專利名稱：使用表達(dá)巢蛋白的干細(xì)胞顯像新生血管的血管發(fā)生模型的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
公開的發(fā)明涉及這樣的觀察，即巢蛋白(nestin)表達(dá)是內(nèi)皮細(xì)胞增殖的 標(biāo)記。巢蛋白表達(dá)對血管發(fā)生而言是一種特別有效的標(biāo)記物，特別是針對 與肺瘤相關(guān)的血管發(fā)生。具體地，巢蛋白可以作為一種針對諸如神經(jīng)膠質(zhì) 瘤、血管母細(xì)胞瘤、神經(jīng)鞘瘤、髓母細(xì)胞瘤、和腦膜瘤的腦部腫瘤的極好 的內(nèi)皮標(biāo)記物。
背景技術(shù)：
巢蛋白和波形纖維蛋白(vimentin)與膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)—樣是一 種中間連絲(intermediate filament),并4皮4企測到大量存在于生長中的大鼠和 人的胚胎中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的神經(jīng)上皮干/祖細(xì)胞中(Lendahl, U等人，Cell (1990) 60: 585-595; Messam， C A.等人，Exp. Neurol. (2000) 161: 585-596 ; Tohyama, T.等人，Lab. Invest. (1992) 66: 303-313; Tohyama, T，等人,Am. J PathoL (1993) 143:258-268))。巢蛋白也許和波形纖維蛋白一起，通過神經(jīng) 上皮細(xì)胞中的共聚合作用形成中間連絲束(Eliasson, C.等人，J. Biol. Chem. (1999) 274: 23996-24006 ; Rutka, J, T.等人，Int. J. Dev. Neurosci. (1999) 17: 503-515)。
巢蛋白mRNA在處于胚胎發(fā)育期第15天(E15)的大鼠胚胎的大腦中高 度表達(dá)，然后下降直到產(chǎn)后第12天(P12)，并且從產(chǎn)后第18天到成體期消 失(Lendahl, U.等人，同上)。使用小鼠中巢蛋白轉(zhuǎn)基因促進(jìn)的P-半乳糖苷酶 表達(dá)分析，在神經(jīng)管閉合(E9)后立即在神經(jīng)上皮細(xì)胞和體節(jié)中檢測到LacZ 活性(Zimmerman,L.等人，Neuron (1994) 12: 11-24)。在E14.5和E16.5 ， LacZ染色在小鼠胚胎紋狀體和大腦皮層中增生的腦室區(qū)域變得更強(qiáng)，在成熟皮 層中表達(dá)水平下降，局限在室管膜細(xì)胞群中。
在人類神經(jīng)膠質(zhì)瘤和成膠質(zhì)細(xì)胞瘤中也檢測到基本的巢蛋白表達(dá)
(Dahlstrand, J.等人，CancerRes (1992) 52: 5334-5341)。同諸如纖維狀細(xì)胞的 星形細(xì)胞瘤這樣的次惡性形式相比，在高度惡性的神經(jīng)膠質(zhì)瘤尤其是成膠 質(zhì)細(xì)胞瘤中頻繁觀察到巢蛋白的免疫染色。相反地，在非腫瘤的腦組織中 很少可通過免疫染色檢測到巢蛋白，但巢蛋白有時(shí)在血管內(nèi)皮中有微弱的顯示。
巢蛋白mRNA大概長6.2千堿基，并且其基因包含三個(gè)內(nèi)含子。有趣 的是，神經(jīng)上皮細(xì)胞特異性的巢蛋白表達(dá)是由巢蛋白基因的第二個(gè)內(nèi)含子 驅(qū)動(dòng)的，而肌肉前體特異性表達(dá)卻是由第 一個(gè)內(nèi)含子驅(qū)動(dòng)的(Lothian, C.等人: Eur. J. Neurosci. (1997) 9: 452-462; Zimmerman, L，等人，同上)。
先前在七種人類神經(jīng)膠質(zhì)瘤/成膠質(zhì)細(xì)胞瘤衍生的細(xì)胞系中檢驗(yàn)到了 巢蛋白的表達(dá)(Kurihara， H.等人.，Gene Cher. (2000) 7: 686-693)。根據(jù) Northern印跡分析，表達(dá)水平從高(U251， KG-1C)到無法檢測(NP-2， LN-Z308, T98G)之間變化。雖然惡性化的程度總體上反映了紳瘤在體內(nèi)的倍 增時(shí)間，然而表達(dá)的水平并不和細(xì)胞系的生長速度平行。神經(jīng)細(xì)胞特異性 的調(diào)節(jié)物，包括在基因5'上游區(qū)域之前的第二個(gè)內(nèi)含子，驅(qū)動(dòng)LacZ以和每 一細(xì)胞系中mRNA表達(dá)水平相應(yīng)的程度表達(dá)(Kurihara,H.等人，同上)。這 種神經(jīng)膠質(zhì)瘤/成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞系中巢蛋白表達(dá)水平的可變性導(dǎo)致了對 從低度到高度惡性化過程中人類神經(jīng)膠質(zhì)瘤/成膠質(zhì)細(xì)胞瘤中的巢蛋白表 達(dá)的重新評^\
雖然在結(jié)腸直腸癌內(nèi)皮中報(bào)導(dǎo)了許多和血管發(fā)生相關(guān)的基因，但巢蛋 白并未包括在其中(Croix， B. S.等人，Science (2000) 289: 1197-1202)。在腦腫 瘤內(nèi)皮中的與血管發(fā)生相關(guān)的基因可能與在結(jié)腸直腸癌內(nèi)皮中的不同。值 得注意的是即使在腦腫瘤細(xì)胞中沒有發(fā)現(xiàn)巢蛋白表達(dá)，在腦腫瘤內(nèi)皮中也 發(fā)現(xiàn)了強(qiáng)烈的巢蛋白表達(dá)。
發(fā)明概述
表達(dá)巢蛋白的細(xì)胞，其由能在再生中的表皮和真皮中增殖的熒光蛋白 (FP)來標(biāo)記，反映了巢蛋白陽性的細(xì)胞群體，這些細(xì)胞在應(yīng)答于損傷時(shí)出現(xiàn)增殖并從靠近病灶位點(diǎn)的突起遷移。巢蛋白表達(dá)作為與腫瘤相關(guān)的血管發(fā) 生的標(biāo)記特別有用。具體地，巢蛋白可以作為針對諸如神經(jīng)膠質(zhì)瘤、血管 母細(xì)胞瘤、神經(jīng)鞘瘤、髓母細(xì)胞瘤、和腦膜瘤等腦部腫瘤的極好的內(nèi)皮標(biāo) 記物而起作用。因此，已描述的發(fā)明具有作為一種血管發(fā)生模型的用途。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，公開的發(fā)明涉及一種監(jiān)測血管發(fā)育的方法，包 括提供血管發(fā)生干細(xì)胞，其中所述干細(xì)胞包含表達(dá)盒，該盒編碼在巢蛋白
調(diào)控元件遺傳控制下的熒光蛋白(FP);在宿主中培養(yǎng)'所述干細(xì)胞；并且監(jiān)測 導(dǎo)致血管發(fā)育的干細(xì)胞的血管發(fā)生活性。
在本發(fā)明的一方面，血管發(fā)生干細(xì)胞是表達(dá)巢蛋白的細(xì)胞，例如毛嚢 細(xì)胞或者肺瘤細(xì)胞。這些細(xì)胞能夠在體外或者體內(nèi)生長。腫瘤細(xì)胞的例子 包括黑色素瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、血管母細(xì)胞瘤、神經(jīng)鞘瘤、髓母細(xì)胞瘤、和 腦膜瘤。
本發(fā)明的另 一方面利用了 一種或多種在巢蛋白調(diào)控元件控制下的熒光 蛋白。這些蛋白質(zhì)的例子包括綠色熒光蛋白(GFP)、紅色熒光蛋白(RFP)、藍(lán) 色熒光蛋白(BFP)和黃色熒光蛋白(YFP)。優(yōu)選地，巢蛋白調(diào)控元件是由人巢 蛋白基因第二內(nèi)含子編碼的。
本發(fā)明的另一方面涉及利用宿主生物體。宿主生物體優(yōu)選是脊推動(dòng)物。 特別優(yōu)選的宿主生物體是哺乳動(dòng)物或者鳥類。優(yōu)選的哺乳動(dòng)物宿主的例子 包括小鼠、大鼠、兔、犬和貓。優(yōu)選的鳥類宿主的例子包括雞和雞卵。
在公開的本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，血管發(fā)生干細(xì)胞包括巢蛋白調(diào)控 下的第一熒光蛋白，并且宿主生物體包含巢蛋白調(diào)控下的第二熒光蛋白， 其中第一熒光蛋白不同于第二熒光蛋白。
公開的本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案涉及篩選血管發(fā)生調(diào)節(jié)劑的方法，包 括提供血管發(fā)生干細(xì)胞，其中干細(xì)胞包含表達(dá)盒，該盒編碼一種在巢蛋白 調(diào)控元件遺傳控制下的熒光蛋白(FP);在血管發(fā)生調(diào)節(jié)試劑存在時(shí)于宿主中 培養(yǎng)這種干細(xì)胞；并且其中監(jiān)測所述干細(xì)胞的血管發(fā)生活性。
本發(fā)明還涉及
1. 一種監(jiān)測血管發(fā)育的方法，包括
