一種表達(dá)巢蛋白的睪丸間質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)方法及其用途
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種表達(dá)巢蛋白的睪丸間質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)方法及其用途，本發(fā)明所述的方法包括：提供一種以C57BL/6為遺傳背景的巢蛋白-綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠模型；飼養(yǎng)小鼠至1周齡或以上，分離睪丸，去除被膜和血管，暴露生精小管后用膠原酶IV消化，過濾消化后的細(xì)胞懸液；通過流式細(xì)胞儀進(jìn)行分選，獲得單個(gè)細(xì)胞，收集表達(dá)綠色熒光蛋白的熒光強(qiáng)度是陰性對(duì)照細(xì)胞的熒光強(qiáng)度的10倍或以上的細(xì)胞，從而分離出所述表達(dá)巢蛋白的睪丸間質(zhì)干細(xì)胞。本發(fā)明提供了根據(jù)上述方法分離的睪丸間質(zhì)來源干/祖細(xì)胞，以及進(jìn)一步在培養(yǎng)基中培養(yǎng)獲得的自我更新和增殖的細(xì)胞，并且提供了將這些細(xì)胞用于制備治療睪酮水平低下的相關(guān)疾病的組合物的用途。
【專利說明】一種表達(dá)巢蛋白的睪丸間質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)方法及其 用途

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及干細(xì)胞與組織工程【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種表達(dá)巢蛋白的睪丸間質(zhì)干 細(xì)胞的分離、培養(yǎng)方法及其用途。

【背景技術(shù)】
[0002] 隨著社會(huì)老齡化問題的進(jìn)程，中老年健康問題得到國際廣泛關(guān)注。遲發(fā)性性腺功 能減退癥（Late-onset hypogonadism. L0H)已經(jīng)成為嚴(yán)重影響中老年男性健康和生活質(zhì)量 的重要疾病之一。LOH的核心機(jī)制是分泌睪酮的睪丸間質(zhì)細(xì)胞隨著年齡的增長，數(shù)量減少和 功能下降，導(dǎo)致體內(nèi)的雄激素缺乏。睪酮不足最終可導(dǎo)致性欲、性功能的減退，還可造成疲 勞、肌肉體積減少、脂肪體積增加、骨質(zhì)疏松、貧血等癥狀，同時(shí)影響情緒與智力下降等嚴(yán)重 影響活質(zhì)量和引發(fā)多器官功能損害（Int J Androl，2009. 32:1-10)。因此，睪酮水平的維持 對(duì)男性意義重大。目前，睪酮替代治療是解決睪酮缺乏的主要手段，臨床上主要使用的是外 源性睪酮制劑，按照給藥途徑可以分為口服睪酮制劑、肌注睪酮制劑、經(jīng)皮膚黏膜吸收睪酮 制劑以及睪酮埋置劑。許多研究表明睪酮替代治療已取得了良好的治療效果，例如：提高性 欲、改善勃起功能、增加性滿意度。但隨后有報(bào)道顯示其治療效果會(huì)隨著時(shí)間的推移逐漸減 弱；LOH患者的腰椎骨密度增加；效果難以持久。其原因在于給藥后血清睪酮濃度存在高峰 和波谷，無法模擬機(jī)體睪酮的生理情況，也無法很好地預(yù)測個(gè)體的吸收模式。同時(shí)，外源性 睪酮能夠通過抑制下丘腦-垂體-性腺軸，繼而導(dǎo)致睪丸局部睪酮濃度下降，最終引起精液 質(zhì)量下降，甚至導(dǎo)致男性不育。另外，體內(nèi)雄激素水平升高可能會(huì)增加痤瘡、男性乳房發(fā)育、 前列腺癌、脂質(zhì)代謝紊亂、心血管事件等。因此，中老年男性性腺功能低下患者使用雄激素 替代治療目前存在比較大的爭議。為此，研究人員一直在探索更為安全、有效、質(zhì)優(yōu)價(jià)廉的 LOH治療方法。
