所述，鎂離子、鉛離子或另外合適的單價(jià)或二價(jià)陽(yáng)離子也可以約1～100mM的濃度范圍存在于組合物中。更優(yōu)選地，組合物中預(yù)定的離子濃度為約2mM～50mM，具體優(yōu)選的濃度為約5mM。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)理解，離子濃度只受下列兩種因素的限制離子來(lái)源(例如鎂離子)在水溶液中的溶解極限以及保證酶促DNA分子以活性構(gòu)型存在于該組合物中的愿望。
本發(fā)明還提供了包括本發(fā)明的酶促DNA分子、脫氧核糖核苷酸-核糖核苷酸雜合分子以及以上述濃度存在的鎂離子或鉛離子的組合物。如上所述，可以用其他單價(jià)或二價(jià)離子(例如，Ca2+)來(lái)取代鎂離子。
本發(fā)明還提供了含有本發(fā)明的酶促DNA分子、含核酸底物(例如，RNA)以及預(yù)定濃度大于1毫摩爾的離子，其中所述底物的長(zhǎng)度大于所述酶促DNA分子上的識(shí)別結(jié)構(gòu)域。
在一個(gè)變化中，組合物包括酶促DNA分子-底物復(fù)合物，其中酶促DNA分子與其底物之間的堿基對(duì)是連續(xù)的。在另一個(gè)實(shí)施方案中，酶促DNA分子與其底物之間的堿基對(duì)被一個(gè)或多個(gè)非互補(bǔ)性的堿基對(duì)間斷。在各種替代的實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物可以進(jìn)一步包括單價(jià)陽(yáng)離子、二價(jià)陽(yáng)離子或二者的組合。
在另一個(gè)變化中，本發(fā)明的酶促DNA分子在二價(jià)陽(yáng)離子存在或缺乏的條件下都能有效地發(fā)揮作用。在一個(gè)變化中，有二價(jià)陽(yáng)離子存在，包括Pb2+、Mg2+、Mn2+、Zn2+或ca2+。替代地，本發(fā)明的酶促DNA分子在單價(jià)陽(yáng)離子存在或缺乏的條件下都能有效地發(fā)揮作用。如此處公開(kāi)的那樣，可以預(yù)見(jiàn)濃度與此處公開(kāi)的Pb2+或Mg2+近似的單價(jià)或二價(jià)陽(yáng)離子都是有用的。
任選地，單價(jià)陽(yáng)離子還可以與二價(jià)陽(yáng)離子同時(shí)存在，或者作為二價(jià)陽(yáng)離子的“替換物”存在。例如，鈉(Na+)或鉀(K+)等單價(jià)陽(yáng)離子可以游離態(tài)離子或以NaCl或KCl等可解離化合物的形式存在。
在一個(gè)實(shí)施方案中，組合物中單價(jià)陽(yáng)離子的濃度為0～1.0M。在另一個(gè)實(shí)施方案中，單價(jià)陽(yáng)離子的濃度范圍為約0～200mM。在其他實(shí)施方案中，單價(jià)陽(yáng)離子的濃度范圍為約1～100mM。替代地，單價(jià)陽(yáng)離子濃度范圍為約2mM～50mM。還有其他的實(shí)施方案中，濃度范圍為約2mM～25mM。
F.使用酶促DNA分子的方法如此處描述的那樣，使用酶促DNA分子的方法覆蓋了現(xiàn)有的酶和/或反義寡聚核苷酸的本領(lǐng)域眾所周知的多種不同用途。正如上述討論的那樣，能切割連接相鄰核酸的鍵(例如，磷酸二酯鍵)的分子具有包括多種不同應(yīng)用的大量用途。例如，具有所公開(kāi)的性能、結(jié)構(gòu)和/或功能的酶促DNA分子可以用于藥用和醫(yī)用產(chǎn)品(例如，用于傷口清創(chuàng)術(shù)、血凝塊的溶解等)，以及家居用品(例如，洗滌劑、牙齒清潔用品、肉致嫩劑)。為了滅活體外和體內(nèi)的RNA等目標(biāo)核酸序列。本發(fā)明所公開(kāi)的化合物、組合物以及方法的工業(yè)用途也為本發(fā)明提供，并完全落在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
本發(fā)明還描述了用于切割任何單鏈、環(huán)狀、部分雙鏈或全長(zhǎng)雙鏈核酸的方法；這些方法中的多數(shù)都使用了本發(fā)明的新型酶促活性核酸分子。在各種實(shí)施方案中，底物的單鏈核酸節(jié)段或單鏈核酸部分包括DNA、修飾后的DNA、RNA、修飾后的RNA或其組合。優(yōu)選地，核酸底物只需在靠近底物切割序列處為單鏈形式以便本發(fā)明的酶促核酸分子能通過(guò)該酶識(shí)別序列雜交到底物切割序列上。
能被本發(fā)明方法切割的核酸底物可以是化學(xué)合成的或酶促產(chǎn)生的，或者它可以是從下列來(lái)源分離得到的噬菌體、病毒、包括動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞、酵母細(xì)胞和細(xì)菌細(xì)胞等在內(nèi)的原核細(xì)胞或者真核細(xì)胞?；瘜W(xué)合成的單鏈或雙鏈核酸可以從多種來(lái)源購(gòu)買獲得，包括但不限于，Research Genetics(Huntsville，AL)。
還可以根據(jù)廠商的提供的方法，利用應(yīng)用生物系統(tǒng)(Foster City，CA)寡核苷酸合成儀來(lái)合成RNA底物。單鏈?zhǔn)删w也是核酸底物的一種來(lái)源。(見(jiàn)Messing et al，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，743642～3646，1977，以及Yanisch-Perron et al，Gene，33103～119，1985)。含單鏈?zhǔn)删w的細(xì)菌細(xì)胞也是合適單鏈核酸底物的一種方便來(lái)源。
下列任一種RNA病毒提供都可以提供能被本發(fā)明的方法切割的單鏈RNA小RNA病毒、披膜病毒、正粘病毒、副粘病毒、彈狀病毒、冠狀病毒、沙粒病毒或反轉(zhuǎn)錄病毒等。如上所述，很多種原核細(xì)胞或真核細(xì)胞也可以是合適核酸底物的極好來(lái)源。
本發(fā)明的方法可以用于單鏈核酸或者環(huán)狀核酸或雙鏈核酸的單鏈部分，含有這些結(jié)構(gòu)的細(xì)胞包括真核細(xì)胞、原核細(xì)胞、植物細(xì)胞、動(dòng)物細(xì)胞、酵母細(xì)胞或細(xì)菌細(xì)胞。這些情況下，本發(fā)明的酶促核酸分子(例如，酶促DNA分子或脫氧核酶)可以發(fā)揮抗病毒劑或基因表達(dá)調(diào)節(jié)因子的作用。下面將進(jìn)一步描述本發(fā)明的酶促DNA分子在這些用途中的實(shí)例。
本發(fā)明的多數(shù)方法中，單鏈核酸的切割發(fā)生在預(yù)先選定的堿基序列的3’端。典型地，該預(yù)定的堿基序列或底物切割序列包括1～10個(gè)核苷酸。在其他優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的酶促DNA分子能識(shí)別切割位點(diǎn)上游或者上游及下游的核苷酸。在各種實(shí)施方案中，酶促DNA分子能識(shí)別切割位點(diǎn)上游的約2～10個(gè)核苷酸；在其他實(shí)施方案中，酶促DNA分子能識(shí)別識(shí)別位點(diǎn)上游的約2～10個(gè)核苷酸以及下游的約2～10個(gè)核苷酸。其他優(yōu)選實(shí)施方案提供了一種能識(shí)別長(zhǎng)度達(dá)到約30個(gè)核苷酸的核酸序列的酶促DNA分子，還更優(yōu)選長(zhǎng)度達(dá)到約20個(gè)核苷酸的核酸序列。
本發(fā)明公開(kāi)的方法通過(guò)改變酶促DNA分子識(shí)別結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列，能使切割發(fā)生在任意的核苷酸序列上。這使得選定位置不含限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)的單鏈核酸也可以被切割。
通過(guò)在合適切割位點(diǎn)處的點(diǎn)特異性水解，可以把本發(fā)明的酶促DNA分子同單鏈核酸底物的任一部分中分離開(kāi)，而底物仍保留有與這種酶促DNA分子結(jié)合的能力。把酶促DNA分子同底物(或“切割產(chǎn)物”)分離從而使得該酶促DNA分子能完成另外的切割反應(yīng)。
通常，在適合核酸切割的條件下，優(yōu)選在生理?xiàng)l件下，用有效量的本發(fā)明的酶促DNA分子處理核酸底物。如果核酸底物中包含DNA，那么切割條件可能包括以約2～10mM濃度存在的二價(jià)陽(yáng)離子。
酶促DNA分子的有效量為切割單鏈核酸中預(yù)定堿基序列所需的量。優(yōu)選地，酶促DNA分子以DNA分子與底物切割位點(diǎn)之間的摩爾比為1～20的量存在。在使用的具體核酸切割條件下，這個(gè)比例可以根據(jù)處理的長(zhǎng)度和具體酶促DNA分子的效率調(diào)整。
因此，在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，處理過(guò)程典型地包括混合，在水溶液中，把含RNA的底物和酶混合形成切割混合物，然后把形成的切割混合物在RNA切割條件下保持足夠長(zhǎng)一段時(shí)間使得能夠在RNA中的任一段預(yù)定的核苷酸序列上切割RNA底物。在各種的實(shí)施方案中，需要提供一種來(lái)源的離子——即單價(jià)或二價(jià)陽(yáng)離子或二者的組合。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，酶促DNA分子切割單鏈核酸所需的時(shí)間已經(jīng)被預(yù)先選定。時(shí)間的長(zhǎng)短為1分鐘到24小時(shí)，并可以根據(jù)反應(yīng)物濃度和反應(yīng)溫度改變。通常，這段時(shí)間為約10分鐘到2小時(shí)以使該酶促DNA分子可以在任意預(yù)定的核苷酸序列上切割單鏈核酸。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了核酸切割條件包括一種來(lái)源的濃度約2～100mM的二價(jià)陽(yáng)離子(例如，PbOAc)。典型地，核酸切割條件包括濃度為約2mM～10mM二價(jià)陽(yáng)離子，具體優(yōu)選濃度約5mM。
通過(guò)測(cè)定在給定的陽(yáng)離子濃度時(shí)被切割的單鏈核酸的量，能夠測(cè)定出核酸切割條件應(yīng)包括的最佳陽(yáng)離子濃度。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解，該最佳陽(yáng)離子濃度可以根據(jù)使用的具體酶促DNA分子改變。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了核酸切割包括一種約6.0～9.0的pH值。一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，pH值范圍為約pH6.5～pH8.0。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，pH值模擬生理?xiàng)l件，即pH值為約7.0～7.8，具體優(yōu)選pH值為約7.5。
本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的是，只要用于核酸切割的pH值能使酶促DNA分子保持活性構(gòu)型，本發(fā)明的方法可以在一個(gè)寬的pH范圍實(shí)施。通過(guò)在預(yù)定核苷酸序列切割單鏈核酸的能力，可以容易地檢測(cè)到具有活性構(gòu)型的酶促DNA分子。
在各種實(shí)施方案中，核酸切割條件還包括一個(gè)變化的溫度范圍。如上所述，盡管此處也提供了工業(yè)應(yīng)用的溫度范圍，但是特別優(yōu)選與生理?xiàng)l件一致的溫度范圍。在一個(gè)實(shí)施方案中，溫度范圍為約15℃～約60℃。另一個(gè)變化中，核酸切割條件包括約30℃～約56℃的濃度范圍。還有另一個(gè)變化中，核酸切割條件包括約35℃～約50℃的濃度范圍。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，核酸切割條件包括約37℃～約42℃的濃度范圍。與核酸切割條件一致的溫度范圍只受期望的切割速度和該具體溫度下該種具體酶促DNA分子的穩(wěn)定性的限制。
在各種方法中，本發(fā)明提供了包括多胺存在的核酸切割條件?？捎糜趯?shí)施本發(fā)明的多胺包括亞精胺、腐胺或精胺等。在一個(gè)變化中，多胺的濃度為約0.01mM～約10mM。在另一個(gè)變化中，多胺的濃度為約1mM～約10mM。核酸切割條件還可以包括以約2mM～約5mM存在的多胺。在各種優(yōu)選實(shí)施方案中，多胺是亞精胺。
G.載體本發(fā)明的特征還在于表達(dá)載體，其中包含位于該載體中編碼本發(fā)明的酶促DNA分子的一個(gè)核酸節(jié)段，優(yōu)選地存在方式為能使該酶促DNA分子在目標(biāo)細(xì)胞(例如，植物細(xì)胞或動(dòng)物細(xì)胞)中表達(dá)。
因此，通常，根據(jù)本發(fā)明的載體優(yōu)選包括質(zhì)粒、粘粒、噬菌粒、病毒或噬菌體載體。優(yōu)選，合適的載體包括單鏈DNA(ssDNA)——例如，環(huán)狀噬菌粒ssDNA。還應(yīng)該被理解到的是根據(jù)本發(fā)明有用的載體不需是環(huán)狀的。
在一個(gè)變化中，優(yōu)選地，在另外的酶促DNA分子編碼序列的兩側(cè)都提供核酸序列，該序列可以被第一酶促DNA分子識(shí)別。該間插序列或旁側(cè)序列優(yōu)選包括至少1個(gè)核苷酸；更優(yōu)選，間插序列或旁側(cè)序列長(zhǎng)度為約2～20個(gè)核苷酸，具體優(yōu)選長(zhǎng)度約5～10個(gè)核苷酸的序列。
根據(jù)本發(fā)明添加一個(gè)聚核苷酸尾，可用于保護(hù)酶促DNA分子的3’末端。這可以通過(guò)使用末端轉(zhuǎn)移酶結(jié)合一個(gè)多聚體序列來(lái)提供。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)載體包括兩個(gè)或多個(gè)酶促DNA分子。在一個(gè)實(shí)施方案中，第一酶促DNA分子有分子內(nèi)切割活性，能識(shí)別和切割核苷酸序列使其釋放出其他酶促DNA序列；即能夠從該載體中“釋放”出其他酶促DNA分子。例如，優(yōu)選構(gòu)建這樣一種載體以便當(dāng)?shù)谝幻复貲NA分子被表達(dá)時(shí)，該第一分子能切割編碼第二酶促DNA分子、第三酶促DNA分子、依此類推的另外核苷酸序列的旁側(cè)序列。假定說(shuō)，第一酶促DNA分子(即，“釋放”分子)能以分子內(nèi)的方式切割寡核苷酸序列，另外的(例如，第二、第三、等等)酶促DNA分子(即“被釋放”分子)不需要具備與“釋放”分子相同的特征。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，“被釋放”(即第二、第三、等等)酶促DNA分子能切割特定的RNA序列，第一(“釋放”)酶促DNA分子具有的核酸酶活性使得它能夠解放出那些“被釋放”分子。在另一個(gè)實(shí)施方案中，“被釋放”酶促DNA分子具有切割酰胺鍵活性，而第一(“釋放”)酶促DNA分子具有核酸酶活性。
替代地，第一酶促DNA分子可以與第二(及第三、第四等)酶促DNA分子分別用一個(gè)單獨(dú)的載體編碼，并具有分子間切割活性。如此處所述，第一酶促DNA分子可能是自身切割酶促DNA分子(例如，脫氧核酶)，第二酶促DNA分子可以是任一期望類型的酶促DNA分子。當(dāng)一個(gè)載體被用來(lái)表達(dá)來(lái)自這些核酸序列的DNA時(shí)，在合適的條件下該DNA能切割每個(gè)旁側(cè)區(qū)域，從而釋放出一個(gè)或多個(gè)拷貝的第二酶促DNA分子。如果需要，也可以將幾個(gè)不同的第二酶促DNA分子置于同一個(gè)細(xì)胞或攜載體中生產(chǎn)不同的脫氧核酶。還提供了，任一個(gè)或多個(gè)載體包括以“釋放”和“被釋放”酶促核酸分子的任一組合方式存在的一個(gè)或多個(gè)核酶或脫氧核酶，只要這種組合可以達(dá)到預(yù)期的結(jié)果釋放出能切割預(yù)定核酸序列的酶促核酸分子。
本發(fā)明還提供了分離和純化酶促DNA分子的方法。除了此處描述的方法以外，也可以采用本領(lǐng)域技術(shù)人員知道的各種純化方法(例如，使用HPLC的方法)和層析分離技術(shù)。參見(jiàn)，例如，公開(kāi)的國(guó)際申請(qǐng)WO93/23569中描述的方法，本申請(qǐng)的公開(kāi)的內(nèi)容在此引入作為參考。
