專利名稱：一種辣椒疫霉菌皺縮壞死蛋白PcCRN1基因克隆及其功能技術(shù)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體地說，本發(fā)明涉及一種皺縮壞死褪綠基因PcCRNl 的分離、瞬時(shí)表達(dá)、體外突變及其沉默技術(shù)方法。此外，系統(tǒng)證明了該基因通過引起寄主葉片褪綠而參與病菌的致病或破壞作用。
背景技術(shù)：
近年來，辣椒疫病發(fā)生危害日趨加重，抗病性鑒定及抗病育種工作進(jìn)展緩慢，病害控制長期依據(jù)化防措施，農(nóng)藥對(duì)人類和環(huán)境污染日趨加重。因此，尋找或界定辣椒疫霉靶標(biāo)致病因子，研制病害發(fā)生危害預(yù)警技術(shù)，建立病害化學(xué)藥劑減量防控技術(shù)措施，有效的遏止病害發(fā)生與危害，一直是分子植物病理學(xué)領(lǐng)域研究的技術(shù)熱點(diǎn)。研究表明植物病原細(xì)菌、真菌、卵菌及線蟲等與寄主互作過程中，常產(chǎn)生一系列的調(diào)控侵染或防衛(wèi)反應(yīng)的效應(yīng)分子，這些效應(yīng)分子主要包括兩類一類是胞質(zhì)效應(yīng)蛋白， 如RXLR效應(yīng)蛋白和皺縮壞死蛋白(Crinkling and Necrosis protein :CRN)，主要通過附著胞或吸器等特殊結(jié)構(gòu)進(jìn)入植物活細(xì)胞；另一類是質(zhì)外效應(yīng)蛋白，主要分泌于胞外，并與胞外靶標(biāo)和質(zhì)外體表面受體發(fā)生作用。目前研究的效應(yīng)蛋白主要有酶抑制劑(葡聚糖酶抑制蛋白GIPl和GIP2、絲氨酸蛋白酶抑制蛋白EPIl和EPI10、半胱氨酸蛋白酶抑制蛋白 EPICl 和 EPIC2)、激發(fā)子 INFl、PcF、NPP (necrosis-inducing protein)、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶、 CBEL(Cellulose Binding, Elicitor and Lectin-like)、RXLR 蛋白家族(ATR、Avr3a 等) 和CRN蛋白家族等。Torto等人(2003年)首次于馬鈴薯致病疫霉(Phytophthora infestans)胞外蛋白cDNA數(shù)據(jù)庫中發(fā)現(xiàn)了皺縮壞死蛋白基因(CRN)，其在農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時(shí)表達(dá)體系中導(dǎo)致本氏煙產(chǎn)生皺縮壞死癥狀。CRN是一類新的效應(yīng)分子，目前該類基因僅發(fā)現(xiàn)于疫霉屬病菌基因組中，相關(guān)研究信息很少。CRN基因由若干基因成員組成，致病疫霉(P. parasitica)中含196個(gè)CRN-like 序列，大豆疫霉(P. sojae)中含100個(gè)CRN-Iike序列，橡膠疫霉菌(P. ramorum)中含19個(gè) CRN-like序列。而且大豆疫霉中的兩個(gè)CRN基因(PsCRN63和PsCRN115)，氨基酸序列同源性達(dá)95. 7%，但功能特性相反，PsCRN63可激發(fā)細(xì)胞壞死，而PsCRNl 15可抑制NPP基因引起的壞死癥狀，表明CRN基因成員具功能多樣性。2010年，Schornack和van Damme研究證明，CRN基因序列N-端保守基序LXLFLAK與RXLR基序功能相似，均可調(diào)控效應(yīng)蛋白進(jìn)入植物細(xì)胞內(nèi)，但在寄主與病原菌互作過程中，CRN效應(yīng)分子致病機(jī)理及作用靶標(biāo)等資料甚少， 至此成為分子植物病理學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。世界范圍內(nèi)，植物病原卵菌易導(dǎo)致多種植物病害，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成了嚴(yán)重?fù)p失，在此基礎(chǔ)上，以重要致病效應(yīng)因子為研究對(duì)象，借助基因和蛋白操作技術(shù)，探明關(guān)鍵基因功能特性，創(chuàng)建其研究技術(shù)體系，預(yù)期研究具重要的理論與實(shí)踐意義。目前無公開發(fā)表過辣椒疫霉皺縮壞死蛋白靶標(biāo)基因的研究信息。

發(fā)明內(nèi)容
基于上述的原因，本發(fā)明提供了 1個(gè)克隆自辣椒疫霉的皺縮壞死蛋白基因PcCRNl 及其功能分析技術(shù)，特別涉及該蛋白基因的分離、瞬時(shí)表達(dá)、體外突變及其沉默突變體制備方法，證明了該基因通過引起寄主葉片產(chǎn)生褪綠癥狀而參與了病菌的致病或破壞作用；借助基因體外突變技術(shù)驗(yàn)證了兩個(gè)保守基序?qū)ζ涔δ艿挠绊懽饔?。由此證明了該基因是辣椒疫霉菌皺縮壞死基因簇的一個(gè)重要成員，本發(fā)明為進(jìn)一步研制卵菌病害快速診斷與預(yù)警技術(shù)提供技術(shù)儲(chǔ)備。本發(fā)明提供的辣椒疫霉的皺縮壞死蛋白基因PcCRNl基因，其基因序列如Seq ID No :1所示；其蛋白質(zhì)氨基酸序列為Seq ID NO :2所示。該基因編碼的農(nóng)桿菌瞬時(shí)表達(dá)蛋白僅導(dǎo)致寄主葉片產(chǎn)生褪綠癥狀。該基因開放閱讀框含1092個(gè)堿基，編碼一種含有363個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，分子量為41. 4kDa,信號(hào)肽含有17個(gè)氨基酸(為氨基酸序列SEQ ID NO :2中1_17氨基酸)，1個(gè) N-糖基化位點(diǎn)，無內(nèi)含子。該基因經(jīng)NCBI-BLAST在線比對(duì)，確認(rèn)其屬于皺縮壞死蛋白基因。