[0003] 葛仁山等人總結(jié)了成體睪丸間質(zhì)細(xì)胞的發(fā)生過程，包括了四個(gè)發(fā)生階段：睪丸間 質(zhì)干細(xì)胞（stem Leydig cell, SLC)、睪丸間質(zhì)祖細(xì)胞（Progenitor Leydig cell)、不成熟 睪丸間質(zhì)細(xì)胞（immature Leydig cell)、成體睪丸間質(zhì)細(xì)胞（Adult Leydig cell)。其中， 睪丸間質(zhì)干細(xì)胞可以在體外擴(kuò)增并分化成為具有睪酮分泌能力的睪丸間質(zhì)細(xì)胞。在大鼠出 生后7天，梭形的睪丸間質(zhì)干細(xì)胞主要分布在大鼠睪丸間質(zhì)部分以及血管周圍。DavidofT 等認(rèn)為睪丸的血管即血管平滑肌細(xì)胞及周細(xì)胞是睪丸間質(zhì)細(xì)胞的前體細(xì)胞，被認(rèn)為最理 想的種子細(xì)胞（Davidoff MS，Middendorff R，Enikolopov G，Riethmacher D, Holstein AF,Muller D.Progenitor cells of the testosterone-producing Leydig cells revealed. The Journal of cell biology 2004 ;167:935_944)。這一研究成果提不可以利 用少量儲(chǔ)存的干細(xì)胞治療LOH患者進(jìn)行治療，提高其臨床應(yīng)用前景。然而，目前對(duì)睪丸間質(zhì) 干細(xì)胞的研究甚少，大多數(shù)局限在對(duì)其細(xì)胞器，組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞分布上。對(duì)睪丸間質(zhì)干細(xì)胞 的體外分離及培養(yǎng)的探討，僅有應(yīng)用Percoll密度梯度離心法，結(jié)合TOGFR-α陽性且LHR 陰性細(xì)胞的免疫選擇（Immunoselection)法，純化出大鼠睪丸中TOGFR-α陽性且LHR陰性 的細(xì)胞，并對(duì)其假定的睪丸間質(zhì)干細(xì)胞做了體外增殖培養(yǎng)、定向分化為睪酮分泌的睪丸間 質(zhì)細(xì)胞。葛仁山等人將分離得到的睪丸間質(zhì)干細(xì)胞移植入睪丸間質(zhì)細(xì)胞損傷大鼠模型中， 證明了睪丸間質(zhì)干細(xì)胞可以在體內(nèi)定植，并分化成有功能的睪丸間質(zhì)細(xì)胞。這些研究，提示 大鼠中的睪丸間質(zhì)干細(xì)胞可以在體外進(jìn)行培養(yǎng)和擴(kuò)增，但是現(xiàn)行方法存在獲得細(xì)胞量少， 細(xì)胞種類不明確，缺乏細(xì)胞鑒定標(biāo)準(zhǔn)等眾多弊端，明顯制約了臨床應(yīng)用，需要進(jìn)一步的深入 研究。
[0004] Nestin是VI型中間絲蛋白，是一種主要的細(xì)胞骨架蛋白，最早在神經(jīng)上皮細(xì)胞和 神經(jīng)系細(xì)胞發(fā)現(xiàn)（Lendahl Ul, Zimmerman LB, McKay RD. CNS stem cells express a new class of intermediate filament protein. Cell, 1990, 60:585-595) 〇 Nestin 除表達(dá)在 神經(jīng)系統(tǒng)前體細(xì)胞外（如：胚胎發(fā)育過程中的小鼠、大鼠和人的神經(jīng)系統(tǒng)），在發(fā)生病理損 傷時(shí)，Nestin也會(huì)出現(xiàn)返祖表達(dá)的現(xiàn)象。另外，在神經(jīng)系統(tǒng)以外的其他組織，例如毛囊干 細(xì)胞，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞等表達(dá)，提示Nestin可能為神經(jīng)系統(tǒng)以外其它祖細(xì)胞的標(biāo)志之 一。目前研究發(fā)現(xiàn)，睪丸間質(zhì)前體細(xì)胞具有表達(dá)Nestin的特征（Curr Top Dev Biol. 2004; 316:369-376)。有文獻(xiàn)報(bào)道，血管平滑?。╒SMCs)和周細(xì)胞（PC)是Leydig細(xì)胞的前體細(xì) 胞，但對(duì)EDS處理后的體內(nèi)模型研究認(rèn)為，在體內(nèi)具有細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)睪丸間質(zhì)細(xì)胞再生能 力的是Nestin表達(dá)的VSMCs和PC，這群細(xì)胞隨后轉(zhuǎn)分化，分化為具有類固醇分泌能力的睪 丸間質(zhì)細(xì)胞且Nestin表達(dá)下調(diào)。因此，認(rèn)為Nestin表達(dá)集中在PCs/VSMCs生成睪丸間質(zhì) 細(xì)胞，并表達(dá)在再生的睪丸間質(zhì)細(xì)胞中，這提示巢蛋白可能是尋找睪丸間質(zhì)干細(xì)胞的重要 標(biāo)志物（J Cell Biol, 2004, 167:935-944)。