應(yīng)該理解的是此處描述的實(shí)施方案的各種結(jié)合都被包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。從上述的描述、下面的實(shí)施例和權(quán)利要求書(shū)中可以清楚地得出本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點(diǎn)。
實(shí)施例下面實(shí)施例是用來(lái)說(shuō)明，而并非限制本發(fā)明的。
1.酶促DNA分子的體外進(jìn)化綜述體外的篩選和分離技術(shù)使得能夠在對(duì)新的催化劑的組成和結(jié)構(gòu)無(wú)任何先驗(yàn)的了解時(shí)就能夠分離到它們。用這些方法可以得到具有新的催化特性的RNA酶。例如，已經(jīng)從tRNAPhe分子的一個(gè)隨機(jī)庫(kù)中得出了在鉛離子存在的條件下具有自動(dòng)切割功能的核酶(Pan et al，Biochemistry，313887-3895，1992)。已經(jīng)分離到的第I類核酶突變體能切割DNA(Beaudry et al，Science，257635-641，1992)或者具有改變了的金屬離子依賴性(Lehman et al，Nature，361182-185，1993)。從一個(gè)隨機(jī)RNA序列庫(kù)開(kāi)始，已經(jīng)得到能催化一種聚合酶樣反應(yīng)的分子(Bartel et al，Science，2611411-1418，1993)。本實(shí)施例中，描述了體外進(jìn)化方法中通過(guò)改變選擇性的限制精煉被進(jìn)化的酶的特異催化性能。
達(dá)爾文進(jìn)化論要求重復(fù)操作3個(gè)過(guò)程(a)遺傳突變體的導(dǎo)入；(b)根據(jù)適應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)選擇個(gè)體；以及(c)擴(kuò)增被選擇的個(gè)體。這些過(guò)程都能夠在體外實(shí)現(xiàn)(Joyce，Gene，8283，1989)?；蛘T變可以通過(guò)化學(xué)修飾、隨機(jī)誘變寡脫氧核苷酸的引入、或聚合酶的不精確拷貝來(lái)實(shí)現(xiàn)。(參見(jiàn)Cadwell et al，PCR方法和應(yīng)用，228-33，1992；Cadwellet al，PCR方法和應(yīng)用，3(增補(bǔ))S136-S140，1994；Chu et al，Virology，98168，1979；Shortle et al，Meth.Enzymol.，100457，1983；Myerset al，Science，229242，1985；Matteucci et al，Nucleic AcidsRes.，113113，1983；Wells et al，Gene，34315，1985；Mcneilet al，Mol.Cell.Biol.，53545，1985；Hutchison et al，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，83710，1986；Derbyshire et al，Gene，46145，1986；Zakour et al，Nature，295708，1982；Lehtovaara etal，Protein Eng.，263，1988；Leung et al，Techique，111，1989；Zhouet al，Nucl.Acids Res.，196052，1991)。
這些基因產(chǎn)物可以被篩選，例如，通過(guò)其結(jié)合一個(gè)配體或完成一個(gè)化學(xué)反應(yīng)的能力來(lái)篩選。(見(jiàn)，例如，Joyce，id.，1989；Robertson etal，Nature，344467，1990；Tuerk et al，Science，249505，1990)。與這些基因產(chǎn)物對(duì)應(yīng)的基因可以通過(guò)交互引物(reciprocal primer)方法來(lái)擴(kuò)增，例如通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)。(見(jiàn)Saiki et al，Science，2301350-54，1985；Saiki et al，Science，239487-491，1988)。
替代地，可以用自動(dòng)維持序列復(fù)制(3SR)進(jìn)行核酸擴(kuò)增。(見(jiàn)Guatelli et al，proc.Natl.Acad.Sci USA，871874，1990，該文獻(xiàn)的內(nèi)容在此引入作為參考。)根據(jù)3SR方法，可以用以下3種反轉(zhuǎn)錄病毒不可缺少的酶在等溫條件下體外指數(shù)擴(kuò)增(復(fù)制)目標(biāo)核酸序列(1)反轉(zhuǎn)錄酶，(2)核糖核酸酶H，以及(3)DNA依賴性的RNA聚合酶。通過(guò)模擬反轉(zhuǎn)錄病毒利用cDNA中間體復(fù)制RNA的策略，該反應(yīng)積聚了初始目標(biāo)的cDNA拷貝和RNA拷貝。
總而言之，如果要使一種酶促DNA分子群體進(jìn)化，可以用一系列連續(xù)的反轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄反應(yīng)通過(guò)cDNA中間體復(fù)制RNA目標(biāo)序列。這種設(shè)計(jì)的關(guān)鍵因素有(a)寡聚核苷酸不但對(duì)目標(biāo)具有特異性，而且含有編碼T7RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)的5，突出端，因此得到的這些cDNAs是活性轉(zhuǎn)錄模板；(b)由于核糖核酸酶H對(duì)中間的RNA-DNA雜合體中的RNA模板的降解，因此可以完成cDNA兩條鏈的合成從而實(shí)現(xiàn)cDNA的合成；以及(c)反應(yīng)產(chǎn)物(cDNA和RNA)可以作為隨后步驟的模板，從而保證了指數(shù)復(fù)制。
如在這些實(shí)施例中公開(kāi)的那樣，如果涉及酶促DNA分子，這種設(shè)計(jì)的各種關(guān)鍵因素會(huì)有所不同。例如，(1)寡聚核苷酸對(duì)目標(biāo)具有特異性，并優(yōu)選以某種方式標(biāo)記過(guò)——例如，通過(guò)生物素化——所以得到的活性模板鏈容易識(shí)別；以及(2)優(yōu)選使用的體外篩選方法取決于最有利的釋放機(jī)制。
實(shí)現(xiàn)達(dá)爾文體外進(jìn)化的一個(gè)主要困難是需要將與基因組有關(guān)的突變和擴(kuò)增同與表型相關(guān)的篩選有機(jī)地結(jié)合在一起。在使用核酸酶時(shí)，該酶的基因型和表型都體現(xiàn)在同一分子中，從而簡(jiǎn)化了該任務(wù)。
A.促DNA分子的設(shè)計(jì)眾所周知，單鏈DNA能夠采取令人感興趣的三級(jí)結(jié)構(gòu)。例如，“tDNA”的結(jié)構(gòu)與相應(yīng)的tRNA的結(jié)構(gòu)非常相似。(參見(jiàn)Paquette et al，Eur.J.Biochem.，189259-265，1990)。而且，將錘頭核酶中的35個(gè)核糖核苷酸取代多達(dá)31個(gè)后，而仍能至少保持一些催化活性，這一點(diǎn)已經(jīng)能做到。(見(jiàn)Perreault et al，Nature，344565-567，1990；Williams et al，proc.Natl.Acad.Sci.USA，89918-921，1992；Yanget al，Biochemistry，315005-5009，1992)。
已經(jīng)將體外篩選技術(shù)應(yīng)用到隨機(jī)序列DNA的大型群體，使得與目標(biāo)配體以高度親和活力結(jié)合的特異性DNA“aptamer”能夠得以回收(Bocket al，Nature，355564-566，1992；Ellington et al Nature，355850-852，1992；Wyatt et al，Proc，Natl.Acad.Sci.USA，911356-1360，1994)。近來(lái)，有兩個(gè)組進(jìn)行了aptamer的第一NMR結(jié)構(gòu)測(cè)定，15mer DNA形成了一種G-四合體結(jié)構(gòu)，并能以高度親和力結(jié)合凝血酶蛋白(Wang et al，Biochemistry，321899-1904，1993；Macaya etal，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，903745-3749，1993)。X-射線晶體學(xué)分析確證了這些發(fā)現(xiàn)(Padmanabhan et al，J.Biol.Chem.，26817651-17654，1993)。
能夠以高度的親和力和特異性與底物分子結(jié)合是一種好的酶的必備條件。此外，酶還必須能利用本身的或輔因子中的位置恰當(dāng)?shù)?well-positioned)的官能團(tuán)加速一種特異性的化學(xué)轉(zhuǎn)化。而且，該酶還必須在反應(yīng)過(guò)程中保持不變，并能實(shí)現(xiàn)催化轉(zhuǎn)換。另外的一個(gè)要求是，酶應(yīng)該是一種含有多個(gè)亞單位的信息大分子，這些亞單位的特異性排列方式?jīng)Q定催化活性。雖然這些標(biāo)準(zhǔn)在語(yǔ)義背景和化學(xué)背景兩個(gè)方面都還存在著爭(zhēng)議，但是可以用它們來(lái)區(qū)分化學(xué)速度加快的現(xiàn)象，這些現(xiàn)象包括從單一溶劑的影響到限制底物擴(kuò)散時(shí)生物酶的作用。(Albery et al，Biochemistry，155631-5640，1976)。
如下面更詳細(xì)描述的那樣，我們努力發(fā)展了一種通用的方法，該方法能從隨機(jī)序列開(kāi)始，快速地獲得DNA催化劑和DNA酶。作為初始目標(biāo)，我們選擇了一種我們認(rèn)為DNA能夠很好完成的反應(yīng)在二價(jià)金屬輔因子的幫助下，水解切割RNA磷酸二酯鍵。這與被各種包括錘頭狀和發(fā)夾狀基元的自然生成的RNA酶催化的反應(yīng)相同。(見(jiàn)，例如，F(xiàn)orster et al，Cell，49211-220，1987；Uhlenbeck，Nature，328596-600，1987；Hampel et al，Biochemistry，284929-4933，1989)。
近來(lái)表明從tRNA分子的隨機(jī)文庫(kù)開(kāi)始，可以得到Pb2+依賴性核酶，這種酶在中性pH值條件下具有位點(diǎn)特異性磷酸酯酶活性(Pan et al，Biochemistry，313887-3895，1992；Pan et al，Nature，358560-563，1992)。這與酵母tRNAPhe的隨機(jī)自身切割反應(yīng)類似(Dirheimer et al，Biochemie，54127-144，1972)，這種隨機(jī)反應(yīng)取決于Pb2+在tRNA的特定位點(diǎn)上的配位作用。(見(jiàn)Rubin et al，J.Biomol.Struct.Dgn.，1639-646，1983Brown et al，Biochemistry，244785-4801，1985)。
如此處公開(kāi)的那樣，我們的目標(biāo)包括發(fā)展能在特定的RNA磷酸酯上實(shí)施Pb2+依賴性切割的DNAs，該磷酸酯最初存在于與這種DNA 5’末端相連的短的前導(dǎo)序列中，最后位于一個(gè)單獨(dú)的分子內(nèi)，該分子能被以具有快速催化反轉(zhuǎn)特點(diǎn)的分子間方式切割。如下面所述，這些目標(biāo)已成功實(shí)現(xiàn)。
關(guān)于DNA與目標(biāo)磷酸酯及周圍核苷酸間如何相互作用還沒(méi)有任何設(shè)想。從一個(gè)50聚體隨機(jī)序列的約1014的庫(kù)開(kāi)始，按常規(guī)方法進(jìn)行體外篩選。在4天內(nèi)進(jìn)行了5次篩選后，該群體整體上都獲得了切割目標(biāo)磷酸酯的能力，在1mM Pb2+存在的條件下該切割反應(yīng)的速度為約0.2min-1。這與同樣反應(yīng)條件下自發(fā)切割的速度相比快了約105倍。
從上述群體中分離出個(gè)體，測(cè)序，并分析其催化活性。根據(jù)這一信息，將反應(yīng)改造成分子間方式，然后將其簡(jiǎn)化使得19聚體的底物能夠被38聚體的DNA酶特異性地切割，該反應(yīng)在23℃、pH7.0以及1mM PbOAc的條件下以1min-1的轉(zhuǎn)換速度開(kāi)始。
B.體外篩選方案制造一個(gè)含約1014個(gè)單鏈DNA分子的初始文庫(kù)，其中所有的分子都含有一個(gè)5’端生物素組件，隨后依次是一個(gè)含有單個(gè)核糖核苷酸的固定結(jié)構(gòu)域、一個(gè)由50個(gè)隨機(jī)脫氧核糖核苷酸組成的強(qiáng)的催化結(jié)構(gòu)域，以及3’端的第二固定結(jié)構(gòu)域(圖1)。
從兩側(cè)帶有引物結(jié)合位點(diǎn)的由50個(gè)隨機(jī)核苷酸的組成的合成cDNA開(kāi)始，利用巢式PCR(聚合酶鏈反應(yīng))技術(shù)構(gòu)建上述文庫(kù)。該巢式PCR使用的合成寡脫氧核苷酸引物的5’端經(jīng)過(guò)生物素化，3’端帶有1個(gè)腺嘌呤核糖核苷酸。核糖核苷酸結(jié)尾的寡核苷酸能夠有效地引導(dǎo)PCR過(guò)程中的模板指導(dǎo)的延伸，這樣就生成了含有單個(gè)嵌入核糖核苷酸的延伸產(chǎn)物。
圖1給出了用于分離能夠切割目標(biāo)RNA磷酸酯的DNAs的選擇性擴(kuò)增方案。通過(guò)PCR擴(kuò)增含有50個(gè)隨機(jī)核苷酸的雙鏈DNA，其中使用的引物5’端經(jīng)過(guò)生物素化(例如，引物3——3a或3b)，3’末端以腺嘌呤核糖核苷酸(用符號(hào)“N”或“rA”代表，其中N和rA都代表腺嘌呤核糖核苷酸)結(jié)尾。把得到雙鏈DNA固定到一種鏈霉親和素基質(zhì)上，用0.2N NaOH洗脫出未被生物素化的DNA鏈。用緩沖液將柱重新平衡后，用加有1mM PbOAc的同一溶液洗滌該柱。具有Pb2+依賴性自身切割性能的DNAs被從柱上釋放出來(lái)，收集洗脫液，用PCR擴(kuò)增。然后用PCR產(chǎn)物啟動(dòng)下面選擇性擴(kuò)增循環(huán)。
讓PCR產(chǎn)物通過(guò)鏈霉親和素親和基質(zhì)，雙鏈DNA中的5’端生物素化的鏈發(fā)生非共價(jià)結(jié)合。用0.2N NaOH粗洗，移去未被生物素化的DNA鏈，23℃下用含有0.5M NaCl、0.5M KCl、50mM MgCl2和50mM HEPES(pH7.0)的緩沖液平衡結(jié)合鏈。接著，在同種緩沖液種加入1mM PbOAc，使得在目標(biāo)磷酸酯上發(fā)生Pb2+依賴性自身切割，從而從鏈霉親和素基質(zhì)中釋放出DNAs的一個(gè)亞單位。原則上，單個(gè)DNA可以通過(guò)各種方式促進(jìn)它自身釋放，例如，破壞生物素與鏈霉親和素之間的相互作用或者切斷一個(gè)脫氧核糖核苷酸連接。根據(jù)這種連接的相對(duì)不穩(wěn)定性，釋放機(jī)制最大可能采用的是切斷核糖核苷3’-O-P鍵，Pb2+依賴性水解切割使得釋放能夠以最快的速度地發(fā)生。然而，理論上講，體外選擇方法應(yīng)該采用最佳釋放機(jī)制，而且那些個(gè)體能最好地實(shí)施該機(jī)制。
把加入Pb2+時(shí)從基質(zhì)上釋放出的DNA分子收集在洗脫液中，乙醇沉淀濃縮，然后利用巢式PCR擴(kuò)增。在構(gòu)建分子的起始文庫(kù)時(shí)，第一次PCR使用的是位于隨機(jī)區(qū)域兩側(cè)的引物(引物1和2)，第二次擴(kuò)增時(shí)使用的是3’末端帶有一個(gè)核糖腺苷酸5’端生物素化引物(引物3b)，因此再次導(dǎo)入了目標(biāo)RNA磷酸酯。選擇性擴(kuò)增反應(yīng)全程需要3～4個(gè)小時(shí)。