該基因的具體克隆制備方法為其步驟如下PcCRNl基因克隆具體步驟A 利用參試?yán)苯芬呙咕闏BS121657 (荷蘭菌種保藏中心提供)提取辣椒疫霉總 RNA,反轉(zhuǎn)錄成cDNA ；B:通過對(duì)已報(bào)道的其它卵菌中同類基因序列比對(duì)，界定該類基因的保守基序 LQLFLAK和WL，從辣椒疫霉基因組數(shù)據(jù)庫中篩選PcCRN基因，并BLAST比對(duì)分析，設(shè)計(jì)特異引物PcCRNl-F1，其序列如Seq ID No 5所示和PcCRNl-R，其序列如Seq ID No 6所示，從 cDNA中分離目的基因PcCRNl，陽性克隆測(cè)序獲得基因全長序列；本發(fā)明所述Pcnppl基因在辣椒煙草內(nèi)瞬時(shí)表達(dá)的具體步驟A 根據(jù)PcCRm基因和表達(dá)載體pGR106酶切位點(diǎn)，設(shè)計(jì)引物，其序列如Seq ID No 11-12所示，構(gòu)建PcCRNl基因PVX表達(dá)載體，將目的基因克隆至表達(dá)載體PVX-pGR106中；B 提取上述重組表達(dá)載體質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞，利福平及卡那霉素篩選農(nóng)桿菌抗性轉(zhuǎn)化子；C:陽性農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化子利用LB液體培養(yǎng)基(含卡那霉素和利福平各50mg/ml)震蕩培養(yǎng)，收集菌體后，用無菌注射器將農(nóng)桿菌懸浮液壓入辣椒、煙草葉片中，進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)。本發(fā)明所述的PcCRm基因，其保守位點(diǎn)突變后在辣椒本氏煙葉內(nèi)的瞬時(shí)表達(dá)的方法，具體步驟如下A 根據(jù)PcCRm基因的保守位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物，其序列如Seq ID No :7_10所示，分別突變PcCRNl基因的保守位點(diǎn)LQLFLTK和WL ；B:突變序列經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證后，利用引物其基因序列如Seq ID Νο:13_14構(gòu)建 PVX-pGR106表達(dá)載體，提取上述重組表達(dá)載體質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞，利福平及卡那霉素篩選農(nóng)桿菌抗性轉(zhuǎn)化子；C 篩選的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化子用LB液體培養(yǎng)基(含卡那霉素和利福平各50mg/ml)震蕩培養(yǎng)，收集菌體后，用無菌注射器將農(nóng)桿菌懸浮液壓入辣椒本氏煙葉片，進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)，檢測(cè)保守位點(diǎn)突變效果。本發(fā)明所述的PcCRNl基因，其基因穩(wěn)定沉默表達(dá)載體構(gòu)建及其沉默菌株制備的方法，具體步驟如下A 根據(jù)PcCRNl基因和PHAM34酶切位點(diǎn)，設(shè)計(jì)特異引物pHCRNl-F，其序列如Seq ID No 15所示和pHCRNl-R，其序列如Seq ID No 16所示，構(gòu)建PcCRNl基因沉默表達(dá)載體，將目的基因克隆至沉默表達(dá)載體PHAM34中；B 制備辣椒疫霉菌原生質(zhì)體，并提取重組表達(dá)質(zhì)粒及標(biāo)記質(zhì)粒PHSPNpt，按比例混合后轉(zhuǎn)化辣椒疫霉原生質(zhì)體，同時(shí)以野生型辣椒疫霉菌株及僅轉(zhuǎn)化標(biāo)記質(zhì)粒PHSPNpt菌株為對(duì)照，篩選抗G418的轉(zhuǎn)化子；C 轉(zhuǎn)化子再培養(yǎng)，誘導(dǎo)產(chǎn)生游動(dòng)孢子后接種辣椒葉片進(jìn)行致病性測(cè)定；D 分別提取轉(zhuǎn)化子菌株及對(duì)照菌株RNA，設(shè)計(jì)PcCRNl基因特異引物RT_CRN1_F，其序列如Seq ID No :3所示和RT-CRN1-R，其序列如Seq ID No :4所示，并設(shè)計(jì)辣椒疫霉內(nèi)參基因actinA特異引物RT_Actin_F，其序列如Seq ID No 17所示和RT_Actin_R，其序列如 Seq ID No 18所示，然后分別借助反轉(zhuǎn)錄PCR及熒光定量PCR檢測(cè)PcCRm基因的沉默效率；E 制備沉默轉(zhuǎn)化子游動(dòng)孢子懸浮液，接種辣椒葉片，與對(duì)照組，包括野生型辣椒疫霉菌株，選自菌株CBS121657 (荷蘭菌種保藏中心提供)及轉(zhuǎn)化標(biāo)記質(zhì)粒PHSPN菌株相比較，檢測(cè)致病性變化。本發(fā)明所用的載體和宿住菌均為常見，pUC19為PcCRNl基因宿主載體，DH5 α為宿主細(xì)胞，PVX(pGR106)為PcCRNl基因表達(dá)載體，農(nóng)桿菌GV3101為該基因的表達(dá)宿主菌， PHAM34為沉默表達(dá)載體，PHSPNpt為沉默表達(dá)的標(biāo)記質(zhì)粒。綜上所述，本發(fā)明提供了 1個(gè)克隆自辣椒疫霉的皺縮壞死蛋白基因PcCRNl及其功能分析技術(shù)，特別涉及該蛋白基因的分離、瞬時(shí)表達(dá)、體外突變及其沉默突變體制備方法， 證明了該基因通過引起寄主葉片產(chǎn)生褪綠癥狀而參與了病菌的致病或破壞作用；借助基因體外突變技術(shù)驗(yàn)證了兩個(gè)保守基序?qū)ζ涔δ艿挠绊懽饔谩Ｓ纱俗C明了該基因是辣椒疫霉菌皺縮壞死基因簇的一個(gè)重要成員，本發(fā)明為進(jìn)一步研制卵菌病害快速診斷與預(yù)警技術(shù)提供技術(shù)儲(chǔ)備。


圖1. PcCRNl基因重組表達(dá)載體示意圖；圖中Kana為卡那抗性，Sal I、Not I、SmaI和ClaI為酶切位點(diǎn)，PcCRNl為目的基因。圖2. PcCRNl基因煙草中瞬時(shí)表達(dá)結(jié)果灰度示意圖；圖中A =PcCRNl基因農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化子接種煙草7天后產(chǎn)生褪綠癥狀(灰度圖中葉片中間發(fā)白部分)；B 空載體pGR106接種7天后無任何癥狀；圖3. PcCRNl基因辣椒葉片內(nèi)瞬時(shí)表達(dá)結(jié)果灰度示意圖；圖中A =PcCRNl基因農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化子接種辣椒葉片7天后產(chǎn)生明顯癥狀(灰度圖中葉片中間發(fā)白部分)；B 空載體pGR106接種7天后無任何癥狀；