目前尚未見有關(guān)研究報(bào)道以巢蛋白為標(biāo)記物分 離和鑒定睪丸間質(zhì)干細(xì)胞的研究。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于克服睪丸間質(zhì)干細(xì)胞缺乏標(biāo)志物，簡化其分離及培養(yǎng)方法，提 供睪丸間質(zhì)干細(xì)胞的鑒定方法，以及其應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0007] 本發(fā)明的表達(dá)巢蛋白的睪丸間質(zhì)干細(xì)胞的分離方法以C57BL/6為遺傳背景的巢 蛋白-綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠模型；
[0008] 飼養(yǎng)所述轉(zhuǎn)基因小鼠模型的小鼠至1周齡，分離小鼠睪丸，用膠原酶IV消化，過濾 消化后的細(xì)胞懸液，濾過篩網(wǎng)，獲得單個(gè)細(xì)胞，所述細(xì)胞產(chǎn)生受巢蛋白增強(qiáng)子控制的增強(qiáng)型 綠色熒光蛋白；
[0009] 將上述單個(gè)細(xì)胞通過流式細(xì)胞儀進(jìn)行分選，用C57B/6小鼠細(xì)胞做陰性對(duì)照細(xì)胞， 收集表達(dá)綠色熒光蛋白的熒光強(qiáng)度是陰性對(duì)照細(xì)胞的熒光強(qiáng)度的10倍或以上的細(xì)胞，從 而分離出所述表達(dá)巢蛋白的睪丸間質(zhì)干細(xì)胞。
[0010] 所述巢蛋白-綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠模型包含以巢蛋白啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)表達(dá)增強(qiáng) 型綠色熒光蛋白的質(zhì)粒，其中，包括上游翻譯位點(diǎn)的啟動(dòng)子區(qū)域長2. 5kb，包含第二個(gè)外顯 子3'到第三個(gè)內(nèi)含子5'的增強(qiáng)子區(qū)域長1.8kb，多聚腺苷化位點(diǎn)與增強(qiáng)型綠色熒光蛋白 cDNA連接。
[0011] 本發(fā)明的分離方法的具體步驟如下：
[0012] 利用C57BL/6為遺傳背景的巢蛋白-綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠模型；利用出生后 7天Nestin-GFP的雄性小鼠及7天的正常C57BL/6雄性小鼠，采用頸椎脫臼法處死，在無菌 條件下打開陰囊部，取出雙側(cè)睪丸并在解剖顯微鏡下去除被膜和血管，暴露生精小管，用含 1 %雙抗的IXPBS反復(fù)沖洗，隨后用吸管及槍頭輕輕吹打，盡量使間質(zhì)組織與曲精細(xì)管分 散開，并用小剪刀剪碎組織部分，隨后放入lmg/ml的IV型膠原酶溶液，于37°C、5% CO2條 件下孵育15min，加入大量含0. 5% BSA的I XPBS終止膠原酶的消化，1500rmp離心5min ; 棄去上清液，用孔徑為40 μ m的尼龍網(wǎng)過濾懸液，去除曲細(xì)精管，收集的濾液以1500rmp離 心5min后，將Nestin-GFP的陽性細(xì)胞懸液樣本和正常C57BL/6的陰性對(duì)照細(xì)胞樣本，經(jīng)流 式分選收集表達(dá)綠色熒光蛋白的熒光強(qiáng)度是陰性對(duì)照細(xì)胞的熒光強(qiáng)度的10倍或以上的細(xì) 胞，從而分離出所述表達(dá)巢蛋白的睪丸間質(zhì)干細(xì)胞。
[0013] 本發(fā)明的分離方法得到的表達(dá)巢蛋白的睪丸間質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)方法如下：將分離 得到的表達(dá)巢蛋白的睪丸間質(zhì)干細(xì)胞在培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，產(chǎn)生自我更新和增殖的細(xì)胞， 經(jīng)實(shí)驗(yàn)表明，單純?cè)贒MEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)分離的巢蛋白陽性睪丸間質(zhì)干細(xì)胞不增殖， 容易分化，在第四代細(xì)胞即不能傳代。