本發(fā)明涉及一種檢測方法，具體是一種單增李斯特氏菌的快速檢測方法。

背景技術：

單核細胞增生李斯特氏菌簡稱單增李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes，LM)，是李斯特菌屬中最重要的人類食源性病原菌。肉、蛋、海產品、乳制品、蔬菜等食品均是LM的主要污染源，人被LM感染后死亡率可達30%，在新生嬰幼兒和免疫力低下的人群中死亡率則高達70%。該菌在4℃冰箱保存的食物中仍能生長繁殖，使其成為冷藏食品中主要的病原菌之一。按照我國國標法規(guī)定的檢測方法，完成LM初篩過程需72~96h。如此長的檢測周期給企業(yè)、國家相關部門對日常產品質量監(jiān)測及LM中毒事件進行快速反饋帶來了一定困難。免疫學檢測是實現LM快速篩查的有效手段之一。比較經典的流程包括前期增菌、免疫磁珠高效富集及膠體金免疫層析試紙條或ELISA檢測等步驟。其中提高免疫磁珠富集效率對縮短LM檢出時間具有較大的貢獻。免疫磁分離是基于抗原、抗體免疫學反應，利用超順磁粒子在磁場存在時能迅速磁化并聚集、磁場消失后可重新分散于溶液的特性的一種磁分離方法。一些研究把免疫磁捕獲和實時熒光PCR技術結合起來，檢測食品中的單核增生李斯特菌。PCR方法和生物傳感器方法都具有較高的檢測靈敏度，一般可將檢測時間減少至24-48小時（依據不同檢測項目而言），但是該方法要求具有較高素質的操作人員、較好的檢測儀器以及檢測條件，因此較難在基層以及企業(yè)大面積推廣使用，同時檢測時間仍很難滿足企業(yè)對出廠前產品質量安全進行快速反應的實際需求，且該方法無法分辨死/活致病菌以及DNA片段的同源性，易造成假陽性偏高的結果；而在檢測很多食品基質時，又會因為一些物質的存在而抑制了DNA聚合酶的活性，從而造成假陰性。免疫學尤其是免疫層析方法，不需復雜儀器設備，檢測時間快（一般15min即可獲得結果），易操作，但目前該類方法總體檢測靈敏度偏低(需要細菌濃度需達到105-6CFU/mL)，因此針對食品樣品檢測，往往需要較長的增菌時間。目前單核增生李斯特菌免疫學方法，采用膠體金免疫層析技術檢測，從增菌到檢測需要至少24小時才能實現25g樣品中單菌的檢測。由于微生物的生長具有其特定的生理周期，通過優(yōu)化培養(yǎng)條件縮短時間效果不明顯；因此多采用免疫磁珠分離技術富集。依賴于特異性抗體的免疫磁珠分離技術可有效地提高待測微生物的檢測靈敏度，已逐漸成為食源性致病菌特異性分離和濃縮的最有效手段之一，并廣泛應用于單核增生李斯特菌等食源性致病菌的富集，大大縮短了食源性致病菌整體檢測時間。以膜為固相載體的膠體金免疫層析法是20世紀80年代在單克隆抗體技術、膠體金免疫技術和新材料技術基礎上發(fā)展起來的一項新型檢測方法。由于其快速、便捷、不需特殊設備、結果判斷直觀、可以現場進行檢測的特點，近年來越來越受到人們的重視，其技術發(fā)展迅速，在的檢測領域得到了廣泛應用。但是對于某些抗原或抗體含量極低的樣本，標記物的顏色很淡幾乎用肉眼難以判斷結果，雖然目前市場上有針對膠體金等標記的免疫層析試紙條判讀的儀器，但是這種儀器僅能對在固相載體表面的標記物顏色檢測，而對固相載體內部的標記物很難檢測到，因此檢測的靈敏度受到很大限制。同時檢測的生物樣本中可能含有顏色物質會嚴重影響檢測的結果和靈敏度。

技術實現要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種單增李斯特氏菌的快速檢測方法，以解決上述背景技術中提出的問題。