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圖4. PcCRNl基因保守位點(diǎn)突變基因在煙草葉片內(nèi)的瞬時(shí)表達(dá)結(jié)果灰度示意圖；圖中A =PcCRNl野生型基因；B =PcCRNl突變LQLFLTK位點(diǎn)基因；C =PcCRNl突變 WL位點(diǎn)基因；D =PVX空載體，均顯示接種7天后癥狀，野生型基因比突變位點(diǎn)基因癥狀明顯 (灰度圖中葉片發(fā)白部分)；圖5. PcCRNl基因穩(wěn)定沉默RT-PCR檢測(cè)電泳結(jié)果示意圖；圖中顯示PcCRNl基因在沉默轉(zhuǎn)化子中轉(zhuǎn)錄水平M =DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量；WT 野生型辣椒疫霉菌株；CK 轉(zhuǎn)標(biāo)記質(zhì)粒轉(zhuǎn)化子；9 =PcCRNl基因沉默轉(zhuǎn)化子PcCRNl-9 ；14 =PcCRNl基因沉默轉(zhuǎn)化子PcCRNl-14 ；選擇辣椒疫霉持家基因actinA為內(nèi)參，actinA基因表達(dá)水平在所有參試菌株中一致；PcCRNl基因在野生型菌株和對(duì)照菌株中均呈現(xiàn)很高的表達(dá)量，而在沉默菌株中其表達(dá)量幾乎檢測(cè)不到；圖6. PcCRNl基因穩(wěn)定沉默熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果示意圖；WT 野生型辣椒疫霉菌株；CK 轉(zhuǎn)標(biāo)記質(zhì)粒轉(zhuǎn)化子；PcCRNl-9和PcCRNl_14 目的基因沉默轉(zhuǎn)化子；PcCRNl基因在沉默菌株中表達(dá)量很低，表達(dá)量減少了 72%和77%，已成功沉默；圖7. PcCRNl基因沉默轉(zhuǎn)化子致病性測(cè)定結(jié)果灰度示意圖；圖中顯示游動(dòng)孢子接種法檢測(cè)PcCRNl基因沉默轉(zhuǎn)化子致病性結(jié)果A 野生型辣椒疫霉菌株游動(dòng)孢子接種2天后癥狀；B 含標(biāo)記質(zhì)粒的辣椒疫霉轉(zhuǎn)化子游動(dòng)孢子接種 2天后癥狀；C 沉默轉(zhuǎn)化子PcCRNl-9游動(dòng)孢子接種辣椒葉片2天后癥狀；D 沉默轉(zhuǎn)化子 PcCRNl-14游動(dòng)孢子接種辣椒葉片2天后癥狀，E 雙蒸水處理葉片，野生型和對(duì)照菌株處理辣椒葉片均能使葉片產(chǎn)生水浸狀壞死病斑，而沉默菌株產(chǎn)生的癥狀減弱，說明PcCRNl基因沉默降低了辣椒疫霉對(duì)辣椒葉片的破壞作用，因此該基因?qū)倮苯芬呙沟囊粋€(gè)重要致病基因。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明所提供的實(shí)施例，均按照常規(guī)實(shí)驗(yàn)條件，如Sambrook等分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè) (New York :Gold Spring Harbor Laboratory Press，1989)，或Draper，J 等(Blackwell 禾斗學(xué)出版社，1988)所述的操作技術(shù)規(guī)程，或按制造廠商的建議實(shí)驗(yàn)條件。實(shí)施例1 (基因分離及克隆)選取辣椒疫霉菌株CBS121657為參試材料，根據(jù)辣椒疫霉基因組中一個(gè)CRN基因 (命名=PcCRNl) (jgi/phycaf7/98651)序列設(shè)計(jì)特異引物 PcCRNl-F1 (其序列如 Seq ID No 5所示)和PcCRNl-R(其序列如Seq ID No :6所示)，利用PCR方法擴(kuò)增篩選目的基因。1、辣椒疫霉總RNA提取(1)辣椒疫霉菌株CBS121657在液體燕麥培養(yǎng)基中于28°C培養(yǎng)3天后，取0. Ig菌絲經(jīng)液氮研磨，移入Iml Trizol溶液室溫靜置5min ；(2)加入0. 2mL氯仿，充分混合混勻，4°C下12000rpm/min離心15min，吸取上清，
重復(fù)一至多次；(3)吸取上清，每Iml Trizol加入0. 25倍異丙醇和0. 25倍RNA沉淀劑，充分混勻，室溫放置 10min，4°C下 12000rpm/min 離心 IOmin ；(4)收集RNA沉淀，用75%乙醇洗滌2次，重復(fù)離心；
(5)吸盡殘存乙醇，或使殘余乙醇充分揮發(fā)；(6)力卩50-100 μ 1 DEPC處理水，將RNA溶液貯存于_70°C保存?zhèn)溆谩?、反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈(1)取 1-2 μ g 總 RNA,加入 ddH20 至 9. 5 μ L，75°C變性 5min，冰浴 5min，稍微離心；(2)力口 IOX擴(kuò)增緩沖液2 μ L ；(3)力口 IOmmol/L dNTP 混合液 2 μ L ；(4)力口 25mmol/LMgCl2 4 μ L ；(5)加引物 Oligo-dT luL；(6)力口 RNA 酶抑制劑 0. 5 μ L ；(7)加反轉(zhuǎn)錄酶 M-MLV lyL；(8)反應(yīng)液混勻后，置室溫lOmin，42°C溫浴60min，85°C水浴放置IOmin ；(9)加入180 μ L ddH20混勻，稍微離心，_20°C下保存，陰性對(duì)照3個(gè)分別是①加入第一鏈cDNA反應(yīng)所需的所有試劑，不加模板RNA ；②加除反轉(zhuǎn)錄酶外的所有試劑；③加除引物外的所有試劑。3、PCR擴(kuò)增獲得PcCRNl基因全長利用全長擴(kuò)增引物PcCRNl-F1 (其序列如Seq ID No 5所示)和PcCRNl-R(其序列如Seq ID No 6所示)從cDNA中擴(kuò)增PcCRNl基因反應(yīng)體系為ddH20(32. 5 μ L)，10 Xbuffer (5 μ L)，MgCL2 (4 μ L)，dNTP (4 μ L)，上下游引物各 1 μ L, DNA (2 μ L)，TaqE (0. 5 μ L)。PCR 反應(yīng)程序?yàn)?5°C 4min ；94°C lmin，55°C lmin，72°C lmin，共 35 個(gè)循環(huán)；最后 72°C延伸 IOmin0取10 μ L反應(yīng)產(chǎn)物電泳檢測(cè)并回收。將回收產(chǎn)物連接PEASYTtm-T3載體，連接體系為回收產(chǎn)物(4 μ DpEASYtm-T3 VectOr(0.4l·! 1)，25°C靜置15min，放冰上終止反應(yīng)。轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5 α，轉(zhuǎn)化步驟為(1)取大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5 α于冰上放置融化，融化后吸取50 μ 1感受態(tài)緩緩地加入到連接產(chǎn)物中，冰上放置30min ；(2)將混合物小心地放入42°C水浴鍋中熱激90s，快速冰上放置2min ；(3)加入400 μ 1不含抗性的LB培養(yǎng)基，200rpm, 37°C震蕩培養(yǎng)Ih以上；(4)涂到含有Amp和IPTG的LB平板上，37°C倒置，過夜培養(yǎng)，篩選陽性克隆，送樣測(cè)序，獲得PcCRm基因全長。