本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，涉及二次諧波成像結(jié)合熒光成像在定位物質(zhì)透皮吸收中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

物質(zhì)透皮途徑主要有三條：角質(zhì)層、毛囊及汗管。其中，后兩條通路經(jīng)常被稱(chēng)為“旁路”，因?yàn)槠つw附屬器與整個(gè)皮膚表面積相比，僅占1％以下，故在大多數(shù)情況下不成為主要吸收途徑，但大分子物質(zhì)及離子型物質(zhì)難以通過(guò)富含類(lèi)脂的角質(zhì)層，可能經(jīng)由這些途徑進(jìn)入皮膚。

對(duì)于透皮吸收物質(zhì)的探測(cè)，主要有體內(nèi)方法和體外方法，體內(nèi)方法包括化學(xué)測(cè)定(檢查物質(zhì)吸收入血的量)、組織檢察(檢察用藥后組織結(jié)構(gòu)的變化)、同位素示蹤(用同位素標(biāo)定藥物，觀察其透皮后的吸收分布)；體外方法包括各種靜態(tài)或流通的擴(kuò)散小室，觀察藥物能否透過(guò)皮片。但無(wú)論是體內(nèi)還是體外的方法，都不能動(dòng)態(tài)觀察待測(cè)物質(zhì)吸收的動(dòng)態(tài)過(guò)程、進(jìn)入皮膚的途徑、在皮膚內(nèi)分布的部位及范圍，而這些指標(biāo)對(duì)于美容護(hù)膚類(lèi)產(chǎn)品的品質(zhì)評(píng)估至關(guān)重要?；瘖y品中的透皮吸收與藥物透過(guò)皮膚進(jìn)入體循環(huán)具有本質(zhì)的不同，主要區(qū)別在于不需要透過(guò)皮膚進(jìn)入體循環(huán)，化妝品中的功能性成分作用于皮膚表面或進(jìn)入表皮或真皮并在該部位聚集和發(fā)揮作用。例如，美白產(chǎn)品中的美白劑需要透過(guò)角質(zhì)層作用于表皮中的基底層，阻斷黑色素的產(chǎn)生。體外補(bǔ)充膠原蛋白使其進(jìn)入真皮層補(bǔ)充體內(nèi)的膠原纖維，恢復(fù)皮膚的彈性。因此明確美容護(hù)膚類(lèi)產(chǎn)品作用于皮膚的部位有助于分析其功效。即使在醫(yī)藥研究領(lǐng)域，已有的組織定位觀察方法如病理切片法，雖可以明確樣品的病理信息，但無(wú)法在切片上標(biāo)示大分子藥物的位置信息。透皮吸收儀作為傳統(tǒng)的研究透吸收作用的儀器，不能動(dòng)態(tài)觀察藥物進(jìn)入皮膚的位置與滯留情況。因此，需要一種簡(jiǎn)單、直觀、不影響待檢測(cè)樣品性狀的檢測(cè)方法。

二次諧波(second harmonic generation，SHG)是光與介質(zhì)的相互作用產(chǎn)生的二次非線(xiàn)性光學(xué)過(guò)程，其信號(hào)強(qiáng)度與激發(fā)光強(qiáng)度平方成線(xiàn)性關(guān)系。皮膚組織分為表皮、真皮、皮下組織三部分，是人體表面積最大的器官，由蛋白質(zhì)、核酸、糖、輔酶等成分組成，主要承擔(dān)著保護(hù)體內(nèi)器官和組織、排汗、感覺(jué)冷熱和壓力等功能^[6]。真皮層來(lái)源于中胚層，由纖維、基質(zhì)、細(xì)胞構(gòu)成，其中I型膠原纖維為真皮的主要構(gòu)成成分，約占95％，集合成束狀。在乳頭層纖維束較細(xì)，排列緊密，走行方向不一，不互相交織。它具有強(qiáng)烈的二階非線(xiàn)性極化率和結(jié)構(gòu)非中心對(duì)稱(chēng)性，是生物組織中能夠產(chǎn)生SHG信號(hào)的重要物質(zhì)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種全新的檢測(cè)待測(cè)物質(zhì)透皮吸收情況的方法。