因此，本發(fā)明在DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上進(jìn)行 改良，優(yōu)選的培養(yǎng)基為無血清培養(yǎng)基，其成分包括：DMEM-F12培養(yǎng)基中加入InM地塞米松、 lng/ml LIF, 5mg/liter insulin, 5mg/litertransferrin, 5ug/liter sodium selenite 的 ITS、5%雞胚提取物、0· ΙπιΜβ-巰基乙醇、1%非必需氨基酸、1% N2、2% B27 (Gibco)、20ng/ ml bFGF、20ng/ml EGF、20ng/ml PDGFBB、20ng/ml 0SM。實(shí)驗(yàn)表明，將該培養(yǎng)用于本發(fā)明所 述的睪丸間質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)，細(xì)胞增殖效果非常好。3天進(jìn)行一次傳代。
[0014] 本發(fā)明對(duì)分離得到的巢蛋白陽性細(xì)胞進(jìn)行睪丸間質(zhì)干細(xì)胞系及干細(xì)胞相關(guān)蛋白 表達(dá)的檢測，從分子水平分析巢蛋白陽性細(xì)胞的細(xì)胞干性的分子生物學(xué)特點(diǎn)，進(jìn)一步提供 該細(xì)胞的克隆形成能力、自我跟新、多向分化能力，從而對(duì)該種干細(xì)胞進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明， 巢蛋白陽性睪丸間質(zhì)干細(xì)胞呈球狀克隆生長，并有較強(qiáng)的GFP熒光。培養(yǎng)的巢蛋白陽性 睪丸間質(zhì)干細(xì)胞表達(dá) Nestin，PDGFR-a，LIFR，PH3, SSEA-I，SSEA-4, GATA-4,但是不表達(dá) 3 β-HSD，LHR等。該細(xì)胞具有克隆形成能力，CCK8試劑盒檢測發(fā)現(xiàn)該細(xì)胞具有增殖能力。 分化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，巢蛋白陽性睪丸間質(zhì)干細(xì)胞可分化為神經(jīng)細(xì)胞（神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞）、 脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞。在睪丸間質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)分化條件下，可分化為睪丸間質(zhì)細(xì)胞， 并分泌睪酮。
[0015] 考慮到本發(fā)明所述的分離的巢蛋白陽性睪丸間質(zhì)干細(xì)胞在體內(nèi)的分化作用，將所 述細(xì)胞移植到去除睪丸間質(zhì)細(xì)胞的大鼠動(dòng)物模型（應(yīng)用大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞的特異性凋亡 誘導(dǎo)劑二甲磺酸乙烷（EDS)，成功建立了睪丸間質(zhì)細(xì)胞凋亡模型）和老年小鼠模型，評(píng)價(jià)該 細(xì)胞在睪丸微環(huán)境中的分化能力及作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該細(xì)胞移植后可以在大鼠及老年小鼠 睪丸內(nèi)定植、分化為睪丸間質(zhì)細(xì)胞、促進(jìn)睪酮的分泌，同時(shí)促進(jìn)精子的發(fā)生過程。因此本發(fā) 明的方法得到的睪丸間質(zhì)干細(xì)胞可以用于制備治療睪酮水平低下相關(guān)疾病的藥物。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0016] 圖1是Nestin-GFP轉(zhuǎn)基因小鼠睪丸組織中獲取巢蛋白陽性細(xì)胞的流式分選培養(yǎng) 圖：
[0017] Nes-GFP轉(zhuǎn)基因小鼠的睪丸產(chǎn)后（A) 7天，（B) 14天和（C) 28天，（D)不同年齡段小 鼠睪丸中巢蛋白陽性睪丸間質(zhì)干細(xì)胞的陽性率。
[0018] 圖2是培養(yǎng)的巢蛋白陽性睪丸間質(zhì)干細(xì)胞基因表達(dá)圖。
[0019] 圖3是培養(yǎng)的巢蛋白陽性睪丸間質(zhì)干細(xì)胞從單個(gè)細(xì)胞增長到克隆球的白光和熒 光觀察圖。