提供血管發(fā)生干細(xì)胞，其中所述干細(xì)胞包含表達(dá)盒，該表達(dá)盒編碼在 巢蛋白調(diào)控元件遺傳控制下的熒光蛋白； 在宿主中培養(yǎng)所述干細(xì)胞；和監(jiān)測導(dǎo)致血管發(fā)育的干細(xì)胞血管發(fā)生活性。
2. 項(xiàng)1的方法，其中所述血管發(fā)生干細(xì)胞是表達(dá)巢蛋白的細(xì)胞。
3. 項(xiàng)2的方法，其中所述表達(dá)巢蛋白的細(xì)胞是毛嚢細(xì)胞。
4. 項(xiàng)3的方法，其中所述毛嚢細(xì)胞生長在體外培養(yǎng)物中。
5. 項(xiàng)2的方法，其中所述表達(dá)巢蛋白的細(xì)胞是腫瘤細(xì)胞。
6. 項(xiàng)5的方法，其中所述腫瘤細(xì)胞來自選自黑色素瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、 血管母細(xì)胞瘤、神經(jīng)鞘瘤、髓母細(xì)胞瘤和腦膜瘤組成的組的腫瘤類型。
7. 項(xiàng)1的方法，其中所述焚光蛋白選自綠色熒光蛋白(GFP)、紅色焚 光蛋白(RFP)、藍(lán)色焚光蛋白(BFP)和黃色熒光蛋白(YFP)組成的組。
8. 項(xiàng)1的方法，其中所述巢蛋白調(diào)控元件是由人巢蛋白基因第二內(nèi)含 子編碼的。
9. 項(xiàng)1的方法，其中所述宿主生物是脊推動(dòng)物生物體。
10. 項(xiàng)9的方法，其中所述宿主生物體是哺乳動(dòng)物或鳥類。
11. 項(xiàng)10的方法，其中所述哺乳動(dòng)物宿主選自小鼠、大鼠、兔、犬和 貓組成的組。
12. 項(xiàng)9的方法，其中所述宿主生物體是雞或者雞卵。
13. 項(xiàng)1的方法，其中所述血管發(fā)生干細(xì)胞包含處于巢蛋白調(diào)節(jié)控制 下的第一熒光蛋白，并且宿主生物包含處于巢蛋白調(diào)節(jié)控制下的第二熒光 蛋白，其中的第一熒光蛋白不同于第二熒光蛋白。
14. 一種篩選血管發(fā)生調(diào)節(jié)劑的方法，包括
提供血管發(fā)生干細(xì)胞，其中所述干細(xì)胞包含表達(dá)盒，該表達(dá)盒編碼在 巢蛋白調(diào)控元件遺傳控制下的熒光蛋白；
在血管發(fā)生調(diào)節(jié)試劑存在下于宿主細(xì)胞中培養(yǎng)干細(xì)胞；和 其中監(jiān)測所述干細(xì)胞的血管發(fā)生活性。
15. 項(xiàng)14的方法，其中所述血管發(fā)生干細(xì)胞是表達(dá)巢蛋白的細(xì)胞。
16. 項(xiàng)15的方法，其中所述表達(dá)巢蛋白的細(xì)胞是毛嚢細(xì)胞。
17. 項(xiàng)16的方法，其中所述毛嚢細(xì)胞生長在體外培養(yǎng)物中。
18. 項(xiàng)15的方法，其中所述表達(dá)巢蛋白的細(xì)胞是腫瘤細(xì)胞。
19. 項(xiàng)18的方法，其中所述肺瘤細(xì)胞來自選自黑色素瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、 血管母細(xì)胞瘤、神經(jīng)鞘瘤、髓母細(xì)胞瘤和腦膜瘤組成的組的肺瘤類型。20. 項(xiàng)14的方法，其中所述熒光蛋白選自綠色熒光蛋白(GFP)、紅色 熒光蛋白(RFP)、藍(lán)色熒光蛋白(BFP)和黃色熒光蛋白(YFP)組成的組。21. 項(xiàng)14的方法，其中所述巢蛋白調(diào)控元件是由人巢蛋白基因第二內(nèi) 含子編碼的。22. 項(xiàng)14的方法，其中所述宿主生物是脊推動(dòng)物生物體。23. 項(xiàng)22的方法，其中所述宿主生物體是哺乳動(dòng)物或鳥類。24. 項(xiàng)23的方法，其中所述哺乳動(dòng)物宿主選自包括小鼠、大鼠、兔、 犬和貓組成的組。25. 項(xiàng)23的方法，其中所述宿主生物體是雞或雞卵。26. 項(xiàng)14的方法，其中所述血管發(fā)生干細(xì)胞包含處于巢蛋白調(diào)節(jié)控制 下的第一熒光蛋白，并且宿主生物包含處于巢蛋白調(diào)節(jié)控制下的第二熒光 蛋白，其中的第一熒光蛋白不同于第二熒光蛋白。附圖簡述圖la-e顯示了來自ND-GFP轉(zhuǎn)基因小鼠背側(cè)皮膚真皮面的視圖。圖中 標(biāo)尺代表100pm的距離。圖2a-g顯示了植入棵鼠皮下組織的ND-GFP觸須毛嚢(vibrissa follicle) 圖像(標(biāo)尺，100pm)。圖3a-c顯示了在棵鼠腎嚢之下移植的ND-GFP觸須毛嚢的圖像(標(biāo)尺， 100,)。圖4a顯示了移植前分離的ND-GFP觸須毛嚢。圖4b顯示了移植后10 天棵鼠受創(chuàng)傷皮膚中的ND-GFP觸須毛嚢圖像。圖4c和4d顯示了來自圖 4b區(qū)域的高放大倍數(shù)圖像，顯示為白色陰影框。圖4e是ND-GFP觸須毛嚢 移植進(jìn)入創(chuàng)傷棵鼠皮膚的示意圖。(標(biāo)尺，100(im)實(shí)施發(fā)明的方式公開的本發(fā)明提供了研究血管發(fā)生的模型系統(tǒng)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方 案中，血管發(fā)生內(nèi)皮干細(xì)胞由編碼熒光蛋白的表達(dá)系統(tǒng)標(biāo)記，所述熒光蛋 白的表達(dá)由已被公開為來自在血管發(fā)生內(nèi)皮干細(xì)胞中優(yōu)選表達(dá)的基因的調(diào) 控序列所控制。所述表達(dá)系統(tǒng)提供可視標(biāo)記物用來觀察血管發(fā)生過程。表優(yōu)選用于控制標(biāo)記蛋白的表達(dá)。因此，公開的模型系統(tǒng)使用編碼一種或多 種巢蛋白調(diào)控序列控制下的熒光蛋白的血管發(fā)生干細(xì)胞來模擬血管發(fā)生。血管發(fā)生干細(xì)胞公開的模型系統(tǒng)使用標(biāo)記的祖細(xì)胞或干細(xì)胞作為血管發(fā)生的標(biāo)記物。 巢蛋白表達(dá)對于干細(xì)胞諸如中樞神經(jīng)系統(tǒng)干細(xì)胞、神經(jīng)上皮干細(xì)胞和毛嚢 鞘祖細(xì)胞是極好的的標(biāo)記物。巢蛋白也是某些癌細(xì)胞的極好的標(biāo)記物，如黑色素瘤(melanoma)和具體是腦腫瘤諸如神經(jīng)膠質(zhì)瘤(glioma)、血管母細(xì)胞 瘤(hemangioblastoma)、 神經(jīng)鞘瘤(Schwannoma)、 髄母細(xì)胞瘤 (medulloblastoma)、 禾口月S月莫瘤(meningioma)。巢蛋白是一種中間連絲，它可作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)祖細(xì)胞的標(biāo)記。具體 地，具有巢蛋白調(diào)控序列控制下的綠色熒光蛋白的轉(zhuǎn)基因小鼠已經(jīng)生成并 用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)干細(xì)胞的自我更新和多潛能的顯示。雖然，在一個(gè)優(yōu)選 的實(shí)施方案中，巢蛋白可能與檢測試劑諸如綠色熒光蛋白連接以利于分離 過程，這些細(xì)胞的其它標(biāo)記能用于分離毛嚢干細(xì)胞以及其它任何檢測試劑。 例如，可以在體外或原位對細(xì)胞進(jìn)行測定并4企測標(biāo)記的結(jié)合伴倡、抗體、 或者結(jié)合的核酸。在將毛嚢干細(xì)胞(hair follicle stem cell)附著于固體支持物 上的實(shí)施方案中，測定可以采用其它類型的信號分子，其中未結(jié)合的信號 分子能與結(jié)合在細(xì)胞上的信號分子分離。例如，信號分子可用放射性同位 素(例如，125I， 131I， 35S, 32P， 14C或3H);光散射標(biāo)簽(Genicon Sciences Corporation, San Diego，CAand see等，美國專利號6,214, 560);酶或蛋白質(zhì) 標(biāo)簽(例如焚光蛋白(FP)或過氧化物酶)；或另一種發(fā)色標(biāo)記或染料(例如， 德克薩斯紅)進(jìn)行標(biāo)記。此外，F(xiàn)ACS或其它的細(xì)胞分離機(jī)制可以用于分離 細(xì)胞。毛嚢干細(xì)胞的定位根據(jù)毛發(fā)周期而變化。在巢蛋白-FP轉(zhuǎn)基因小鼠的毛 發(fā)初始生長的早期，表達(dá)巢蛋白的細(xì)胞定位于位于毛嚢干細(xì)胞所在的毛嚢 突起中的皮脂腺正下方的永久上端毛嚢(permanent upper hair follicle)之中。 在突起部分的表達(dá)巢蛋白的細(xì)胞相對較小，呈卵形并通過小的樹突相互連 接而圍繞著發(fā)干(hair shaft)。圖3顯示了毛嚢中表達(dá)巢蛋白的細(xì)胞的定位是 依賴于毛發(fā)周期的。