實(shí)施列2 (辣椒疫霉菌皺縮壞死蛋白基因PcCRNl在辣椒、煙草葉片瞬時(shí)表達(dá))1、PVX表達(dá)載體構(gòu)建(1)設(shè)計(jì)引物結(jié)合表達(dá)載體pGR106和PcCRNl基因酶切位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物(其序列如Seq ID No 11-14所示)，構(gòu)建PVX表達(dá)載體。保證目的基因片斷以一個(gè)方向插入質(zhì)粒中，在PcCRNl的 5’和3’端分別設(shè)計(jì)酶切位點(diǎn)。(2)構(gòu)建PVX表達(dá)載體用帶酶切位點(diǎn)的引物擴(kuò)增基因，采用高保真酶進(jìn)行擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系為質(zhì)粒 (2 μ 1) ,5 XPrime STAR Buffer (含 MgCl2) (10 μ 1) ,dNTP mixture (2. 5mM) (4 μ 1)、上游引物(Ιμ )、下游引物(1 μ 1) > Prime STAR DNA Polymerse (0· 5 μ 1)、ddH20 (31. 5 μ 1) ；PCR 反應(yīng)程序?yàn)?5°C預(yù)變性5min，然后94°C變性lmin，72°C 30s反應(yīng)30個(gè)循環(huán)，最后72°C完全延IOmin ；PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，用1 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，收集正確的條帶，進(jìn)行膠純化回收后待用。(3)雙酶切、連接、轉(zhuǎn)化將膠回收產(chǎn)物和空載體質(zhì)粒用相同的酶進(jìn)行雙酶切，雙酶切體系為質(zhì)粒/回收產(chǎn)物(20μ 1)、酶 Ι(2μ 1)、酶 ΙΙ(2μ l)U0XBuffer(4y 1), ddH20(12y 1),體系混勻后37°C反應(yīng)3-5h后進(jìn)行純化回收。將目的基因回收產(chǎn)物和載體回收產(chǎn)物經(jīng)T4連接酶于16°C下連接，連接體系為目的基因雙酶切產(chǎn)物(3 μ 1)、載體雙酶切產(chǎn)物(1μ 1)、 T4Buffer (2 μ 1)、T4DNA ligase (1 μ 1)、ddH20 (2 μ 1)，體系混勻后 16°C過夜反應(yīng)。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5 α，步驟同前。陽性克隆篩選驗(yàn)證后，送測(cè)序公司測(cè)序。2、農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化2. 1重組質(zhì)粒的提取(1)將含有質(zhì)粒的大腸桿菌接種于含有適量抗生素的LB培養(yǎng)基中，37 °C， 220-250rpm震蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期；(2)取ImL菌液至1. 5mL的離心管中，8000rpm,離心Imin ；(3)去上清，收集菌體；(4)加入200 μ L預(yù)冷的溶液I，震蕩懸浮菌體；(5)加入400 μ L新鮮配制的溶液II，顛倒混勻，12000rpm離心5min ；(6)加入300 μ L預(yù)冷的溶液III，顛倒混勻，置冰上5min，12000rpm,離心5min，上清轉(zhuǎn)入另一只離心管中；(7)加入等體積的苯酚/氯仿/異戊醇，震蕩混勻，12000rpm離心5min ；(8)上層水相轉(zhuǎn)入另一只離心管中，加入等體積的異丙醇，混勻后室溫放置 IOmin, 12000rpm 離心 IOmin,去上清；(9)沉淀用70 %乙醇洗2次，倒置干燥；(10)用30 μ L TE (含20 μ g的RNA酶)溶解沉淀，取5 μ L電泳檢測(cè)，其余_20°C保存。2. 2凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌(1)倒含抗生素(rif)的平板，挑取少量農(nóng)桿菌GV3101劃線，28°C培養(yǎng)48h ；(2)挑取農(nóng)桿菌單菌落接種于5ml LB液體培養(yǎng)基(含rif)中，28°C、200rpm/mim 培養(yǎng)過夜；(3)取2ml培養(yǎng)物于IOOml的LB液體培養(yǎng)基(含rif)中繼續(xù)培養(yǎng)，直至OD6tltl為 0. 5左右；(4)將培養(yǎng)物冰浴 3Omin, 4°C、5000r/min、離心 5min，棄上清；(5)用 20ml 冷的 0. 2M CaCl2 輕輕懸浮菌液，冰上放置 20min，4°C、5000r/min，離心5min，棄去上清液；(6)用2ml預(yù)冷的0. 2M CaCl2懸浮，備用；(7)取重組質(zhì)粒在冰上融化，在10 μ 1質(zhì)粒中加入100 μ 1農(nóng)桿菌感受態(tài)，冰上放置 30min ；
(8)液氮凍融 lmin，37°C水浴 5min ；(9)加入500μ1不加抗生素的LB液體培養(yǎng)基，28°C，150-160r/min，震蕩培養(yǎng) 3-5h ；(10)將搖好的菌液涂在含有抗生素(rif，KaNa)的平板上，吹干后于28°C培養(yǎng)；(11)當(dāng)平板上長出有點(diǎn)黃白色的菌落時(shí)，挑單克隆于5ml含抗生素(rif，KaNa)的 LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)；(12)菌液有點(diǎn)黃白色時(shí)收集起來提質(zhì)粒，PCR和酶切驗(yàn)證，驗(yàn)證后備用。3、農(nóng)桿菌接種(1)接種前3d，用含抗生素(rif，KaNa)的LB培養(yǎng)基誘導(dǎo)帶有重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌，28°C培養(yǎng)48h，再用誘導(dǎo)培養(yǎng)基(90mM磷酸緩沖液PH = 7.0，90mM硫酸銨，1.5mM檸檬酸鉀，ImM硫酸鎂，0. 2%葡萄糖，0. 5%甘油)誘導(dǎo)之前需要加0. IM氯化鈣，IOmM MES, 200 μ M AS，25ppm KaNa, 12. 