[0020] 圖4是培養(yǎng)的巢蛋白陽性睪丸間質(zhì)干細(xì)胞增殖曲線圖。
[0021] 圖5是巢蛋白陽性睪丸間質(zhì)干細(xì)胞分化后RT-PCR圖。
[0022] 圖6是巢蛋白陽性睪丸間質(zhì)干細(xì)胞分化后免疫熒光染色檢測睪丸間質(zhì)細(xì)胞相關(guān) 蛋白表達(dá)圖。
[0023] 圖7是巢蛋白陽性睪丸間質(zhì)干細(xì)胞分化后分泌睪酮圖。
[0024] 圖8是巢蛋白陽性睪丸間質(zhì)干細(xì)胞移植到EDS模型大鼠，注射了巢蛋白陽性睪丸 間質(zhì)干細(xì)胞的大鼠睪酮水平的示意圖。
[0025] 圖9是巢蛋白陽性睪丸間質(zhì)干細(xì)胞的體內(nèi)分化圖。
[0026] 圖10是巢蛋白陽性睪丸間質(zhì)干細(xì)胞移植入22個(gè)月大的小鼠睪丸后，注射了巢蛋 白陽性睪丸間質(zhì)干細(xì)胞的22月齡小鼠睪酮水平示意圖。
[0027] 圖11是巢蛋白陽性睪丸間質(zhì)干細(xì)胞移植入10天后促進(jìn)精子生產(chǎn)圖。

【具體實(shí)施方式】
[0028] 下面的實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步詳細(xì)描述。
[0029] 實(shí)施例一：小鼠成體巢蛋白陽性睪丸間質(zhì)細(xì)胞的分離
[0030] 本實(shí)施例從小鼠成體睪丸中分離獲得表達(dá)巢蛋白（Nestin)的睪丸間質(zhì)干細(xì)胞。
[0031] 選擇巢蛋白-GFP小鼠：本實(shí)驗(yàn)的轉(zhuǎn)基因小鼠是來自于日本京都大學(xué)醫(yī)學(xué)院 生理學(xué)教研室構(gòu)建的特異性標(biāo)記巢蛋白-綠色熒光蛋白（Nestin-GFP)轉(zhuǎn)基因小鼠 模型(Yamaguchi M, Saito H, Suzuki M, Mori K. Visualization of neurogenesis in the central nervous system using nestin promoter-GFP transgenic mice. Neuror印ort2000. 11:1991-1996)。但也可選用其他巢蛋白-GFP小鼠，它們的共同特征是： 包含以Nestin啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)表達(dá)GFP的質(zhì)粒,包括上游的翻譯位點(diǎn)的啟動(dòng)子區(qū)域長2. 5kb,包 含第二個(gè)外顯子3'到第三個(gè)內(nèi)含子5'的增強(qiáng)子區(qū)域長1.8kb，多聚腺苷化位點(diǎn)與增強(qiáng)型 GFP (EGFP) cDNA 連接。
[0032] 本發(fā)明利用該動(dòng)物模型的研究發(fā)現(xiàn)，不同年齡小鼠睪丸中存在巢蛋白陽性細(xì)胞 (即表達(dá)受巢蛋白增強(qiáng)子控制的綠色熒光蛋白），主要分布在睪丸間質(zhì)部分。本發(fā)明進(jìn)一步 利用流式分選技術(shù)，成功分離得到巢蛋白陽性睪丸間質(zhì)細(xì)胞。
[0033] 分離方法具體如下：
[0034] a.取出生后7天生殖系統(tǒng)發(fā)育健全的Nes-GFP的雄性小鼠及相同天數(shù)的正常 C57BL/6雄性小鼠，采用頸椎脫臼法處死，在無菌條件下打開陰囊部，取出雙側(cè)睪丸并在解 剖顯微鏡下去除被膜和血管，暴露生精小管，用含1 %雙抗的IXPBS反復(fù)沖洗。隨后用吸管 及槍頭輕輕吹打，盡量使間質(zhì)組織與曲精細(xì)管分散開，并用小剪刀剪碎組織部分。隨后放入 lmg/ml含少量DNase酶的IV型膠原酶溶液，于37°C、5% C02條件下孵育10?20min，加 入大量含〇. 5% BSA的IXPBS終止膠原酶的消化，1500rmp離心5min ;棄去上清液，用孔徑 為40 μ m的尼龍網(wǎng)過濾懸液，去除未消化的曲細(xì)精管，收集的濾液以1500rmp離心5min后， 將Nes-GFP的陽性細(xì)胞懸液樣本和正常C57BL/6的陰性對(duì)照細(xì)胞樣本，分別將細(xì)胞用流式 緩沖液重懸至已標(biāo)記好的流式上樣管中。
[0035] b.使用流式細(xì)胞儀（BD influx cell sorter)先對(duì)正常的C57BL/6的陰性對(duì)照組 細(xì)胞懸液進(jìn)行流式上樣，選出陰性熒光信號(hào)區(qū)域作為陰性對(duì)照。隨后對(duì)Nestin-GFP的陽性 細(xì)胞懸液進(jìn)行流式上樣，分選純化出睪丸中GFP表達(dá)的陽性細(xì)胞，用培養(yǎng)基對(duì)分選出的細(xì) 胞進(jìn)行收集。