本發(fā)明所提供的檢測(cè)待測(cè)物質(zhì)透皮吸收情況的方法，是以皮膚真皮層中膠原所產(chǎn)生的SHG信號(hào)作為皮膚組織的結(jié)構(gòu)內(nèi)參，觀察被熒光標(biāo)記的待測(cè)物質(zhì)經(jīng)皮吸收的過(guò)程和/或在皮膚組織中的聚集部位。

具體而言，所述方法可包括如下步驟：

(1)將所述待測(cè)物質(zhì)進(jìn)行熒光標(biāo)記；

(2)將經(jīng)步驟(1)熒光標(biāo)記后的所述待測(cè)物質(zhì)涂抹于皮膚外表面，然后對(duì)涂抹了所述待測(cè)物質(zhì)的皮膚組織采集SHG信號(hào)和熒光信號(hào)；

(3)通過(guò)觀察步驟(2)所采集的SHG信號(hào)和熒光信號(hào)的位置關(guān)系和/或變化過(guò)程，來(lái)確定所述待測(cè)物質(zhì)經(jīng)皮吸收的過(guò)程和/或在皮膚組織中的聚集部位；其中，所述SHG信號(hào)代表皮膚真皮層中的膠原；所述熒光信號(hào)代表所述待測(cè)物質(zhì)。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，步驟(2)中，采集所述SHG信號(hào)和所述熒光信號(hào)時(shí)所采用的儀器具體為雙光子掃描共聚焦顯微鏡。

進(jìn)一步，采用所述雙光子掃描共聚焦顯微鏡采集所述SHG信號(hào)和所述熒光信號(hào)時(shí)，SHG激發(fā)波長(zhǎng)具體為950nm，雙光子熒光激發(fā)波長(zhǎng)具體為750nm。

更加具體的，采用所述雙光子掃描共聚焦顯微鏡采集所述SHG信號(hào)和所述熒光信號(hào)時(shí)，激發(fā)光由物鏡聚焦到涂抹了所述待測(cè)物質(zhì)的皮膚組織上，產(chǎn)生的背向SHG信號(hào)與熒光信號(hào)由同一個(gè)放大倍數(shù)為25倍、數(shù)值孔徑為1.05的水浸顯微鏡物鏡來(lái)收集；雙光子熒光通道使用高通濾波片，波長(zhǎng)范圍420-460nm；在SHG通道使用窄帶濾波片，波長(zhǎng)范圍465-485nm；所述皮膚組織做全層Z軸掃描，步進(jìn)5μm，圖像采集速度10μm/pixel。完成圖像采集后，還包括將所得圖像進(jìn)行iMaris 7.4.2圖像渲染處理的步驟，紅色為SHG成像，藍(lán)色為熒光成像。

在所述方法中，所述待測(cè)物質(zhì)可為美容產(chǎn)品或者藥品。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述待測(cè)物質(zhì)具體為膠原蛋白。所采用的熒光分子為iFluor^TM350。

另外，二次諧波成像結(jié)合熒光成像的方法在檢測(cè)待測(cè)物質(zhì)透皮吸收情況中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。如下組合產(chǎn)品在制備檢測(cè)待測(cè)物質(zhì)透皮吸收情況的產(chǎn)品中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍：采集SHG信號(hào)的儀器和/或試劑，采集熒光信號(hào)的儀器和/或試劑，用于熒光標(biāo)記的熒光物質(zhì)。

其中，所述待測(cè)物質(zhì)可為美容產(chǎn)品或者藥品。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述待測(cè)物質(zhì)具體為膠原蛋白。所采用的熒光分子為iFluor^TM350。

在本發(fā)明中，所述方法為非疾病診斷治療的方法；所述應(yīng)用為非疾病診斷治療的應(yīng)用。

皮膚組織中具有非常豐富的自發(fā)熒光，如表皮中的角蛋白，上皮細(xì)胞中的NADH，上皮組織中的膠原蛋白和彈性蛋白等。這些熒光信號(hào)雖可被雙光子顯微鏡所收集但易與樣品標(biāo)記的熒光信號(hào)相混淆不適合作為內(nèi)參進(jìn)行樣品的皮膚吸收定位。SHG信號(hào)是生物組織原發(fā)性信號(hào)，因?yàn)闆](méi)有能量吸收，從而消除了光毒性、光損傷和光漂白性，可以長(zhǎng)時(shí)間的追蹤活細(xì)胞組織的生理活動(dòng)過(guò)程。SHG信號(hào)具有高度的方向性，能反映出樣品內(nèi)部的細(xì)微結(jié)構(gòu)，其光強(qiáng)度與激發(fā)光強(qiáng)度平方成正比，光譜寬度在飛秒激光下理論上只有10nm，利用窄波帶通濾光片可以有效排除熒光的干擾。

