一種煙草疫霉菌lamp檢測引物及其快速檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種煙草疫霉菌LAMP引物及其快速檢測方法，專用于煙草疫霉菌特異檢測。根據(jù)煙草疫霉ITS基因序列設計出了一種煙草疫霉菌的LAMP引物。經過恒溫擴增和加入SYBR green I顯色劑或瓊脂糖凝膠電泳檢測，可觀察到綠色熒光或出現(xiàn)LAMP特異性的梯形帶。所述的LAMP引物及其快速檢測方法可在生產實踐中對煙草疫霉菌感染的植株和土壤中煙草疫霉菌進行快速、靈敏、準確的檢測，同時可用于田間病害的早期診斷和病菌的監(jiān)測和鑒定，并且操作簡便易行。
【專利說明】一種煙草疫霉菌LAMP檢測引物及其快速檢測方法

【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種煙草疫霉菌LAMP引物及其快速檢測方法，專用于煙草疫霉高靈敏度快速分子檢測，同時可用于田間煙草黑脛病的早期診斷，屬于農作物病害檢測、鑒定及防治【技術領域】。

【背景技術】
[0002]煙草疫霉菌(Phytophthoraparasitica = Phytophthora nicotianae)侵染煙草引起的煙草黑脛病是煙草生產上的毀滅性病害之一，煙草黑脛病是威脅世界煙草生產的主要病害，同時也是我國煙草生產中危害嚴重的病害之一?？晌：緹煛駸?、晾煙、香料煙、白肋煙等所有栽培煙草，主要侵染煙草根部和莖基部，其初侵染來源為帶菌土壤及病殘體。煙株發(fā)病后其根系和莖基部變黑腐爛，并很快萎蔫死亡，有極強的破壞性，對煙葉的產量和品質影響極大。煙草黑脛病菌在自然條件下還可以侵染草莓、茄子等其它重要經濟作物。煙草黑脛病在生產中常常與煙草根黑腐病及煙草青枯病等根莖類病害混合發(fā)生，給病害的診斷造成困難。病原菌本身的形態(tài)學和生物學性狀具有較大的變異性，因而菌種鑒定也較為困難。因此建立煙草疫霉菌快速檢測體系，早期對發(fā)病植株及土壤進行疫霉菌快速準確檢測，對病害的預測預報及其傳播和流行的控制均有重要的理論和實際意義。
[0003]目前對煙草疫霉菌的檢測技術與方法主要包括常規(guī)檢測方法和普通PCR法等。常規(guī)的檢測方法通過病原菌的生物學培養(yǎng)、形態(tài)學觀察及柯赫氏法則來判斷其種類。傳統(tǒng)方法在煙草疫霉菌檢測中發(fā)揮了重要作用，但是費時費力，而且要求操作者具備一定的病原菌分離、形態(tài)學鑒定等方面的專業(yè)知識。形態(tài)學特征為基礎的常規(guī)病害診斷技術，耗時長、效率低，較難滿足對煙草疫霉病診斷的實際生產需要，很容易錯過病害防治的最佳時期。隨著核酸相關的鑒定方法的發(fā)展，基于PCR的方法已經成功用于檢測煙草疫霉菌，雖然PCR法在特異性和敏感性上有較大的提高，但是檢測時間仍然比較長，大概3-4h，同時PCR方法依賴精密的溫度循環(huán)裝置。其檢測靈敏度比較高，但是檢測過程復雜，不能滿足快速檢測的需求。因此，建立一套快速準確的檢測方法來對煙草疫霉菌進行檢測。
[0004]環(huán)介導等溫擴增技術(LOOP-mediatedisothermal amplificat1n, LAMP)是日本的榮研株式會發(fā)明的一種新的核酸擴增技術，因為其操作簡單、快速、特異性高、成本低等優(yōu)點，成為可以替代PCR的樣報的核酸擴增技術。其特點是針對靶基因的6個區(qū)域設計4個特異引物，在Bst大片段聚合酶的作用下引起自循環(huán)鏈置換反應，60-65°C范圍保溫60min內，即可完成核酸擴增反應，通過熒光染色后在紫外燈下即可清晰的觀察到反應結果。
[0005]由于LAMP擴增過程依賴識別靶序列6個獨立區(qū)域，所以反應特異性很強，并且核酸擴增過程是在恒溫條件下進行，普通水浴鍋或者有穩(wěn)定熱源的設備就能滿足反應要求，檢測成本大大降低。由于LAMP反應具有簡單、高效、快速、經濟等特征，因而應用前景極為廣泛。目前LAMP檢測主要應用于人、動物病原物、食品安全等的檢測，在植物病原菌檢測中也有報道，但有關煙草疫霉菌的LAMP檢測國內還未見報道。