在毛發(fā)生長終期(telogen)和毛發(fā)初始生長初期，熒光蛋 白陽性的細(xì)胞，例如，表達(dá)巢蛋白的細(xì)胞，主要位于突起區(qū)域(bulgearea)。在毛發(fā)生長終期和毛發(fā)初始生長的早期已經(jīng)看到表達(dá)熒光蛋白的毛嚢干細(xì) 胞。來自于毛發(fā)生長終期的毛嚢干細(xì)胞顯示為是原始的并且已經(jīng)定位，它 們優(yōu)選進(jìn)行收獲，雖然這些細(xì)胞可以從毛發(fā)周期的任何階段收獲。申請?zhí)?0/251，657,題為"巢蛋白表達(dá)的毛嚢干細(xì)胞"的美國專利探討了收獲的技術(shù)， 在此處引用作為參考。在毛發(fā)初始生長中期和晚期，表達(dá)熒光蛋白的細(xì)胞定位于上部外根鞘 和突起區(qū)域而不是毛發(fā)基質(zhì)球中。這些觀察結(jié)果提示表達(dá)巢蛋白的細(xì)胞形 成了外根鞘，其與觀察到的毛嚢干細(xì)胞的行為一致。免疫組織化學(xué)染色的 結(jié)果顯示巢蛋白、熒光蛋白、角蛋白5/8和角蛋白15共定位于毛嚢突起細(xì) 胞、外根鞘細(xì)胞和皮脂腺的基底細(xì)胞中。這些數(shù)據(jù)進(jìn)一步表明在毛嚢突起 部中表達(dá)巢蛋白-熒光蛋白的細(xì)胞是毛嚢干細(xì)胞。巢蛋白驅(qū)動(dòng)的綠色熒光蛋 白也一皮發(fā)現(xiàn)在嚢間神經(jīng)狀網(wǎng)絡(luò)中高度表達(dá)。神經(jīng)干細(xì)胞中、毛嚢干細(xì)胞中 和嚢間神經(jīng)狀網(wǎng)絡(luò)中巢蛋白的普遍表達(dá)提示它們的共同起源。在一般應(yīng)用中，將標(biāo)記的細(xì)胞引入宿主生物體，在這里細(xì)胞生長并且 分化以形成新生血管。新生血管一般與宿主生物體中存在的血管交叉合流 (anastomosis)。利用標(biāo)準(zhǔn)的植入方法諸如移植、經(jīng)皮注射和植入可以將標(biāo)記 的細(xì)^^植入到任何合適的宿主中并且讓其發(fā)展和發(fā)育。才直入可以以本領(lǐng)域已知的任何方式來實(shí)施。在一個(gè)實(shí)施方案中，將毛 嚢干細(xì)胞或由其分化的細(xì)胞經(jīng)系統(tǒng)注入受試者體內(nèi)。在另一方面，將毛嚢 干細(xì)胞或由其分化的細(xì)胞直接注入受試者的器官或組織中。優(yōu)選地器官或 組織是視網(wǎng)膜、大腦、肝或與心血管相關(guān)的組織或肌肉，例如心臟或肺。 另外，也涉及附著或生長在合成支持物上然后進(jìn)行植入的細(xì)胞或組織。與 由其源細(xì)胞而來的受試者相比，毛嚢干細(xì)胞或由其分化的細(xì)胞能夠被異源 移植到不同受試者中。然而，由于毛嚢干細(xì)胞的可得性，在一個(gè)優(yōu)選的實(shí) 施方案中細(xì)胞能夠從待治療的受試者體內(nèi)獲取并且如果需要，可以生長以 提供分化的細(xì)胞，并且可以對干細(xì)胞或分化的細(xì)胞進(jìn)行自體移植。由于本 發(fā)明的干細(xì)胞足夠原始因而當(dāng)移植時(shí)宿主不太可能排斥所述細(xì)胞，所以還 考慮了毛嚢干細(xì)胞庫的用途。將標(biāo)記細(xì)胞移植入脊推動(dòng)物中的技術(shù)包括通過在需要位置的進(jìn)行手術(shù) 原位移植(SOI)的直接移植。腎嚢中的移植是優(yōu)選的種植位點(diǎn)。當(dāng)標(biāo)記的細(xì) 胞是胂瘤細(xì)胞時(shí)，移植的位點(diǎn)一般是腫瘤細(xì)胞來源的位置。合適的位點(diǎn)包括肺、肝、胰腺、胃、乳房、卵巢、前列腺、骨髓、大腦和其它對惡性敏 感的組織。 一旦標(biāo)記細(xì)胞已經(jīng)移植，脊推動(dòng)物就成為用于研究血管發(fā)生的 模型系統(tǒng)。標(biāo)記的細(xì)胞于是可以發(fā)展發(fā)育并且在脊推動(dòng)物遠(yuǎn)離種植位點(diǎn)的 位點(diǎn)監(jiān)測FP標(biāo)記細(xì)胞的出現(xiàn)。監(jiān)測可以對脊推動(dòng)物整體進(jìn)行直接觀察，例 如用熒光顯微鏡，或?qū)⒔M織切片進(jìn)行顯微檢查。用作模型的合適的脊推動(dòng)物受試者優(yōu)選哺乳動(dòng)物受試者，最優(yōu)選諸如 兔、大鼠、小鼠、犬、貓等方便的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。為了和人類受試者更接近的 相似性，應(yīng)該使用靈長類動(dòng)物。特別有用的受試者是對肺瘤發(fā)育敏感的受 試者，例如有受損免疫系統(tǒng)的受試者， 一般為棵鼠或SCID小鼠。任何適當(dāng) 的脊推動(dòng)物受試者都能使用，主要根據(jù)方便以及與最終目標(biāo)系統(tǒng)的相似性 指導(dǎo)受試者的選擇。體外系統(tǒng)如組織培養(yǎng)物也能作為合適的宿主。適合于 這種研究的系統(tǒng)包括固體支持的培養(yǎng)物諸如那些在膠原凝膠等上維持的培 養(yǎng)物。標(biāo)記的細(xì)胞可以通過在體外使用標(biāo)準(zhǔn)的直接基因傳遞方法或者在體內(nèi) 從轉(zhuǎn)基因宿主中收獲標(biāo)記的細(xì)胞而制備。直接的基因傳遞方法包括使用脂質(zhì)體、磷酸4丐沉淀、電穿孔和基因槍。優(yōu)選脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染。例如，優(yōu)選地使用編碼在巢蛋白調(diào)控元件控制下的熒光蛋白或其它標(biāo)記的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體 制備標(biāo)記的癌癥細(xì)胞。優(yōu)選地?zé)晒獾鞍讟?biāo)記的毛嚢干細(xì)胞從轉(zhuǎn)基因動(dòng)物源 中收獲。巢蛋白表達(dá)調(diào)控元件用于區(qū)別性地驅(qū)動(dòng)血管發(fā)生干細(xì)胞中編碼熒 光蛋白的序列的表達(dá)，由此制成干細(xì)胞標(biāo)記物用于血管發(fā)生。熒光蛋白所述模型通常涉及產(chǎn)生一種或多種熒光蛋白標(biāo)記的細(xì)胞。熒光蛋白標(biāo) 記的細(xì)胞是通過將表達(dá)系統(tǒng)導(dǎo)入宿主細(xì)胞而制得，其中表達(dá)系統(tǒng)包括在一 種或多種巢蛋白調(diào)控序列控制下的熒光蛋白。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中， 對脊推動(dòng)物宿主生物體優(yōu)選哺乳動(dòng)物或鳥類宿主進(jìn)行修飾以包含一種或多 種熒光蛋白標(biāo)記的細(xì)胞。對這些細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)或讓其在宿主生物體內(nèi)生長。多年來多種焚光蛋白已經(jīng)被用作標(biāo)記。最初分離的蛋白發(fā)射綠色波長并且被稱作綠色焚光蛋白(GFP)。因此，盡管包括紅色熒光蛋白、藍(lán)色熒 光蛋白和黃色熒光蛋白等的多種顏色蛋白已經(jīng)得到制備，通常綠色熒光蛋 白仍成為這些熒光蛋白的通用標(biāo)記。這些蛋白的性質(zhì)已經(jīng)在下述文獻(xiàn)中探討過，例如美國專利6，232, 523; 6, 235， 967; 6, 235，968和6,251,384,在此 將其全部引用作為參考。這些專利描述了使用各種顏色的熒光蛋白監(jiān)測轉(zhuǎn) 基因鼠中細(xì)胞生長和肺瘤轉(zhuǎn)移。另外，在美國專利申請?zhí)?9/812,710中這 些熒光蛋白已經(jīng)用于監(jiān)測由啟動(dòng)子介導(dǎo)的表達(dá)；在美國專利申請?zhí)?10/192,7400中用于監(jiān)測細(xì)菌感染并且在美國臨時(shí)申請?zhí)?0/425， 776中用 于監(jiān)測細(xì)胞分離。在美國臨時(shí)申請?zhí)?0/404,005和60/427,604中披露了 使用不同顏色的熒光蛋白標(biāo)記細(xì)胞的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)，由此在美國臨時(shí)申 請?zhí)?0/445， 583中描述了相同顏色的一致熒光。在此引用所有這些文獻(xiàn)作 為參考。巢蛋白巢蛋白是一種可作為祖細(xì)胞或干細(xì)胞標(biāo)記物的中間連絲基因。(智人屬 (//omo ^p/ms)巢蛋白(NES)， mRNA (NM-OOMH))。巢蛋白的表達(dá)將干 細(xì)胞和更加分化的細(xì)胞區(qū)分開來。神經(jīng)上皮干細(xì)胞表達(dá)巢蛋白并且當(dāng)它們 由增殖性干細(xì)胞分化成有絲分裂后的神經(jīng)元時(shí)強(qiáng)烈下調(diào)巢蛋白(Lendahl，等 人，(1990) Cell 60: 585-595.)。