實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明利用真皮層中膠原的SHG信號(hào)做為皮膚組織的結(jié)構(gòu)內(nèi)參，觀察熒光標(biāo)記的膠原蛋白經(jīng)皮吸收的過(guò)程及聚集部位，熒光信號(hào)與SHG信號(hào)沒(méi)有疊加，表征清晰，直觀準(zhǔn)確地反映膠原類(lèi)物質(zhì)透皮吸收的途徑及作用部位，操作簡(jiǎn)便，快速準(zhǔn)確。本發(fā)明為透皮吸收的藥品及美容產(chǎn)品的活性檢測(cè)提供新的檢測(cè)方法。

附圖說(shuō)明

圖1為SDS-PAGE電泳條帶。其中，A為明場(chǎng)；B為365nm紫外光下觀察結(jié)果。泳道1為Marker，泳道2、3為未標(biāo)記熒光的R-hc，泳道4、5為iF-R-hc。

圖2為小鼠皮膚HE染色結(jié)果。

圖3為iMaris渲染圖。其中，A為大鼠皮膚真皮層膠原SHG圖像(激發(fā)波長(zhǎng)950nm)；B為iF-R-hc雙光子成像(激發(fā)波長(zhǎng)750nm)，箭頭所指為從毛囊擴(kuò)散出的iF-R-hc；C為SHG成像與熒光成像結(jié)合圖；D為SHG成像與熒光成像結(jié)合的剖面圖；E、F為局部放大圖，現(xiàn)實(shí)iF-R-hc沿毛囊深入到膠原纖維的下層150μm處。

具體實(shí)施方式

下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。

下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。

基因工程菌表達(dá)的人源膠原蛋白(re-combinant human collagen,R-hc)，由天津伊瑞雅生物科技有限公司提供(生產(chǎn)批號(hào)20161101)。BALB/c小鼠，(20±2)g：由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司(許可證號(hào)SCXK(京)2012-0001)提供。用于膠原蛋白標(biāo)記的熒光分子iFluorTM350succinimidyl ester，AAT Bioquest，激發(fā)/發(fā)射波長(zhǎng)(346nm/443nm)。雙光子共聚焦掃描顯微鏡，Olympus(FV1000)，Mai Tai DeepSee激光器(120fs，80MHz)。

實(shí)施例1、二次諧波結(jié)合雙光子熒光成像方法檢測(cè)人源膠原蛋白透皮吸收情況

一、熒光標(biāo)記R-hc

精密稱(chēng)取人源膠原蛋白R(shí)-hc干粉100mg，向其中加入磷酸鹽緩沖液10mL充分溶解，用1mol/L NaHCO₃溶液調(diào)pH 8.5±0.5。向iFluor^TM350中(1mg)加入無(wú)水DMSO1ml得到1mg/mL的染液。磁力攪拌器邊攪拌邊將熒光染液逐滴加入蛋白溶液中，避免將熒光素粘于燒瓶壁(大約在20min內(nèi)加完)，加完后，繼續(xù)避光攪拌12h左右。結(jié)合期間應(yīng)保持蛋白溶液于4℃左右，故需將燒杯和攪拌器一起移入4℃冰箱中。將熒光標(biāo)記后的蛋白取出放入透析袋中，置入避光含有超純水的大燒杯中，每4h換一次水，至超純水中檢測(cè)無(wú)熒光時(shí)停止透析。將熒光蛋白取出，冷凍干燥成粉末，待用。

采用5％濃縮膠，10％分離膠，R-hc和熒光標(biāo)記R-hc(iFluorTM350-Re-combinant human collagen，iF-R-hc)的上樣量為50μg,上樣體積為20μL，80V電壓下150min。電泳結(jié)束后，先用紫外光(365nm)下觀察熒光條帶，再經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色后，白光下觀察蛋白條帶，依據(jù)熒光條帶及蛋白條帶與蛋白質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)條帶的相對(duì)位置能夠確定蛋白是否被熒光探針成功標(biāo)記。