5ppm rif，將菌液稀釋 50 倍，然后 28°C誘導(dǎo) 24h，8000rpm/min，4°C離心 15min。再用 MMA(10mM MES PH = 5. 6，IOmM MgCl2, 200 μ M AS)培養(yǎng)至 OD600 = 0. 5-0. 6。(2)挑選生長24d左右的健康辣椒葉片和健康煙草葉片進(jìn)行接種。用Iml的注射器(去除針頭)，從葉片背面將菌液滲透。每天進(jìn)行癥狀觀察，其結(jié)果如圖2和圖3所示。實(shí)施列3 (PcCRNl基因保守位點(diǎn)突變后在本氏煙內(nèi)瞬時(shí)表達(dá))1、保守位點(diǎn)的突變根據(jù)文獻(xiàn)中報(bào)道的CRN基因保守序列LQLFLTK和WL，利用引物(其序列如Seq ID No :7_8所示)突變LQLFLTK，利用引物(其序列如Seq ID No :9_10所示)突變WL序列，分別將保守位點(diǎn)突變。2、PVX表達(dá)載體的構(gòu)建(1)設(shè)計(jì)引物并構(gòu)建表達(dá)載體設(shè)計(jì)帶酶切位點(diǎn)的引物并擴(kuò)增基因，采用高保真酶進(jìn)行擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系為質(zhì)粒(2 μ 1) ,5 XPrime STAR Buffer (含 MgCl2) (10 μ 1)、dNTP mixture (2. 5mM) (4μ 1)、上游引物(1 μ 1)、下游引物(1 μ 1) ,Prime STAR DNA Polymerse (0. 5 μ 1) ^ddH2O (31. 5 μ 1)； PCR反應(yīng)程序?yàn)?5°C預(yù)變性5min，然后94°C變性lmin，72°C 30s反應(yīng)30個(gè)循環(huán)，最后72°C 完全延IOmin ；PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，用1 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，收集正確的條帶，進(jìn)行膠純化回收后待用。(3)雙酶切、連接、轉(zhuǎn)化將膠回收后的產(chǎn)物和空載體質(zhì)粒用相同的酶同時(shí)進(jìn)行雙酶切，雙酶切體系為質(zhì)粒 / 回收產(chǎn)物(20μ 1)、酶 Ι(2μ 1)、酶 II (2 μ 1)、10 X Buffer (4 μ 1)、ddH20 (12 μ 1)，體系混勻后37。C反應(yīng)3-5h后進(jìn)行純化回收。將目的基因回收的產(chǎn)物和載體回收的產(chǎn)物經(jīng)T4 連接酶16°C連接，連接體系為目的基因雙酶切產(chǎn)物(3 μ 1)、載體雙酶切產(chǎn)物(1μ 1)、T4 Buffer (2 μ 1)、T4 DNA ligase (1 μ 1)、ddH20 (2 μ 1)，體系混勻后 16°C過夜反應(yīng)。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5 α，步驟同前。陽性克隆篩選驗(yàn)證后，送測(cè)序公司測(cè)序。3、農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化3.1重組質(zhì)粒的提取(1)將含有質(zhì)粒的大腸桿菌接種于含有適量抗生素的LB培養(yǎng)基中，37 °C， 220-250rpm震蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期；
(2)取ImL菌液至1. 5mL的離心管中，8000rpm，離心Imin ；(3)去上清，收集菌體；(4)加入200 μ L預(yù)冷的溶液I，震蕩懸浮菌體；(5)加入400 μ L新鮮配制的溶液II，顛倒混勻，12000rpm離心5min ；(6)加入300 μ L預(yù)冷的溶液III，顛倒混勻，置冰上5min，12000rpm,離心5min，上
清轉(zhuǎn)入另一只離心管中；(7)加入等體積的苯酚/氯仿/異戊醇，震蕩混勻，12000rpm離心5min ；(8)上層水相轉(zhuǎn)入另一只離心管中，加入等體積的異丙醇，混勻后室溫放置 IOmin, 12000rpm 離心 IOmin,去上清；(9)沉淀用70 %乙醇洗2次，倒置干燥；(10)用30 μ L TE (含20 μ g的RNA酶)溶解沉淀，取5 μ L電泳檢測(cè)，其余_20°C保存。3. 2凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌(1)倒含抗生素(rif)的平板，挑取少量農(nóng)桿菌GV3101劃線，28°C培養(yǎng)48h ；(2)挑取農(nóng)桿菌單菌落接種于5ml LB液體培養(yǎng)基(含rif)中，28°C、200rpm/mim 培養(yǎng)過夜；(3)取2ml培養(yǎng)物于IOOml的LB液體培養(yǎng)基(含rif)中繼續(xù)培養(yǎng)，直至OD6tltl為 0. 5左右；(4)將培養(yǎng)物冰浴 30min，4°C、5000r/min、離心 5min，棄上清；(5)用 20ml 冷的 0. 2M CaCl2 輕輕懸浮菌液，冰上放置 20min，4°C、5000r/min，離心5min，棄去上清液；(6)用2ml預(yù)冷的0. 2M CaCl2懸浮，備用；(7)取重組質(zhì)粒在冰上融化，在10 μ 1質(zhì)粒中加入100 μ 1農(nóng)桿菌感受態(tài)，冰上放置 30min ；(8)液氮凍融 lmin，37°C水浴 5min ；(9)加入500μ1不加抗生素的LB液體培養(yǎng)基，28°C，150-160r/min，震蕩培養(yǎng) 3-5h ；(10)將搖好的菌液涂在含有抗生素(rif，KaNa)的平板上，吹干后于28°C培養(yǎng)；(11)當(dāng)平板上長出有點(diǎn)黃白色的菌落時(shí)，挑單克隆于5ml含抗生素(rif，KaNa)的 LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)；(12)菌液有點(diǎn)黃白色時(shí)收集起來提質(zhì)粒，PCR和酶切驗(yàn)證，驗(yàn)證后備用。4、農(nóng)桿菌接種(1)接種前3d，用含抗生素(rif，KaNa)的LB培養(yǎng)基誘導(dǎo)帶有重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌，28°C培養(yǎng)48h，再用誘導(dǎo)培養(yǎng)基(90mM磷酸緩沖液PH = 7.0，90mM硫酸銨，1.5mM檸檬酸鉀，ImM硫酸鎂，0. 2%葡萄糖，0. 5%甘油)誘導(dǎo)之前需要加0. IM氯化鈣，IOmM MES, 200 μ M AS，25ppm KaNa, 12. 5ppm rif，將菌液稀釋 50 倍，然后 28°C誘導(dǎo) 24h，8000rpm/min，4°C離心 15min。再用 MMA(10mM MES PH = 5. 6，IOmM MgCl2, 200uM AS)培養(yǎng)至 0D6。。= 0. 5-0. 6。(2)挑選生長24d左右的煙草植株進(jìn)行接種。用Iml的注射器(去除針頭)，從葉片背面將菌液滲透。每天進(jìn)行癥狀觀察，其結(jié)果如圖4所示。