該方法的每個(gè)循環(huán)中都通過(guò)下列3種途徑來(lái)純化這些分子第一，PCR擴(kuò)增后，用酚抽提兩次，用氯仿/異戊醇抽提一次，然后用乙醇沉淀；第二，將DNA結(jié)合到鏈霉親和素上后，在強(qiáng)變性條件下洗去所有未生物素化的分子；以及第三，加Pb2+洗脫后，用乙醇沉淀。由于沒(méi)有采用任何凝膠電泳純化步驟，因此沒(méi)有任何選擇壓力來(lái)把這些分子限制到一種特定長(zhǎng)度。
C.選擇催化活性DNA進(jìn)行連續(xù)5輪體外選擇，為了逐漸增強(qiáng)選擇的嚴(yán)格性，加入Pb2+后逐漸縮短反應(yīng)時(shí)間。在第1到第3輪中，反應(yīng)時(shí)間是1小時(shí)，在第4輪中，反應(yīng)時(shí)間是20分鐘，在第5輪中，是1分鐘。在與體外選擇過(guò)程相同的條件下，將單鏈DNAs的起始庫(kù)與每輪選擇后得到的分子群體同時(shí)進(jìn)行自身切割活性分析(圖2)。
為了進(jìn)行這種分析，用5’-32P代替5’生物素組件制備分子，這就使得對(duì)起始原料和5’切割產(chǎn)物二者都可以進(jìn)行檢測(cè)。溫育5分鐘后，初始庫(kù)(G0)或第1輪和第2輪選擇后得到的群體中都未檢測(cè)到任何活性。第3輪(G3)后得到的DNAs表現(xiàn)出一般水平的活性；這種水平穩(wěn)定增加，第5輪(G5)后得到的DNAs自身切割的比例達(dá)到大約50％。即使延長(zhǎng)溫育時(shí)間后，也只能在目標(biāo)磷酸酯上檢測(cè)到切割。
圖2給出的是DNA起始庫(kù)(G0)以及第1輪到第5輪選擇(G1～G5)后得到的群體的自身切割活性。反應(yīng)混合物包括50mM MgCl2、0.5M NaCl、0.5M KCl、和50mM HEPES(23℃下pH7.0)，以及3nM[5’-32P]標(biāo)記的DNA，在含或不含1mM PbOAc的條件下23℃溫育5分鐘。符號(hào)Pre代表含108個(gè)核苷酸的前體DNA(SEQ ID NO 4)；Clv代表含28個(gè)核苷酸的5’切割產(chǎn)物(SEQ ID NO 5)；M代表引物3a(SEQ ID NO 6)，其長(zhǎng)度相當(dāng)于5’切割產(chǎn)物。
顯示出的含28個(gè)核苷酸的5’切割產(chǎn)物優(yōu)選具有下列序列5’-GGGACGAATTCTAATACGACTCACTATN-3’，其中“N”代表位于3’末端帶有另外的2’，3’-環(huán)磷酸的腺苷核糖核苷酸(SEQ ID NO 5)。在替代實(shí)施方案中，“N”代表位于分子3’末端帶有另外的2’磷酸或3’磷酸的腺苷核糖核苷酸。
圖2中，“GO”一列中“Pre”條帶包括一種含108個(gè)核苷酸的前體DNAs樣品，其中每個(gè)分子中都包括50個(gè)隨機(jī)核苷酸。因此，任何給定的“Pre”樣品都含有各種前體DNAs，每個(gè)樣品都可能與前面和后面的樣品不同?！癎1到“G5”列的“Pre”中富集的催化活性的DNA分子逐漸增加，但是仍含有大量的不同的DNA序列(即在50個(gè)核苷酸的隨機(jī)結(jié)構(gòu)域上不同)。圖3給出了來(lái)自“G5 Pre”DNA的這些不同序列的一個(gè)樣品。
利用鳥(niǎo)槍法克隆技術(shù)從G5群體中分離出個(gè)體；然后從這些亞克隆中取20個(gè)，測(cè)定完整的核苷酸序列(見(jiàn)圖3)。(參見(jiàn)Cadwell et al，PCR方法和應(yīng)用，228-33，1992；Cadwell et al，PCR方法和應(yīng)用，3(增補(bǔ))S136-S140，1994)。在這20個(gè)序列中，有5個(gè)是獨(dú)一無(wú)二的，兩個(gè)只發(fā)生了兩次，1個(gè)發(fā)生了3次，以及1個(gè)發(fā)生了8次。在DNA的起始庫(kù)中已經(jīng)隨機(jī)合成的50個(gè)核苷酸的區(qū)域中，所有這些單個(gè)的突變體都具有共同的序列單元。它們都含有兩個(gè)假定的模板結(jié)構(gòu)域，一個(gè)與緊靠切割位點(diǎn)上游的一些核苷酸互補(bǔ)，另一個(gè)與下游的至少4個(gè)核苷酸互補(bǔ)。在這兩個(gè)假定的模板結(jié)構(gòu)域之間有一個(gè)含1～11個(gè)核苷酸的可變結(jié)構(gòu)域，接下來(lái)是固定序列5’-AGCG-3’，然后是含3～8個(gè)核苷酸的第二可變結(jié)構(gòu)域，最后是固定序列5’-CG-3’或5’-CGA-3’。位于這兩個(gè)假定結(jié)構(gòu)域之外的核苷酸在序列和長(zhǎng)度兩個(gè)方面都是高度可變的。在所有被測(cè)序的克隆中，與50個(gè)初始-隨機(jī)核苷酸對(duì)應(yīng)的區(qū)域仍然保持著50個(gè)核苷酸的總長(zhǎng)度。
圖3給出的是從5輪選擇后得到的群體中分離的單個(gè)突變體的序列對(duì)比。頂部給出的是固定的底物結(jié)構(gòu)域 (5’-GGGACGAATTCTAATACGACTCACTATrAGGAAGAGATGGCGAC-3’，或5’-GGGACGAATTCTAATACGACTCACTATNGGAAGAGATGGCGAC-3’，其中N代表腺苷核糖核苷酸)(SEQ ID NO 13)。其中帶有一個(gè)用倒三角形標(biāo)出的目標(biāo)核糖腺苷酸。用豎框框起來(lái)的部分是共同參與了推定的堿基配對(duì)相互作用的底物核苷酸。將與50個(gè)初始隨機(jī)核苷酸對(duì)應(yīng)的序列與底物結(jié)構(gòu)域進(jìn)行反向平行比較。所有這些突變體3’末端都是一個(gè)固定序列5’-CGGTAAGCTTGGCAC-3’(SEQ ID NO 1)(“引物位點(diǎn)”；未顯示)。圖的左右兩邊指示出的是位于初始隨機(jī)區(qū)域中被推定與底物之間形成堿基對(duì)的核苷酸；每個(gè)顯示出的序列中被單獨(dú)框起來(lái)的部分是酶促DNA分子的推定堿基配對(duì)(或底物結(jié)合)結(jié)構(gòu)域。兩個(gè)框型柱中顯示的是推定催化結(jié)構(gòu)域中的高度保守核苷酸。
當(dāng)預(yù)見(jiàn)到另外的資料會(huì)有助于構(gòu)建催化結(jié)構(gòu)域的一種有意義的二級(jí)結(jié)構(gòu)模型時(shí)，我們注意到，如同錘頭核酶和發(fā)夾核酶一樣，我們的酶促DNA分子的催化結(jié)構(gòu)域似乎也包含一個(gè)兩側(cè)各夾有一個(gè)底物結(jié)合區(qū)域的保守核心，這些底物結(jié)合區(qū)域與底物之間通過(guò)堿基對(duì)相互作用。與錘頭核酶和發(fā)夾核酶類似，催化活性DNAs似乎也需要一小段不配對(duì)的底物核苷酸——這種情況下是5’-CGA-3’——位于兩個(gè)參與堿基配對(duì)的區(qū)域之間。
另一個(gè)有趣的現(xiàn)象是，注意到這9個(gè)不同的突變體表現(xiàn)出的與底物間假定互補(bǔ)形式都各不相同。一些個(gè)體中，堿基對(duì)是連續(xù)的，而另一些中堿基對(duì)被一個(gè)或多個(gè)非互補(bǔ)對(duì)間斷。通常趨勢(shì)是，與切割位點(diǎn)上游核苷酸之間的相互作用比同下游核苷酸之間的相互作用比更緊密。關(guān)于結(jié)合的研究和定點(diǎn)誘變分析應(yīng)該能使我們能夠更深入理解并進(jìn)一步證實(shí)這種推測(cè)。
為了獲得對(duì)催化功能所需序列的進(jìn)一步了解，對(duì)上述9個(gè)突變體中的6個(gè)進(jìn)行自身切割活性測(cè)試，并在本發(fā)明公開(kāi)的選擇條件下進(jìn)化(見(jiàn)圖3)。不出所料，這20種亞克隆中的8個(gè)中出現(xiàn)的序列被證明是最有活性的，一級(jí)速度穩(wěn)定在1.4min-1。在自身切割測(cè)試中，所有這些受測(cè)的突變體都顯示出活性，都產(chǎn)生了與切割目標(biāo)RNA磷酸酯對(duì)應(yīng)的單鏈5’端標(biāo)記產(chǎn)物。
在不同的反應(yīng)條件下，對(duì)優(yōu)勢(shì)亞克隆做進(jìn)一步分析。它的自身切割活性是Pb2+依賴性的，但是如果從反應(yīng)混合物中省去Mg2+該活性不受影響。還需要一種單價(jià)陽(yáng)離子，可以用Na+和K+來(lái)滿足。在0～1.0M(r＝0.988)濃度范圍內(nèi)，反應(yīng)速度隨著單價(jià)陽(yáng)離子濃度的增加呈線性增加。下面過(guò)程中將進(jìn)一步評(píng)估其他可以影響反應(yīng)的變化因素，例如pH、溫度以及其他二價(jià)金屬陽(yáng)離子。
2.材料和方法A.寡核糖核苷酸和寡核糖核苷酸類似物合成的DNAs以及DNA類似物購(gòu)自操縱子技術(shù)公司(OperonTechnology)。19個(gè)核苷酸的底物5’-pTCACTATrAGGAAGAGATGG-3’(或5’-pTCACTATNGGAAGAGATGG-3’，其中N代表腺苷核糖核苷酸)(SEQ ID NO7)是按照以前公開(kāi)的方法(Breaker et al，Biochemistry，3311980-11986，1994)，用5’-CCATCTCTTCCTATAGTGAGTCCGGCTGCA-3’作為模板，通過(guò)反轉(zhuǎn)錄酶催化5’-pTCACTATrA-3’(或5’-pTCACTATN-3’，其中N代表腺苷核糖核苷酸)(SEQ ID NO 8)的延伸獲得的。引物3，5’-GGGACGAATTCTAATACGACTCACTATrA-3’(或5’-GGGACGAATTCTAATACGACTCACTATN-3’，其中N代表腺苷核糖核苷酸)(SEQ ID NO 6)用[γ-32P]ATP和T4聚核苷酸激酶進(jìn)行5’-端標(biāo)記(引物3a)或者用[γ-S]ATP和T4聚核苷酸激酶進(jìn)行5’末端硫代磷?；缓笥肗-碘乙?；?N’-生物素酰己烯二胺(biotinylhexylenediamine)生物素化(引物3b)。
B.DNA庫(kù)的制備用下列合成引物通過(guò)PCR擴(kuò)增制備DNA的起始庫(kù)5’-GTGCCAAGCTTACCG-N50-GTCGCCATCTCTTCC-3’(SEQ ID NO 4)，其中N為G、A、T和C的等摩爾混合物。把含有隨機(jī)寡聚體500pM、引物1(5’-GTGCCAAGCTTACCG-3’，SEQ ID NO 10)1000pM、引物2(5’-CTGCAGAATTCTAATACGACTCACTATAGGAAGAGATGGCGAC-3’，SEQ ID NO 11)500pM、引物3b 500pM、[α-32P]ATP10 Ci以及Taq DNA聚合酶0.2Uμl-1的PCR反應(yīng)物2ml加入到50mM KCl、1.5mM MgCl2、10mM Tris-HCl(23℃下pH8.3)、0.01％白明膠以及每種dNTP各0.2mM中，92℃溫育1min，50℃溫育1min，72℃溫育2min，然后在下列條件下進(jìn)行5個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增92℃、1min，50℃、1min，72℃溫育1min。擴(kuò)增得到的產(chǎn)物用酚抽提兩次，氯仿/異戊醇抽提一次，然后用乙醇沉淀分離DNA。
C.體外選擇將上述DNA的起始庫(kù)重懸在500μL的緩沖液A(1M NaCl和50mMHEPES(23℃下pH7.0))中，并反復(fù)通過(guò)鏈霉親和素柱(AffiniTip Strep20，Genosys，The Woodlands，TX)。用體積為100μL的緩沖液A洗滌5次，接著用體積為100μL的0.2N NaOH洗滌5次，然后用體積為100μL的緩沖液B(0.5M NaCl、0.5MKCl、50mM MgCl2和50mM HEPES(23℃下pH7.0))平衡5次。在1小時(shí)內(nèi)，用加有1mM PbOAc的緩沖液B20μL洗脫被固定的單鏈DNA 3次。固定和洗脫的全過(guò)程均在23℃下完成。把洗脫成分收集在等體積的緩沖液C(50mM HEPES(23℃下pH7.0)和80mMEDTA)中，用乙醇沉淀DNA。
PCR擴(kuò)增以上得到的DNA，100μL的反應(yīng)混合物中含有20pM引物1、20pM引物2、Taq DNA聚合酶0.05Uμl-1、50mM KCl、1.5mM MgCl2、10mM Tris-HCl(23℃下pH8.3)、0.01％白明膠以及每種dNTP各0.2mM，在下列條件下擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)92℃、10sec，50℃、30sec，72℃、30sec。反應(yīng)產(chǎn)物用酚抽提兩次，氯仿/異戊醇抽提一次，然后用乙醇沉淀回收DNA。取上面擴(kuò)增的DNA約4pM加入到第二輪、巢式PCR的100μL反應(yīng)物中，該反應(yīng)物中含有引物1100pM、引物3b 100pM、[α-32P]ATP20μCi、Taq DNA聚合酶0.1Uμl-1，將總體積200μL反應(yīng)混合物在下列條件下擴(kuò)增10個(gè)循環(huán)92℃、1min，50℃、1min，72℃溫育1min。再一次抽提和沉淀PCR產(chǎn)物，將得到的DNA重懸于50μL的緩沖液A中，然后用其開(kāi)始下一輪的選擇。
除了第3輪結(jié)束時(shí)巢式PCR的反應(yīng)體積為100μL外，按照上述方法進(jìn)行第2輪和第3輪的擴(kuò)增。在第4輪中，加入Pb2+后將洗脫時(shí)間縮短到20min(2個(gè)20μL的洗脫體積)，只將回收到的DNA的一半用于第一次PCR，第一次PCR只進(jìn)行15個(gè)溫度循環(huán)。在第5輪的過(guò)程中，洗脫時(shí)間縮短到1min(2個(gè)20μL的洗脫體積)，只將回收到的DNA的1/4用于第一次PCR，第一次PCR進(jìn)行15個(gè)溫度循環(huán)。按照上述方法(Tsang etal，Biochemistry，335966-5973，1994)，將第5輪選擇后得到的DNA進(jìn)行亞克隆和測(cè)序。
D.催化活性DNAs的動(dòng)力學(xué)分析在上述條件下，用5’-32P標(biāo)記物在25μL的反應(yīng)混合物中通過(guò)不對(duì)稱PCR制備DNA群體和各種亞克隆個(gè)體，該反應(yīng)混合物中含有引物3a 10pmol、加入的DNA 0.5pM以及Taq DNA聚合酶0.1Uμl-1，在下列條件下擴(kuò)增10個(gè)循環(huán)92℃、1min，50℃、1min，72℃溫育1min。將得到的[5’-32P]標(biāo)記的擴(kuò)增產(chǎn)物在10％聚丙烯酰胺/8M凝膠上電泳純化。
將DNA置于緩沖液B中溫育10min后，進(jìn)行自身切割分析。通過(guò)加入終濃度為1mM的PbOAc來(lái)啟動(dòng)反應(yīng)，通過(guò)加入等體積的緩沖液C終止反應(yīng)。用10％聚丙烯酰胺/8M凝膠電泳分離反應(yīng)產(chǎn)物。多次-轉(zhuǎn)換情況的動(dòng)力學(xué)分析在緩沖液B中進(jìn)行，為了防止物質(zhì)吸附到管壁上在該緩沖液中加入了50μg mL-1的BSA。將底物和酶分子分別置于不含Pb2+的緩沖液中預(yù)溫育5min，然后合并，加入終濃度為1mM的PbOAc啟動(dòng)反應(yīng)。
3.能夠完成分子間切割的脫氧核酶的進(jìn)化A.轉(zhuǎn)變成分子間方式由于突變體的催化結(jié)構(gòu)域和底物結(jié)構(gòu)域之間推定的堿基配對(duì)相互作用是可變的，所以覺(jué)得將DNA催化的反應(yīng)轉(zhuǎn)變成分子間方式應(yīng)該是相當(dāng)簡(jiǎn)單的。在這種情況下，我們希望簡(jiǎn)化催化劑的底物結(jié)合區(qū)域，以便使其中的每個(gè)都能與底物之間形成連續(xù)的7～8個(gè)堿基對(duì)。此外，我們希望提供一種最小的底物，將該底物限制到含兩個(gè)堿基配對(duì)區(qū)域和插入序列5’-GGA-3’(圖4A)。
圖4A和4B給出了一個(gè)分子間反應(yīng)中RNA磷酸酯的DNA-催化切割，該反應(yīng)以催化轉(zhuǎn)換開(kāi)始。圖4A是19聚體底物和38聚體DNA酶之間形成的復(fù)合物的簡(jiǎn)圖。底物中包括單個(gè)腺嘌呤核糖核苷酸(“rA”或“N”，緊靠箭頭)，其兩側(cè)是脫氧核糖核苷酸。合成DNA酶是圖3中給出的最常發(fā)生的突變體的38核苷酸部分。位于推定催化結(jié)構(gòu)域中的高度保守核苷酸被“框了起來(lái)”。如圖所示，一個(gè)保守區(qū)域是“AGCG”，而另一個(gè)保守區(qū)域是“CG”(按5’-3’的方向閱讀)。