為實現上述目的，本發(fā)明提供如下技術方案：

一種單增李斯特氏菌的快速檢測方法，包括以下步驟：1）制備偶聯單抗的金磁微粒；取抗單增生李斯特氏菌單抗與納米金磁微?；旌希辉跍囟?7℃時，放在轉速為10-15rpm的旋轉儀上，偶聯時間30~60min，磁分離3~5min，棄上清；用清洗緩沖液清洗3遍之后，用1mL封閉劑與磁珠混合封閉1h；2）使用偶聯單抗的金磁微粒捕獲菌：培養(yǎng)單增生李斯特氏菌，將菌液濃度調整為107CFU/mL、106CFU/mL、105CFU/mL、104CFU/mL，各取1mL備用；取待測樣品溶液1mL、各濃度菌液1mL，分別與步驟1）所得偶聯單抗的金磁微粒100~150μg，溫度37℃，轉速10-15rpm混合孵育30~60min，；孵育后磁分離3~5min后，棄上清，用PBS緩沖液清洗后，復溶于PBS中；3）制作免疫層析試紙條；將單增生李斯特氏菌兔多抗和兔抗鼠二抗噴到硝酸纖維膜上分別作為檢測線T線和質控線C線，濃度均為1.0~2.0mg/mL，噴量均為0.5~1.0μL/cm，37℃真空干燥過夜，將樣本墊、硝酸纖維膜、吸水紙、濾紙依次粘貼在PVC底板上，貼好后將其切成4mm寬的條子，裝卡；將制備好的試紙條置于錫箔袋中加干燥劑密封，置于干燥缸保存?zhèn)溆茫?）利用雙抗夾心法對樣品進行測定；將捕獲到菌的金磁微粒稀釋到濃度50~150μg/mL，取100μL滴加到試紙條加樣孔中，10min后用免疫層析分析儀讀取，記錄T線吸光度、C線吸光度和T/C的值；5）定性分析：用肉眼觀察結果進行定性分析，T線顯色則說明樣品中有單增生李斯特氏菌，T線不顯色則說明樣品中沒有單增生李斯特氏菌或是含有單增生李斯特氏菌的量低于最低檢測下限104CFU/mL；6)待檢測基因組DNA的提?。河眉毦蚪MDNA提取試劑盒提取細菌DNA；7)環(huán)介導等溫擴增步驟：金磁微粒加入反應體系，擴增溫度為62.5℃，實時濁度儀中反應60min，80℃，5min，終止反應；8)直接通過實時濁度儀觀察或擴增產物經2％瓊脂糖凝膠電泳鑒定；9）定量分析：使用免疫層析分析儀測量T線、C線的吸光度，T線和C線的吸光度的比值記為T/C值，以不同菌的濃度為橫坐標，T/C值為縱坐標繪制標準曲線；參考所做的標準曲線圖，確定普通樣品中的單增生李斯特氏菌數量。

作為本發(fā)明再進一步的方案：所述步驟1）納米金磁微粒粒徑為50nm；步驟1）抗單核增生李斯特氏菌單抗的量50~100μg對應50nm的納米金磁微粒的量為0.5~1.0mg。

與現有技術相比，本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明能克服傳統(tǒng)檢測方法存在的檢測周期長、步驟繁瑣、費時費力等缺點，使檢測時間大大縮短，操作步驟和勞動強度也大為縮減，達到省時省力、快速靈敏的要求。