【發(fā)明內容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供一種用于煙草疫霉菌快速檢測的LAMP引物組。
[0007]本發(fā)明的另一目的在于提供一種煙草疫霉菌的LAMP快速檢測方法。該方法用于快速檢測煙草疫霉病菌，通過該方法可以快速診斷出疑似病株是否受煙草疫霉病菌侵染。
[0008]實現(xiàn)本發(fā)明的技術方案如下:
[0009]一種煙草疫霉菌LAMP檢測引物序列如下:
[0010]外側引物F3:5 ’ -CTGGTTGTGAAGGCTGCTAT-3 ’
[0011]B3:5，-CCACCCTACTTCGCAACAG-3，
[0012]內側引物 FIP: 5 ’ -AGCCGAAGCCAACCATACCACATTGGCGACTGGTTTGTCT-3，
[0013]BIP:5’ -TGGACGTTTTTCCTGCTGTGGCAAAAGCCAAGCCACCGAG-3’
[0014]一種煙草疫霉菌的LAMP檢測體系的建立:
[0015]LAMP 檢測=LAMP 反應體系 25 μ L，其中 F3 與 B3 各 0.25 μ L (20 μ mol/L)，F(xiàn)IP 與 BIP各 I μ L(20 μ mol/L)，10XThermoPol React1n buffer2.5 μ L,Betaine5μ L(10 μ mol/L)，dNTPsl μ L(10mmol/L)，BstDNA 聚和酶 I μ L (8U/ μ L)，DNA 模板 0.5 μ L,不足部分用無菌雙蒸水補足；LAMP反應條件為在60-65°C溫育60min，80°C保溫lOmin。更優(yōu)選的溫育溫度為63°C溫育 60min。
[0016]所述的檢測方法為熒光染料目測觀察法和瓊脂糖凝膠電泳法。所述熒光染料目測觀察法:在LAMP反應的最終擴增產物中加入I μ L顯色劑，顯色劑為SYBR green I，顯色結果觀察到綠色熒光判斷為陽性，橙色判斷為陰性。所述瓊脂糖凝膠電泳法:取3μ LPCR擴增產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，如果出現(xiàn)LAMP特征性的梯形帶判斷為陽性，即可判斷所述的煙草組織或土壤中存在煙草疫疫霉菌。沒有出現(xiàn)擴增條帶判斷為陰性，即所述的煙草組織或土壤中未存在煙草疫霉菌。
[0017]本發(fā)明建立了煙草疫霉菌快速、特異性強、靈敏度高的檢測技術體系，對于煙草疫霉菌引物病害顯癥之前的早期監(jiān)測，確定病害防治最佳時期具有十分重要的意義。本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比，具有以下的技術優(yōu)勢:
[0018]1、結果可靠:本發(fā)明所設計出的LAMP檢測引物，對來源不同的49種不同真菌與卵菌，以及帶煙草疫霉菌的組織和土壤進行了測試驗證，因此結果可靠性具有充分的保證；
[0019]2、特異性強:本發(fā)明所采用的LAMP引物是針對煙草疫霉菌ITS序列中6個不同區(qū)域設計出4條特異性引物，6個區(qū)域中任何區(qū)域與引物不匹配增色不能進行核酸擴增，故特異性高；
[0020]3、靈敏度高:LAMP對煙草疫霉菌的檢測靈敏度高，在DNA水平上可達到10fg，比常規(guī)PCR檢測高1000倍；
[0021]4、實用性好:本發(fā)明所設計出的LAMP引物，可用于帶煙草疫霉菌的組織和土壤快速檢測，因此本方法的實用性強，可滿足對帶菌組織和土壤中存在的煙草疫霉菌進行快速可靠的檢測和鑒定的需要；