圖4B給出的是用于測(cè)定下列反應(yīng)的Km(負(fù)斜率)和Vmax(y軸截距)的Eadie-Hoftstee曲線在與體外選擇相同的條件下，DNA催化切割[5’-32P]標(biāo)記的底物。測(cè)定反應(yīng)的初始速度，該反應(yīng)中包括5nM DNA以及0.125μM、0.5μM、1μM、2μM或4μM底物。
在設(shè)計(jì)催化結(jié)構(gòu)域時(shí)，我們主要根據(jù)最有活性突變體的組成，在突變體的5’端截去2個(gè)核苷酸，3’端截去11個(gè)核苷酸。位于兩個(gè)模板區(qū)域之間的15個(gè)核苷酸保持不變，在3’端模板區(qū)域中插入一個(gè)核苷酸形成能與底物之間堿基配對(duì)的一連串核苷酸。將底物簡(jiǎn)化成下列序列5’-TCACTATrA·GGAAGAGATGG-3’(或5’-TCACTATN·GGAAGAGATGG-3’，其中“N”代表腺苷核糖核苷酸)(SEQ ID NO 12)，其中下劃線部分的核苷酸是參與同催化活性DNA分子堿基配對(duì)的兩個(gè)區(qū)域。
在簡(jiǎn)化反應(yīng)系統(tǒng)中，使用全部由脫氧核糖核苷酸組成的38聚體催化活性DNA分子(催化劑)和包括一個(gè)其余全部DNA序列中插入單個(gè)核糖核苷酸的19聚體底物，這種簡(jiǎn)化的反應(yīng)系統(tǒng)可以使高效的DNA-催化磷酸酯切割能迅速轉(zhuǎn)換，該反應(yīng)系統(tǒng)。在0.01μM催化劑和1μM底物存在的條件下溫育90分鐘后，46％的底物被切割，與催化劑的46次轉(zhuǎn)換相對(duì)應(yīng)。對(duì)該反應(yīng)進(jìn)行預(yù)先的動(dòng)力學(xué)分析，在多次轉(zhuǎn)換的條件下評(píng)估。DNA催化劑表現(xiàn)出Michaelis-Menten動(dòng)力學(xué)特性，kcat和Km值分別為1min～1和2μM(見(jiàn)圖4B)。Km值明顯地大于基于watson-crick相互作用而預(yù)想的催化劑和底物之間的解離常數(shù)。在同樣的反應(yīng)條件下溫育底物(但不含催化劑)；得到的kuncat值為4×10-6min-1。這與在0.5mM Pb2+、pH7.0、37℃條件下水解更不穩(wěn)定的1-硝基苯酚-1，2-丙二醇的報(bào)道數(shù)值5×10-3min-1(Breslow et al，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，884080-4083，1991)一致。
現(xiàn)在，可以進(jìn)行下述假定核糖核苷2’-羥基攻擊鄰近磷酸，通過(guò)這種水解機(jī)制啟動(dòng)磷酸酯切割反應(yīng)，產(chǎn)生帶有2‘(3’)-環(huán)磷酸末端的5’端產(chǎn)物以及末端為5’-羥基的3’端產(chǎn)物。支持這個(gè)機(jī)制的是，3’切割產(chǎn)物可以用T4寡聚核苷激酶和[γ-32P]ATP有效地磷酸化，這一點(diǎn)和自由的5’-羥基的可獲得法相一致。
B.討論5輪體外選擇后，得到能夠催化目標(biāo)RNA磷酸酯的高效Pb2+依賴性切割反應(yīng)的單鏈DNA分子的群體。根據(jù)這種群體中分離到的代表性個(gè)體的共同特征，構(gòu)建了催化劑以及底物的簡(jiǎn)化型式，生成了分子間快速催化轉(zhuǎn)換的一種示范。因此，上述38聚體催化結(jié)構(gòu)域提供了DNA酶或者被稱為“脫氧核酶”的一個(gè)實(shí)例。
一種信息大分子，它能夠促進(jìn)以快速轉(zhuǎn)換起始并遵從Michaelis-Menten動(dòng)力學(xué)的反應(yīng)中的化學(xué)轉(zhuǎn)化，基于這種事實(shí)可以把這種分子稱為酶，但這可能不能滿足每個(gè)人關(guān)于什么是酶的見(jiàn)解。有人可能根據(jù)定義堅(jiān)持酶必須是一種多肽。但是，如果接受RNA酶這個(gè)概念，然后接受類似的關(guān)于DNA酶的觀點(diǎn)似乎就是順理成章的。如果考慮我們能以多快的速度地從隨機(jī)序列DNAs庫(kù)中生產(chǎn)出這種分子，我們預(yù)料在不遠(yuǎn)的將來(lái)會(huì)有許多其他的合成DNA分子的實(shí)例出現(xiàn)。
RNA磷酸酯的Pb2+依賴性切割簡(jiǎn)化了配合的Pb2+-羥基的確切定位的要求，從而促進(jìn)與切割位點(diǎn)鄰接的2’羥基的去質(zhì)子化，由于RNA磷酸酯的Pb2+依賴性切割是這樣一種簡(jiǎn)單的反應(yīng)，所以選擇它作為研究DNA催化的初始目標(biāo)。(見(jiàn)Pan et al，in The RNA World，Gesteland & Atkins(eds.)，pp.271-302，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，NY(1993)。)眾所周知，Pb2+配合于嘌呤的N7位、鳥(niǎo)嘌呤的O6位、尿嘧啶的O4位和胞嘧啶的N3位(Brown et al，Nature，303543～546，1993)。因此，與RNA在糖組成和構(gòu)象兩方面的差異看來(lái)并不可能阻止DNA形成定義明確的Pb2+-結(jié)合口袋。
選擇在其余全部DNA序列中含有單個(gè)核糖核苷酸的底物是由于它提供了一個(gè)用于切割的獨(dú)一無(wú)二的優(yōu)勢(shì)位點(diǎn)，并且確保任何一種得到的催化活性都?xì)wDNA所獨(dú)有。底物識(shí)別好象是依靠?jī)蓚€(gè)催化劑與底物之間堿基配對(duì)的區(qū)域。然而，位于這兩個(gè)區(qū)域之間的未配對(duì)核苷酸5’-GGA-3’可能在底物識(shí)別、金屬離子的配合或者催化功能的其他方面發(fā)揮重要的作用。
進(jìn)一步還預(yù)料到了，所有的RNA分子、其他的RNA-DNA復(fù)合體以及含一個(gè)或多個(gè)核苷酸類似物的分子都可能是可接受的底物。如此處公開(kāi)的那樣，本發(fā)明描述的體外進(jìn)化方法可以成功地用于生產(chǎn)具有期望特性的酶促DNA分子；現(xiàn)在正沿著這些線索進(jìn)行進(jìn)一步的分析。
此外，使用本發(fā)明描述的方法，測(cè)定酶與底物之間的堿基配對(duì)相互作用的產(chǎn)生是否與序列有關(guān)的研究也在進(jìn)行當(dāng)中。此處公開(kāi)的Pb2+依賴性的脫氧核酶也可能是研究DNA的結(jié)構(gòu)以及酶促活性時(shí)值得考慮的模型化合物。
本發(fā)明中用于快速生產(chǎn)DNA催化劑的方法有著相當(dāng)?shù)钠毡樾?，這使得我們能夠使用其他輔因子觸發(fā)與潛在催化結(jié)構(gòu)域相連的目標(biāo)鍵的切割。在這一點(diǎn)上，發(fā)展能夠在生理?xiàng)l件下特異性地切割目標(biāo)RNAs的Mg2+依賴性DNA酶是有意義的，發(fā)展能夠在其他陽(yáng)離子存在的條件下發(fā)揮功能的DNA酶也同樣如此(見(jiàn)實(shí)施例4)。這些分子將為傳統(tǒng)上特異性滅活目標(biāo)RNAs的反義方法和核酶方法提供替代方法。
因此，DNA可以與RNA及蛋白質(zhì)一起加入到能夠展現(xiàn)出酶促活性的生物大分子的行列中。DNA的催化能力的全部范圍還有待探索，但是根據(jù)體外選擇方法，例如本研究中使用的方法將會(huì)迅速地啟動(dòng)這些探索。
與其他大分子催化劑相比，DNA酶可以提供幾種重要的特性。首先，它們易于制備，當(dāng)今許多實(shí)驗(yàn)室都配備了自動(dòng)DNA合成儀而且DNA亞磷酰胺的成本也很低。其次，與RNA相比，它們是很穩(wěn)定的化合物，因此會(huì)加速它們?cè)谏镅芯恐械膽?yīng)用。第三，我們預(yù)料它們能夠適合當(dāng)前使用不具有切割RNA活性的反義DNAs的治療領(lǐng)域。用DNA類似物也可以進(jìn)行體外篩選，這些類似物包括具有核酸酶抗性的化合物，例如含有硫代磷酸酯的DNA，只要這些類似物能夠被制備成脫氧核糖核苷5’-三磷酸，并且可以作為DNA依賴性DNA聚合酶的底物。最后，DNA酶為我們理解大分子催化功能的基礎(chǔ)提供了一個(gè)新的窗口。例如，對(duì)催化同一化學(xué)轉(zhuǎn)化的以蛋白質(zhì)為基礎(chǔ)的酶、以RNA為基礎(chǔ)的酶以及以DNA為基礎(chǔ)的酶進(jìn)行比較分析是有意義的。
4.催化活性DNAs其他家族除了DNA的起始庫(kù)由包括40個(gè)隨機(jī)核苷酸的分子組成以外，基本上按照上面實(shí)施例2.B.中描述的方法通過(guò)PCR制備DNA起始庫(kù)。因此，此處描述的DNA起始庫(kù)是利用下列合成寡聚體通過(guò)PCR制備而成5’-GGG ACG AAT TCT AAT ACG ACT CAC TAT rA GG AAG AGA TGG CGA CATCTC N40GT GAC GGT AAG CTT GGC AC-3’(SEQ ID NO 23)，其中N是G、A、T、C的等摩爾混合物，選擇能夠沿著目標(biāo)rA切割磷酸酯的DNA分子。(見(jiàn)圖6A)。
分別在Pb2+、Zn2+、Mn2+或Mg2+四者之一存在的條件下進(jìn)行選擇擴(kuò)增，因此生產(chǎn)出了至少4個(gè)家族的催化活性DNA分子。正如圖5中給出的那樣，在不同的陽(yáng)離子存在的條件下產(chǎn)生的催化活性DNA分子表現(xiàn)出了特異性的活性。
圖5給出的是表現(xiàn)選擇的催化活性DNAs的4個(gè)家族的特異性內(nèi)切核糖核酸酶活性的聚丙烯酰胺凝膠照片。Pb2+依賴性家族分子的選擇以并排的方式重復(fù)出現(xiàn)作為對(duì)照。在每組的3個(gè)泳道中，第1泳道顯示的是在不含金屬陽(yáng)離子條件下選擇的無(wú)活性群體，第2泳道顯示的是金屬陽(yáng)離子存在條件下觀察到的活性，第3泳道顯示的無(wú)活性的起始庫(kù)(GO)?，F(xiàn)在，觀察到的反應(yīng)活性順序是Pb2+＞Zn2+＞Mn2+＞Mg2+，反映了相應(yīng)金屬氫氧化物的pKa。
在預(yù)先選擇的二價(jià)離子存在的情況下進(jìn)行5輪(G5)或6輪(G6)選擇性擴(kuò)增，就可獲得期望的內(nèi)切核酸酶活性。對(duì)Mg2+存在的情況下進(jìn)行的選擇性擴(kuò)增的如下描述是用來(lái)例舉的。
除用1mM Mg2+代替1mM Pb2+作為二價(jià)金屬陽(yáng)離子外，按照上述實(shí)施例2中描述的方法進(jìn)行6輪體外選擇性擴(kuò)增。(參見(jiàn)Breaker et al，Chem. & Biol.，1223-229，1994)，在此引入作為參考，這些文獻(xiàn)基本上描述的是同一種方法。)6輪以后分離單個(gè)克隆，并從這些克隆中取出24個(gè)測(cè)定核苷酸序列。所有這些序列均以下列序列起始5’-GGG ACG AAT TCT AAT ACG ACTCAC TAT rA GG AAG AGA TGG CGA CA(SEQ ID NO 23的1～44位)，以下列序列終止CGG TAA GCT TGG CAC 3’(SEQ ID NO 23的93～107位)。
起始庫(kù)中的TCTC N40GTGA(SEQ ID NO 23的45～92位)的中間節(jié)段具有下列變化形式(13) CCG CCC ACC TCT TTT ACG AGC CTG TAC GAA ATA GTGCTC TTG TTA GTA T(SEQ ID NO 24)(5) TCT CTT CAG CGA TGC ACG CTT GTT TTA ATG TTG CACCCA TGT TAG TGA(SEQ ID NO 25)(2) TCT CAT CAG CGA TTG AAC CAC TTG GTG GAC AGA CCCATG TTA GTG A(SEQ ID NO 26)(1) CCG CCC ACC TCT TTT ACG AGC CTG TAC GAA ATA GTGTTC TTG TTA GTA T(SEQ ID NO 27)(1) CCG CCC ACC TCT TTT ACG AGC CTG TAC GAA ATA GTGCTC TCG TTA GTA T(SEQ ID NO 28)(1) TCT CAG ACT TAG TCC ATC ACA CTC TGT GCA TAT GCCTGC TTG ATG TGA(SEQ ID NO 29)(1) -CT CTC ATC TGC TAG CAC GCT CGA ATA GTG TCA GTCGAT GTG A(SEQ ID NO 30).
括號(hào)中的數(shù)目表示具有特定序列的克隆的數(shù)目。注意到一些突變(粗體字高亮顯示)發(fā)生在初始隨機(jī)之外的位置上。
24個(gè)克隆中有5個(gè)具有上面列出的第二個(gè)序列(即SEQ ID NO 25)，選擇該序列作為領(lǐng)導(dǎo)(即主要)化合物用于進(jìn)一步的研究。在pH7.0、23℃以及含有濃度為1mM的下列各種二價(jià)金屬離子和1M NaCl的條件下，測(cè)量切割活性金屬離子 kobs不含 未做Mg2+2.3×10-3Mn2+6.8×10-3Zn2+4.2×10-2Pb2+1.1×10-2因此，雖然該領(lǐng)導(dǎo)化合物是在Mg2+存在的條件下篩選得到的，但是在所有4種二價(jià)全屬離子存在的條件下該領(lǐng)導(dǎo)化合物也具有活性。相反，Mn2+、Zn2+或Pb2+存在條件下篩選出的DNA分子在Mg2+存在條件下卻不表現(xiàn)出任何活性。
此外，在制備全部含硫代磷酸酯DNA類似物時(shí)候，Mg2+存在條件下6輪體外選擇得到的DNAs群體表現(xiàn)出Mg2+依賴性的切割活性，觀察到的速度為～10-3min-1。含硫代磷酸酯類似物是酶促制備而成的，所以在每個(gè)立體核心(stereocenter)都有Rρ構(gòu)型。與未經(jīng)修飾的DNA相比，這種化合物對(duì)細(xì)胞核酸酶具有一定的抗性。
該領(lǐng)導(dǎo)化合物在40個(gè)核苷酸位置(下劃線部分)上是重隨機(jī)(re-randomized)的，導(dǎo)入了機(jī)率為15％的突變(這3個(gè)可能的堿基取代中的每個(gè)都是5％。)。對(duì)該重隨機(jī)群體進(jìn)行另外7輪體外選擇。在后4輪中，從群體中移去Pb2+存在條件下表現(xiàn)活性的分子以后，讓其余部分接受1mMMg2+存在條件下的反應(yīng)。在第7輪以后分離單個(gè)克隆，并取出這些克隆中的14個(gè)測(cè)定核苷酸序列。所有這些序列均以下列序列起始5’-GGGACG AAT TCT AAT ACG ACT CAC TAT rA GG AAG AGA TGG CGA CAT CTC(SEQ ID NO 23的1～48位)，以下列序列終止GTG ACG GTA AGC TTGGCA C3’(SEQ ID NO 23的89～107位)。
與40部分隨機(jī)位置(N40，SEQ ID NO 23的49～88位)對(duì)應(yīng)的中間節(jié)段可以下列方式變化(4) TAC AGC GAT TCA CCC TTG TTT AAG GGT TAC ACC CATGTT A(SEQ ID NO 31)(2) ATC AGC GAT TAA CGC TTG TTT CAA TGT TAC ACC CATGTT A(SEQ ID NO 32)(2) TTC AGC GAT TAA CGC TTA TTT TAG CGT TAC ACC CATGTT A(SEQ ID NO 33)(1) ATC AGC GAT TCA CCC TTG TTT TAA GGT TGC ACC CATGTT A(SEQ ID NO 34)(1) ATC AGC GAT TCA CCC TTG TTT AAG CGT TAC ACC CATGTT G(SEQ ID NO 35)(1) ATC AGC GAT TCA CCC TTG TTT TAA GGT TAC ACC CATGTT A(SEQ ID NO 36)(1) ATC AGC GAT TAA CGC TTA TTT TAG CGT TAC ACC CATGTT A(SEQ ID NO 37)(1) ATC AGC GAT TAA CGC TTG TTT TAG TGT TGC ACC CATGTT A(SEQ ID NO 38)(1) ATC AGC GAT TAA CGC TTA TTT TAG CAT TAC ACC CATGTT A(SEQ ID NO 39).