具體實施方式

下面對本發(fā)明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述。

本發(fā)明實施例中，一種單增李斯特氏菌的快速檢測方法，包括以下步驟：1）制備偶聯單抗的金磁微粒；取抗單增生李斯特氏菌單抗與納米金磁微?；旌?；在溫度37℃時，放在轉速為10-15rpm的旋轉儀上，偶聯時間30~60min，磁分離3~5min，棄上清；用清洗緩沖液清洗3遍之后，用1mL封閉劑與磁珠混合封閉1h；2）使用偶聯單抗的金磁微粒捕獲菌：培養(yǎng)單增生李斯特氏菌，將菌液濃度調整為107CFU/mL、106CFU/mL、105CFU/mL、104CFU/mL，各取1mL備用；取待測樣品溶液1mL、各濃度菌液1mL，分別與步驟1）所得偶聯單抗的金磁微粒100~150μg，溫度37℃，轉速10-15rpm混合孵育30~60min，；孵育后磁分離3~5min后，棄上清，用PBS緩沖液清洗后，復溶于PBS中；3）制作免疫層析試紙條；將單增生李斯特氏菌兔多抗和兔抗鼠二抗噴到硝酸纖維膜上分別作為檢測線T線和質控線C線，濃度均為1.0~2.0mg/mL，噴量均為0.5~1.0μL/cm，37℃真空干燥過夜，將樣本墊、硝酸纖維膜、吸水紙、濾紙依次粘貼在PVC底板上，貼好后將其切成4mm寬的條子，裝卡；將制備好的試紙條置于錫箔袋中加干燥劑密封，置于干燥缸保存?zhèn)溆茫?）利用雙抗夾心法對樣品進行測定；將捕獲到菌的金磁微粒稀釋到濃度50~150μg/mL，取100μL滴加到試紙條加樣孔中，10min后用免疫層析分析儀讀取，記錄T線吸光度、C線吸光度和T/C的值；5）定性分析：用肉眼觀察結果進行定性分析，T線顯色則說明樣品中有單增生李斯特氏菌，T線不顯色則說明樣品中沒有單增生李斯特氏菌或是含有單增生李斯特氏菌的量低于最低檢測下限104CFU/mL；6)待檢測基因組DNA的提?。河眉毦蚪MDNA提取試劑盒提取細菌DNA；7)環(huán)介導等溫擴增步驟：金磁微粒加入反應體系，擴增溫度為62.5℃，實時濁度儀中反應60min，80℃，5min，終止反應；8)直接通過實時濁度儀觀察或擴增產物經2％瓊脂糖凝膠電泳鑒定；9）定量分析：使用免疫層析分析儀測量T線、C線的吸光度，T線和C線的吸光度的比值記為T/C值，以不同菌的濃度為橫坐標，T/C值為縱坐標繪制標準曲線；參考所做的標準曲線圖，確定普通樣品中的單增生李斯特氏菌數量。所述步驟1）納米金磁微粒粒徑為50nm；步驟1）抗單核增生李斯特氏菌單抗的量50~100μg對應50nm的納米金磁微粒的量為0.5~1.0mg。

實施例1：

本發(fā)明單增李斯特氏菌的快速檢測方法，包括以下步驟：1）制備偶聯單抗的金磁微粒；取抗單增生李斯特氏菌單抗與納米金磁微?；旌希辉跍囟?7℃時，放在轉速為10rpm的旋轉儀上，偶聯時間30min，磁分離3min，棄上清；用清洗緩沖液清洗3遍之后，用1mL封閉劑與磁珠混合封閉1h；2）使用偶聯單抗的金磁微粒捕獲菌：培養(yǎng)單增生李斯特氏菌，將菌液濃度調整為107CFU/mL、106CFU/mL、105CFU/mL、104CFU/mL，各取1mL備用；取待測樣品溶液1mL、各濃度菌液1mL，分別與步驟1）所得偶聯單抗的金磁微粒100μg，溫度37℃，轉速10-15rpm混合孵育30min，；孵育后磁分離3~5min后，棄上清，用PBS緩沖液清洗后，復溶于PBS中；3）制作免疫層析試紙條；將單增生李斯特氏菌兔多抗和兔抗鼠二抗噴到硝酸纖維膜上分別作為檢測線T線和質控線C線，濃度均為1.0mg/mL，噴量均為0.5μL/cm，37℃真空干燥過夜，將樣本墊、硝酸纖維膜、吸水紙、濾紙依次粘貼在PVC底板上，貼好后將其切成4mm寬的條子，裝卡；將制備好的試紙條置于錫箔袋中加干燥劑密封，置于干燥缸保存?zhèn)溆茫?）利用雙抗夾心法對樣品進行測定；將捕獲到菌的金磁微粒稀釋到濃度50μg/mL，取100μL滴加到試紙條加樣孔中，10min后用免疫層析分析儀讀取，記錄T線吸光度、C線吸光度和T/C的值；5）定性分析：用肉眼觀察結果進行定性分析，T線顯色則說明樣品中有單增生李斯特氏菌，T線不顯色則說明樣品中沒有單增生李斯特氏菌或是含有單增生李斯特氏菌的量低于最低檢測下限104CFU/mL；6)待檢測基因組DNA的提?。河眉毦蚪MDNA提取試劑盒提取細菌DNA；7)環(huán)介導等溫擴增步驟：金磁微粒加入反應體系，擴增溫度為62.5℃，實時濁度儀中反應60min，80℃，5min，終止反應；8)直接通過實時濁度儀觀察或擴增產物經2％瓊脂糖凝膠電泳鑒定；9）定量分析：使用免疫層析分析儀測量T線、C線的吸光度，T線和C線的吸光度的比值記為T/C值，以不同菌的濃度為橫坐標，T/C值為縱坐標繪制標準曲線；參考所做的標準曲線圖，確定普通樣品中的單增生李斯特氏菌數量。所述步驟1）納米金磁微粒粒徑為50nm；步驟1）抗單核增生李斯特氏菌單抗的量50μg對應50nm的納米金磁微粒的量為0.5mg。