實(shí)施列4(辣椒疫霉皺縮壞死蛋白基因PcCRNl沉默突變體獲得及致病性鑒定)1、PcCRNl基因沉默表達(dá)載體的構(gòu)建(1)設(shè)計(jì)引物結(jié)合表達(dá)載體PHAM34和PcCRm基因的酶切位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物(其序列如kq ID No 15-16所示)，構(gòu)建表達(dá)載體。(2)構(gòu)建表達(dá)載體用帶酶切位點(diǎn)引物擴(kuò)增基因，采用高保真酶進(jìn)行擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系為質(zhì)粒 (2 μ 1) ,5 XPrime STAR Buffer (含 MgCl2) (10 μ l)、dNTP mixture (2. 5mM) (4 μ 1)、上游引物(Ιμ )、下游引物(1 μ 1) > Prime STAR DNA Polymerse (0· 5 μ 1)、ddH20 (31. 5 μ 1) ；PCR 反應(yīng)程序?yàn)?5°C預(yù)變性5min，然后94°C變性lmin，72°C 30s反應(yīng)30個(gè)循環(huán)，最后72°C完全延IOmin ；PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，用1 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，收集正確的條帶，進(jìn)行膠純化回收后待用。(3)雙酶切、連接、轉(zhuǎn)化將膠回收產(chǎn)物和空載體質(zhì)粒用相同的酶同時(shí)雙酶切，雙酶切體系為質(zhì)粒/回收產(chǎn)物(20μ 1)、酶 Κ2μ 1)、酶 Κ2μ l)、10XBuffeH4y l)、ddH20(12y 1，體系混勻后 37 °C 反應(yīng)3- 后進(jìn)行純化回收。將目的基因回收的產(chǎn)物和載體回收的產(chǎn)物經(jīng)T4連接酶16°C連接，連接體系為目的基因雙酶切產(chǎn)物(3 μ 1)、載體雙酶切產(chǎn)物(1 μ 1)、T4 Buffer (2 μ 1), T4 DNA ligase (1 μ 1)、(！dH2(K2 μ 1)，體系混勻后，16°C過夜反應(yīng)。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5ci，步驟同前。陽性克隆篩選驗(yàn)證后，送測(cè)序公司測(cè)序。2、質(zhì)粒提取分別提取重組質(zhì)粒PHAMM/PcCRNl及沉默標(biāo)記質(zhì)粒PHSPNpt，步驟如下(1)將含有質(zhì)粒的大腸桿菌接種于含有適量抗生素的LB培養(yǎng)基中，37 °C， 220-250rpm震蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期；(2)取ImL菌液至1. 5mL的離心管中，8000rpm，離心Imin ；(3)去上清，收集菌體；(4)加入200 μ L預(yù)冷的溶液I，震蕩懸浮菌體；(5)加入400 μ L新鮮配制的溶液II，顛倒混勻，12000rpm離心5min ；(6)加入300 μ L預(yù)冷的溶液III，顛倒混勻，置冰上5min，12000rpm,離心5min，上清轉(zhuǎn)入另一只離心管中；(7)加入等體積的苯酚/氯仿/異戊醇，震蕩混勻，12000rpm離心5min ；(8)上層水相轉(zhuǎn)入另一只離心管中，加入等體積的異丙醇，混勻后室溫放置 IOmin, 12000rpm 離心 IOmin,去上清；(9)沉淀用70 %乙醇洗2次，倒置干燥；(10)用30 μ L TE (含20 μ g的RNA酶)溶解沉淀，取5 μ L電泳檢測(cè)，其余_20°C保存。3、PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化3.1辣椒疫霉活化培養(yǎng)(1)在NPB培養(yǎng)基上活化辣椒疫霉菌株CBS121657，在25°C下黑暗培養(yǎng)；(2)培養(yǎng)3-4天后，將其切成Icm2的菌絲塊向每個(gè)裝有50mL NPB培養(yǎng)基的250ml錐形瓶中放入6-10塊，在25°C下黑暗培養(yǎng)2天。3. 2辣椒疫霉原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化步驟(1)實(shí)驗(yàn)前配制40%聚乙二醇-4000溶液，完全溶解后，用細(xì)菌過濾器除菌后置冰上；(2)用滅菌的200ml燒杯(帶紗布)收集菌絲，并用鑷子將菌絲放入含有0. 8M Mannitol的培養(yǎng)皿中漂洗一次，然后將漂洗過后的菌絲移入盛有0. 8M Mannitol的離心管中室溫下?lián)u洗IOmin ；(3)配制20ml酶解液，在滅菌燒杯中溶解后備用；(4)通常在酶解50min時(shí)，最好不要超過60min，用事先包扎好兩層mira-cloth的 50ml燒杯來過濾菌絲收集原生質(zhì)體，然后將收集好的原生質(zhì)體倒入50mli^lcOn離心管中， 40C 1500rpm 離心 3min ；(5)棄上清，先加IOml左右的W5 solution輕輕重懸原生質(zhì)體，再加W5 solution 至 35ml,40C 1500rpm 離心 4min ；(6)棄去上清液，先加5ml左右的W5 solution輕輕重懸原生質(zhì)體，將原生質(zhì)體的濃度調(diào)至2 X 106/ml，然后在冰上放置30min，在4°C 1500rpm離心^iin ；(7)棄上清，加入與第七步W5 solution相同體積的MMg solution重懸原生質(zhì)體， 室溫放置IOmin ；(8)取若干支新的50ml Falcon離心管置于冰上，在管壁上作好記錄，然后向管底部加入1體積(約5 μ 1)的pHSPN質(zhì)粒+3體積(10-25 μ 1)的轉(zhuǎn)化質(zhì)粒，(9)向每個(gè)加好質(zhì)粒的50ml Falcon離心管中加入Iml原生質(zhì)體，冰置5_10min ；(10)向每個(gè)離心管加三次580 μ 1的PEG溶液，共1. 74mlPEG，在加的過程中輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)離心管，使得PEG能順著管壁流進(jìn)質(zhì)粒與原生質(zhì)體的混合液中，加完三次后輕輕地?fù)艄苁够靹?，在冰上放?0min ；(11)滅菌培養(yǎng)皿中加入10ml Pea/0. 5M Mannitol培養(yǎng)液，再加20 μ 1的Amp C