[0036] 圖1是出生7天、14天、28天的巢蛋白-GFP小鼠睪丸中巢蛋白陽性睪丸間質(zhì)干細(xì) 胞細(xì)胞流式分選圖。如圖1所示，用C57B/6小鼠細(xì)胞做陰性對(duì)照細(xì)胞，巢蛋白-GFP小鼠 睪丸間質(zhì)細(xì)胞熒光強(qiáng)度是對(duì)照的10倍或以上時(shí)收集細(xì)胞，為巢蛋白陽性睪丸間質(zhì)干細(xì)胞， 從圖中可以看出陽性率最高的為7天的老鼠62. 4%，并可以看出隨著年齡增長陽性率呈下 降趨勢(shì)，根據(jù)這一結(jié)果，為了獲取更多的陽性細(xì)胞，我們就可以選擇7天小鼠為主要實(shí)驗(yàn)對(duì) 象。
[0037] 實(shí)施例二：巢蛋白陽性睪丸間質(zhì)干細(xì)胞自我更新和增殖能力的鑒定
[0038] 本實(shí)施例是在實(shí)施例一的基礎(chǔ)上，對(duì)所獲得的巢蛋白陽性睪丸間質(zhì)干細(xì)胞自我更 新和增殖能力進(jìn)行鑒定。
[0039] a.巢蛋白陽性睪丸間質(zhì)干細(xì)胞自我更新能力的鑒定：
[0040] 將從小鼠成體睪丸中分選獲得的單個(gè)巢蛋白陽性細(xì)胞分別置于6孔板的各個(gè)單 孔中進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)液成分包括DMEM-F12培養(yǎng)基中加入InM地塞米松、lng/ml LIF，5mg/ liter insulin, 5mg/litertransferrin, 5ug/liter sodium selenite 的 ITS、5%雞胚提取 物、0· ΙπιΜβ -巰基乙醇、1%非必需氨基酸、1% N2、2% B27(Gibco)、20ng/ml bFGF、20ng/ml EGF、20ng/ml roGFBB、20ng/ml OSM。上述培養(yǎng)基中，分選的原代細(xì)胞貼壁生長。7天后傳 代，形成球樣生長。觀察細(xì)胞克隆的形成情況，當(dāng)細(xì)胞克隆大小達(dá)到50 μ m以上、密度達(dá)到 70%，用37°C的0. 05%胰蛋白酶-EDTA對(duì)細(xì)胞消化30秒，進(jìn)行傳代。
[0041] 應(yīng)用免疫熒光染色的方法進(jìn)行包括H)GFR-a、LIFR、胚胎干細(xì)胞標(biāo)志物，例 如SSEA-1、SSEA-4,睪丸間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物L(fēng)HR和3 β -HSD，GATA4以及細(xì)胞增殖相關(guān)標(biāo)志 物？113的染色，細(xì)胞切片用4%多聚甲醛固2〇1^11，？85緩沖液中浸洗51^11\3次，0.2% Triton-X-IOO穿透30分鐘，正常山羊血清室溫孵育20分鐘，加一抗，濕化盒中4°C過夜，力口 二抗，室溫孵育1小時(shí)，熒光顯微鏡觀察結(jié)果。
[0042] 圖2顯示了巢蛋白陽性睪丸間質(zhì)干細(xì)胞球的巢蛋白與上述干細(xì)胞增殖重新編 程有關(guān)的標(biāo)志物的免疫熒光共染色結(jié)果。結(jié)果表明，巢蛋白陽性睪丸間質(zhì)干細(xì)胞球表達(dá) PDGFR- a、LIFR、SSEA1、SSEA4、GATA4、PH3 等，但不表達(dá) LHR、3 β -HSD。
[0043] b.巢蛋白陽性睪丸間質(zhì)干細(xì)胞增殖能力的鑒定：
[0044] 為了演示巢蛋白陽性睪丸間質(zhì)干細(xì)胞的自我更新能力，我們從P7代巢蛋白陽性 睪丸間質(zhì)干細(xì)胞消化得到單細(xì)胞，進(jìn)行單細(xì)胞球體形成試驗(yàn)（圖3)。圖3表明單細(xì)胞培養(yǎng) 10天后可形成克隆。圖4表明單細(xì)胞的播種顯示了 CCK-8細(xì)胞增殖活性檢測結(jié)果。結(jié)果表 明，巢蛋白陽性睪丸間質(zhì)干細(xì)胞具有較強(qiáng)的細(xì)胞增殖能力。
[0045] c.巢蛋白陽性睪丸間質(zhì)干細(xì)胞分化能力的鑒定：