結(jié)果如圖1所示，其中，A為考馬斯亮藍(lán)凝膠成像，B為紫外光下觀察熒光條帶圖。由圖A可見(jiàn)R-hc分子量在58kD左右，圖B顯示其熒光標(biāo)記成功，且標(biāo)記過(guò)程對(duì)其分子量大小無(wú)顯著影響。

二、皮膚組織選取及SHG及雙光子熒光成像

1、皮膚組織選取

小鼠麻醉后剃去背部毛發(fā)，將步驟一所得iF-R-hc溶液(1mg/mL)均勻涂抹于已暴露的背部皮膚組織，避光，室溫條件下待其皮膚自然吸收1h后取下2cm×2cm全層皮膚組織，平鋪于載玻片上。將全層皮膚組織置于雙光子掃描共聚焦顯微鏡下進(jìn)行圖像采集。采集后皮膚做經(jīng)常規(guī)脫水、包埋、切片后進(jìn)行HE染色。用Image Pro Plus6.0軟件圖像處理，以基底層為起點(diǎn)，皮下組織與真皮層銜接處為終點(diǎn)，測(cè)量真皮層平均厚度。

2、皮膚組織的SHG及雙光子熒光成像

SHG成像與雙光子熒光成像均從背向收集信號(hào)，SHG激發(fā)波長(zhǎng)950nm，雙光子熒光激發(fā)波長(zhǎng)750nm，激發(fā)光由物鏡聚焦到皮膚樣品組織上，產(chǎn)生的背向SHG信號(hào)與熒光信號(hào)由同一個(gè)放大倍數(shù)為25倍、數(shù)值孔徑為1.05的水浸顯微鏡物鏡來(lái)收集，雙光子熒光通道使用高通濾波片，波長(zhǎng)范圍420-460nm；在SHG通道使用窄帶濾波片，波長(zhǎng)范圍465-485nm，組織做全層Z軸掃描，步進(jìn)5μm，圖像采集速度10μm/pixel。將所得圖像進(jìn)行iMaris 7.4.2圖像渲染處理，紅色為SHG成像，藍(lán)色為熒光成像。

3、結(jié)果

膠原主要存在于皮膚的真皮層中，是真皮的支撐結(jié)構(gòu)，其網(wǎng)狀架構(gòu)為皮膚提供了保護(hù)和彈性(圖2中右)，在纖維之間則分布著大量的水分、細(xì)胞外基質(zhì)和功能性細(xì)胞，是皮膚重要的生化反應(yīng)場(chǎng)所，為表皮層提供水分和營(yíng)養(yǎng)。小鼠皮膚的HE染色結(jié)果顯示(圖2中左)，從表皮基底層到皮下組織，即真皮層平均厚度在158μm左右，膠原蛋白層應(yīng)存在于此區(qū)域中。

給小鼠皮膚涂抹iF-R-hc 1h后取小鼠皮膚進(jìn)行觀察，二次諧波信號(hào)顯示，小鼠皮膚本底膠原蛋白SHG信號(hào)較強(qiáng)，由前期研究表明[王毅，鮑進(jìn)，盛巡，等.用光學(xué)二次諧波成像技術(shù)觀察皮膚內(nèi)不同種類(lèi)的膠原[J].激光生物學(xué)報(bào),2005,14(4):274-278.]其可能為I型膠原纖維，位于皮下100μm左右的真皮層中(圖3中A)，分布有毛囊結(jié)構(gòu)的空腔(箭頭所示)。

外源iF-R-hc雙光子掃描成像結(jié)果顯示(圖3中B)，該蛋白主要集中于毛囊內(nèi)，但已有一點(diǎn)蛋白從毛囊擴(kuò)散到真皮層內(nèi)(如圖3中E、F箭頭所示)，該蛋白聚集的位置在圖3中C疊加圖中可清晰顯示。從圖3中D縱向剖面圖中可以看出，外源iF-R-hc與內(nèi)源膠原開(kāi)始于同一深度并沿毛囊向下延伸，其深度可達(dá)150μm，但未超過(guò)真皮層厚度。