液，并在培養(yǎng)皿上作好記錄；(12)向每個(gè)離心管中加2ml Pea/0. 5M Mannitol培養(yǎng)液，并且緩慢顛倒一次，冰上放置2min ；(13)再向每個(gè)離心管中加8ml Pea/0. 5M Mannitol培養(yǎng)液，并且緩慢顛倒一次，冰上放置2min ；(14)將離心管中液體倒入事先加好10ml Pea/0. 5M Mannitol培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中， 在25°C下靜置培養(yǎng)，過夜再生，并將離心管保存好明日再用；(15)從過夜生長的培養(yǎng)皿中取5μ1在顯微鏡下鏡檢再生的情況，將培養(yǎng)皿中所有的液體吸到前日對(duì)應(yīng)的離心管中，2000rpm離心5min ；(16)棄去上清使管內(nèi)液體剩5ml左右，將其懸浮，然后加15ml含有30yg/ml G418 的PM培養(yǎng)基，混勻后倒入培養(yǎng)皿中，吹干水汽，在25°C培養(yǎng)；(17)兩天后，通常在培養(yǎng)基表面上可以看到有菌絲長出，待大部分新生菌絲長出后，用含30μ g/ml G418的PM培養(yǎng)基覆蓋，25°C下繼續(xù)培養(yǎng)；(18)約過兩三天后可以看到有菌絲從覆蓋過PM培養(yǎng)基上再次長出，便直接用含 50 μ g/ml G418的PM培養(yǎng)基再次覆蓋，在25°C下繼續(xù)培養(yǎng)；
(19)將重新從覆蓋的培養(yǎng)基里面長出小菌落挑到含50 μ g/ml G418的V8培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)并且篩選；(20)將最終確定為轉(zhuǎn)化子菌株用于后面實(shí)驗(yàn)。3. 3RT-PCR 檢測(cè)液體培養(yǎng)轉(zhuǎn)化子的菌絲，提取菌絲RNA并反轉(zhuǎn)錄，通過普通PCR檢測(cè)，以actinA基因作為內(nèi)參基因(其序列如^^ ID No :17-18所示)，以野生型菌株及轉(zhuǎn)化標(biāo)記質(zhì)粒菌株為對(duì)照。PCR 反應(yīng)采用體系 % :ddH20 (32. 5 μ L), 10 X buffer (5 μ L), MgCL2 (4 μ L), dNTPGyL)，上下游引物各IyL, DNA(2 μ L), TaqE (0. 5 μ L) 0反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性 5min,然后進(jìn)行以下循環(huán)；94°C變性lmin，55°C退火30s，72°C延伸30s，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)， 最后72°C總延伸lOmin. PCR產(chǎn)物經(jīng)1 %的瓊脂糖凝膠電泳分析。3. 4熒光定量PCR檢測(cè)普通PCR檢測(cè)后，挑選帶比較弱或無帶的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)；以辣椒疫霉actinA基因?yàn)閮?nèi)參(序列如kq ID No :21和kq ID No :22)，以野生型菌株及轉(zhuǎn)化標(biāo)記質(zhì)粒菌株為對(duì)照，反應(yīng)體系為2. 5XrealMasterMix及20XSTOR solution混合物 11. 25 μ L,上下游引物各 1 μ L, cDNA 模板 2 μ L, ddH20 11. 75 μ L。利用Bio-Radi Cycler進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)條件95°C預(yù)變性2min，然后進(jìn)行以下循環(huán)；94°C變性15s，55°C退火15s，68°C延伸30s，共進(jìn)行45個(gè)循環(huán)，最后65-95°C制備溶解曲線。選擇actinA為內(nèi)參基因，每個(gè)樣品做三個(gè)重復(fù)，用2_ΔΔ"法對(duì)樣本基因進(jìn)行表達(dá)差異相對(duì)定量分析。計(jì)算方法為Δ ACt = (Ct
target
~CT actinA)待測(cè)樣本— (Ct
target
~CT actinA)校準(zhǔn)樣本，
果如圖6所示。3. 5致病性檢測(cè)制備PcCRNl沉默轉(zhuǎn)化子游動(dòng)孢子懸浮液(1)將沉默轉(zhuǎn)化子菌株轉(zhuǎn)移至10% V8培養(yǎng)基培養(yǎng)4d，從菌落邊緣挑取菌絲塊移至新鮮10% V8培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)4d備用。(2)切取菌落邊緣菌絲塊2塊，放于新鮮的10%的V8固體平板上，25°C黑暗培養(yǎng) 3-4d ；(3)在菌落邊緣切取2X2mm的菌絲塊，取10-20塊放于滅菌的培養(yǎng)皿中，加入 10%的V8液體培養(yǎng)基，25°C黑暗放置2-3d，可見絲發(fā)狀菌絲叢；(4)加滅菌水(以浸沒菌絲為宜)，每隔1 換水至游動(dòng)孢子產(chǎn)生，并調(diào)節(jié)游動(dòng)孢子濃度至1 X IO5個(gè)/ml，利用游動(dòng)孢子懸浮液進(jìn)行致病性分析。然后按照如下步驟接種辣椒葉片進(jìn)行致病性測(cè)定辣椒選用自交系品種(5-6葉期)葉片，游動(dòng)孢子濃度調(diào)至IX IO5個(gè)/ml。將選取葉片消毒70%乙醇處理30s，0. 升汞處理7min，于滅菌水中沖洗3次，晾干備用，晾干后將葉片平鋪于預(yù)準(zhǔn)備水瓊脂平板，每個(gè)平板放置3片，每個(gè)葉片接種2 μ 1游動(dòng)孢子懸浮液， 每個(gè)樣品接10個(gè)葉片，野生型辣椒疫霉菌、標(biāo)記質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子游動(dòng)孢子懸浮液及無菌水作對(duì)照，每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每天觀察記載癥狀變化，拍照記錄，其結(jié)果如圖7所示。