巢蛋白也在肌肉前體中表達(dá)但不在成熟肌肉 細(xì)胞中表達(dá)。在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中，巢蛋白基因第一和第二內(nèi)含子中獨(dú)立的細(xì) 胞類型特異性元件分別一致地將報(bào)告基因的表達(dá)指向發(fā)育中的肌肉和神經(jīng) 前體。巢蛋白第二內(nèi)含子包含一個(gè)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)干細(xì)胞中行使功能的增 強(qiáng)子(Zimmerman，等人，(1994)N euron 12: 11-24; (//owo s，.em nestin gene, intron2 (AF004335))。這些元件的鑒定有利于對發(fā)生在某些祖細(xì)胞或干細(xì)胞 最終分化時(shí)，對基因表達(dá)轉(zhuǎn)換控制機(jī)制的分析。下列實(shí)施例意在說明公開發(fā)明的范圍，并不以任何方式對其進(jìn)行限制。實(shí)施例1增殖性上皮細(xì)胞表達(dá)巢蛋白如由在靜態(tài)培養(yǎng)的牛主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)的高水平巢蛋白所表明 的，增殖性上皮細(xì)胞表達(dá)巢蛋白。在下面討論的實(shí)施例中使用牛主動(dòng)脈內(nèi) 皮細(xì)胞(BAECs)以檢查內(nèi)皮巢蛋白的表達(dá)。內(nèi)皮巢蛋白在靜態(tài)培養(yǎng)中通過細(xì)胞分裂而增殖，而增殖在生理層流(大約15 dyn/cm2)下降低(Malek， A. M.等人，JAMA (1999) 282 : 2035-2042)。通 過Northern印跡分析和免疫染色檢測到巢蛋白在靜態(tài)培養(yǎng)的BAECs中強(qiáng)烈 表達(dá)。為了檢查巢蛋白表達(dá)是否是增殖依賴的，對BAECs進(jìn)行15 dyn/cm2 的切變壓力流測試持續(xù)12小時(shí)。將用剃刀從牛胸主動(dòng)脈內(nèi)表面刮下的牛主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(BAECs)用于 后面實(shí)驗(yàn)中。隨后將BAECs在含有具有20%胎牛血清的RPMI 1640的6孔 板里進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)BAECs形成了直徑3到6 mm的集落時(shí)，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到 新的6孔板中，其中胎牛血清減少到10%。通過7到12次傳代對生長在卵 石狀片層構(gòu)造中的培養(yǎng)細(xì)胞系進(jìn)行選擇并保存在液氮中備用。在0.5mm厚的石英蓋玻片上培養(yǎng)BAECs。翻轉(zhuǎn)蓋玻片并放置于平行平 板式流動(dòng)槽中(內(nèi)部尺寸16 mm寬x35mm長x200mm深)，正如先前描 述的(Negishi， Y.等人，XPterioscler. Shromb. Vasc. Biol. (2001) 21: 785-790)。將 此裝置于37。C放置在C02培養(yǎng)箱中。在先前描述過的方程的基礎(chǔ)上計(jì)算切 變壓力強(qiáng)度(Negishi, Y.等人，同上)。流速調(diào)整到15 dyn/cm2，和生理流速相 適應(yīng)。接下來在pH 7.4的含4%聚曱醛的0.1 M磷酸緩沖液中固定BAECs持 續(xù)24小時(shí)(組織)或1小時(shí)(培養(yǎng)的細(xì)胞)。使用含50mMNH4Cl的PBS 處理BAECs以淬滅任何游離的曱醛，接著在第一抗體溫育前通過0.1%皂苷 和0.4%牛血清白蛋白處理使其具有通透性。首先將BAECs和1: 5000稀釋 的抗巢蛋白的第一抗體一起溫育。對于BAECs,第二抗體使用吲哚二羧基 氰(indodicarbocyanide)偶聯(lián)的親和純化的驢抗兔IgG (紅色)(Jackson hnmunoresearch, West Grove, Peimsylvania)。 纟田月包才亥通過4 ， 6- 二氛基 (diamidino)-2-苯基吲哚復(fù)染為藍(lán)色。為了 Northern印跡分析，從BAECs中提取總RNA，通過6. 3%曱醛/ 50%曱酰胺變性，在含6.6°/。曱醛的1.0%瓊脂糖凝膠上電泳，隨后印跡到尼 龍膜上(Amersham Life Science, Tokyo, Japan)。使用來自人巢蛋白DNA片段 (560 bp)的探針進(jìn)行雜交，該才果針通過隨機(jī)引發(fā)法(random priming procedure) 用"P脫氧-CTP標(biāo)記。甘油醛-3-磷酸脫氪酶探針用作對照。為了進(jìn)行Western印跡，在裂解緩沖液(70 mM Tris-HCl, pH 6.8， 11.2% 甘油，3% SDS, 0.01%溴酚藍(lán)，5% 2-巰基乙醇)中溶解U251人成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞獲得細(xì)胞裂解物。隨后將細(xì)胞裂解物在還原條件下于7.5%聚丙烯酰胺
凝膠上電泳，隨后印跡到硝酸纖維素膜上用l:7500稀釋的兔抗人巢蛋白抗 血清進(jìn)行探測。巢蛋白印跡使用ECL探測系統(tǒng)(Amersham, Buckinghamshire, United Kingdom)進(jìn)行檢測。
通過Northern印跡分析發(fā)現(xiàn)巢蛋白mRNA的表達(dá)隨切向壓力流而顯著 減弱。而且，通過免疫染色確認(rèn)了流動(dòng)依賴性(flow-dependent)巢蛋白表達(dá)下 降。
實(shí)施例2
對于大腦腫瘤的巢蛋白免疫染色
通過注射合成的覆蓋人巢蛋白序列c末端n個(gè)氨基酸的寡聚肽在家兔
中激發(fā)針對巢蛋白的多克隆抗體。通過Western印跡發(fā)現(xiàn)此抗體與從U251 細(xì)胞提取的210到240kD蛋白質(zhì)反應(yīng)，正如先前報(bào)道的一樣(Messam, C. A. 等人，同上；Tohyama, T.等人，同上(1992))。免疫印跡顯示為雙重體 (doublet),可能因?yàn)樘妓衔锏男揎棽町悓?dǎo)致，正如先前報(bào)道的那樣 (Messam,C.A.等人，同上)。當(dāng)合成的寡聚肽加入到U251細(xì)胞裂解物中時(shí)免 疫印跡消失，表明免疫印跡代表巢蛋白。
使用包括波形纖維蛋白、GFAP、角蛋白和肌間線蛋白(desmin)的其它 中間連絲進(jìn)一步檢驗(yàn)這種抗體的交叉反應(yīng)性。針對人波形纖維蛋白的抗體 和U251與HeLa細(xì)胞提取物的反應(yīng)都顯示出略超過50-kD分子量標(biāo)記位置
的條帶，但和HeLa細(xì)胞提取物的反應(yīng)則沒有。使用合并的小鼠單克隆抗體， 抗細(xì)胞角蛋白AE1/AE3檢測角蛋白，所述抗細(xì)胞角蛋白AE1/AE3識(shí)別酸性 和堿性角蛋白的廣泛亞家族。所述抗細(xì)胞角蛋白AE1/AE3識(shí)別來自HeLa 細(xì)胞提取物中大約50kD的蛋白，但與U251細(xì)胞提取物反應(yīng)微弱。針對人 肌間線蛋白的抗體與U251和HeLa細(xì)胞提取物的反應(yīng)沒有顯示任何條帶。 非免疫的(nonimmune)兔血清與U251和HeLa細(xì)胞提取物反應(yīng)沒有顯示任何 人工(artifactual)條帶。因此，針對巢蛋白的抗體顯示出與先前報(bào)道的巢蛋白 分子大小的蛋白質(zhì)相應(yīng)的大條帶(Messam, C. A.，等人,同上；Tohyama, T.等 人，同上(1992))，但其并不與其它中間連絲發(fā)生交叉反應(yīng)。隨后用這種抗體對71個(gè)腦腫瘤樣本進(jìn)行免疫染色。71個(gè)人腦腫瘤樣本
包括57個(gè)神經(jīng)膠質(zhì)瘤和14個(gè)其它腦腫瘤。神經(jīng)膠質(zhì)瘤包括6個(gè)世界衛(wèi)生 組織(WHO)—級腫瘤、11個(gè)二級腫瘤、18個(gè)三級腫瘤和22個(gè)四級腫瘤。 其它腦肺瘤包括4個(gè)血管母細(xì)胞瘤、3個(gè)腦膜瘤、2個(gè)非典型腦膜瘤和兩個(gè) 神經(jīng)鞘瘤。全部71個(gè)腦肺瘤都在Gunma大學(xué)醫(yī)學(xué)院 (Gunma University School of Medicine )神經(jīng)外科切除。這些診斷建立在依據(jù)位于Gunma大學(xué) 醫(yī)學(xué)院(Gunma University School of Medicine )病理學(xué)系的修訂版WHO分 類的常規(guī)病理檢驗(yàn)的基礎(chǔ)上。
