專利名稱：一種鑒別辣椒抗疫病性狀的分子標記方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于辣椒育種領(lǐng)域，具體涉及一種植物分子標記技術(shù)，特別涉及 一種鑒別辣椒抗疫病性狀的分子標記方法，該方法適用于抗疫病分子標記輔 助育種。
背景技術(shù)：
辣椒疫病是危害辣椒生產(chǎn)的主要病害之一，在世界上許多國家都有發(fā) 生，在我國青海、新疆、甘肅、陜西、'北京、遼寧、上海、浙江、湖南、四 川、云南等辣椒主產(chǎn)區(qū)均有大面積發(fā)生、流行的報導(dǎo)。隨著辣椒產(chǎn)業(yè)的發(fā)展， 辣椒疫病有逐年加重的趨勢，造成了嚴重的經(jīng)濟損失。該病害的病原菌為
(尸/^o/ /^2oraca/^dLeon)，辣椒的苗期、成株期均可受害，莖、葉和果 實都能發(fā)病。傳播速度快，發(fā)病田經(jīng)常絕產(chǎn)，造成嚴重的經(jīng)濟損失。目前生 產(chǎn)上控制辣椒疫病以化學(xué)防治為主，防治效果差，且污染環(huán)境；此外，辣椒 疫霉菌易發(fā)生變異，常導(dǎo)致耐(抗)藥菌株的產(chǎn)生。采用土壤消毒雖有較好 地防效，但生產(chǎn)上大面積使用則較為困難。
抗疫病品種的應(yīng)用是防治或減輕辣椒疫病危害的有效途徑。目前世界上 許多辣椒主產(chǎn)國家均已把選育抗疫病品種作為辣椒育種工作的主要目標之 一。但目前對疫病表現(xiàn)出極高抗性的辣椒資源，它們的共同缺點是果形小、 品質(zhì)較差、轉(zhuǎn)育周期長，難以滿足辣椒產(chǎn)業(yè)化對品種更新?lián)Q代加速的要求。 與傳統(tǒng)育種相比，分子標記育種更快、更節(jié)省人力、節(jié)約時間、提高效率。 分子標記技術(shù)在植物育種中主要起輔助性作用。它主要尋找與目標基因緊密 連鎖的分子標記，然后從雜交子代中檢測分子標記是否存在。檢測到了分子 標記的植株，表明含有目的基因，可以進一步優(yōu)化和篩選。
3利用抗病基因產(chǎn)物具有保守結(jié)構(gòu)域的特性，通過人工合成與已知抗病基
因產(chǎn)物的保守序列類似的簡并引物，以植物總DNA為模板進行PCR擴增，就 可得到該種植物的抗病基因同源序列。許多研究證明， 一些抗病基因同源序 列與抗病基因密切連鎖，甚至就是抗病基因的一部分。此外，抗病基因同源 序列還具有容易獲得、擴增結(jié)果穩(wěn)定和使用費用低廉等優(yōu)點。因此，分離和 克隆植物的抗病基因同源序列成為當前人們比較認同的標記、定位和克隆植 物抗病基因的策略之一。
利用抗病基因同源序列獲得的基因，往往是一段缺乏5'端與3'端的DNA 序列，獲得全長基因序列可采用未知側(cè)翼序列擴增~~DNA Walking步移 法，簡稱步移法。此法所選擇的引物雖與己知DNA序列互補，但兩引物3' 端是反向的。染色體步移技術(shù)主要應(yīng)用于基因克隆、步查獲得新物種中基因 的非保守區(qū)域、鑒定T-DNA或轉(zhuǎn)座子的插入位點、染色體測序工作中的空隙 填補，從而獲得完整的基因組序列等方面。

發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺陷或不足，本發(fā)明的目的在于，提供一種鑒別 辣椒抗疫病性狀的分子標記方法，該方法采用與辣椒抗疫病基因緊密連鎖的 抗病基因同源序列分子標記，從而實現(xiàn)在育種過程中快速、有效選擇抗疫病 材料，加速辣椒抗疫病育種進程。
為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下的技術(shù)解決方案 一種鑒別辣椒抗疫病性狀的分子標記方法，其特征在于，包括以下步驟:
1) 人工設(shè)計合成一對核苷酸序列作為引物，該引物是由堿基組成的特 定序列的寡聚體，其中
正向引物5 ， - AGGTGGTCTTCAATGATCAGAGA -3 ， 反向引物5,-CCTGAGGCAAATTCCAAATCTC國3，
2) 提取辣椒基因組的DNA，以引物對辣椒基因組DNA進行PCR擴增，抗疫病材料和感疫病材料均可擴增出長度為590 bp的片段；
3) PCR擴增產(chǎn)物在37 'C條件下經(jīng)I酶切16 h后，I酶的酶切 位點為抗疫病品種克隆的基因序列第324bp處；酶切產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝 膠上電泳、溴化乙錠染色，用凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照記錄，抗疫病植株酶 切產(chǎn)物有325 bp和265 bp兩條譜帶，感疫病植株只有590bp —條譜帶。