括號(hào)中的數(shù)目表示具有那種具體序列的克隆的數(shù)目。粗體顯示的是那些與領(lǐng)導(dǎo)化合物相比不同的核苷酸。
這些克隆的切割活性的正式分析正在進(jìn)行。該群體整體上表現(xiàn)出了Mg2+依賴性的切割活性，觀察到的速度為～10-2min-1，與Pb2+存在條件下表現(xiàn)出活性的活性相當(dāng)。
圖6A和6B分別提供的是一個(gè)“原始”催化活性DNA分子和用本發(fā)明公開(kāi)的選擇擴(kuò)增方法得到的幾個(gè)催化活性DNA分子中的一個(gè)的二級(jí)結(jié)構(gòu)的圖象。圖6A給出的是來(lái)自起始庫(kù)的示范分子，該分子表現(xiàn)出了SEQ IDNO 23代表的分子的總體構(gòu)象。如圖所示，各種互補(bǔ)核苷酸位于隨機(jī)區(qū)域(N40)的旁側(cè)。
圖6B圖中顯示的是一個(gè)通過(guò)此處公開(kāi)的方法產(chǎn)生的Mg2+依賴性催化活性DNA分子(或“DNAzymes”)。箭頭指示出的是底物核酸中核糖核苷酸的位置。(所顯示的分子包括此處定名為SEQ ID NO 25的序列，以及SEQ ID NO 23的“起始”序列和“終止”序列。)如此處公開(kāi)的那樣，上述通過(guò)體外選擇得到的“家族”的每個(gè)成員中的內(nèi)切核酸酶活性持續(xù)增強(qiáng)，所以可以預(yù)料用此處公開(kāi)的原則可以成功地生產(chǎn)出期望特異性逐漸增強(qiáng)的酶促DNA分子。
5.較大的RNA序列的切割作為上述研究的延續(xù)，我們已經(jīng)發(fā)展了能夠切割全部由RNA組成的底物的DNA酶，而不是如上所述的在其余全部DNA中插入單個(gè)核糖核苷酸的底物。(參見(jiàn)Breaker et al，Chem. & Biol.，1223-229，1994)；Breaker et al，Chem. & Biol.，2655-660，1994)。作為目標(biāo)序列，我們選擇HIV-1 RNA的U5長(zhǎng)末端重復(fù)序列(LTR)中的共12個(gè)高度保守的核苷酸，其序列為5’GUAACUAGAGAU 3’(SEQ ID NO 49)。
根據(jù)上述實(shí)施例中描述的方法，我們生成了一個(gè)1014個(gè)具有下列組成的DNA分子的庫(kù)5’-GGAAAA r(GUAACUAGAGAU)GGAAGAGATGGCGAC N50CGGTAAGCTTGGCAC-3’(SEQ ID NO 50)，此處N是脫氧核糖核苷酸G、A、T和C的等摩爾混合物，鑒定為“r(GUAACUAGAGAU)”的序列由脫氧核糖核苷酸組成。(任選地，可以改變序列起始5’端核苷酸，例如，通過(guò)在5’末端核糖核苷酸部分之前的序列中加入1個(gè)另外的dA殘基，因此生成了閱讀為“GGAAAAA”的起始序列，并生成了長(zhǎng)度為99個(gè)殘基的SEQ ID NO 50。顯然，如此處詳細(xì)描述的那樣，這僅僅是為了構(gòu)建特異性的酶促DNA分子而可能做的修飾中的一個(gè)實(shí)例。)通過(guò)以100pmol的5’-GTGCCAAGCTTACCG-N50-GTCGCCATCTCTTCC-3’(N＝G、A、T或C)為模板對(duì)5’-生物素-d(GGAAAAA)r(GUAACUAGAGAU)d(GGAAGAGATGGCGAC)-3’進(jìn)行模板-指導(dǎo)延伸來(lái)生產(chǎn)起始庫(kù)，50μL的反應(yīng)混合物中包含Superscript II反轉(zhuǎn)錄酶(RT；Gibco BRL)10Uμl-1、3mM MgCl2、75mM KCl、50mM Tris*HCl(pH8.3)以及每種dNTP各0.2mM。向反應(yīng)混合物中加入微量的[5’-32P]標(biāo)記的引物使得延伸效率能得到監(jiān)察。合并除RT之外的所有成分，在65℃溫育5min，然后在10min中內(nèi)冷卻到45℃。加入RT，然后將混合物在45℃溫育45min，然后加入Na2EDTA終止反應(yīng)。加入終濃度為1M的NaCl，通過(guò)讓延伸產(chǎn)物重復(fù)通過(guò)4個(gè)鏈霉親和素親和柱(Genosys)而使其固定。
用體積為100μL的洗滌緩沖液(1M NaCl、50mM Tris*HCl(pH7.5)、0.1mM Na2EDTA)洗滌柱5次，接著用體積為100μL的0.1N NaOH洗滌5次，然后用體積為100μL的洗滌緩沖液在37℃下洗滌5次，然后在37℃下1小時(shí)內(nèi)用20μL等量反應(yīng)緩沖液(10mM MgCl2、1MNaCl、50mM Tris*HCl(pH7.5))洗脫3次?；厥障疵撓聛?lái)的分子，并使用引物5’-生物素-GGAAGAGATGGCGAC-3’和5’-GTGCCAAGCTTACCG-3’進(jìn)行PCR擴(kuò)增。按照上述方法，將PCR產(chǎn)物固定在鏈霉親和素親和柱上，用體積為100μL的洗滌緩沖液洗滌5次，用體積為40μL的0.1N NaOH洗脫得到未生物素化的鏈。乙醇沉淀分離到的DNAs，并將其用做引物延伸反應(yīng)中的模板開(kāi)始下一輪選擇。除了延伸反應(yīng)規(guī)模減小了5倍和PCR規(guī)模減小了2倍外，第2～10輪按照上述方法進(jìn)行。
根據(jù)切割位于插入的RNA目標(biāo)序列中的磷酸酯的能力，對(duì)因此而產(chǎn)生的酶促DNA分子進(jìn)行篩選。基于酶促DNA分子在10mM MgCl2、pH7.5和37℃的條件下的活性，進(jìn)行10輪體外選擇擴(kuò)增。在選擇過(guò)程中，競(jìng)選其中“優(yōu)選的”切割位點(diǎn)以及在所有這些優(yōu)選位點(diǎn)都能進(jìn)行切割的“最佳”催化劑。兩個(gè)位點(diǎn)和兩個(gè)催化劑家族表現(xiàn)出最有效的切割能力(見(jiàn)圖7)。
圖7給出的是基本上按照此處描述的方法進(jìn)行10輪體外選擇擴(kuò)增得到的結(jié)果中的一部分。如圖所示，兩個(gè)位點(diǎn)和兩個(gè)催化劑家族表現(xiàn)出對(duì)目標(biāo)序列的最有效的切割。切割條件基本上同圖7中的顯示，就是，10mM Mg2+、pH7.5和37℃；圖中顯示的是反應(yīng)進(jìn)行2小時(shí)后收集的數(shù)據(jù)。相對(duì)于代次數(shù)目(此處為0～10)繪制出切割率(％)。垂直柱表示的是能夠在指定位點(diǎn)切割底物中目標(biāo)序列的催化活性DNA分子的數(shù)目/普遍性，其中條紋柱顯示的是在G↓UAACUAGAGAU處的切割，空白(無(wú)陰影)柱顯示的是在GUAACUA↓GAGAU處的切割。與此處一致，圖7中，箭頭指示的是兩個(gè)相鄰核苷酸之間發(fā)生切割的位點(diǎn)。
對(duì)來(lái)自第8輪和第10輪選擇擴(kuò)增得到的群體的各種個(gè)體進(jìn)行了克隆。然后，對(duì)來(lái)自第8輪的29個(gè)個(gè)體和來(lái)自第10輪的32個(gè)個(gè)體測(cè)定核苷酸序列(分別見(jiàn)表2和3)。
表2和表3中，標(biāo)題“核苷酸序列”下方給出的是所有鑒定的克隆中與起始庫(kù)中隨機(jī)的50個(gè)核苷酸(即N50)相對(duì)應(yīng)的部分；因此，通常，一個(gè)給定克隆的全長(zhǎng)核苷酸序列包括“N50”節(jié)段之前，之后的序列以及包括該節(jié)段的序列，如果和底物連接在一起，就沒(méi)有發(fā)生自身切割。例如，(非自身切割)克隆的全序列通?？赡馨⊿EQ ID NO 50的第1～33位殘基，接著是代表隨機(jī)N50區(qū)域的殘基，再接著是SEQ ID NO 50的第84～98位殘基，或者SEQ ID NO 51的第1～34位殘基，接著是代表隨機(jī)N50區(qū)域的殘基，再接著是SEQ ID NO 51的第85～99位殘基。然而，可以相信的是，每個(gè)克隆的N50(或N40)區(qū)域——或其一部分——在確定特定酶促DNA分子的特異性和/或活性中都是特別重要的。在底物與DNAzyme各自為獨(dú)立分子的反應(yīng)中，這一點(diǎn)尤其明顯(見(jiàn)，例如，圖8和圖9)。
第8輪或第10輪后得到的個(gè)體分別被定名為8-x或10-x。SEQ ID NOS也被列出，與每個(gè)克隆的“N50”區(qū)域?qū)?yīng)。
表2來(lái)自第8輪擴(kuò)增的克隆個(gè)體克隆編號(hào) SEQ ID NO “N50”核苷酸序列(5’-3’)8-2 52 CCA ATA GTG CTA CTG TGT ATC TCA ATG CTGGAA ACA CGG GTT ATC TCC CG8-4 53 CCA AAA CAG TGG AGC ATT ATA TCT ACT CCACAA AGA CCA CTT TTC TCC CG8-5154 ATC CGT ACT AGC ATG CAG ACA GTC TGT CTGCTT TTT CAT TAC TCA CTC CC8-14 55 CAA TTC ATG ATG ACC AAC TCT GTC AAC ACGCGA ACT TTT AAC ACT 6GC A8-17256 CTT CCA CCT TCC GAG CCG GAC GAA GTT ACTTTT TAT CAC ACT ACG TAT TG8-3 57 GGC AAG AGA TGG CAT ATA TTC AGG TAA CTGTGG AGA TAC CCT GTC TGC CA8-6 58 CTA GAC CAT TCA CGT TTA CCA AGC TAT GGTAAG AAC TAG AAT CAC GCG TA8-8 59 CGT ACA CGT GGA AAA GCT ATA AGT CAA GTTCTC ATC ATG TAC CTG ACC GC8-10 60 CAG TGA TAC ATG AGT GCA CCG CTA CGA CTAAGT CTG TAA CTT ATT CTA CC8-22 61 ACC GAA TTA AAC TAC CGA ATA GTG TGG TTTCTA TGC TTC TTC TTC CCT GA8-11 62 CAG GTA GAT ATA ATG CGT CAC CGT GCT TACACT CGT TTT ATT AGT ATG TC8-21 63 CCC TAC AAC ACC ACT GGG CCC AAT TAG ATTAAC GCT ATT TTA TAA CTC G8-12 64 CCA AAC GGT TAT AAG ACT GAA AAC TCA ATC
AAT AGC CCA ATC CTC GCC C8-13 65 CAC ATG TAT ACC TAA GAA ATT GGT CCC GTAGAC GTC ACA GAC TTA CGC CA8-23 66 CAC AAC GAA AAC AAT CTT CCT TGG CAT ACTGGG GAG AAA GTC TGT TGT CC8-40 67 CAC ACG AAC ATG TCC ATT AAA TGG CAT TCCGTT TTT CGT TCT ACA TAT GC8-24 68 CAG AAC GAG GGT CTT GTA AGA CTA CAC CTCCTC AGT GAC AAT AAT CCT G8-26 69 CAC TAC AGC CTG ATA TAT ATG AAG AAC AGGCAA CAA GCT TAT GCA CTG G8-27 70 GGG TAC ATT TAT GAT TCT CTT ATA AAG AGAATA TCG TAC TCT TTT CCC CA8-28 71 CCA AAG TAC ATT CCA ACC CCT TAT ACG TGAAAC TTC CAG TAG TTT CCT A8-29 72 CTT GAA GAT CCT CAT AAG ACG ATT AAA CAATCC ACT GGA TAT AAT CCG GA8-34 73 CGA ATA GTG TCC ATG ATT ACA CCA ATA ACTGCC TGC CTA TCA TGT TTA TG8-35 74 CCA AGA GAG TAT CGG ATA CAC TTG GAA CATAGC TAA CTC GAA CTG TAC CA8-36 75 CCA CTG ATA AAT AGG TAA CTG TCT CAT ATCTGC CAA TCA TAT GCC GTA8-37 76 CCC AAA TTA TAA ACA ATT TAA CAC AAG CAAAAG GAG GTT CAT TGC TCC GC8-39 77 CAA TAA ACT GGT GCT AAA CCT AAT ACC TTGTAT CCA AGT TAT CCT CCC CC1與10-4、10-40相同2與8-20、8-32、8-38、10-1、10-34相同；10-11的1個(gè)突變；10-29的3個(gè)突變表3來(lái)自第8輪擴(kuò)增的克隆個(gè)體克隆編號(hào) SEQ ID NO “N50”核苷酸序列(5’-3’)10-3378 CCG AAT GAC ATC CGT AGT GGA ACC TTG CTTTTG ACA CTA AGA AGC TAC AC10-10 79 CCA TAA CAA ATA CCA TAG TAA AGA TCT GCATTA TAT TAT ATC GGT CCA CC10-12 80 CAG AAC AAA GAT CAG TAG CTA AAC ATA TGGTAC AAA CAT ACC ATC TCG CA10-14 81 CCT TTA GTT AGG CTA GCT ACA ACG ATT TTTCCC TGC TTG GCA ACG ACA C10-15 82 CTC CCT ACG TTA CAC CAG CGG TAC GAA TTTTCC ACG AGA GGT AAT CCG CA10-19 83 CGG CAC CTC TAG TTA GAC ACT CCG GAA TTTTTC CCC10-39 84 CGG CAC CTC TAG TTA GAC ACT CCG GAA TTTTAG CCT ACC ATA GTC CGG T10-23 85 CCC TTT GGT TAG GCT AGC TAC AAC GAT TTTTCC CTG CTT GAA TTG TA10-27486 CCC TTT GGT TAG GCT AGC TAC AAC GAT TTTTCC CTG CTT GAC CTG TTA CGA10-31 87 CCT TTA GTT AGG CTA GCT ACA ACG ATT TTTCCC TGC TTG GAA CGA CAC10-18 88 CAT GGC TTA ATC ATC CTC AAT AGA AGA CTACAA GTC GAA TAT GTC CCC CC10-20 89 CAA CAG AGC GAG TAT CAC CCC CTG TCA ATAGTC GTA TGA AAC ATT GGG CC10-6 90 TAC CGA CAA GGG GAA TTA AAA GCT AGC TGGTTA TGC AAC CCT TTT CGC A10-7 91 CTC GAA ACA GTG ATA TTC TGA ACA AAC GGGTAC TAC GTG TTC AGC CCC C10-8 92 CCA ATA ACG TAA CCC GGT TAG ATA AGC ACTTAG CTA AGA TGT TTA TCC TG10-16 93 CAA TAC AAT CGG TAC GAA TCC AGA AAC ATAACG TTG TTT CAG AAT GGT CC10-21 94 GCA ACA ACA AGA ACC AAG TTA CAT ACA CGTTCA TCT ATA CTG AAC CCC CA10-24 95 CCT TTG AGT TCC TAA ATG CCG CAC GGT AAGCTT GGC ACA CTT TGA CTG TA10-28 96 CAA AGA TCT CAC TTT GGA AAT GCG AAA TATGTA TAT TCG CCC TGT CTG C10-33 97 CCA CGT AGA ATT ATC TGA TTT ATA ACA TAACGC AGG ATA ACT CTC GCC CA10-35 98 CAC AAG AAA GTG TCG TCT CCA GAT ATT TGAGTA CAA GAA ACT ACG CCC10-36 99 CAT GAA GAA ATA GGA CAT TCT ACA GGC TGGACC GTT ACT ATG CCT GTA GG10-37 100 CAT AGG ATA ATC ATG GCG ATG CTT ATG ACGTGT ACA TCT ATA CCT T10-38 101 CAG ATG ATC TTC CTT TAA AGA CTA CCC TTTAAA GAA ACA TAA GGT ACC CC310-5的1個(gè)突變410-30的1個(gè)突變隨后測(cè)量了各種克隆的自身切割活性。發(fā)現(xiàn)克隆8-5、8-17和10-3在5’GUAACU↓AGAGAU 3’位點(diǎn)能有效地切割，而克隆10-14、10-19和10-27在5’G↓UAACUAGAGAU 3’位點(diǎn)能有效地切割。當(dāng)將分子的RNA部分延伸成序列5’GGAAAAAGUAACUAGAGAUGGAAG 3’(SEQ ID NO 51的第1～24位殘基)時(shí)，克隆8-17、10-14和10-27保留了全部活性，而克隆8-5、10-3和10-19表現(xiàn)出的活性減弱。隨后，發(fā)現(xiàn)克隆10-23在涉及延伸后的RNA結(jié)構(gòu)域的自身切割反應(yīng)中表現(xiàn)出高水平的活性。
還應(yīng)該提到的是，如果相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)人員的興趣有所不同，為了生產(chǎn)出有特定特異性的酶促DNA分子，可以對(duì)根據(jù)本發(fā)明公開(kāi)的方法構(gòu)建的聚核苷酸分子中“N50”節(jié)段之前的序列或之后的序列，即“N50”區(qū)域旁側(cè)的底物結(jié)合區(qū)域采取多種形式的變化，例如改變長(zhǎng)度、核苷酸序列、核酸類型等等。例如，盡管此處將SEQ ID NO 51的第1～24位殘基描述為RNA核苷酸，替代地它們可以包括DNA、RNA或其組合。(因此，例如，可以容易地將SEQ ID NO 51改變成第1～7位核酸殘基包括DNA，第8～19為殘基包括RNA，第20～99位殘基包括DNA，等等。)類似地，“N50”區(qū)域之前的核苷酸可以包括RNA、DNA或其組合。如此處公開(kāi)的那樣，“N50”(或“N40”——見(jiàn)實(shí)施例4)之前或之后區(qū)域的長(zhǎng)度也可以改變。而且，N50或N40區(qū)域之前的或之后的序列可以被截短、延長(zhǎng)或整個(gè)缺失。
而且，如上所述，在實(shí)施例描述的方法中我們選用HIV RNA的特定區(qū)域作為目標(biāo)序列；這種序列不是可以選做目標(biāo)的唯一序列。顯然，相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)人員可以根據(jù)我們的教導(dǎo)構(gòu)建和設(shè)計(jì)出對(duì)于其他目標(biāo)序列具有特異性的酶促DNA分子。如此處公開(kāi)的那樣，如SEQ ID NO 50和51顯示的那樣，這樣的目標(biāo)序列可以被構(gòu)建成或插入到含有DNA、RNA或其組合的較大序列中。
通過(guò)把酶和底物區(qū)域分離到單獨(dú)的分子中，可以容易地將自身切割反應(yīng)轉(zhuǎn)變成分子間切割反應(yīng)。選擇克隆8-17和10-23作為原型分子。在以多次轉(zhuǎn)換起始的反應(yīng)中，二者均表現(xiàn)出能夠作為DNA酶切割單獨(dú)的全部-RNA底物(圖8)。隨后，將劃分出切割位點(diǎn)的未配對(duì)核苷酸每一側(cè)的底物結(jié)合臂縮短到7個(gè)堿基對(duì)(圖9)。
圖8給出的是本發(fā)明的兩個(gè)催化活性DNA分子——克隆8-17和10-23的核苷酸序列、切割位點(diǎn)以及轉(zhuǎn)換速度。反應(yīng)條件如圖所示，也就是，10mM Mg2+、pH7.5和37℃。左邊是鑒定為克隆8-17的DNAzyme，箭頭指示的是RNA底物的切割位點(diǎn)。底物序列(5’-GGAAAAAGUAACUAGAGAUGGAAG-3’)——與DNAzyme分離(即給出的是分子間切割)——如圖標(biāo)記。類似地，右邊顯示的是此處鑒定為克隆10-23的DNAzyme，箭頭指示的是RNA底物的切割位點(diǎn)。再次列出底物序列。酶8-17的轉(zhuǎn)換速度為約0.6hr-1；酶10-23的轉(zhuǎn)換速度為約1hr-1。
如圖8中所示，能切割單個(gè)底物分子的克隆8-17催化活性DNA分子的核苷酸序列如下列所示5’-CTTCCACCTTCCGAGCCGGACGAAGTTACTTTTT-3’(SEQ ID NO 56的1～34位殘基)。在同一圖中，能切割單個(gè)底物分子的克隆10-23催化活性DNA分子的核苷酸序列如下列所示5’-CTTTGGTTAGGCTAGCTACAACGATTTTTCC-3’(SEQ ID NO 85的3～33位殘基)。
圖9進(jìn)一步給出了本發(fā)明的兩個(gè)催化活性DNA分子——克隆8-17和10-23的核苷酸序列、切割位點(diǎn)和轉(zhuǎn)換速度。反應(yīng)條件如圖所示，也就是，10mM Mg2+、pH7.5和37℃。與圖8中相同，左邊給出的是鑒定為克隆8-17的DNAzyme，箭頭指示的是RNA底物的切割位點(diǎn)。底物序列(5’-GGAAAAAGUAACUAGAGAUGGAAG-3’)——與DNAzyme分離(即給出的是分子間切割)——如圖標(biāo)記。類似地，右邊顯示的是此處鑒定為克隆10-23的DNAzyme，箭頭指示的是RNA底物的切割位點(diǎn)。再次給出了底物序列。酶8-17的Kobs值為約0.002min-1；酶10-23的Kobs值為約0.01min-1。
如圖9所示，能切割單個(gè)底物分子的克隆8-17催化活性DNA分子的核苷酸序列如下列所示5’-CCACCTTCCGAGCCGGACGAAGTTACT-3’(SEQID NO 56的4～30位殘基)。在同一圖中，能切割單個(gè)底物分子的克隆10-23催化活性DNA分子的核苷酸序列如下列所示5’-CTAGTTAGGCTAGCTACAACGATTTTTCC-3’(SEQ ID NO 85的5～33位殘基，在5’末端用“CTA”取代了“TTG”)。
切割RNA的DNA酶的催化速度還沒(méi)有被完全優(yōu)化。如上述公開(kāi)的以及以前研究中報(bào)道的那樣，通過(guò)對(duì)原型分子進(jìn)行部分隨機(jī)化以及進(jìn)行附加輪的選擇擴(kuò)增，我們已經(jīng)能夠提高催化速度。但是，我們發(fā)現(xiàn)在pH7.5和37℃的條件下，8-17和10-23這兩種DNA分子在Mg2+存在時(shí)的Km值分別為約5mM和2mM；這確實(shí)與分子內(nèi)切割的情況一致。
6.通用底物酶的制備上述內(nèi)容表明，本發(fā)明的酶能夠催化切割含有預(yù)先選定序列的目標(biāo)核酸。而且，給出了的酶能夠切割純粹為DNA的核酸，或在脫氧核糖核苷酸(即DNA)序列中插入了核糖核苷酸(即RNA組分)的核酸，或純粹為RNA的核酸。另外，底物可以更換，而制備出來(lái)的酶可以切割此底物。
根據(jù)本發(fā)明，提供了一種能夠在生理?xiàng)l件下以高效和特異的動(dòng)力學(xué)方式切割任一目標(biāo)底物的酶，即包含一段預(yù)先選定的長(zhǎng)約10～30個(gè)核苷酸的核苷酸序列的任一底物。這種酶易于制備且成本低廉，可以用于目標(biāo)RNA的滅活，具體為信使RNA(mRNA)的滅活，也可以用于探測(cè)結(jié)構(gòu)RNA以及用于重組RNA的處理，例如作為序列特異性的內(nèi)切核糖核酸酶。
就滅活RNAs而言，該酶可以具體地用于目標(biāo)細(xì)胞RNAs的滅活，例如“反義”寡脫氧核糖核苷酸能夠用于阻斷mRNA功能。但是，由于本發(fā)明的酶提供了識(shí)別和催化兩種功能，所以本發(fā)明的酶優(yōu)于反義反應(yīng)物，能夠進(jìn)行催化轉(zhuǎn)換，而反義分子僅僅提供了等摩爾方式的識(shí)別(即非催化方式)，而且還必須依靠其他細(xì)胞酶來(lái)進(jìn)行RNA滅活反應(yīng)。
下面部分描述了在上述“10-23”和“8-17”基序的基礎(chǔ)上改進(jìn)了的酶的制備。這些改進(jìn)了的酶是通用型的酶，能夠切割任一預(yù)先選定的目標(biāo)序列，正如此處進(jìn)一步描述的那樣，這種目標(biāo)特異性只依賴于該酶的底物結(jié)合區(qū)域序列。
按照上述實(shí)施例5中描述的方法，在連續(xù)數(shù)輪的選擇擴(kuò)增過(guò)程中，對(duì)定名為“10-23”和“8-17”的兩個(gè)基序進(jìn)行鑒定，再塑造使其成為分子問(wèn)切割反應(yīng)，并且表現(xiàn)出在這種方式下的高效運(yùn)行。