在含4。/。聚曱醛的0.1 M磷酸緩沖液、pH7.4中固定人腦腫瘤和肺瘤組 織持續(xù)24小時(shí)(組織)或1小時(shí)(培養(yǎng)的細(xì)胞)。小片的組織樣本包埋入 優(yōu)化的切片溫度化合物中以進(jìn)行顯微切片。組織切面首先和1: 5000稀釋的 針對巢蛋白的第 一抗體一起溫育。對于大腦或腫瘤組織，可使用LSAB2/HRP 染色試劑盒作為第二抗體反應(yīng)系統(tǒng)。步驟包括第二抗體反應(yīng)然后是和辣根 過氧化物酶標(biāo)記的《連霉親合素系統(tǒng)的酶反應(yīng)。在酶反應(yīng)中，過氧化物酶催 化3-氨基-9-乙基咔唑(ethylcarbazole)成為可溶的棕色產(chǎn)物。
盡管如前所述(Dahlstrand， J.，等人,同上)一些血管內(nèi)皮細(xì)胞顯示出偶然 的微弱染色，但正常大腦皮層組織不會(huì)被這種抗體免疫染色。在膠質(zhì)母細(xì) 胞瘤(glioblastoma)(WHO IV級)中， 一般的巢蛋白染色隨著腫瘤細(xì)胞發(fā)育進(jìn) 程呈纖絲分布。在這種肺瘤中染色的強(qiáng)度被分類為4+。巢蛋白染色也在圓 形肺瘤細(xì)胞中以鈕狀(button-like)簇的形式明顯存在(惡性寡聚星形瘤細(xì)胞 (anaplastic oligoasgrocytoma),染色強(qiáng)度3+)。在一些III級和IV級的神經(jīng)膠 質(zhì)瘤中，染色局制在增殖的內(nèi)皮，(膠質(zhì)母細(xì)胞瘤，IV級)(惡性寡聚突膠質(zhì) 細(xì)胞瘤，III級)。在低等級的神經(jīng)膠質(zhì)瘤中，在相當(dāng)數(shù)量的腫瘤中染色微弱 到可以忽略，但沿著肺瘤的內(nèi)皮可以注意到清晰的染色，(寡突膠質(zhì)細(xì)胞瘤, II級)。在其它腦腫瘤(神經(jīng)鞘瘤和腦膜瘤)中這種趨勢更明顯，它們的內(nèi)皮有 針對巢蛋白的強(qiáng)烈陽性免疫染色然而腫瘤細(xì)胞卻一點(diǎn)也沒有染色。因此， 腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)巢蛋白與惡性的WHO等級無關(guān)。
實(shí)施例3
血管母細(xì)胞瘤中的巢蛋白表達(dá)由于巢蛋白在增殖中的內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)，懷疑它甚至在血管母細(xì)胞瘤 中表達(dá)，這是因?yàn)槌裳苣讣?xì)胞被認(rèn)為是造血細(xì)胞和成血管細(xì)胞的前體
(Eichmann， A.，等人，Proc. Natl. Acad. Sci. UNA (1997) 94: 5141-5146)。為了
檢查這種組織，檢測了四種人血管母細(xì)胞瘤。 一種內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記，von Willebrand因子，可以沿著血管母細(xì)胞瘤的內(nèi)皮和孩支細(xì)管進(jìn)行陽性免疫染色 (Bohling， T.,等人.，IARC Press (2000), Lyon, France, 223-226)。
巢蛋白也主要地在血管母細(xì)胞瘤的微細(xì)管中進(jìn)行免疫染色。然而包含 稀薄細(xì)胞質(zhì)和突起狀(convex-shaped)細(xì)胞核的常見內(nèi)皮細(xì)胞不是巢蛋白染 色陽性的。因?yàn)閮?nèi)皮細(xì)胞的外形類似于普通脈管，這種類型的內(nèi)皮細(xì)胞可 以被很好的區(qū)分并且缺失了巢蛋白表達(dá)。包含血管母細(xì)胞瘤的巢蛋白陽性 細(xì)胞可以反應(yīng)真正轉(zhuǎn)變的血管母細(xì)胞瘤。因此，巢蛋白不僅是針對神經(jīng)上 皮干細(xì)胞與神經(jīng)膠質(zhì)瘤也是針對血管母細(xì)胞瘤和正在增殖的內(nèi)皮細(xì)胞的標(biāo) 記蛋白質(zhì)。
實(shí)施例4
血管母細(xì)胞瘤中的巢蛋白免疫染色
中間連絲蛋白質(zhì)，巢蛋白，標(biāo)記中樞神經(jīng)系統(tǒng)的祖細(xì)胞。 通過將綠色熒光蛋白放置于巢蛋白調(diào)控序列的控制之下來選擇性標(biāo)記 祖代(progenitor)中樞神經(jīng)系統(tǒng)干細(xì)胞。先前已經(jīng)披露了在毛發(fā)初始生長早期 或毛嚢生長階段、在巢蛋白-綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠中由綠色焚光蛋白熒 光標(biāo)記的表達(dá)巢蛋白的細(xì)胞，出現(xiàn)在位于毛嚢干細(xì)胞所在的毛嚢突起中的 皮脂腺的正下方的永久上端毛嚢里。這就是毛嚢外根鞘干細(xì)胞的定位位點(diǎn)。 位于突起部分的表達(dá)巢蛋白的細(xì)胞相對較小，呈卵形并通過小的樹突相互 連接圍繞著發(fā)干。表達(dá)巢蛋白的細(xì)胞在毛嚢中的精確定位隨毛發(fā)周期而變 化。
這些觀察結(jié)果顯示表達(dá)巢蛋白的細(xì)胞對皮膚的再生發(fā)揮作用。這些數(shù) 據(jù)顯示在毛嚢突起部位的由綠色熒光蛋白標(biāo)記的表達(dá)巢蛋白的細(xì)胞確實(shí)不 僅是毛囊外根鞘的而且也是表皮的祖細(xì)胞。
目前使用了皮膚創(chuàng)傷的幾種不同模型并且每一種模擬了.臨床情況的不 同方面且準(zhǔn)確性的程度不同。經(jīng)過穿孔活體檢查損傷后在第1、 3、 5、7和 9天測定皮膚傷口的巢蛋白-綠色熒光蛋白表達(dá)。在第5天表達(dá)巢蛋白的細(xì)胞更廣泛地散布于真皮和表皮的基底層之中。到了第3天，檢測到了巢蛋
白-綠色熒光蛋白表達(dá)細(xì)胞的增加，并在損傷后第5到9天達(dá)到了最大的免
疫強(qiáng)度。
近來，Taylor, G.等人在Cell (2000) 102: 451-461中報(bào)導(dǎo)毛囊突起干細(xì)胞 具有潛在的雙能性，這是因?yàn)樗鼈儾粌H能生成毛嚢細(xì)胞也能生成上皮細(xì)胞。 其它的實(shí)驗(yàn)也提供了成年小鼠觸須(觸須線)毛嚢上端外根鞘中包含多潛 能干細(xì)胞的證據(jù)，此干細(xì)胞可以分化成為毛嚢基質(zhì)細(xì)胞、皮脂腺基底細(xì)胞 和上皮。
近來，有報(bào)道說從哺乳動(dòng)物皮膚真皮中分離到的多功能成熟干細(xì)胞， 其稱作皮膚衍生前體，能夠在培養(yǎng)物中增殖并且分化以產(chǎn)生神經(jīng)元、神經(jīng) 膠質(zhì)、平滑肌細(xì)胞和脂肪細(xì)胞。然而，這些干細(xì)胞在皮膚中確切定位還是 未知的，它們的功能仍然是不清楚的。
本文公開了在毛嚢細(xì)胞中作為神經(jīng)祖細(xì)胞標(biāo)記物的巢蛋白的表達(dá)。巢 蛋白連接在熒光蛋白上(GFP)，這樣可以觀察到每個(gè)周期中表達(dá)巢蛋白的細(xì) 胞形成了毛嚢的主要部分。神經(jīng)干細(xì)胞蛋白質(zhì)一巢蛋白一在毛嚢干細(xì)胞中 的表達(dá)提示了 一種可能的聯(lián)系。
多潛能、巢蛋白陽性、纖維結(jié)合素陽性的干細(xì)胞(SKPs)能夠從新生的和 成熟的皮膚中生成，這些前體源于真皮，它們與間葉干細(xì)胞有所不同。單 個(gè)的SKPs克隆能夠分化成為神經(jīng)外胚層和中胚層語系，包括(但可能不限 于)神經(jīng)、神經(jīng)膠質(zhì)、平滑肌細(xì)胞和脂肪細(xì)胞。研究表明SKPs能夠經(jīng)過至 少一年的時(shí)間而不會(huì)喪失產(chǎn)生這些分化細(xì)胞類型的能力。最后，人類研究 顯示相似的前體可能出現(xiàn)在成人皮膚中。因此，SKPs顯然代表了一種新的 多潛能成熟干細(xì)胞，它可能比其它成熟干細(xì)胞有更少的"偏向"。從可得到 的、潛在自體組織來源如哺乳動(dòng)物皮膚中分離并且擴(kuò)展得到這種干細(xì)胞的 能力具有重要的治療用途。
這些發(fā)現(xiàn)顯示GATA-3為特異反應(yīng)性皮炎(AD)的關(guān)鍵決定因素。因此， 巢蛋白調(diào)控的FP轉(zhuǎn)基因鼠科動(dòng)物模型與理解在過敏性皮膚疾病如AD中 Th2細(xì)胞和Th2細(xì)胞因子的作用的生理意義相關(guān)。
實(shí)施例5
巢蛋白-FP轉(zhuǎn)基因小鼠巢蛋白是一種中間連絲(IF)基因，它是中樞神經(jīng)系統(tǒng)祖細(xì)胞和神經(jīng)上皮
干細(xì)胞的標(biāo)記物。將攜帶有在巢蛋白第二內(nèi)含子增強(qiáng)子控制下的EGFP的增 強(qiáng)GFP(EGFP)的轉(zhuǎn)基因小鼠用來研究和目測檢驗(yàn)CNS干細(xì)胞的自更新和多 能性。如由巢蛋白調(diào)控的EGFP表達(dá)所證明的，下面討論的工作顯示毛嚢干 細(xì)胞強(qiáng)烈地表達(dá)巢蛋白。
毛發(fā)初始生長期的誘導(dǎo)