本發(fā)明的鑒別辣椒抗疫病性狀的分子標記方法，步驟簡單快捷、穩(wěn)定可 靠，鑒別結(jié)果與田間抗病性鑒定結(jié)果準確一致、重復(fù)性好，特別適用于抗疫 病分子標記輔助育種，能夠很好地提高選擇效率，加速育種進程。


圖1為7個辣椒自交系PCR擴增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳分析。M: DNA Marker; 1: A5; 2: All; 3: B17; 4: B23; 5: B2; 6: B32; 7: B19
圖2為7個辣椒自交系PCR擴增產(chǎn)物酶切產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳分析。M: DNAMarker; 1: A5; 2: All; 3: B17; 4: B23; 5: B2; 6: B32; 7: B19
圖3為7個辣椒自交系PCR擴增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳分析。M: DNA Marker; 1: B3; 2: Pll; 3: B4; 4: P30; 5: B12; 6: P97; 7: P45
圖4為7個辣椒自交系PCR擴增產(chǎn)物酶切產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳分析。M: DNAMarker; 1: B3; 2: Pll; 3: B4; 4: P30; 5: B12; 6: P97; 7: P45。
以下結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作更詳細的說明。
具體實施例方式
以下相關(guān)參考文獻在本發(fā)明中被得以應(yīng)用
辣椒LRR類抗病基因同源序列的克隆與分析，馬維等，西北農(nóng)林科技 大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，第1期，2008。
A PCR畫based approach for isolating pathogen resistance gene from potato with potential for application in plants. Leister D， Ballvora A， Salamini F， Gebhardt C. Nature Genet, 14， 1996。以PCR鑒定轉(zhuǎn)基因植株的微量DNA提取方法，鞏振輝等，西北農(nóng)業(yè) 大學(xué)學(xué)報，第1期，1997。
辣椒疫病三種接種方法的比較，易圖永等，中國蔬菜，第2期，2003。 本發(fā)明的鑒別辣椒抗疫病性狀的分子標記方法，首次以辣椒抗、感疫病 材料為試材，根據(jù)植物抗性基因保守區(qū)域設(shè)計引物(馬維等，辣椒LRR類 抗病基因同源序列的克隆與分析[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)， 2008， 36 (1): 143~148)，以辣椒基因組DNA為模板擴增，得到抗疫病基 因同源序列片段，再利用DNA Walking步移法(Leister D， Ballvora A， Salamini F， Gebhardt C. A PCR-based approach for isolating pathogen resistance gene from potato with potential for application in plants [J]. Nature Genet ， 1996， 14: 421 429。)獲得了辣椒疫病抗性基因Ca"朋。通過對C""朋基因序列 限制性酶切位點分析，篩選適宜的限制性酶切位點，結(jié)合PCR擴增與酶切 產(chǎn)物多態(tài)性分析，創(chuàng)建和優(yōu)化辣椒疫病抗性基因的分子標記體系，開發(fā)出與 辣椒抗疫病基因連鎖的分子標記，以期加快辣椒抗疫病分子育種進程。 具體包括如下步驟
1、 一對核苷酸序列作為引物，該引物是由堿基組成的特定序列的寡聚
體，其中
正向引物5 ，- AGGTGGTCTTCAATGATCAGAGA -3 ， 反向引物5，-CCTGAGGCAAATTCCAAATCTC-3，
2、 辣椒基因組DNA的提取采用改良SDS方法提取辣椒基因組DNA (鞏振輝等，以PCR鑒定轉(zhuǎn)基因植株的微量DNA提取方法[J].西北農(nóng)業(yè)大
學(xué)學(xué)報，1997， 25 (1): 45-47)。
3、 以步驟1所述核苷酸分子為引物，對步驟2辣椒基因組DNA進行 PCR擴增，抗疫病材料和感疫病材料均可擴增出長度為590 bp的片段。PCR 擴增體系如下