[0022]5、操作簡便快速:應用本發(fā)明方法，對帶煙草疫霉菌的組織和土壤進行檢測可在I小時內完成，且LAMP核酸擴增是在等溫條件下進行，只需要一個水浴鍋即可，不需要復雜的儀器設備和昂貴的分子試劑，結果肉眼直接可見。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0023]圖1為本發(fā)明煙草疫霉菌的LAMP特異性檢測結果圖。其中:泳道M為marker，泳道I為陽性對照，泳道2為陰性對照，泳道3-10為煙草疫霉菌，泳道11-20為其它卵菌和真菌菌株。
[0024]圖2為本發(fā)明煙草疫霉菌的LAMP靈敏性檢測結果圖。其中:泳道M為marker，泳道 1-10 模板濃度分別為 1ng, lng, 10pg, 1pg, lpg, 10fg, 1fg 和 Ifg0
[0025]圖3為本發(fā)明對發(fā)病植株的檢測結果圖。其中:泳道M為marker，泳道I為陽性對照，泳道2為陰性對照,泳道3為發(fā)病組織,泳道4為發(fā)病土壤,泳道5為健康組織。

【具體實施方式】
[0026]本發(fā)明的技術內容包括煙草疫霉菌的LAMP檢測引物，LAMP引物序列分別為:
[0027]外側引物F3:5 ’ -CTGGTTGTGAAGGCTGCTAT-3 ’
[0028]B3:5， -CCACCCTACTTCGCAACAG-3’
[0029]內側引物 FIP: 5，-AGCCGAAGCCAACCATACCACATTGGCGACTGGTTTGTCT-3，
[0030]BTP:5，-TGGACGTTTTTCCTGCTGTGGCAAAAGCCAAGCCACCGAG-3’
[0031]利用LAMP引物檢測煙草疫霉菌結果可觀察到綠色熒光或瓊脂糖凝膠電泳出現(xiàn)LAMP特征性的梯形帶。
[0032]主要試劑:Bst DNA聚合酶大片段購自美國New England B1labs司；其余試劑均購自上海生工生物技術有限公司。引物由上海生工生物技術有限公司合成。
[0033]實施例1:LAMP弓I物對煙草疫霉菌的特異性擴增及引物序列的驗證
[0034]本發(fā)明的關鍵性技術是煙草疫霉菌的高效特異擴增的引物序列及其擴增方法。為了驗證煙草疫霉菌的特異引物序列，本發(fā)明以四川、安徽等省的26株煙草疫霉菌和23種其它植物病原菌為供試材料，采用CTAB法提取組織中煙草疫霉菌的DNA。具體方法如下:取0.5克干燥菌絲，加液氮研磨成粉末狀,迅速移入1.5ml Eppendorf管中；加入800 μ I的CTAB提取緩沖液，混勻(CTAB在65°C水浴預熱)，每5min輕輕震蕩幾次，20min后12000r/min,離心15min ;小心吸取上清液,加入等體積的酹:氯仿(各400 μ I)溶液,混勻，4°C, 12000r/min,離心1min ;小心吸取上清液,加入等體積的氯仿,混勻,4°C, 12000r/min,離心lOmin。重復步驟(4) 1_2次，以蛋白層不出現(xiàn)為止；取上清，-20°C沉淀lh,4°C,12000r/min，離心1min ;棄去上清液，用70%乙醇洗滌沉淀2次；室溫下干燥后(一般干燥5-1511^11)，溶于30-5(^1 DEPC去離子水中，用紫外分光光度計檢測DNA濃度并稀釋至50ng/ μ I,于-20°C下保存?zhèn)溆谩?br> [0035]對23株其它植物病原菌菌株和26個煙草疫霉菌菌株進行LAMP檢測，驗證LAMP方法的特異性。
[0036]①LAMP 反應體系 25 μ 1:包含 F3 與 B3 各 0.25 μ L (20 μ mol/L)，F(xiàn)IP 與 BIP 各I μ L(20 μ mol/L)，10XThermoPol React1n buffer2.5 μ L, Betaine5μ L(10 μ mol/L)，dNTPsl μ L(10mmol/L)，BstDNA 聚和酶 I μ L (8U/ μ L)，DNA 模板 0.5 μ L，不足部分用無菌雙蒸水補足；LAMP反應條件為在63°C溫育60min,80°C保溫lOmin。