用熱的松香和蜂蠟混合物對的6-8個(gè)星期大、處于毛發(fā)生長終期的巢蛋 白調(diào)控的GFP轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行脫毛。在脫毛(毛發(fā)生長終期)前和脫毛后 第1-5天(毛發(fā)初始生長早期)、第8和10天(毛發(fā)初始生長中期(catagen) )、第14和15天(毛發(fā)初始生長晚期)以及第19和20天(毛發(fā)生長中期 )從背部皮膚切下樣本(5x5mm2)。將皮膚樣本分成兩部分， 一部分用于焚 光顯微檢查而另一部分用于冷凍切片。簡單的說，將皮膚樣本包埋入組織 冷凍包埋培養(yǎng)基中并在-8(TC冷凍過夜。使用LeicaCM1850恒冷切片機(jī)切出 8pm厚的切片。冷凍切片進(jìn)行空氣干燥和二碘化丙錠復(fù)染用于熒光顯微檢 查。
熒光和共聚焦顯微檢查
切去s. c.組織后，在配備了 GFP光學(xué)配件的Nikon焚光顯微鏡下直接 觀察巢蛋白-GFP皮膚樣本的真皮上部分和表皮下部分。同時(shí)也使用了安裝 在具有10倍PlanApo物鏡的Nikon Optiphot上的MRC-600共聚焦成像系 統(tǒng)(Bio-Rad)。
免疫組織化學(xué)染色
通過使用DAKO ARK動(dòng)物研究試劑盒(巢蛋白和角蛋白)并按照制造商 說明書的DAKO EnVision雙染色系統(tǒng)來檢測石蠟包埋的C57B16小鼠和巢 蛋白-GFP轉(zhuǎn)基因小鼠皮膚切片中巢蛋白、角蛋白5、 8和15、和GFP的共 定位。簡單地說，通過在過氧化物酶封閉溶液中溫育5分鐘來淬滅皮膚樣 本中內(nèi)源過氧化物酶的活性。載玻片隨后和預(yù)備好的生物素標(biāo)記的第一抗 體(GFPmAb, 1: 100;巢蛋白mAb， 1: 80;角蛋白5/8 mAb, 1: 250;和角蛋白 15 mAb, 1: 100)—起溫育15分鐘，然后和鏈霉親合素過氧化物酶一起溫育15分鐘。通過和底物發(fā)色團(tuán)3, 3'-二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine)(DAB)或 者快速核酸紅一起溫育5分鐘以完成染色。棕色(DAB)或櫻桃紅(快速 核酸紅)染色用于抗原染色。巢蛋白mAb(大鼠401)由Iowa大學(xué)購得(Iowa City )。角蛋白5 / 8 mAb (MAB3228)和角蛋白15 mAb (CBL 272)由Chemicon購得。
具有巢蛋白控制的GFP表達(dá)的細(xì)胞位于處于毛嚢干細(xì)胞所在的毛嚢突 起中皮脂腺的正下方的毛發(fā)生長終期毛嚢的永久上部區(qū)域中。這些細(xì)胞相 對較小，呈卵形或圓形并通過小的樹突相互連接。
表達(dá)巢蛋白的細(xì)胞的定位和數(shù)量是依賴于毛發(fā)周期的。通過脫毛誘導(dǎo) 小鼠(6-8周大)毛發(fā)生長終期毛嚢的毛發(fā)生長初期后，接下來在發(fā)育的毛 嚢里進(jìn)行GFP標(biāo)記的巢蛋白生產(chǎn)細(xì)胞的發(fā)育和增殖。正如先前對毛嚢干細(xì) 胞的描述，在毛發(fā)生長終期毛嚢中的綠色熒光、巢蛋白表達(dá)細(xì)胞只位于上 端永久突起區(qū)域。脫毛后2到3天，表達(dá)巢蛋白的毛嚢細(xì)胞已經(jīng)增殖并從 突起向下遷移。在毛發(fā)初始生長的中期和晚期階段，表達(dá)巢蛋白的毛嚢細(xì) 胞占據(jù)了外根鞘的上2/3，而從毛嚢下1/3以及毛發(fā)基質(zhì)球中消失。在毛 發(fā)生長中期，當(dāng)毛發(fā)球基質(zhì)細(xì)胞經(jīng)歷退化和變性時(shí)，外根鞘中表達(dá)巢蛋白 -GFP的細(xì)胞的數(shù)量隨著毛嚢皺縮一起減少。最終，到下一個(gè)毛發(fā)生長終期 這些細(xì)胞只位于突起處。
所述數(shù)據(jù)顯示表達(dá)巢蛋白的細(xì)胞包括毛嚢外根鞘的真性祖細(xì)胞或干細(xì) 胞。在毛發(fā)初始生長的高峰，整個(gè)毛嚢外根鞘2/3長度由表達(dá)巢蛋白的細(xì) 胞組成。這顯然是發(fā)源于處于毛發(fā)生長終期表達(dá)巢蛋白的細(xì)胞簇中并且隨 毛發(fā)周期同步增殖。大多數(shù)毛發(fā)初始生長期的毛嚢外根鞘一定是由這些推 定的干細(xì)胞衍生而來，因?yàn)榭紤]到物理、生理和時(shí)間障礙從周圍組織中大 量募集細(xì)胞是不太可能的。這些結(jié)果提供了關(guān)于活干細(xì)胞形成新毛嚢結(jié)構(gòu) 重要部分的描述。
這些結(jié)果得到了其它發(fā)現(xiàn)的有力支持。近來，Oshima， H.等人在Cell (2001) 104: 233-245中報(bào)道成體大鼠觸須毛嚢外根鞘的上端區(qū)域包含有多能 干細(xì)胞，其響應(yīng)形態(tài)發(fā)生信號從而生成多種毛嚢、皮脂腺和真皮。這些發(fā) 現(xiàn)和我們觀察到的外根鞘中的巢蛋白-GFP表達(dá)相一致。
這些巢蛋白-GFP表達(dá)的毛嚢祖細(xì)胞或干細(xì)胞也表達(dá)角蛋白5/8和角 蛋白15,其是毛嚢干細(xì)胞的潛在標(biāo)記物。免疫組織化學(xué)染色的結(jié)果顯示巢蛋白、GFP、角蛋白5/8和角蛋白15共定位于毛嚢突起細(xì)胞、外根鞘細(xì)胞 和皮脂腺基底細(xì)胞中。這些數(shù)據(jù)進(jìn)一步支持了在毛嚢突起中的表達(dá)巢蛋白 -GFP的細(xì)胞是外根鞘的祖代細(xì)胞。
最近的對于毛嚢生物學(xué)的關(guān)注潮已經(jīng)揭示了除了在形成發(fā)干中明顯的 作用之外，功能和細(xì)胞類型的令人驚訝的復(fù)雜性。這里報(bào)道的觀察結(jié)果顯 示在毛嚢里的外根鞘祖細(xì)胞分享了先前在神經(jīng)干細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的巢蛋白標(biāo) 記。這一發(fā)現(xiàn)暗示了毛嚢細(xì)胞和神經(jīng)干細(xì)胞之間可能的聯(lián)系。這些數(shù)據(jù)也 證實(shí)了先前所懷疑的情形，即，已經(jīng)顯示出在毛發(fā)初始生長階段能夠表達(dá) 巢蛋白-GFP的突起細(xì)胞可增殖以形成大量的外根鞘。當(dāng)然，表達(dá)巢蛋白的 細(xì)胞可能發(fā)揮了更廣泛的作用并且可作為整個(gè)毛嚢的干細(xì)胞而起作用。在 本案中，毛嚢的保留部分，例如，內(nèi)層根鞘和基質(zhì)，能夠從表達(dá)巢蛋白的 細(xì)胞中發(fā)源但隨著分化進(jìn)程可能會(huì)丟失巢蛋白的表達(dá)。
實(shí)施例6 分離毛嚢干細(xì)胞
分離表達(dá)巢蛋白-GFP的毛嚢突起干細(xì)胞并在體外培養(yǎng)。切除毛發(fā)生長 終期的巢蛋白-GFP轉(zhuǎn)基因小鼠皮膚樣本并切碎。隨后將切碎的組織在胰蛋 白酶(0.25 %)，膠原酶(0.4 %)和分散酶(l.O %)的混合物中、37。C消化兩小 時(shí)。在裝配了熒光光學(xué)配件的解剖顯微鏡下分離突起區(qū)域中有表達(dá)巢蛋白 -GFP細(xì)胞的單個(gè)毛嚢。接著在焚光解剖顯微鏡下使用精細(xì)注射器進(jìn)一步分 離在毛嚢突起區(qū)域表達(dá)巢蛋白-GFP的細(xì)胞。
實(shí)施例6 生長的干細(xì)胞
把來自于毛嚢突起區(qū)域的表達(dá)巢蛋白-GFP的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到不含生長因子 添加物的M21培養(yǎng)基中，這是一種用于神經(jīng)球生長的典型神經(jīng)維持培養(yǎng)基 (Uchida， N.,等人Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2000) 97: 14720-14725)。 12天 后，神經(jīng)球狀集落出現(xiàn)。在另一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，從毛嚢突起區(qū)域分離的表達(dá)巢 蛋白-GFP的細(xì)胞以10細(xì)胞/證2的密度生長在包含曱基纖維素(1.2 %)的神 經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基中，每兩天向該培養(yǎng)基中添加生長因子(EGF) (20 ng/ml)、 成纖維細(xì)胞生長因子(FGF) (20 ng/ml)和白血病抑制因子(Lif) (10 ng/ml)。當(dāng)球體在培養(yǎng)基中出現(xiàn)時(shí)，將它們轉(zhuǎn)移到不含曱基纖維素的新平板上。次級 球體也是從一級球體產(chǎn)生的。接著分析這些球體的分化潛能。
實(shí)施例7
B16F10鼠科動(dòng)物黑色素瘤細(xì)胞和巢蛋白表達(dá)
下面顯示用B16F10鼠科動(dòng)物黑色素瘤細(xì)胞在體內(nèi)和體外模擬內(nèi)皮細(xì) 胞的行為和血管發(fā)生過程。在體外腫瘤細(xì)胞的索形成(cord formation)是由缺
體(VEGF受體2)的抗體所抑制。