實施例2：

本發(fā)明單增李斯特氏菌的快速檢測方法，包括以下步驟：1）制備偶聯單抗的金磁微粒；取抗單增生李斯特氏菌單抗與納米金磁微粒混合；在溫度37℃時，放在轉速為15rpm的旋轉儀上，偶聯時間60min，磁分離3~5min，棄上清；用清洗緩沖液清洗3遍之后，用1mL封閉劑與磁珠混合封閉1h；2）使用偶聯單抗的金磁微粒捕獲菌：培養(yǎng)單增生李斯特氏菌，將菌液濃度調整為107CFU/mL、106CFU/mL、105CFU/mL、104CFU/mL，各取1mL備用；取待測樣品溶液1mL、各濃度菌液1mL，分別與步驟1）所得偶聯單抗的金磁微粒150μg，溫度37℃，轉速15rpm混合孵育30~60min，；孵育后磁分離3~5min后，棄上清，用PBS緩沖液清洗后，復溶于PBS中；3）制作免疫層析試紙條；將單增生李斯特氏菌兔多抗和兔抗鼠二抗噴到硝酸纖維膜上分別作為檢測線T線和質控線C線，濃度均為2.0mg/mL，噴量均為1.0μL/cm，37℃真空干燥過夜，將樣本墊、硝酸纖維膜、吸水紙、濾紙依次粘貼在PVC底板上，貼好后將其切成4mm寬的條子，裝卡；將制備好的試紙條置于錫箔袋中加干燥劑密封，置于干燥缸保存?zhèn)溆茫?）利用雙抗夾心法對樣品進行測定；將捕獲到菌的金磁微粒稀釋到濃度150μg/mL，取100μL滴加到試紙條加樣孔中，10min后用免疫層析分析儀讀取，記錄T線吸光度、C線吸光度和T/C的值；5）定性分析：用肉眼觀察結果進行定性分析，T線顯色則說明樣品中有單增生李斯特氏菌，T線不顯色則說明樣品中沒有單增生李斯特氏菌或是含有單增生李斯特氏菌的量低于最低檢測下限104CFU/mL；6)待檢測基因組DNA的提?。河眉毦蚪MDNA提取試劑盒提取細菌DNA；7)環(huán)介導等溫擴增步驟：金磁微粒加入反應體系，擴增溫度為62.5℃，實時濁度儀中反應60min，80℃，5min，終止反應；8)直接通過實時濁度儀觀察或擴增產物經2％瓊脂糖凝膠電泳鑒定；9）定量分析：使用免疫層析分析儀測量T線、C線的吸光度，T線和C線的吸光度的比值記為T/C值，以不同菌的濃度為橫坐標，T/C值為縱坐標繪制標準曲線；參考所做的標準曲線圖，確定普通樣品中的單增生李斯特氏菌數量。所述步驟1）納米金磁微粒粒徑為50nm；步驟1）抗單核增生李斯特氏菌單抗的量100μg對應50nm的納米金磁微粒的量為1.0mg。

對于本領域技術人員而言，顯然本發(fā)明不限于上述示范性實施例的細節(jié)，而且在不背離本發(fā)明的精神或基本特征的情況下，能夠以其他的具體形式實現本發(fā)明。因此，無論從哪一點來看，均應將實施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本發(fā)明的范圍由所附權利要求而不是上述說明限定，因此旨在將落在權利要求的等同要件的含義和范圍內的所有變化囊括在本發(fā)明內。此外，應當理解，雖然本說明書按照實施方式加以描述，但并非每個實施方式僅包含一個獨立的技術方案，說明書的這種敘述方式僅僅是為清楚起見，本領域技術人員應當將說明書作為一個整體，各實施例中的技術方案也可以經適當組合，形成本領域技術人員可以理解的其他實施方式。