用如圖9中所示的產(chǎn)生對(duì)單個(gè)底物分子位點(diǎn)特異性催化切割的反應(yīng)(即分子間切割)在下列類似生理?xiàng)l件下進(jìn)行進(jìn)一步的研究2mMMgCl2、150mM KCl、pH7.5和37℃，速度為約kcat=O.01min-1。
沿著底物的一個(gè)未配對(duì)的嘌呤核苷酸發(fā)生了切割，該核苷酸的旁側(cè)是與酶互補(bǔ)的寡核苷酸。5’端和3’端切割產(chǎn)物分別帶有一個(gè)2’(3’)環(huán)磷酸和5’羥基，表示著涉及攻擊鄰近磷酸上的2 羥基的反應(yīng)機(jī)制。對(duì)于8-17和10-23這兩個(gè)基序酶而言，只要酶的底物結(jié)合臂以互補(bǔ)的方式改變，就能做到改變底物序列而不喪失催化活性。酶8-17對(duì)于位于緊靠切割位點(diǎn)的下游處的rG-dt“擺動(dòng)”配對(duì)有著特異性地需求。在這個(gè)位置上用Waston-Crick堿基對(duì)取代時(shí)催化活性消失。酶10-23的底物結(jié)合臂與底物之間完全是通過(guò)Waston-Crick配對(duì)而相互作用的?；蛎?-17和10-23的催化核心位于兩個(gè)底物結(jié)合臂之間，分別含有13和15個(gè)脫氧核苷酸。
為了更精確地定義催化核心的序列要求，每種基序都構(gòu)建了一個(gè)1014個(gè)突變體的文庫(kù)，在整個(gè)核心中的每個(gè)核苷酸位置上都導(dǎo)入了機(jī)率為25％的突變。每個(gè)文庫(kù)都用6種不同的體外選擇方法進(jìn)行處理，包括共52輪的選擇性擴(kuò)增。為了對(duì)與這兩種原型分子有關(guān)的序列進(jìn)行一次徹底的測(cè)試，對(duì)篩選方法和嚴(yán)緊性都進(jìn)行了改變。對(duì)來(lái)自所選擇群體的個(gè)體進(jìn)行了克隆，測(cè)序，并測(cè)定了催化活性。該方法具體操作如下。
在酶8-17和10-23基礎(chǔ)上的重選擇包括對(duì)每種基序的6個(gè)不同的系統(tǒng)。每個(gè)系統(tǒng)需要5～21輪體外篩選，在篩選操作和反應(yīng)時(shí)間上相同。所有切割反應(yīng)均在下列條件下進(jìn)行2mM MgCl2、150M NaCl、50mMTris*HCl(pH7.5)，37℃。反應(yīng)時(shí)間從早期輪次的60min變化到晚期輪次的1min。模板的每個(gè)起始庫(kù)都建立在與原型互補(bǔ)序列的基礎(chǔ)之上，該原型分子帶有每個(gè)都是7個(gè)核苷酸的固定的結(jié)合臂和一個(gè)每個(gè)核苷酸位置上都有機(jī)率為25％的隨機(jī)性的催化核心。對(duì)于基序8-17和10-23而言，模板分別具有以下序列5’-gtgccaagcttaccgagtaactTCG-TCCGGCTCGGRagatgggtcgtctgtccttccATCTCTAGTTACTTTTTC-3’和5’-gttgccaagcttaccg-ggaaaaaTCGTTGTAGCTAGCCtaactaggtcgtctgtccttccATCTCTAGTTACTTTTTC-3’(PCR引物位點(diǎn)用小寫(xiě)字母表示；下劃線部分是底物結(jié)合臂；斜體部分是隨機(jī)位置)。該模板引導(dǎo)的延伸中使用的引物的序列如下5’-生物素-r(GGAAAAA-GUAACUAGAGAUGG)d(AAGAGATGGCGAC)-3’。以8-17為基礎(chǔ)的篩選所用的引物為5’-GTGCCAAGCTTACCGAGTAACT-3’和5’-d(GGAAGGACAGACGACC-CATC)rU，以10-23為基礎(chǔ)的篩選所用的引物為5’-GTGCCAAGCTTACCGGGAAAAA-3’和5’-d(GGAAGGACAGACGACCTAGTT)rA。PCR引物中包括結(jié)合臂，因此固定了這些序列。每套引物其中1個(gè)含有1個(gè)3’末端核糖核苷酸，這就使得能夠通過(guò)非模板鏈的堿性水解以及隨后的聚丙烯酰胺凝膠電泳純化分離，把模板鏈從雙鏈PCR產(chǎn)物中分離出來(lái)。上述系統(tǒng)中的一些使用了以凝膠為基礎(chǔ)的篩選方案。在這些情況下，PCR引物為5’-生物素-GTGCCAAGCTTACCG-3’和5’-GAAAAAGTAACTAG-AGATGGAAGGACAGACGACC-3’，延伸反應(yīng)是利用引物5’-r(GGAAAAAGUAACUAGAGAUGGAAG)-3’在固體載體上進(jìn)行的。向反應(yīng)混合物中加入微量的[α-32P]-dATP標(biāo)記延伸產(chǎn)物，用堿洗脫延伸產(chǎn)物，并用變性聚丙烯酰胺凝膠純化方法進(jìn)行了純化，然后用電洗脫回收。然后讓這些分子反應(yīng)，凝膠電泳分離切割后的分子。
如上所述，初始篩選的第8輪和第10輪以后，對(duì)單個(gè)分子進(jìn)行克隆和測(cè)序。來(lái)自第8輪的第17個(gè)克隆(8-17)和來(lái)自第10輪的第23個(gè)克隆(10-23)分別具有以下序列5’-cacggttcga-atggcGTTATGCATCACACTATTTTTCATTGAAGCAGGCCGAGCCTT CCACCTTCcagcggtag-agaagg-3’和5’-cacggttcgaatggcATGTTAAGTTCGTCCCTTTTTAGCAACATCGATCGGATT-GGTTTCCCcagcggtagagaagg-3’(小寫(xiě)字母部分為PCR引物位點(diǎn)；下劃線部分是底物結(jié)合臂)。對(duì)于分子間反應(yīng)來(lái)說(shuō)，合成的寡脫氧核苷酸是在上述克隆序列的基礎(chǔ)上制備而成的，但不含底物結(jié)合臂之外的區(qū)域。它們可以用于切割與構(gòu)建初始文庫(kù)所使用的引物序列相同的的全部-RNA的底物(見(jiàn)上述內(nèi)容)。隨后，DNA酶的底物結(jié)合臂被縮短到每個(gè)只含7個(gè)核苷酸，并且與RNA底物完美地互補(bǔ)。
就酶8-17而言，克隆個(gè)體中序列變化表明，催化活性核心由一個(gè)內(nèi)在的短莖-環(huán)結(jié)構(gòu)與緊隨其后的含4-5個(gè)核苷酸的不配對(duì)區(qū)域組成(圖10)。莖部分總是包含3個(gè)核苷酸，至少其中有2個(gè)是G-C。環(huán)部分是固定不變的，序列為5’-AGC-3’。莖延長(zhǎng)或環(huán)序列改變的合成結(jié)構(gòu)都沒(méi)有表現(xiàn)出催化活性。不配對(duì)區(qū)域把莖的3’端的半段與下游底物結(jié)合結(jié)構(gòu)域連接起來(lái)，該不配對(duì)區(qū)域的序列為5’-WCGR-3’或5’-WCGAA-3’(W＝A或T；R＝A或G)。這個(gè)區(qū)域中序列為5’-TCGAA-3’的突變體表現(xiàn)出的催化活性最強(qiáng)，但是這種在酶8-17適用的改良不適用于其他底物序列。
盡管酶基序10-23的催化核心的第8位核苷酸是T時(shí)(原型中就是如此)提供了最高水平的活性，但是該位置上的核苷酸可以變化為T、C或A。對(duì)RNA底物與相應(yīng)的互補(bǔ)DNA酶形成的大量不同的組合的測(cè)試發(fā)現(xiàn)基序10-23可以適應(yīng)任一底物序列。
然后，用多次轉(zhuǎn)換反應(yīng)測(cè)量基序10-23和8-17的突變體的催化活性，典型地，不同的日子進(jìn)行的同一實(shí)驗(yàn)表現(xiàn)出＜20％的偏差。在1次轉(zhuǎn)換和多次轉(zhuǎn)換實(shí)驗(yàn)得到的動(dòng)力學(xué)數(shù)值是近似的；用合成的RNA底物得到的數(shù)值比用體外轉(zhuǎn)錄的底物得到的數(shù)值稍差。從Kobs vs.Kobs/[S]的改良Eadie-Hofstee曲線的最佳擬合線的y軸截距和負(fù)斜率中分別測(cè)定了kcat和Km的報(bào)道值。在持續(xù)的Km的[S]范圍內(nèi)，每條曲線由10個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)組成，[S]相對(duì)于[E]過(guò)量10倍。典型地，Kobs值建立在從反應(yīng)起初的10％階段得到5個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)的基礎(chǔ)之上。將底物和酶單獨(dú)在反應(yīng)緩沖液中預(yù)溫育10min，然后合并啟動(dòng)反應(yīng)。為了防止物質(zhì)吸附到管壁上，所有反應(yīng)中均加有0.01％十二烷基硫酸鈉。加入50mM 4-(2-羥乙基)-哌嗪-1-丙磺酸。動(dòng)力學(xué)數(shù)值不依賴于緩沖液的同一性。用20％的聚丙烯酰胺凝膠電泳分離反應(yīng)產(chǎn)物，用磷光計(jì)(phosphorimager)定量。
切割發(fā)生在1個(gè)單個(gè)未配對(duì)核苷酸的3’端一側(cè)，優(yōu)選地該核苷酸是1個(gè)后面接1個(gè)嘧啶的嘌呤。由A和U圍成的目標(biāo)位點(diǎn)的切割效率最高，在類似生理?xiàng)l件下的催化速度為約0.1min-1。
一個(gè)在A*U位點(diǎn)切割切割RNA的DNA酶能夠被用于以任一mRNA起始密碼子(A*U)為目標(biāo)。作為實(shí)驗(yàn)，制備了對(duì)應(yīng)于HIV-1 gag/聚合酶(gag/pol)mRNA(5’-GGAGAGAGA*UGGGUGCG)的17mer的合成版本和體外轉(zhuǎn)錄版本。在一個(gè)類似生理?xiàng)l件下進(jìn)行的以kcat為0.15min-1、Km為0.47nM起始的反應(yīng)中，這兩種版本的底物都在期望位置被相應(yīng)的DNA酶10-23切割(催化效率，kcat/Km＝3.2×108M-1min-1)(圖11)。在1～250mM的濃度范圍內(nèi)，催化速度隨著MgCl2濃度的增加而加快，pH7.5和37℃的條件下Mg2+的表觀Km值為180mM。在7.0～8.5的pH范圍內(nèi)，催化速度以近似對(duì)數(shù)方式隨著pH的升高而加快，這與被切割的磷酸酯鄰接處的2’羥基的去質(zhì)子化一致。pH8.0、37℃以及50mM MgCl2存在的條件可以用于RNA的實(shí)驗(yàn)室操作，這種條件下，kcat為3.4min-1且Km為0.76nM。與已知的切割RNA的RNA酶相比，DNA酶10-23的催化效率在生理?xiàng)l件和實(shí)驗(yàn)條件下都有利。與蛋白質(zhì)酶核糖核酸酶A相比，該DNA酶的kcat降低了104倍而Km優(yōu)化了105倍。
酶10-23能夠被用于切割各種生物學(xué)上相關(guān)RNAs。我們制備了與HIV-1的gag/聚合酶、env、vpr、tat、nef IGF-R和E100連接酶的mRNA起始位點(diǎn)周圍的15-17個(gè)核苷酸相對(duì)應(yīng)的合成RNA底物。上述每種底物都在預(yù)期的位置被合成的DNA酶切割，該酶中包含10-23催化核心及其旁側(cè)的每個(gè)都由7～12個(gè)核苷酸組成的底物結(jié)合臂(表4)。類似生理?xiàng)l件下，上述所有情況的催化速度都是約0.1min-1。然而，Km值隨著底物核苷酸組成的不同而不同。對(duì)于富含鳥(niǎo)嘌呤核苷的gag/聚合酶底物，當(dāng)使用的是7個(gè)核苷酸的底物結(jié)合臂或7個(gè)核苷酸的底物結(jié)合臂時(shí)，Km＜1nM。當(dāng)使用的是7個(gè)核苷酸的底物結(jié)合臂時(shí)，env和vpr底物以效率低得多的Km切割，但是當(dāng)這些底物結(jié)合臂每個(gè)上的核苷酸數(shù)目增至8個(gè)時(shí)Km得到充分的優(yōu)化。
表4類似生理?xiàng)l件下各種RNA底物的DNA-催化下的切割基因SEQ ID N0 目標(biāo)序列臂長(zhǎng) kcat(min-1) Km(nM)HIV-1gag 102 GGAGAGAGA*UGGGUGCG 8+8 0.10.7gag 103 GAGAGAGA*UGGGUGC 7+7 0.10.9env 104 CAGUGGCAA*UGAGAGUG 8+8 0.04 9env 105 AGUGGCAA*UGAGAGU 7+7 0.03 900vDr 106 GAGGAUAGA*UGGAACAA 8+8 0.120vDr 107 AGGAUAGA*UGGAACA 7+7 0.08 500tat 108 GCAAGAAA*UGGAGCC 7+7 0.04 300nef 109 CUAUAAGA*UGGGUGA 7+7 0.05 900FIVgag 110 UACAGCAACA*UGGGGAAUGG9+100.005 8gag 111 CAUGGGGAA*UGGACAGGG 8+9 0.006 5IGF-R112 CAAAUAAAAGGGA*UGAAGUCUGG 12+10 0.02 20113 AAGGAAUGAAG*UCUGGCUCCG 10+10 0.350114 AUACCGCAAAG*UCUUUGAGAAUU 10+12 0.130115 AAGUCUUUGAGAG*UUUCCUGCAC 12+10 0.05 21116 AACACCACCA*UGUCCAGCC 9+9 0.06 2117 GGCCUUUCACA*UUGUACCGC10+90.110118 UUGUACCGCA*UCGAUAUCCAC 9+110.06 1E100 連接酶119 GAACAUUACAUUA*UAGUGACCAG 12+10 1.080表4中測(cè)定并給出的動(dòng)力學(xué)數(shù)值是在多次轉(zhuǎn)換條件下得到的，合成的RNA底物比合成的DNA酶過(guò)量10倍以上，使用的反應(yīng)條件如下2mMMgCl2、150mM NaCl、pH7.5、37℃，在25mM MgCl2存在下得到的。
作為對(duì)本發(fā)明的DNA酶能夠提供的底物結(jié)合區(qū)域(臂)的突變體的進(jìn)一步說(shuō)明，這些臂的長(zhǎng)度系統(tǒng)的變化范圍為4～13個(gè)核苷酸殘基，使用表4中所示的HIV-1gag基因起始密碼子目標(biāo)核苷酸序列。除了臂長(zhǎng)進(jìn)行如圖13所示的變化外，上述制備的每種DNA酶結(jié)構(gòu)的反應(yīng)都是單獨(dú)進(jìn)行的。與以前一樣，催化活性DNA酶的動(dòng)力學(xué)特性在以下條件下測(cè)定的2mM Mg2+、150M NaCl、pH7.5、37℃，并測(cè)定了酶的多次轉(zhuǎn)換。對(duì)基序10-23修飾使其能與HIV-1gag基因互補(bǔ)結(jié)合后，測(cè)量Kcat(min-1)和Km(nM)，并顯示于圖13中。
這些結(jié)果表明，每個(gè)底物結(jié)合區(qū)域的每個(gè)臂中的核苷酸在5～13的全部范圍內(nèi)觀察到的催化速度都是有效的，而在7～10個(gè)核苷酸的優(yōu)選范圍內(nèi)是特別有效的。這些結(jié)果還表明，對(duì)于5～13個(gè)核苷酸的臂長(zhǎng)而言，達(dá)到最大催化速度一半(half maximal cataylsis)時(shí)酶的有效濃度為100～0.05納摩爾(nM)，7～13個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度特別優(yōu)選。
把多種修飾摻入到DNA酶10-23中，并測(cè)試其在10％的胎牛血清中的穩(wěn)定性(圖13)。這些修飾包括1)該DNA的3’末端的1個(gè)“倒轉(zhuǎn)的”(3’，3’-連接)胸腺嘧啶；2)兩個(gè)底物結(jié)合臂的遠(yuǎn)端一側(cè)的5個(gè)2’-O-甲基殘基；3)在兩個(gè)底物結(jié)合臂的所有位置上的2’-O-甲基殘基；4)催化核心中的5個(gè)嘌呤-嘌呤位點(diǎn)上的硫代磷酸酯位點(diǎn)；5)兩個(gè)底物結(jié)合臂遠(yuǎn)端側(cè)上的3個(gè)硫代磷酸酯。倒轉(zhuǎn)的胸苷酸提供的保護(hù)最好(t1/2＞60min)。除核心上的那5個(gè)P＝S取代以外，與未修飾的DNA相比，所有其他修飾都導(dǎo)致了血清穩(wěn)定性的增強(qiáng)。所有修飾后的DNA酶都保持了催化活性。
因此，本發(fā)明描述了一種具有位點(diǎn)特異性內(nèi)切核酸酶活性的催化活性DNA分子，該分子可以設(shè)計(jì)成切割任一預(yù)先選定的底物核酸序列。該DNA分子(酶)具有位于核心區(qū)域旁側(cè)的第一和第二兩個(gè)底物結(jié)合區(qū)域(臂)，每個(gè)臂上都有一段與目標(biāo)底物核酸序列中的部分互補(bǔ)的序列，因此第一和第二臂一起限定出了被切割的底物核酸序列?；パa(bǔ)意味著底物結(jié)合區(qū)域與目標(biāo)序列通過(guò)常規(guī)的Waston-Crick堿基配對(duì)方式結(jié)合在一起。
上述臂可以有多種長(zhǎng)度。但是，因?yàn)榭吹介L(zhǎng)度能夠影響催化速度(kcat)和酶的有效濃度(Km)，所以優(yōu)選的臂長(zhǎng)為每個(gè)臂有5～13核苷酸互補(bǔ)，優(yōu)選約6～11個(gè)核苷酸，更優(yōu)選長(zhǎng)度約7～10個(gè)核苷酸。
核心區(qū)域具有以下列通式為基礎(chǔ)的多種序列(I.)T(莖)’AGC(莖)”Z，其中所述的(莖)’和(莖)”都是3個(gè)連續(xù)的核苷酸，以(莖)’∶(莖)”配對(duì)雜交時(shí)，其中應(yīng)包括至少2個(gè)G∶C對(duì)，其中所述的Z＝WCGR或WCGAA，W＝A或T且R＝A或G。這種莖結(jié)構(gòu)如圖10所示，顯示了3個(gè)互補(bǔ)的堿基對(duì)。具體優(yōu)選的是圖10所示的基序8-17的核心區(qū)域的原型結(jié)構(gòu)，“TCCGAGCCGGACGA”(SEQ ID NO 120)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，該核心區(qū)域能夠具有根據(jù)下列通式的序列(II.)RGGCTAGCXACAACGA(SEQ ID NO 122)，其中所述的X＝T、C或A，R＝A或G。具體優(yōu)選的是圖10所示的基序10-23的核心區(qū)域的原型結(jié)構(gòu)，“RGGCTAGCTACAACGA”(SEQ ID NO121)。
如圖12所示，上述設(shè)計(jì)的DNA酶能夠根據(jù)臂的長(zhǎng)度不同表現(xiàn)出一定范圍的有用的催化速度和有效催化濃度。生理?xiàng)l件下，典型地，根據(jù)基序8-17或10-23的本發(fā)明的DNA酶具有約0.005～0.1min-1的催化轉(zhuǎn)換速度(Kcat)，優(yōu)選約0.01～0.1min-1，更優(yōu)選約0.03～0.1min-1。一種具體優(yōu)選的酶的速度為約0.1min-1。在生理?xiàng)l件下，本發(fā)明的根據(jù)基序8-17或10-23的DNA酶也具有約0.05～1000納摩爾(nM)的催化半數(shù)最大有效濃度(half maximal effective concentration)(Km)，優(yōu)選約0.7～900nM，更優(yōu)選低于約1.0微摩爾(μM)，最優(yōu)選約0.1(μM)。
上述內(nèi)容還說(shuō)明，一種優(yōu)選的DNA酶具有的核苷酸修飾能穩(wěn)定該DNA酶使其能在生理?xiàng)l件下使用。只要該酶按照此處定義和測(cè)量的那樣能保持它的催化活性，那么多種修飾中的任一種都可以選用，因此本發(fā)明不只限于一種具體的穩(wěn)定修飾。優(yōu)選的修飾能使目標(biāo)DNA對(duì)外源或內(nèi)源溶核消化(nucleolytic digestion)的敏感性減弱。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述修飾包括摻入1個(gè)或多個(gè)核苷硫代磷酸酯殘基，這種描述見(jiàn)Zhang etal，Biochem.Pharmacol.，50545-556(1995)或Stein，C.A.，TrendsBiotechnol.，14147-149(1996)。硫代磷酸酯可以出現(xiàn)在臂中或核心中，在一個(gè)實(shí)施方案中可包括位于核心中的1個(gè)二聯(lián)嘧啶(dipyrimidine)上的1個(gè)殘基。眾所周知并如上述Zhang等人描述的那樣，另一種修飾包括糖核苷酸的核糖或脫氧核糖成分的2’位置上的O-甲基的取代。另外一種修飾是把1個(gè)插入的末端核苷酸連接到DNA分子的3’末端上，從而封閉了該3’末端，如同1個(gè)自由的5’末端。這種結(jié)構(gòu)能夠阻斷3’內(nèi)切核酸酶，可以通過(guò)在3’末端形成1個(gè)3’-3’連接的核苷酸(即一個(gè)倒轉(zhuǎn)的核苷酸)。在3’末端制備1個(gè)3’插入核苷酸是眾所周知的，利用寡核苷酸合成中的修飾后的固體載體，該載體以插入的末端3’殘基為起始原料的。一種優(yōu)選的用于該目的的固體載體材料是Dt-5’-CPG 500，可從Glen Research(標(biāo)準(zhǔn)成分，VA)，是一種帶有修飾后殘基的經(jīng)修飾的可控制孔(Controlled pore)的玻璃樹(shù)脂。
上述包括特定的實(shí)施方案和實(shí)施例的說(shuō)明書(shū)是用來(lái)說(shuō)明本發(fā)明的，而并非對(duì)本發(fā)明的限制。不脫離本發(fā)明的實(shí)際精神和范圍可以得出大量其他的變化和修改。
序列表(1)一般信息(i)申請(qǐng)人The Scripps Research Institute(ii)發(fā)明名稱酶促DNA分子(iii)序列數(shù)101(iv)通訊地址(A)收件人The Scripps Research Institute(B)街道10666 North Torrey Pines Road，TPC-8(C)城市La Jolla(D)州加利弗尼亞(E)國(guó)家美國(guó)(f)郵政編碼92037(v)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)介質(zhì)類型軟盤(B)計(jì)算機(jī)IBM PC可兼容機(jī)(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release#1.0，Version#1.25(vi)當(dāng)前申請(qǐng)資料(A)申請(qǐng)?zhí)朠CT/US95/(B)申請(qǐng)日01-DEC-1995(C)分類號(hào)(vii)在先申請(qǐng)資料(A)申請(qǐng)?zhí)朥S 08/472,194
(B)中請(qǐng)日1995-6-07(vii)在先申請(qǐng)資料(A)申請(qǐng)?zhí)朥S 08/349,023(B)申請(qǐng)日1994-12-2(viii)律師/代理人資料(A)姓名Logan，April C.
(B)登記號(hào)33，950(C)資料/文檔號(hào)463.2 PC(ix)通訊資料(A)電話(619)554-2937(B)傳真(619)554-6312(2)SEQ ID NO1的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度15個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO1CGGTAAGCTT GGCAC 15(2)SEQ ID NO2的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度20個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形(ii)分子類型DNA(基因組)(ix)特征
(A)名稱/關(guān)鍵詞misc_差異(B)位置取代(8，″″)(D)其它資料/標(biāo)準(zhǔn)名＝“腺苷核糖核苷酸”(xi)序列描述SEQ ID NO2TCACTATNAG GAAGAGATGG 20(2)SEQ ID NO3的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度38個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO3ACACATCTCT GAAGTAGCGC CGCCGTATAG TGACGCTA 38(2)SEQ ID NO4的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度80個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO4GTGCCAAGCT TACCGNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN 60NNNNNGTCGC CATCTCTTCC 80(2)SEQ ID NO5的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度28個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(ix)特征