[0046] 為了演示巢蛋白陽性睪丸間質(zhì)干細(xì)胞的分化能力，利用常規(guī)神經(jīng)分化，成骨，成 月旨，成軟骨培養(yǎng)液中進(jìn)行分化。分化7天后發(fā)現(xiàn)，巢蛋白陽性睪丸間質(zhì)干細(xì)胞具有向神經(jīng)元 及星形膠質(zhì)細(xì)胞的分化能力。21天后，可向成骨細(xì)胞，脂肪細(xì)胞，軟骨細(xì)胞分化。在特定睪 丸間質(zhì)細(xì)胞分化培養(yǎng)液（DMEM-F12培養(yǎng)基中加入2%FCS，10ng/ml PDGF-BB，lnM T3，lng/ml LH，70ng/ml IGF-I，IOng PDGF-BB以及ITS)中分化7天。如圖5和圖6所示：巢蛋白陽 性睪丸間質(zhì)干細(xì)胞可向成熟睪丸間質(zhì)細(xì)胞分化。通過RT-PCR分析，分化的細(xì)胞表達(dá)StAR， 3 β-HSD，LHR。如圖7所示，睪酮ELISA檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著分化時(shí)間的增加，睪酮分泌增 商。
[0047] 實(shí)施例三：觀察巢蛋白陽性睪丸間質(zhì)干細(xì)胞在體內(nèi)組織修復(fù)中作用
[0048] a.大鼠EDS模型的建立：
[0049] 干細(xì)胞對(duì)體內(nèi)受損組織的再生能力是一個(gè)重要的特征。因此，我們調(diào)查巢蛋白陽 性睪丸間質(zhì)干細(xì)胞是否能在睪丸間質(zhì)細(xì)胞缺失的大鼠模型中促進(jìn)睪丸間質(zhì)的功能恢復(fù)。先 前的研究表明the cytotoxin ethane dimethanesulfonate(EDS)經(jīng)過4天的處理可能耗 盡睪丸間質(zhì)細(xì)胞。我們選擇三組成年大鼠，分別為正常組、模型組、細(xì)胞組。模型組和細(xì)胞 組的大鼠接種EDS，4天后PKH26-標(biāo)記的IxlO 6巢蛋白陽性睪丸間質(zhì)干細(xì)胞被注入到睪丸 實(shí)質(zhì)中。移植第10天時(shí)測量血清中睪酮濃度。圖8顯示，巢蛋白陽性睪丸間質(zhì)干細(xì)胞移植 促進(jìn)血清睪酮增加，明顯高于對(duì)照老年鼠。
[0050] b.老年鼠模型的建立
[0051] 在雄性老鼠，血清睪酮水平隨著年齡的老化而下降。為了測試巢蛋白陽性睪丸間 質(zhì)干細(xì)胞是否能夠在衰老模型中恢復(fù)睪酮的生產(chǎn)，我們注入PKH26-標(biāo)記的IxlO 6巢蛋白陽 性睪丸間質(zhì)干細(xì)胞到22個(gè)月的老年鼠的睪丸，并以3個(gè)月齡小鼠和沒有注入細(xì)胞的22個(gè) 月老年小鼠為對(duì)照。分別于10天時(shí)測量血清中睪酮濃度，同時(shí)分別相應(yīng)時(shí)間段小鼠的睪 丸，進(jìn)行冰凍切片，觀察其組織損傷修復(fù)情況。圖9顯示通過免疫熒光染色檢測PKH26陽性 細(xì)胞與P450scc、LHR共定位情況。以3個(gè)月齡年輕小鼠為對(duì)照，免疫熒光染色顯示老年小 鼠中P45〇 SCC或LHR陽性細(xì)胞的明顯減少。相反，將巢蛋白陽性睪丸間質(zhì)干細(xì)胞移植到22 個(gè)月老年小鼠的睪丸間質(zhì)10天后，P45〇 SCC、LHR的表達(dá)水平增高。圖10顯示巢蛋白陽性 睪丸間質(zhì)干細(xì)胞注入老年小鼠睪丸后，促進(jìn)血清睪酮增加，明顯高于對(duì)照老年小鼠。
[0052] c.蘇木精-尹紅（HE)染色
[0053] 方法同常規(guī)石蠟切片蘇木精-尹紅（HE)染色。觀察精子細(xì)胞。如圖11所示，處 理EDS的大鼠及老年小鼠發(fā)育過程中的精子細(xì)胞明顯減少，而巢蛋白陽性睪丸間質(zhì)干細(xì)胞 移植顯著促進(jìn)了精子的發(fā)育過程。
[0054] 盡管已經(jīng)示出和描述了本發(fā)明的實(shí)施例，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員而言，可以 理解在不脫離本發(fā)明的原理和精神的情況下可以對(duì)這些實(shí)施例進(jìn)行多種變化、修改、替換 和變型，本發(fā)明的范圍由所附權(quán)利要求及其等同物限定。
【權(quán)利要求】