[0037]②在LAMP反應的最終擴增產物中加入I μ L顯色劑，所述顯色劑為SYBR green I，顯色結果觀察到綠色熒光，判斷為陽性，橙色判斷為陰性?；蛉?μ L擴增產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，如果出現(xiàn)LAMP特征性的梯形帶，即可判斷為陽性，沒有出現(xiàn)擴增條帶判斷為陰性。
[0038]2.檢測結果:除了煙草疫霉菌顯色結果可觀察到綠色熒光或瓊脂凝膠電泳檢測出現(xiàn)LAMP特征性的梯形帶外，檢測了 23種其它植物病原菌菌株顯色結果為橙色或瓊脂糖凝膠電泳沒有出現(xiàn)擴增條帶(部分結果見圖1)。這說明該引物具有很強的特異性，可被用于生產實踐中發(fā)病組織及土壤中煙草疫霉菌快速可靠的檢測和鑒定。
[0039]實施例2 =LAMP引物對煙草疫霉菌的靈敏性檢測
[0040]1.煙草疫霉菌的LAMP靈敏性檢測
[0041]采用10倍濃度系列稀釋法將提取的煙草疫霉菌DNA稀釋成1000ng、100ng、10ng、lng、lOOpg、10pg、lpg、0.lpg、0.01pg、0.0Olpg 共 10 個不同濃度梯度。
[0042]①LAMP 反應體系 25 μ 1:包含 F3 與 B3 各 0.25 μ L (20 μ mol/L)，F(xiàn)IP 與 BIP 各I μ L(20 μ mol/L)，10XThermoPol React1n buffer2.5 μ L, Betaine5μ L(10 μ mol/L)，dNTPsl μ L(10mmol/L)，BstDNA 聚和酶 I μ L (8U/ μ L)，DNA 模板 0.5 μ L，不足部分用無菌雙蒸水補足；LAMP反應條件為在63°C溫育60min,80°C保溫lOmin。
[0043]②在LAMP反應的最終擴增產物中加入I μ L顯色劑，所述顯色劑為SYBR green I，顯色結果觀察到綠色熒光，判斷為陽性，橙色判斷為陰性?；蛉?μ L擴增產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，如果出現(xiàn)LAMP特征性的梯形帶，即可判斷為陽性，沒有出現(xiàn)擴增條帶判斷為陰性。
[0044]2.檢測結果:煙草疫霉菌的LAMP靈敏性檢測，結果可觀察到綠色熒光或瓊脂糖凝膠電泳出現(xiàn)LAMP特征性的梯形帶,檢測靈敏度可達0.1pg0
[0045]實施例3:發(fā)病組織或土壤中煙草疫霉菌的檢測
[0046]1.樣品采集:植物組織樣品采自四川省涼山州西昌煙草生產區(qū)；土壤樣品采自四川省涼山州德昌煙草生產區(qū)。
[0047]2.DNA提取及檢測
[0048]發(fā)病植物組織采用NaOH快速裂解法提取煙草疫霉菌的DNA，具體過程如下:(I)將煙草病莖洗凈、晾干，剪發(fā)病部位；(2)按Img病葉加入10yL(0.5mol/L Na0H,0.5% PVP)計量，將組織充分磨碎成糊，在12000g離心機中離心5min ； (3)取上清20 μ L與等體積的
0.lmol/LTris-HCL(pH8.0)混合；(4)稀釋 10 倍、100 倍、1000 倍液，分別取 I μ L 原液、10倍、100倍、1000倍液作為PCR模板進行擴增。
[0049]發(fā)病土壤采用土壤DNA提取法提取土壤中煙草疫霉菌的DNA。具體方法如下:取過過篩的土壤冷凍抽干24-48h后加少量石英砂，倒入液氮充分研磨，將研磨后的土壤細粉分裝至1.5ml離心管中，每管加入500 μ L0.4%脫脂奶粉溶液，渦旋混勻。12000rpm離心15min。取上清加入等體積蛋白酶K緩沖液，加終濃度為10 μ g/ml蛋白酶K，55°C水浴l_3h。水浴結束后，加入1/2體積的7.5M NH4AC溶液,上下顛倒混勻。12000rpm離心15min。吸上清加2倍體積無水乙醇_20°C沉淀(沉淀時間1.5h)。沉淀結束后，12000rpm離心15min。用70%乙醇洗滌沉淀后傾去，室溫晾干。