(A)名稱/關(guān)鍵詞misc_特征(B)位置28(D)其它資料/標(biāo)準(zhǔn)名＝“2’3’環(huán)磷酸”(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞misc-差異(B)位置取代(28，””)(C)其他資料/標(biāo)準(zhǔn)名＝“腺苷核糖核苷酸”(xi)序列描述SEQ ID NO5GGGACGAATT CTAATACGAC TCACTATN 28(2)SEQ ID NO6的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度28個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞misc_差異(B)位置取代(28，″″)(D)其它資料/標(biāo)準(zhǔn)名＝“腺苷核糖核苷酸”(xi)序列描述SEQ ID NO6GGGACGAATT CTAATACGAC TCACTATN 28(2)SEQ ID NO7的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度19個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞misc_差異(B)位置取代(8，″″)
(D)其它資料/標(biāo)準(zhǔn)名＝“腺苷核糖核苷酸”(xi)序列描述SEQ ID NO7TCACTATNGG AAGAGATGG 19(2)SEQ ID NO8的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度8個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞misc_差異(B)位置取代(8，″″)(D)其它資料/標(biāo)準(zhǔn)名＝“腺苷核糖核苷酸”(xi)序列描述SEQ ID NO8TCACTATN 8(2)SEQ ID NO9的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度30個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO9CCATCTCTTC CTATAGTGAG TCCGGCTGCA 30(2)SEQ ID NO10的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度15個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)
(xi)序列描述SEQ ID NO10GTGCCAAGCT TACCG 15(2)SEQ ID NO11的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度43個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO11CTGCAGAATT CTAATACGAC TCACTATAGG AAGAGATGGC GAC 43(2)SEQ ID NO12的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度19個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞misc_差異(B)位置取代(8，″″)(D)其它資料/標(biāo)準(zhǔn)名＝“腺苷核糖核苷酸”(xi)序列描述SEQ ID NO12TCACTATNGG AAGAGATGG 19(2)SEQ ID NO13的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度43個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(ix)特征
(A)名稱/關(guān)鍵詞misc_差異(B)位置取代(28，″″)(D)其它資料/標(biāo)準(zhǔn)名＝“腺苷核糖核苷酸”(xi)序列描述SEQ ID NO13GGGACGAATT CTAATACGAC TCACTATNGG AAGAGATGGC GAC 43(2)SEQ ID NO14的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度50個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO14TCACACATCT CTGAAGTAGC GCCGCCGTAT GTGACGCTAG GGGTTCGCCT50(2)SEQ ID NO15的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度50個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO15GGGGGGAACG CCGTAACAAG CTCTGAACTA GCGGTTGCGA TATAGTCGTA50(2)SEQ ID NO16的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度50個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO16CGGGACTCCG TAGCCCATTG CTTTTTGCAG CGTCAACGAA TAGCGTATTA50
(2)SEQ ID NO17的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度50個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO17CCACCATGTC TTCTCGAGCC GAACCGATAC TTACGTCATA CCTCCCGTAT50(2)SEQ ID NO18的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度50個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO18GCCAGATTGC TGCTACCAGC GGTACGAAAT AGTGAAGTGT TCGTGACTAT50(2)SEQ ID NO19的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度50個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO19ATAGGCCATG CTTTGGCTAG CGGCACCGTA TAGTGTACCT GCCCTTATCG50(2)SEQ ID NO20的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度50個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO20TCTGCTCTCC TCTATTCTAG CAGTGCAGCG AAATATGTCG AATAGTCGGT50(2)SEQ ID NO21的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度50個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO21TTGCCCAGCA TAGTCGGCAG ACGTGGTGTT AGCGACACGA TAGGCCCGGT50(2)SEQ ID NO22的資科(i)序列特征(A)長(zhǎng)度50個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO22TTGCTAGCTC GGCTGAACTT CTGTAGCGCA ACCGAAATAG TGAGGCTTGA50(2)SEQ ID NO23的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度107個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞misc_差異(B)位置取代(28，″″)
(D)其它資料/標(biāo)準(zhǔn)名＝“腺苷核糖核苷酸”/標(biāo)記物＝rA(xi)序列描述SEQ ID NO23GGGACGAATT CTAATACGAC TCACTATNGG AAGAGATGGC GACATCTCNN NNNNNNNNNN 60NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNGT GACGGTAAGC TTGGCAC 107(2)SEQ ID NO24的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度49個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO24CCGCCCACCT CTTTTACGAG CCTGTACGAA ATAGTGCTCT TGTTAGTAT 49(2)SEQ ID NO25的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度48個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO25TCTCTTCAGC GATGCACGCT TGTTTTAATG TTGCACCCAT GTTAGTGA 48(2)SEQ ID NO26的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度46個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO26TCTCATCAGC GATTGAACCACTTGGTGGAC AGACCCATGT TAGTGA 46
(2)SEQ ID NO27的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度49個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO27CCGCCCACCT CTTTTACGAG CCTGTACGAA ATAGTGTTCT TGTTAGTAT 49(2)SEQ ID NO28的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度49個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO28CCGCCCACCT CTTTTACGAG CCTGTACGAA ATAGTGCTCT CGTTAGTAT 49(2)SEQ ID NO29的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度48個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO29TCTCAGACTT AGTCCATCAC ACTCTGTGCA TATGCCTGCT TGATGTGA 48(2)SEQ ID NO30的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度42個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO30CTCTCATCTG CTAGCACGCT CGAATAGTGT CAGTCGATGT GA42(2)SEQ ID NO31的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度40個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO31TACAGCGATT CACCCTTGTT TAAGGGTTAC ACCCATGTTA 40(2)SEQ ID NO32的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度40個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO32ATCAGCGATT AACGCTTGTT TCAATGTTAC ACCCATGTTA 40(2)SEQ ID NO33的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度40個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO33TTCAGCGATT AACGCTTATT TTAGCGTTAC ACCCATGTTA 40(2)SEQ ID NO34的資料
(i)序列特征(A)長(zhǎng)度40個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO34ATCAGCGATT CACCCTTGTT TTAAGGTTGC ACCCATGTTA 40(2)SEQ ID NO35的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度40個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO35ATCAGCGATT CACCCTTGTT TAAGCGTTAC ACCCATGTTG 40(2)SEQ ID NO36的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度40個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO36ATCAGCGATT CACCCTTGTT TTAAGGTTAC ACCCATGTTA 40(2)SEQ ID NO37的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度40個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO37ATCAGCGATT AACGCTTATT TTAGCGTTAC ACCCATGTTA 40(2)SEQ ID NO38的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度40個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO38ATCAGCGATT AACGCTTGTT TTAGTGTTGC ACCCATGTTA 40(2)SEQ ID NO39的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度40個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO39ATCAGCGATT AACGCTTATT TTAGCATTAC ACCCATGTTA 40(2)SEQ ID NO40的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度10個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO40GCCATGCTTT10(2)SEQ ID NO41的資料(i)序列特征
(A)長(zhǎng)度10個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO41CTCTATTTCT10(2)SEQ ID NO42的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度12個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO42TATGTGACGC TA 12(2)SEQ ID NO43的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度10個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO43TATAGTCGTA10(2)SEQ ID NO44的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度11個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)
(xi)序列描述SEQ ID NO44ATAGCGTATT A 11(2)SEQ ID NO45的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度13個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO45ATAGTTACGT CAT13(2)SEQ ID NO46的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度14個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO46AATAGTGAAG TGTT 14(2)SEQ ID NO47的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度11個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO47ATAGGCCCGG T 11(2)SEQ ID NO48的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度14個(gè)堿基對(duì)
(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO48AATAGTGAGG CTTG 14(2)SEQ ID NO49的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度12個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型RNA(基因組)(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO49GUAACUAGAG AU 12(2)SEQ ID NO50的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度98個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義無(wú)(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞misc差異(B)位置7..18(D)其它資料/注意＝“第7～18位是RNA；序列其余部分為DNA”(xi)序列描述SEQ ID NO50GGAAAAGUAA CUAGAGAUGG AAGAGATGGC GACNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN 60NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNCGGTAAG CTTGGCAC 98(2)SEQ ID NO51的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度99個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義無(wú)(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞misc_差異(B)位置1..24(D)其它資料/注意＝“第1～24位是RNA；序列其余部分為DNA”(xi)序列描述SEQ ID NO51GGAAAAAGUA ACUAGAGAUG GAAGAGATGG CGACNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN 60NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNCGGTAA GCTTGGCAC99(2)SEQ ID NO52的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度50個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO52CCAATAGTGC TACTGTGTAT CTCAATGCTG GAAACACGGG TTATCTCCCG50(2)SEQ ID NO53的資料(i)序列特征
(A)長(zhǎng)度50個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO53CCAAAACAGT GGAGCATTAT ATCTACTCCA CAAAGACCAC TTTCTCCCG 50(2)SEQ ID NO54的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度50個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO54ATCCGTACTA GCATGCAGAC AGTCTGTCTG CTTTTTCATT ACTCACTCCC50(2)SEQ ID NO55的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度49個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO55CAATTCATGA TGACCAACTC TGTCAACACG CGAACTTTTA ACACTGGCA 49(2)SEQ ID NO56的資料
(i)序列特征(A)長(zhǎng)度50個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO56CTTCCACCTT CCGAGCCGGA CGAAGTTACT TTTTATCACA CTACGTATTG50(2)SEQ ID NO57的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度50個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO57GGCAAGAGAT GGCATATATT CAGGTAACTG TGGAGATACC CTGTCTGCCA50(2)SEQ ID NO58的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度50個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO58CTAGACCATT CACGTTTACC AAGCTATGGT AAGAACTAGA ATCACGCGTA50
(2)SEQ ID NO59的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度50個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO59CGTACACGTG GAAAAGCTAT AAGTCAAGTT CTCATCATGT ACCTGACCGC50(2)SEQ ID NO60的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度50個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO60CAGTGATACA TGAGTGCACC GCTACGACTA AGTCTGTAAC TTATTCTACC50(2)SEQ ID NO61的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度50個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO61ACCGAATTAA ACTACCGAAT AGTGTGGTTT CTATGCTTCT TCTTCCCTGA50(2)SEQ ID NO62的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度50個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO62CAGGTAGATA TAATGCGTCA CCGTGCTTAC ACTCGTTTTA TTAGTATGTC50(2)SEQ ID NO63的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度49個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO63CCCTACAACA CCACTGGGCC CAATTAGATT AACGCTATTT TATAACTCG 49(2)SEQ ID NO64的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度49個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義無(wú)