B16F10鼠科動(dòng)物黑色素瘤細(xì)胞系(B16F10)生長在DMEM培養(yǎng)基、10% FCS、 37 °C、 5。/。C02的條件下。將DsRed-2基因(CLONTECH)插入到基于 逆轉(zhuǎn)錄病毒的哺乳動(dòng)物表達(dá)載體pLNCX (CLONTECH)中以形成pLNCX DsRed-2載體。逆轉(zhuǎn)錄病毒的生產(chǎn)是通過將pLNCX DsRed-2轉(zhuǎn)染進(jìn)入PT67 包裝細(xì)胞進(jìn)行的，這種包裝細(xì)胞產(chǎn)生包含DsRed-2基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒上清 液。
B16F10在包含15%FCS的RPMI 1640培養(yǎng)基(GIBCO)中培養(yǎng)。感染前 24小時(shí)，將70%的融合PT67/RFP細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含7% FBS培養(yǎng)基的新鮮 DMEM中。耙標(biāo)細(xì)胞在感染前以1-2 x105每60 mm平4反的纟田月包密l,甫才反 生長18小時(shí)。
把感染的B16F10細(xì)胞移植到宿主nu/nu小鼠中并且允許腫瘤細(xì)胞生 長。定位腫瘤樣本并將其與正常組織一起切除以進(jìn)行熒光顯微觀察。通過 包含熒光蛋白的血管的出現(xiàn)，顯微圖像表明出血管發(fā)生活性的存在。
實(shí)施例8
皮膚中來自表達(dá)巢蛋白的毛囊細(xì)胞的新生血管
攜帶處于巢蛋白第二內(nèi)含子增強(qiáng)子控制下的GFP的轉(zhuǎn)基因小鼠 (ND-GFP)被用于對自更新和多能CNS干細(xì)胞的研究和顯影。如由巢蛋白調(diào) 控的GFP表達(dá)所證明的，毛嚢干細(xì)胞強(qiáng)烈表達(dá)巢蛋白。
對于下面討論的結(jié)果，使用裝配了汞燈動(dòng)力電源的Olympus IMT-2反轉(zhuǎn) 顯微鏡(Melville, NY)進(jìn)行焚光顯微觀察。熒光顯微鏡有一套GFP濾光鏡 (Chroma Technology, Rockingham, VT)。同時(shí)也使用了安裝在具有Plan ApoIO倍物鏡的Nikon Optiphot上的MRC-600共聚焦成像系統(tǒng)(Bio-Rad)直接觀 察具有GFP表達(dá)的皮膚組織。
依照制造商的說明書，在空氣干燥的皮膚和冷凍切片中進(jìn)行了針對 CD31和von Willebrand因子(VWF)的免疫組織化學(xué)染色，其中對于CD31 使用抗大鼠Ig辣根過氧化物酶(HRP)檢測試劑盒(BD Biosciences)或?qū)τ?VWF使用抗兔Ig (HRP)檢測試劑盒(BD Biosciences)。 CD31 mAb (CBL1337) 從Chemicon購得。VWF多克隆抗體(A0082)從DAKO購得。底物發(fā)色團(tuán) 3， 3'-二氨基聯(lián)苯胺染色被用于進(jìn)行檢測。
毛發(fā)初始生長期小鼠皮膚巢蛋白表達(dá)的顯影
使用轉(zhuǎn)基因ND-GFP小鼠(6-8周大具有幾乎專一的毛發(fā)生長終期(靜止 期)毛嚢)進(jìn)行毛發(fā)初始生長期小鼠皮膚中巢蛋白表達(dá)的顯示。使用三溴乙醇 (tribromoethanol)(i. p.注射量，0.2mll.2%溶液/10g體重)麻醉小鼠。使用 用熱的松香和蜂蠟混合物對小鼠進(jìn)行脫毛以誘導(dǎo)毛發(fā)初始生長。
當(dāng)毛嚢處于毛發(fā)初始生長早期時(shí)，脫毛前和脫毛后第48和72小時(shí)在 麻醉狀態(tài)下切除背部皮膚樣本。皮膚樣本分成3部分， 一部分用于熒光顯 微檢測而其它的用于冷凍切片或者空氣干燥片段。用于冷凍切片的樣本包 埋入組織冷凍包埋培養(yǎng)基(DAKO)中并冷凍在-80。C過夜。用Leica CM1850 (Leica, Deerfield， IL)低溫切片機(jī)切出5pm厚的切片并進(jìn)行空氣干燥。


圖1顯示了從ND-GFP轉(zhuǎn)基因小鼠的背側(cè)皮膚真皮側(cè)的視圖。圖IA顯 示了來自轉(zhuǎn)基因小鼠背部皮膚的相差顯微圖像。皮脂腺體(向下的箭頭)位于 發(fā)干(向上的箭頭)周圍。圖IB顯示了相差顯微圖像加上GFP的熒光。 ND-GFP細(xì)胞在毛嚢突起區(qū)域中是可見的并且也可以看見血管。毛嚢突起區(qū) 域位于皮脂腺下方。
圖1C顯示了 GFP的熒光?？梢钥匆奛D-GFP血管連 接于ND-GFP毛嚢。圖ID表示毛發(fā)生長終期毛嚢的示意圖，其中顯示了 ND-GFP毛嚢突起區(qū)域和血管網(wǎng)絡(luò)的位置。
圖1E也顯示了 GFP的焚光。可 見ND-GFP血管與ND-GFP毛嚢突起區(qū)相聯(lián)系。本圖中標(biāo)尺代表100pm的 距離。
如
圖1A-D中所見，表達(dá)巢蛋白的毛嚢和ND-GFP-標(biāo)記的皮膚脈管網(wǎng)絡(luò) 相互連接。免疫組織化學(xué)染色顯示脈管展示(display)CD31抗原和VWF，表
明它們是血管。ND-GFP觸須毛嚢到棵鼠創(chuàng)傷皮膚的移植
為了移植目的，通過手術(shù)獲得ND-GFP轉(zhuǎn)基因小鼠的觸須毛嚢。麻醉 轉(zhuǎn)基因小鼠并在無菌環(huán)境下進(jìn)行所有的手術(shù)過程。切下包含觸須墊的上唇， 暴露其內(nèi)表面。在雙目顯微鏡下切分毛嚢并使用精細(xì)鑷輕輕的沿著頸口從 墊上拔起以摘下毛嚢。隨后將所有的毛嚢保存在包含B-27添加物 (GIBCO/BRL)的DMEM/F-12培養(yǎng)基中。
如上所述，用三溴乙醇麻醉受體棵鼠。將完整厚度的皮膚樣本進(jìn)行折 疊并且使用2-mm活檢穿孔器產(chǎn)生兩個(gè)分開約15mm的相鄰?fù)暾穸葌凇?隨后移植ND-GFP觸須毛嚢。使用尼龍線(6-0)縫合切口。進(jìn)一步切割移植 后小鼠的皮下組織樣本并通過熒光顯微鏡直接觀察，并且進(jìn)行空氣干燥或 者準(zhǔn)備冷凍切片以用于免疫組織化學(xué)染色。創(chuàng)傷后IO天麻醉小鼠并切下創(chuàng) 傷皮膚樣本進(jìn)行分析。
圖2A-G顯示了移植到棵鼠的皮下組織的ND-GFP觸須毛嚢圖像。圖 2A顯示了移植28天后毛嚢的相差顯微圖像。預(yù)先存在的血管顯示在圖像 的底部。圖2B顯示了相同毛嚢的相差顯微圖像加上GFP的焚光。在這張 圖像中顯示出巢蛋白陽性血管和預(yù)先存在的血管相互連接。圖2C顯示了移 植后毛嚢的GFP熒光的圖像。在圖2B和2C中，可以看見ND-GFP血管從 移植后的ND-GFP毛嚢中生長出來并且和棵鼠皮膚中預(yù)先存在的血管聯(lián)系 在一起。圖2D和2E顯示了圖分別來自2B和2C的高放大倍數(shù)圖像。(f和 g)圖2F和2G顯示共定位的GFP信號和內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物CD31的圖像。圖 2F是熒光圖像，圖2G顯示空氣干燥并用CD31進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色的相 同視野的圖像。(標(biāo)尺，100pm)
到第3天從移植后4果鼠皮膚的ND-GFP毛嚢中探測到了 ND-GFP脈管 的生長。正如在上面關(guān)于圖2所討論的，到28天，表達(dá)巢蛋白-GFP的脈管 已經(jīng)發(fā)育成廣泛的分支網(wǎng)絡(luò)并且與受試棵鼠中存在的脈管交叉合流。免疫 組織化學(xué)染色顯示CD31抗原和GFP熒光共定位在新生血管中。
在棵鼠腎嚢下方移植ND-GFP觸須毛嚢細(xì)胞
按上述方式收獲觸須毛嚢。接著將所有的毛嚢保存在包含B-27添加物 的DMEM/F-12培養(yǎng)基中并置于冰上，直至將它們移植到6-8周大的"w/做 小鼠的腎嚢下方，這些小鼠按照上述方法麻醉。在受試小鼠的左側(cè)腹肋切 開，暴露出腎臟。將兩個(gè)毛嚢插入到腎嚢下方。再將腎臟放回原位，并且使用尼龍線(6-0)縫合切口 。在14天將每個(gè)移植鼠的腎臟切下并使用熒光顯
微鏡直接觀察。
圖3A-C顯示了移植的ND-GFP觸須毛嚢在棵鼠腎嚢下的圖像?？梢钥?到移植后14天ND-GFP脈管形成了網(wǎng)絡(luò)，這可通過相差顯微圖像(圖3A)、 相差顯微圖像加上GFP熒光(圖3B)和GFP熒光圖像(圖3D)看到。(標(biāo) 尺，100pm)。 ND-GFP脈管顯示出與預(yù)先存在的血管發(fā)生交叉合流。
將ND-GFP觸須毛嚢移植到棵鼠腎嚢下方之后，第14天被觀察到圍繞 著移植的毛囊的ND-GFP血管網(wǎng)絡(luò)。ND-GFP脈管顯示出與預(yù)先存在的血管 發(fā)生交叉合流。
創(chuàng)傷皮膚中來自移植毛囊的ND-GFP脈管的增強(qiáng)生長