1權(quán)利要求
1.辣椒疫霉菌皺縮壞死蛋白基因PcCRNl，其特征在于其基因序列如SeqID No:l所示；其氨基酸序列為SEQ ID NO :2所示，該基因編碼的農(nóng)桿菌瞬時(shí)表達(dá)蛋白僅導(dǎo)致寄主葉片產(chǎn)生褪綠癥狀。
2.一種辣椒疫霉菌皺縮壞死蛋白基因PcCRNl基因分離克隆及其在辣椒煙草內(nèi)瞬時(shí)表達(dá)的方法，其特征在于其步驟如下DPcCRNI基因克隆具體步驟采用CTAB法提取辣椒疫霉菌DNA，通過對(duì)已報(bào)道的其它卵菌中同類基因序列比對(duì)，界定該類基因的保守基序LQLFLAK和WL，從辣椒疫霉基因組數(shù)據(jù)庫中篩選PcCRN基因，并BLAST比對(duì)分析，設(shè)計(jì)特異引物PcCRNl-Fl，其序列如Seq ID No 5所示和PcCRNl-R，其序列如Seq ID No :6所示，分離目的基因PcCRNl，陽性克隆測(cè)序獲得基因全長序列；2)Pcnppl基因在辣椒煙草內(nèi)瞬時(shí)表達(dá)的具體步驟A 根據(jù)PcCRNl基因和表達(dá)載體pGR106酶切位點(diǎn)，設(shè)計(jì)引物，其序列如Seq ID No: 11-12所示，構(gòu)建PcCRNl基因PVX表達(dá)載體，將目的基因克隆至表達(dá)載體PVX-pGR106中； B 提取上述重組表達(dá)載體質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞，利福平及卡那霉素篩選農(nóng)桿菌抗性轉(zhuǎn)化子；C 陽性農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化子利用LB液體培養(yǎng)基，其中含卡那霉素和利福平各50mg/ml，震蕩培養(yǎng)，收集菌體后，用無菌注射器將農(nóng)桿菌懸浮液壓入辣椒、煙草葉片中，進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)。
3.如權(quán)利要求1所述的PcCRm基因，其保守位點(diǎn)突變后在辣椒本氏煙葉內(nèi)的瞬時(shí)表達(dá)的方法，其特征在于具體步驟如下A 根據(jù)PcCRNl基因的保守位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物，其序列如Seq ID No :7_10所示，分別突變 PcCRNl基因的保守位點(diǎn)LQLFLTK和WL ；B 突變序列經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證后，利用引物其基因序列如Seq ID No 13-14構(gòu)建PVX_pGR106 表達(dá)載體，提取上述重組表達(dá)載體質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞，利福平及卡那霉素篩選農(nóng)桿菌抗性轉(zhuǎn)化子；C 篩選的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化子用LB液體培養(yǎng)基其中含卡那霉素和利福平各50mg/ml，震蕩培養(yǎng)，收集菌體后，用無菌注射器將農(nóng)桿菌懸浮液壓入辣椒本氏煙葉片，進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)，檢測(cè)保守位點(diǎn)突變效果。
4.如權(quán)利要求1所述的PcCRNl基因，其基因穩(wěn)定沉默表達(dá)載體構(gòu)建及其沉默菌株制備的方法，其特征在于具體步驟如下A 根據(jù)PcCRNl基因和PHAM34酶切位點(diǎn)，設(shè)計(jì)特異引物pHCRNl_F，其序列如SeqID No 15所示和pHCRNl-R，其序列如SeqID No 16所示，構(gòu)建PcCRNl基因沉默表達(dá)載體，將目的基因克隆至沉默表達(dá)載體PHAM34中；B 制備辣椒疫霉菌原生質(zhì)體，并提取重組表達(dá)質(zhì)粒及標(biāo)記質(zhì)粒PHSPNpt，按比例混合后轉(zhuǎn)化辣椒疫霉原生質(zhì)體，同時(shí)以野生型辣椒疫霉菌株及僅轉(zhuǎn)化標(biāo)記質(zhì)粒PHSPNpt菌株為對(duì)照，篩選抗G418的轉(zhuǎn)化子；C 轉(zhuǎn)化子再培養(yǎng)，誘導(dǎo)產(chǎn)生游動(dòng)孢子后接種辣椒葉片進(jìn)行致病性測(cè)定； D 分別提取轉(zhuǎn)化子菌株及對(duì)照菌株RNA，設(shè)計(jì)PcCRNl基因特異引物RT-CRN1-F，其序列如Seq ID No :3所示和RT-CRN1-R，其序列如Seq ID No :4所示，并設(shè)計(jì)辣椒疫霉內(nèi)參基因 actinA特異引物RT_Actin_F，其序列如Seq ID No 17所示和RT_Actin_R，其序列如SeqID No 18所示，然后分別借助反轉(zhuǎn)錄PCR及熒光定量PCR檢測(cè)PcCRNl基因的沉默效率；E 制備沉默轉(zhuǎn)化子游動(dòng)孢子懸浮液，接種辣椒葉片，與對(duì)照組，包括野生型辣椒疫霉菌株及轉(zhuǎn)化標(biāo)記質(zhì)粒PHSPN菌株相比較，檢測(cè)致病性變化。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，特別提供了克隆自辣椒疫霉菌的1個(gè)皺縮壞死蛋白基因PcCRN1與致病相關(guān)的研究技術(shù)，該基因表現(xiàn)出功能特異性，僅引起寄主葉片產(chǎn)生退綠癥狀。依據(jù)農(nóng)桿菌瞬時(shí)表達(dá)及沉默技術(shù)，證明了該基因通過引起寄主葉片產(chǎn)生退綠癥狀而對(duì)寄主產(chǎn)生致病或破壞作用，并利用體外突變技術(shù)證明了該基因編碼的1個(gè)保守基序與其功能特性有關(guān)。因此，該技術(shù)發(fā)明提供了辣椒疫霉一個(gè)對(duì)寄主有破壞作用的新基因及其研究技術(shù)，該技術(shù)發(fā)明為研制卵菌病害快速診斷與預(yù)警技術(shù)提供技術(shù)儲(chǔ)備。
文檔編號(hào)C12N1/15GK102286493SQ201110162600
公開日2011年12月21日 申請(qǐng)日期2011年6月16日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月16日
發(fā)明者張修國 申請(qǐng)人:山東農(nóng)業(yè)大學(xué)