(xi)序列描述SEQ ID NO64CCAAACGGTT ATAAGACTGA AAACTCAATC AATAGCCCAA TCCTCGCCC 49(2)SEQ ID NO65的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度50個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO65CACATGTATA CCTAAGAAAT TGGTCCCGTA GACGTCACAG ACTTACGCCA50(2)SEQ ID NO66的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度50個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO66CACAACGAAA ACAATCTTCC TTGGCATACT GGGGAGAAAG TCTGTTGTCC50(2)SEQ ID NO67的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度50個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假設(shè)無(wú)
(iv)反義無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO67CACACGAACA TGTCCATTAA ATGGCATTCC GTTTTTCGTT CTACATATGC50(2)SEQ ID NO68的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度49個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO68CAGAACGAGG GTCTTGTAAG ACTACACCTC CTCAGTGACA ATAATCCTG 49(2)SEQ ID NO69的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度49個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO69CACTACAGCC TGATATATAT GAAGAACAGG CAACAAGCTT ATGCACTGG 49(2)SEQ ID NO70的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度50個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)
(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO70GGGTACATTT ATGATTCTCT TATAAAGAGA ATATCGTACT CTTTTCCCCA50(2)SEQ ID NO71的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度49個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO71CCAAAGTACA TTCCAACCCCTT ATACGTGA AACTTCCAGT AGTTTCCTA 49(2)SEQ ID NO72的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度50個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO72CTTGAAGATC CTCATAAGAC GATTAAACAA TCCACTGGAT ATAATCCGGA50(2)SEQ ID NO73的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度50個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO73CGAATAGTGT CCATGATTAC ACCAATAACT GCCTGCCTAT CATGTTTATG50(2)SEQ ID NO74的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度50個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO74CCAAGAGAGT ATCGGATACA CTTGGAACAT AGCTAACTCG AACTGTACCA50(2)SEQ ID NO75的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度48個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO75CCACTGATAA ATAGGTAACT GTCTCATATC TGCCAATCAT ATGCCGTA 48(2)SEQ ID NO76的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度50個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO76CCCAAATTAT AAACAATTTA ACACAAGCAA AAGGAGGTTC ATTGCTCCGC50(2)SEQ ID NO77的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度50個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO77CAATAAACTG GTGCTAAACC TAATACCTTG TATCCAAGTT ATCCTCCCCC50(2)SEQ ID NO78的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度50個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO78CCGAATGACA TCCGTAGTGG AACCTTGCTT TTGACACTAA GAAGCTACAC50(2)SEQ ID NO79的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度50個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸
(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO79CCATAACAAA TACCATAGTA AAGATCTGCA TTATATTATA TCGGTCCACC50(2)SEQ ID NO80的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度50個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO80CAGAACAAAG ATCAGTAGCT AAACATATGG TACAAACATA CCATCTCGCA50(2)SEQ ID NO81的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度49個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO81CCTTTAGTTA GGCTAGCTAC AACGATTTTT CCCTGCTTGG CAACGACAC 49(2)SEQ ID NO82的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度50個(gè)堿基對(duì)
(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO82CTCCCTACGT TACACCAGCG GTACGAATTT TCCACGAGAG GTAATCCGCA50(2)SEQ ID NO83的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度36個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO83CGGCACCTCT AGTTAGACAC TCCGGAATTT TTCCCC 36(2)SEQ ID NO84的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度49個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO84CGGCACCTCT AGTTAGACAC TCCGGAATTT TAGCCTACCA TAGTCCGGT 49(2)SEQ ID NO85的資料(i)序列特征
(A)長(zhǎng)度47個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO85CCCTTTGGTT AGGCTAGCTA CAACGATTTT TCCCTGCTTG AATTGTA 47(2)SEQ ID NO86的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度51個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO86CCCTTTGGTT AGGCTAGCTA CAACGATTTT TCCCTGCTTG ACCTGTTACG A 51(2)SEQ ID NO87的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度48個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO87CCTTTAGTTA GGCTAGCTAC AACGATTTTT CCCTGCTTGG AACGACAC 48(2)SEQ ID NO88的資料
(i)序列特征(A)長(zhǎng)度50個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO88CATGGCTTAA TCATCCTCAA TAGAAGACTA CAAGTCGAAT ATGTCCCCC 50(2)SEQ ID NO89的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度50個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO89CAACAGAGCG AGTATCACCC CCTGTCAATA GTCGTATGAA ACATTGGGCC50(2)SEQ ID NO90的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度49個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO90TACCGACAAG GGGAATTAAA AGCTAGCTGG TTATGCAACC CTTTTCGCA 49
(2)SEQ ID NO91的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度49個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO91CTCGAAACAG TGATATTCTG AACAAACGGG TACTACGTGT TCAGCCCCC 49(2)SEQ ID NO92的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度50個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO92CCAATAACGT AACCCGGTTA GATAAGCACT TAGCTAAGAT GTTTATCCTG50(2)SEQ ID NO93的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度50個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO93CAATACAATC GGTACGAATC CAGAAACATA ACGTTGTTTC AGAATGGTCC50(2)SEQ ID NO94的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度50個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO94GCAACAACAA GAACCAAGTT ACATACACGT TCATCTATAC TGAACCCCCA50(2)SEQ ID NO95的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度50個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO95CCTTTGAGTT CCTAAATGCC GCACGGTAAG CTTGGCACAC TTTGACTGTA50(2)SEQ ID NO96的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度49個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義無(wú)
(xi)序列描述SEQ ID NO96CAAAGATCTC ACTTTGGAAA TGCGAAATAT GTATATTCGC CCTGTCTGC 49(2)SEQ ID NO97的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度50個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO97CCACGTAGAA TTATCTGATT TATAACATAA CGCAGGATAA CTCTCGCCCA50(2)SEQ ID NO98的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度48個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO98CACAAGAAAG TGTCGTCTCC AGATATTTGA GTACAAGGAA CTACGCCC 48(2)SEQ ID NO99的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度50個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假設(shè)無(wú)
(iv)反義無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO99CATGAAGAAA TAGGACATTC TACAGGCTGG ACCGTTACTA TGCCTGTAGG50(2)SEQ ID NO100的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度46個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO100CATAGGATAA TCATGGCGAT GCTTATGACG TGTACATCTA TACCTT46(2)SEQ ID NO101的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度50個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO101CAGATGATCT TCCTTTAAAG ACTACCCTTT AAAGAAACAT AAGGTACCCC50
權(quán)利要求
1.一種具有位點(diǎn)特異性內(nèi)切核酸酶活性的催化活性DNA分子，這種活性針對(duì)預(yù)先選定的底物核酸序列中被定義為切割位點(diǎn)的核苷酸序列具有特異性，所述分子具有位于核心區(qū)域旁側(cè)的第一和第二兩個(gè)底物結(jié)合區(qū)域，其中所述的第一底物結(jié)合區(qū)域有一段序列與所述預(yù)先選定的底物核酸序列中的第一部分互補(bǔ)，所述的第二底物結(jié)合區(qū)域有一段序列與所述預(yù)先選定的底物核酸序列中的第二部分互補(bǔ)，所述核心區(qū)域有一段根據(jù)下列通式的序列(I.)T(莖)’AGC(莖)”Z，其中(莖)’和(莖)”都是具有以下特征的一種三聯(lián)核苷酸即當(dāng)(莖)’(莖)”雜交配對(duì)時(shí)形成的3個(gè)堿基對(duì)中至少包括2個(gè)GC對(duì)，其中所述的Z＝WCGR或WCGAA，W＝A或T且R＝A或G；或(II)RGGCTAGCXACAACGA(SEQ ID NO 122)，其中所述的X＝T、C或A，R＝A或G。
2.權(quán)利要求1中的分子，其中所述的通式I為SEQ ID NO 120(8-17)。
3.權(quán)利要求1中的分子，其中所述的通式II為SEQ ID NO 121(10-23)。
4.權(quán)利要求1中的分子，其中所述的第一或第二底物結(jié)合區(qū)域的長(zhǎng)度為5～13個(gè)核苷酸。
5.權(quán)利要求1中的催化活性DNA分子，其中所述的催化活性DNA分子包括脫氧核糖核苷酸(DNA)、修飾后的DNA、核苷酸類似物或其組合。
6.權(quán)利要求1中的催化活性DNA分子，其中所述的底物核酸包括RNA、DNA、修飾后的RNA、修飾后的DNA、核苷酸類似物或其組合。
7.權(quán)利要求1中的催化活性DNA分子，其中所述的催化活性DNA分子包括一段具有5’和3’末端的單鏈脫氧核糖核酸，其中所述的末端經(jīng)過(guò)具有外切核酸酶抗性的核苷酸的修飾。
8.權(quán)利要求7中的催化活性DNA分子，其中所述的具有外切核酸酶抗性的核苷酸包括核苷硫代磷酸酯。
9.權(quán)利要求1中的催化活性DNA分子，其中所述的第一或第二底物結(jié)合區(qū)域包括至少2個(gè)硫代磷酸酯核苷。
10.權(quán)利要求1中的催化活性DNA分子，其中所述的核心區(qū)域包括在所述核心中的二聯(lián)嘧啶上有1個(gè)硫代磷酸酯核苷。
11.權(quán)利要求7中的催化活性DNA分子，其中所述的3’末端包括1個(gè)倒轉(zhuǎn)的(3’，3’-連接)核苷酸。
12.權(quán)利要求1中的催化活性DNA分子，其中所述的催化活性DNA分子包括1個(gè)2’O-甲基核糖核苷酸。
13.權(quán)利要求1中的催化活性DNA分子，其中所述的第一和第二底物結(jié)合區(qū)域包括一段與選自SEQ ID NOs 102～119的序列互補(bǔ)的核苷酸序列。
14.權(quán)利要求1中的催化活性DNA分子，其中所述的分子能夠催化Km值約0.05～1000nM的反應(yīng)。
15.權(quán)利要求1中的催化活性DNA分子，其中所述的催化活性DNA分子以低于約1.0微摩爾的Km與所述底物結(jié)合。
16.權(quán)利要求1中的催化活性DNA分子，其中所述的催化活性DNA分子以低于約0.1納摩爾的Km與所述底物結(jié)合。
17.權(quán)利要求1中的催化活性DNA分子，其中所述的分子具有的催化反應(yīng)轉(zhuǎn)換速度(kcat)為約0.005～0.1min-1。
18.權(quán)利要求1中的催化活性DNA分子，其中所述的內(nèi)切核酸酶活性因二價(jià)陽(yáng)離子的存在而增強(qiáng)。
19.權(quán)利要求18中的催化活性DNA分子，其中所述的二價(jià)陽(yáng)離子選自Pb2+、Mg2+、Mn2+、Zn2+、和Ca2+。
20.權(quán)利要求18中的催化活性DNA分子，其中所述的內(nèi)切核酸酶活性因Mg2+存在而增強(qiáng)。
21.權(quán)利要求1中的催化活性DNA分子，其中所述的內(nèi)切核酸酶活性因單價(jià)陽(yáng)離子的存在而增強(qiáng)。
22.權(quán)利要求21中的催化活性DNA分子，其中所述的單價(jià)陽(yáng)離子選自Na+和K+。
23.一種組合物，其中包括根據(jù)權(quán)利要求1的催化活性DNA分子的兩種或多種群體，其中每種群體中的催化活性DNA分子能切割同一底物中的不同的核苷酸序列。
24.一種組合物，其中包括根據(jù)權(quán)利要求1的催化活性DNA分子的兩種或多種群體，其中每種群體中的催化活性DNA分子能識(shí)別不同的底物。
25.一種切割目標(biāo)核酸分子的方法，包括a)將根據(jù)權(quán)利要求1的催化活性DNA分子和具有一段由所述的第一和第二廢物結(jié)合區(qū)域預(yù)篩的底物核酸序列的目標(biāo)核酸分子混合，形成反應(yīng)混合物；以及b)在預(yù)定的反應(yīng)條件下，保持所述的混合物使得所述DNA分子能夠切割所述目標(biāo)核酸分子，從而產(chǎn)生一定數(shù)目的底物產(chǎn)物。
26.權(quán)利要求25中的方法，其中所述的底物包括RNA。
27.權(quán)利要求25中的方法，其中所述的預(yù)定的反應(yīng)條件包括有單價(jià)陽(yáng)離子、二價(jià)陽(yáng)離子或二者的存在。
28.權(quán)利要求25中的方法，其中所述的混合包括把所述催化活性DNA分子導(dǎo)入到含目標(biāo)核酸分子的細(xì)胞中。
29.一種構(gòu)建催化活性DNA分子的方法，該分子能夠切割目標(biāo)核酸分子中的預(yù)定的底物核酸序列，該方法包括以下步驟a)從目標(biāo)核酸分子中篩選一段長(zhǎng)度為10～26個(gè)核苷酸的底物核酸序列；以及b)合成一種包括位于核心區(qū)域旁側(cè)的第一和第二兩個(gè)底物結(jié)合區(qū)域的脫氧核糖核酸分子，其中所述的第一底物結(jié)合區(qū)域有一段序列與所述預(yù)先選定的底物核酸序列中的第一部分互補(bǔ)，所述的第二底物結(jié)合區(qū)域有一段序列與所述預(yù)先選定的底物核酸序列中的第二部分互補(bǔ)，所述核心區(qū)域有一段根據(jù)下列通式的序列(I.)T(莖)’AGC(莖)”Z，其中(莖)’和(莖)”都是具有以下特征的一種三聯(lián)核苷酸即當(dāng)(莖)’(莖)”雜交配對(duì)時(shí)形成的3個(gè)堿基對(duì)中至少包括2個(gè)GC對(duì)，其中所述的Z＝WCGR或WCGAA，W＝A或T且R＝A或G；或(II.)RGGCTAGCXACAACGA(SEQ ID NO 122)，其中所述的X＝T、C或A，R＝A或G。
30.權(quán)利要求29中的方法，其中所述的通式I為SEQ ID NO 120(8-17)。
31.權(quán)利要求29中的方法，其中所述的通式II為SEQ ID NO 121(10-23)。
32.權(quán)利要求29中的方法，其中所述的第一或第二底物結(jié)合區(qū)域的長(zhǎng)度為5～13個(gè)核苷酸。
33.權(quán)利要求29中的方法，其中所述的催化活性DNA分子包括脫氧核糖核苷酸(DNA)、修飾后的DNA、核苷酸類似物或其組合體。
34.權(quán)利要求29中的方法，其中所述的催化活性DNA分子包括一段具有5’和3’末端的單鏈脫氧核糖核酸，其中所述的末端經(jīng)過(guò)具有外切核酸酶抗性的核苷酸的修飾。
35.權(quán)利要求29中的方法，其中所述的具有外切核酸酶抗性的核苷酸包括核苷硫代磷酸酯。
36.權(quán)利要求29中的方法，其中所述的第一或第二底物結(jié)合區(qū)域包括至少2個(gè)硫代磷酸酯核苷。
37.權(quán)利要求29中的方法，其中所述的核心區(qū)域包括在所述核心中的二聯(lián)嘧啶上有1個(gè)硫代磷酸酯核苷。
38.權(quán)利要求34中的方法，其中所述的3’末端包括1個(gè)倒轉(zhuǎn)的(3’，3’-連接)核苷酸。
39.權(quán)利要求29中的方法，其中所述的催化活性DNA分子包括1個(gè)2’O-甲基核糖核苷酸。
40.權(quán)利要求29中的方法，其中所述的第一和第二底物結(jié)合區(qū)域包括一段與選自SEQ ID NOs 102～119的序列互補(bǔ)的核苷酸序列。
41.權(quán)利要求29中的方法，其中所述的分子能夠催化Km值為約0.05～1000nM的反應(yīng)。
42.權(quán)利要求29中的方法，其中所述的分子具有的催化反應(yīng)轉(zhuǎn)換速度(kcat)為約0.005～0.1min-1。
43.權(quán)利要求29中的方法，其中所述的內(nèi)切核酸酶活性因二價(jià)陽(yáng)離子的存在而增強(qiáng)。
44.權(quán)利要求43中的方法，，其中所述的二價(jià)陽(yáng)離子選自Pb2+、Mg2+、Mn2+、Zn2+、和Ca2+。
45.權(quán)利要求29中的方法，其中所述的內(nèi)切核酸酶活性因單價(jià)陽(yáng)離子的存在而增強(qiáng)。
46.權(quán)利要求45中的方法，其中所述的單價(jià)陽(yáng)離子選自Na+和K+。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種脫氧核糖核酸酶——催化活性DNA分子或酶促DNA分子——這種酶能夠以位點(diǎn)特異性的方式切割核酸序列或核酸分子,尤其是RNA分子,并且還公開(kāi)了含有這種酶的組合物。本發(fā)明還公開(kāi)了制備及使用本發(fā)明中的酶和組合物的方法。
文檔編號(hào)C12N9/22GK1261920SQ98806724
公開(kāi)日2000年8月2日 申請(qǐng)日期1998年4月29日 優(yōu)先權(quán)日1997年4月29日
發(fā)明者G·F·喬伊斯, R·R·布雷克 申請(qǐng)人:斯克里普斯研究學(xué)院