收獲包含移植的ND-GFP觸須毛發(fā)嚢的受創(chuàng)傷皮膚樣本用于熒光顯微 觀察。圖4A顯示了移植前分離的ND-GFP觸須毛嚢。圖4B顯示了移植后 10天棵鼠受創(chuàng)傷皮膚中的ND-GFP觸須毛嚢圖像?？梢钥匆奛D-GFP脈管 從ND-GFP觸須毛嚢向正在愈合的傷口的生長。圖4C和4D顯示了來自圖 4B區(qū)域的高放大倍數(shù)圖像，顯示為白色陰影框。圖4E是ND-GFP觸須毛 嚢移植進(jìn)入創(chuàng)傷棵鼠皮膚的示意圖。(標(biāo)尺，lOOpm)
圖4的影像顯示出ND-GFP脈管從毛嚢向傷口生長。在移植的毛嚢附 近出現(xiàn)的傷口顯著地增強(qiáng)了脈管的生長。顯然，起源于毛嚢的脈管能夠響 應(yīng)于傷口附近產(chǎn)生的血管發(fā)生信號。免疫組織化學(xué)染色顯示出CD31在生長 到傷口里的表達(dá)ND-GFP的脈管中表達(dá)。
討論
血管發(fā)生，毛細(xì)血管高度活躍的生長與破壞，已經(jīng)在理解組織維持、 創(chuàng)傷修復(fù)和惡性腫瘤生長中占據(jù)了日益重要的角色。識(shí)別新血管的細(xì)胞來 源已經(jīng)在學(xué)術(shù)上和治療方案中越來越重要。已經(jīng)有大量的關(guān)于內(nèi)皮細(xì)胞由 骨髓來源的干細(xì)胞生成的最近報(bào)道。這也是內(nèi)皮干細(xì)胞可以從脂肪組織中 衍生的證據(jù)。然而，由于皮膚獨(dú)特的結(jié)構(gòu)，這些先前確認(rèn)的內(nèi)皮干細(xì)胞的 來源可能不能用于提供皮膚血管。上面提供的結(jié)果顯示出先前未認(rèn)識(shí)到的 毛嚢干細(xì)胞的重要功能是提供能在皮膚中形成血管的內(nèi)皮細(xì)胞。
毛嚢干細(xì)胞的全部潛能可能比這里報(bào)道的更加廣泛。 一些調(diào)查發(fā)現(xiàn)從 哺乳動(dòng)物真皮層分離出的成熟多潛能干細(xì)胞一稱作由皮膚衍生的前體一可 以在培養(yǎng)中增殖并分化成神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)、平滑肌細(xì)胞和脂肪細(xì)胞。然而，這些干細(xì)胞在皮膚中的確切定位還是未知的，它們的功能也是不清楚 的。本篇報(bào)道指出毛嚢是用于皮膚血管的干細(xì)胞的重要來源并且很可能也 可以用于其它組織。這些結(jié)果支持了毛嚢細(xì)胞對創(chuàng)傷修復(fù)和皮膚移植物的 存活有重要意義的報(bào)道。
實(shí)施例9
用于篩選血管發(fā)生促進(jìn)復(fù)合物的血管發(fā)生模型
為了實(shí)現(xiàn)移植目的，如實(shí)施例8所述，手術(shù)收獲來自ND-GFP轉(zhuǎn)基因 小鼠的觸須毛嚢。隨后將所有毛嚢保存在含有B-27添加物(GIBCO/BRL)的 DMEM/F-12培養(yǎng)基中。
麻醉受試棵小鼠，將一個(gè)完整厚度的皮膚樣本進(jìn)行折疊并且使用2-mm 活檢穿孔器產(chǎn)生兩個(gè)分開約15 mm的相鄰?fù)暾穸葌?。隨后移植ND-GFP 觸須毛嚢。使用尼龍線(6-0)縫合切口。
小鼠分為實(shí)驗(yàn)組和對照組。實(shí)驗(yàn)組接受了一系列的處理，包括血管內(nèi) 皮生長因子、包含在可藥用載體中的已知的血管發(fā)生促進(jìn)復(fù)合物。對照組 小鼠只接受載體。
處理后，繼而切下移植小鼠的皮下組織樣本并直接在熒光顯微鏡下觀 察，并且進(jìn)行空氣干燥或準(zhǔn)備進(jìn)行用于免疫組織化學(xué)染色的冷凍切片。從 實(shí)驗(yàn)組和對照組中獲得樣本中血管發(fā)生活性的程度。同對照組樣本相比實(shí) 驗(yàn)組樣本顯示了基于GFP活性總量的高度的血管發(fā)生活性。
本實(shí)施例顯示出披露的模型系統(tǒng)具有篩選血管發(fā)生試劑的用途。
實(shí)施例10
用于篩選血管發(fā)生移植復(fù)合物的血管發(fā)生模型
為了移植目的，如實(shí)施例8所述，通過手術(shù)獲得來自ND-GFP轉(zhuǎn)基因 小鼠的觸須毛嚢。隨后將所有毛嚢保存在含有B-27添加物(GIBCO/BRL)的 DMEM/F-12培養(yǎng)基中。
麻醉受試棵鼠，將完整厚度的皮膚樣本進(jìn)行折疊并且使用2-mm活檢穿 孔器產(chǎn)生兩個(gè)分開約15 mm的相鄰?fù)暾穸葌?。隨后移植ND-GFP觸須 毛嚢。使用尼龍線(6-0)縫合切口。小鼠分為實(shí)驗(yàn)組和對照組。實(shí)驗(yàn)組接受了 一系列的處理包括血管抑制 素、包含在可藥用載體中的已知的血管發(fā)生抑制復(fù)合物。對照組小鼠只接
受載體。
處理后，繼而切下移植小鼠的皮下組織樣本并直接在熒光顯微鏡下觀 察，并且進(jìn)行空氣干燥或準(zhǔn)備進(jìn)行用于免疫組織化學(xué)染色的冷凍切片。從 實(shí)驗(yàn)組和對照組中獲得樣本中血管發(fā)生活性的程度。同對照組樣本相比實(shí)
驗(yàn)組樣本顯示了基于GFP活性總量的降低程度的血管發(fā)生活性。
本實(shí)施例顯示出披露的模型系統(tǒng)具有篩選抗血管發(fā)生試劑的用途。
實(shí)施例11
將表達(dá)FP的毛嚢細(xì)胞移植入FP轉(zhuǎn)基因宿主
在轉(zhuǎn)基因小鼠中制備表達(dá)ND-GFP的觸須毛嚢細(xì)胞。將轉(zhuǎn)基因宿主生 物，履/歷小鼠進(jìn)行改造以便表達(dá)巢蛋白調(diào)控下的RFP。如實(shí)施例8所討論 的，將表達(dá)ND-GFP的觸須毛嚢細(xì)胞移植到在ND-RFP轉(zhuǎn)基因宿主生物體 中制造的皮膚傷口中。
收獲包含移植的ND-GFP觸須毛嚢細(xì)胞的創(chuàng)傷皮膚樣本用于熒光顯微 觀察。移植前對分離的ND-GFP觸須毛嚢進(jìn)行顯微觀察。移植10天后顯示 受創(chuàng)傷的nu/nu ND-RFP小鼠皮膚中的ND-GFP毛嚢的圖像。可以看見 ND-GFP脈管從ND- GFP觸須毛嚢向正在愈合的傷口生長。還能看見從傷 口中伸出的ND-RFP脈管。
權(quán)利要求
1.一種監(jiān)測血管發(fā)育的方法，包括提供血管發(fā)生干細(xì)胞，其中所述干細(xì)胞包含表達(dá)盒，該表達(dá)盒編碼在巢蛋白調(diào)控元件遺傳控制下的熒光蛋白；在宿主中培養(yǎng)所述干細(xì)胞；和監(jiān)測導(dǎo)致血管發(fā)育的干細(xì)胞血管發(fā)生活性。
2. 權(quán)利要求1的方法，其中所述血管發(fā)生干細(xì)胞是表達(dá)巢蛋白的細(xì)胞。
3. 權(quán)利要求2的方法，其中所述表達(dá)巢蛋白的細(xì)胞是毛嚢細(xì)胞。
4. 權(quán)利要求3的方法，其中所述毛嚢細(xì)胞生長在體外培養(yǎng)物中。
5. 權(quán)利要求2的方法，其中所述表達(dá)巢蛋白的細(xì)胞是腫瘤細(xì)胞。
6. 權(quán)利要求5的方法，其中所述腫瘤細(xì)胞來自選自黑色素瘤、神經(jīng)膠 質(zhì)瘤、血管母細(xì)胞瘤、神經(jīng)鞘瘤、髓母細(xì)胞瘤和腦膜瘤組成的組的腫瘤類 型。
7. 權(quán)利要求l的方法，其中所述熒光蛋白選自綠色熒光蛋白(GFP)、 紅色熒光蛋白(RFP)、藍(lán)色熒光蛋白(BFP)和黃色熒光蛋白(YFP)組成的組。
8. 權(quán)利要求l的方法，其中所述巢蛋白調(diào)控元件是由人巢蛋白基因第 二內(nèi)含子編碼的。
9. 權(quán)利要求l的方法，其中所述宿主生物是脊推動(dòng)物生物體。
10. 權(quán)利要求9的方法，其中所述宿主生物體是哺乳動(dòng)物或鳥類。
11. 權(quán)利要求10的方法，其中所述哺乳動(dòng)物宿主選自小鼠、大鼠、兔、 犬和貓組成的組。
12. 權(quán)利要求9的方法，其中所述宿主生物體是雞或者雞卵。
13. 權(quán)利要求l的方法，其中所述血管發(fā)生千細(xì)胞包含處于巢蛋白調(diào) 節(jié)控制下的第一熒光蛋白，并且宿主生物包含處于巢蛋白調(diào)節(jié)控制下的第 二熒光蛋白，其中的第一熒光蛋白不同于第二熒光蛋白。
全文摘要
本發(fā)明涉及使用表達(dá)巢蛋白的干細(xì)胞顯像新生血管的血管發(fā)生模型。公開的發(fā)明涉及這樣的觀察結(jié)果，即巢蛋白表達(dá)是內(nèi)皮細(xì)胞增殖的標(biāo)記。巢蛋白表達(dá)作為標(biāo)記對于血管發(fā)生，特別是對于與腫瘤相關(guān)的血管發(fā)生特別有用。具體地，巢蛋白可以作為針對諸如神經(jīng)膠質(zhì)瘤、血管母細(xì)胞瘤、神經(jīng)鞘瘤、髓母細(xì)胞瘤、和腦膜瘤的腦部腫瘤的極好的內(nèi)皮標(biāo)記物而起作用。因此，公開的發(fā)明涉及這種標(biāo)記作為模型化血管發(fā)生活性的基礎(chǔ)的用途。
文檔編號A01K67/027GK101514356SQ200910133849
公開日2009年8月26日 申請日期2004年10月28日 優(yōu)先權(quán)日2003年10月28日
發(fā)明者天羽康之, 平 姜, 李玲娜, 萌 楊 申請人:抗癌公司