每份樣品所提DNA用1yL TE (或無菌超純水)溶解，-20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0050]①LAMP 反應體系 25 μ 1:包含 F3 與 B3 各 0.25 μ L (20 μ mol/L)，F(xiàn)IP 與 BIP 各I μ L(20 μ mol/L)，10XThermoPol React1n buffer2.5 μ L, Betaine5μ L(10 μ mol/L)，dNTPsl μ L(10mmol/L)，BstDNA 聚和酶 I μ L (8U/ μ L)，DNA 模板 0.5 μ L,不足部分用無菌雙蒸水補足；LAMP反應條件為在63°C溫育60min,80°C保溫lOmin。
[0051]②在LAMP反應的最終擴增產物中加入I μ L顯色劑，所述顯色劑為SYBR green I，顯色結果觀察到綠色熒光，判斷為陽性，橙色判斷為陰性?；蛉?μ L擴增產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，如果出現(xiàn)LAMP特征性的梯形帶，即可判斷為陽性，沒有出現(xiàn)擴增條帶判斷為陰性。
[0052]3.檢測結果
[0053]如圖3所示，發(fā)病組織或土壤中感染煙草疫霉菌，紫外燈下可觀察到綠色熒光或瓊脂糖凝膠電泳出現(xiàn)LAMP特征性的梯形帶，健康組織則可觀察到橙色熒光或瓊脂糖凝膠電泳不出現(xiàn)LAMP特征性的梯形帶。
【權利要求】
1.一種煙草疫霉菌LAMP檢測引物及其快速檢測方法，其特征在于:所述的煙草疫霉菌LAMP檢測引物為: 外側引物 F3:5，-CTGGTTGTGAAGGCTGCTAT-3，
B3:5’ -CCACCCTACTTCGCAACAG-3’
內側引物 FIP:5’ -AGCCGAAGCCAACCATACCACATTGGCGACTGGITTGTCT-3’
BIP:5’ -TGGACGTTTTTCCTGCTGTGGCAAAAGCCAAGCCACCGAG-3’。
2.如權利要求1所述的煙草疫霉菌LAMP檢測引物及其快速檢測方法，其特征在于:所述LAMP的檢測體系為:LAMP反應體系25 μ L，其中F3與B3各0.25 μ L (20 μ mol/L)，F(xiàn)IP與BIP各I μ L(20 μ mol/L)，10 X ThermoPol React1n buffer2.5 μ L，Betaine5 μ L(10 μ mol/L)，dNTPsl μ L(10mmol/L)，BstDNA 聚和酶 I μ L (8U/ μ L)，DNA 模板 0.5 μ L,不足部分用無菌雙蒸水補足；LAMP反應條件為在60-65°C溫育60min，80°C保溫lOmin。
3.如權利要求2所述的煙草疫霉菌LAMP檢測引物及其快速檢測方法，其特征在于:所述的LAMP反應溫育溫度為63°C溫育60min。
4.如權利要求1所述的煙草疫霉菌LAMP檢測引物及其快速檢測方法，其特征在于:所述的檢測方法為熒光染料目測觀察法，在LAMP反應的最終擴增產物中加入I μ L顯色劑，顯色劑為SYBR green I，顯色結果觀察到綠色熒光判斷為陽性，橙色判斷為陰性。
5.如權利要求1所述的煙草疫霉菌LAMP檢測引物及其快速檢測方法，其特征在于:所述的檢測方法為，取3 μ LPCR擴增產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，如果出現(xiàn)LAMP特征性的梯形帶判斷為陽性，沒有出現(xiàn)擴增條帶判斷為陰性。
【文檔編號】C12Q1/04GK104232755SQ201410350133
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2014年7月17日 優(yōu)先權日:2014年7月17日
【發(fā)明者】王勇, 張海珊, 高正良, 許大鳳, 劉東陽, 盧軍, 周本國, 章東方, 嚴丹侃, 王芳 申請人:四川省煙草公司涼山州公司, 安徽省農業(yè)科學院植物保護與農產品質量安全研究所, 安徽省農業(yè)科學院煙草研究所