1. 一種表達(dá)巢蛋白的睪丸間質(zhì)干細(xì)胞的分離方法，其特征在于：以C57BL/6為遺傳背 景的巢蛋白-綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠模型； 飼養(yǎng)所述轉(zhuǎn)基因小鼠模型的小鼠至1周齡，分離小鼠睪丸，用膠原酶IV消化，過濾消化 后的細(xì)胞懸液，濾過篩網(wǎng)，獲得單個(gè)細(xì)胞，所述細(xì)胞產(chǎn)生受巢蛋白增強(qiáng)子控制的增強(qiáng)型綠色 突光蛋白； 將上述單個(gè)細(xì)胞通過流式細(xì)胞儀進(jìn)行分選，用C57B/6小鼠細(xì)胞做陰性對(duì)照細(xì)胞，收集 表達(dá)綠色熒光蛋白的熒光強(qiáng)度是陰性對(duì)照細(xì)胞的熒光強(qiáng)度的10倍或以上的細(xì)胞，從而分 離出所述表達(dá)巢蛋白的睪丸間質(zhì)干細(xì)胞。
2. 如權(quán)利要求1所述的表達(dá)巢蛋白的睪丸間質(zhì)干細(xì)胞的分離方法，其特征在于：所述 巢蛋白-綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠模型包含以巢蛋白啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)表達(dá)增強(qiáng)型綠色熒光蛋 白的質(zhì)粒，其中，包括上游翻譯位點(diǎn)的啟動(dòng)子區(qū)域長2. 5kb，包含第二個(gè)外顯子3'到第三個(gè) 內(nèi)含子5'的增強(qiáng)子區(qū)域長I. 8kb，多聚腺苷化位點(diǎn)與增強(qiáng)型綠色熒光蛋白cDNA連接。
3. 如權(quán)利要求1或2所述的表達(dá)巢蛋白的睪丸間質(zhì)干細(xì)胞的分離方法，其特征在于： 所述的分離方法的具體步驟如下： 利用C57BL/6為遺傳背景的巢蛋白-綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠模型；利用出生后7天 Nestin-GFP的雄性小鼠及7天的正常C57BL/6雄性小鼠，采用頸椎脫臼法處死，在無菌條 件下打開陰囊部，取出雙側(cè)睪丸并在解剖顯微鏡下去除被膜和血管，暴露生精小管，用含 1 %雙抗的IXPBS反復(fù)沖洗，隨后用吸管及槍頭輕輕吹打，盡量使間質(zhì)組織與曲精細(xì)管分 散開，并用小剪刀剪碎組織部分，隨后放入lmg/ml的IV型膠原酶溶液，于37°C、5% CO2條 件下孵育15min，加入大量含0. 5% BSA的I XPBS終止膠原酶的消化，1500rmp離心5min ; 棄去上清液，用孔徑為40 μ m的尼龍網(wǎng)過濾懸液，去除曲細(xì)精管，收集的濾液以1500rmp離 心5min后，將Nestin-GFP的陽性細(xì)胞懸液樣本和正常C57BL/6的陰性對(duì)照細(xì)胞樣本，經(jīng)流 式分選收集表達(dá)綠色熒光蛋白的熒光強(qiáng)度是陰性對(duì)照細(xì)胞的熒光強(qiáng)度的10倍或以上的細(xì) 胞，從而分離出所述表達(dá)巢蛋白的睪丸間質(zhì)干細(xì)胞。
4. 一種培養(yǎng)如權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的方法得到的表達(dá)巢蛋白的睪丸間質(zhì)干細(xì)胞 的方法，其特征在于：將分離得到的表達(dá)巢蛋白的睪丸間質(zhì)干細(xì)胞在培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，產(chǎn) 生自我更新和增殖的細(xì)胞，所述的培養(yǎng)基為無血清培養(yǎng)基，其成分包括：DMEM-F12培養(yǎng)基 中力口入 InM地塞米松、lng/ml LIF, 5mg/liter insulin, 5mg/litertransferrin, 5ug/liter sodium selenite的ITS、5%雞胚提取物、0. ΙπιΜβ-巰基乙醇、1%非必需氨基酸、1% N2、 2% Β27(Gibco)、20ng/ml bFGF、20ng/ml EGF、20ng/ml PDGFBB、20ng/ml 0SM。
5. -種如權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的方法得到的表達(dá)巢蛋白的睪丸間質(zhì)干細(xì)胞用于 制備治療睪酮水平低下導(dǎo)致相關(guān)疾病的藥物的用途。
【文檔編號(hào)】A61P5/26GK104212767SQ201410469362
【公開日】2014年12月17日 申請(qǐng)日期:2014年9月15日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月15日
【發(fā)明者】項(xiàng)鵬, 姜美花, 蔡炳, 臧志軍, 汪建成 申請(qǐng)人:中山大學(xué)