6(1) 反應(yīng)液體積為25^L，所用物品的組成及含量為
10倍PCR buffer 2.5 ^L， 25 mmol丄國1 MgCl2 2.0 pL， 5 U'^iL-1 DNA 聚合酶0.2 jxL， 5 mmol丄-1 dNTPs 1.0 (oL， 20 ^imol'L"正向引物1.0 ^L， 20 pmol'L"下游引物l.OnL，基因組DNA1.0pL (50ng'iaL")， ddH20 16.3 pL。
(2) PCR擴增反應(yīng)條件為
PCR擴增反應(yīng)在PCR儀上進行，反應(yīng)條件為94 -C預(yù)變性5 min; 94 °C 變性1 min， 58 。C退火1 min， 72 "C延伸1 min，進行35個循環(huán)；最后72 °C 延伸10 min,隨后于4 'C保存?zhèn)溆谩?br> 4、 PCR擴增產(chǎn)物在37 "C條件下經(jīng)Beg I酶切16 h后，酶切產(chǎn)物經(jīng)2 % 瓊脂糖凝膠上電泳、溴化乙錠染色，用凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照記錄?？挂?病植株酶切產(chǎn)物有325 bp和265 bp兩條譜帶，感疫病植株只有590bp —條 譜帶。
以下是發(fā)明人給出的實施例，這些實施例僅是用于理解本發(fā)明，本發(fā)明 不限于這些實施例。 實施例l:
1、 人工設(shè)計合成的核苷酸序列作為引物
正向引物5 ，- AGGTGGTCTTCAATGATCAGAGA -3 ， 反向引物5 ，- CCTGAGGCAAATTCCAAATCTC -3 ，
2、 辣椒基因組DNA的提取采用改良SDS方法分別提取7個辣椒自 交系A(chǔ)5、 All、 B17、 B23、 B2、 B32及B19基因組DNA (鞏振輝等，以 PCR鑒定轉(zhuǎn)基因植株的微量DNA提取方法[J].西北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，1997， 25 (1): 45-47)。
3、 以步驟1所述核苷酸分子為引物，分別對上述7個辣椒自交系基因 組DNA進行PCR擴增，7個辣椒自交系均可擴增出長度為590 bp的片段(圖 1為7個辣椒自交系PCR擴增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳分析。M: DNAMarker;1: A5; 2: All; 3: B17; 4: B23; 5: B2; 6: B32; 7: B19)。 PCR擴增 體系如下
(1) 反應(yīng)液體積為25pL，所用物品的組成及含量為
10倍PCR buffer 2.5 fiL, 25 mmol.L.1 MgCl2 2.0 pL， 5 U.nL-1 &《DNA 聚合酶0.2 ^L， 5 mmol.U1 dNTPs 1.0 ^L， 20拜ol.L-1正向引物1.0 j^L， 20 pmoH/下游引物I.OmL，基因組DNA1.0pL (50ng^L")， ddH20 16.3 pL。
(2) PCR擴增反應(yīng)條件為
PCR擴增反應(yīng)在PCR儀上進行，反應(yīng)條件為94 。C預(yù)變性5min; 94 °C 變性1 min， 58 "C退火1 min， 72 。C延伸1 min,進行35個循環(huán)；最后72 °C 延伸10 min。隨后于4 'C保存?zhèn)溆谩?br> 4、 PCR擴增產(chǎn)物在37 。C條件下經(jīng)Scg I酶切16 h后，酶切產(chǎn)物經(jīng)2 % 瓊脂糖凝膠上電泳、溴化乙錠染色，用凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照記錄(圖2 為7個辣椒自交系PCR擴增產(chǎn)物酶切產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳分析。M: DNA Marker; 1: A5; 2: All; 3: B17; 4: B23; 5: B2; 6: B32; 7: B19)。 結(jié)果表明，辣椒自交系A(chǔ)5、 All、 B17、 B23、 B32及B19酶切產(chǎn)物均有325 bp和265 bp兩條譜帶，鑒別為抗疫病材料；而辣椒自交系B2只有590bp 一條譜帶，鑒別為感疫病材料。
采用灌根接種法(易圖永等，辣椒疫病三種接種方法的比較[J].中國蔬 菜，2003 (2): 16~18)對辣椒自交系對疫病抗病性鑒定結(jié)果表明辣椒自 交系A(chǔ)5、 All、 B17、 B23、 B32及B19為抗疫病自交系，辣椒自交系B2 為感疫病自交系。因此，利用本發(fā)明創(chuàng)制的鑒別辣椒抗疫病特性的分子標記 與植株真實抗性相一致，適用于抗疫病分子標記輔助育種。 實施例2:
1、人工設(shè)計合成的核苷酸序列作為引物
正向引物5 ， - AGGTGGTCTTCAATGATCAGAGA國3 ，
8反向弓I物5,- CCTGAGGCAAATTCCAAATCTC -3'
2、 辣椒基因組DNA的提取采用改良SDS方法分別提取7個辣椒自 交系B3、 Pll、 B4、 P30、 B12、 P97和P45基因組DNA。
3、 以步驟1所述核苷酸分子為引物，分別對上述7個辣椒自交系基因 組DNA進行PCR擴增，7個辣椒自交系均可擴增出長度為590 bp的片段(圖 3為7個辣椒自交系PCR擴增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳分析。M: DNAMarker;
1: B3; 2: Pll; 3: B4; 4: P30; 5: B12; 6: P97; 7: P45)。 PCR擴增 體系如下
(1) 反應(yīng)液的體積為25pL，所用物品的組成及含量為
10倍PCR buffer 2.5 pL， 25 mmol丄-1 MgCl2 2,0 ^L， 5 U.pL-1 DNA 聚合酶0.2 |xL， 5 mmol.L" dNTPs 1.0 ^L， 20拜ol.L-1正向引物1.0 ^L， 20 limol'L-1下游引物1.0 mL，基因組dna 1.0 (50 ng^！/1)， ddH20 16.3 pL。
(2) PCR擴增反應(yīng)條件為
PCR擴增反應(yīng)在PCR儀上進行，反應(yīng)條件為94 。C預(yù)變性5 min; 94 °C 變性1 min， 58 'C退火1 min， 72 'C延伸1 min，進行35個循環(huán)；最后72 °C 延伸10min。隨后于4'C保存?zhèn)溆谩?br> 4、 PCR擴增產(chǎn)物在37。C條件下經(jīng)萬cgl酶切16h后，酶切產(chǎn)物經(jīng)2% 瓊脂糖凝膠上電泳、溴化乙錠染色，用凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照記錄(圖4 為7個辣椒自交系PCR擴增產(chǎn)物酶切產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳分析。M: DNA Marker; 1: B3; 2: Pll; 3: B4; 4: P30; 5: B12; 6: P97; 7: P45丄 結(jié)果表明，辣椒自交系Pl 1 、 P30、 P97及P45酶切產(chǎn)物均有325 bp和265 bp 兩條譜帶，鑒別為抗疫病材料；而辣椒自交系B3、 B4和B12只有590bp 一條譜帶，鑒別為感疫病材料。
采用灌根接種法(易圖永等，辣椒疫病三種接種方法的比較[J].中國蔬 菜，2003 (2): 16~18)對辣椒自交系對疫病抗病性鑒定結(jié)果表明辣椒自交系Pll、 P30、 P97及P45為抗疫病自交系，辣椒自交系B3、 B4和B12 為感疫病自交系。因此，利用本發(fā)明創(chuàng)制的鑒別辣椒抗疫病特性的分子標記 與植株真實抗性相一致，適用于抗疫病分子標記輔助育種。
權(quán)利要求
1、一種鑒別辣椒抗疫病性狀的分子標記方法，其特征在于，包括以下步驟1)人工設(shè)計合成一對核苷酸序列作為引物，該引物是由堿基組成的特定序列的寡聚體，其中正向引物5’-AGGTGGTCTTCAATGATCAGAGA-3’反向引物5’-CCTGAGGCAAATTCCAAATCTC-3’2)提取辣椒基因組的DNA，以引物對辣椒基因組DNA進行PCR擴增，抗疫病材料和感疫病材料均可擴增出長度為590bp的片段；3)PCR擴增產(chǎn)物在37℃條件下經(jīng)Bcg I酶切16h后，Bcg I酶的酶切位點為抗疫病品種克隆的基因序列第324bp處；酶切產(chǎn)物經(jīng)2％瓊脂糖凝膠上電泳、溴化乙錠染色，用凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照記錄，抗疫病植株酶切產(chǎn)物有325bp和265bp兩條譜帶，感疫病植株只有590bp一條譜帶。
2、 如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)的PCR擴 增反應(yīng)包括(1) 25 PCR反應(yīng)體系，包括10倍PCR buffer 2.5 pL， 25 mmol'L-1 MgCl2 2.0 ^L， 5 U.pL-1 7hg DNA聚合酶0.2 ^L， 5 mmol.L" dNTPs 1.0 pL， 20pmol丄"正向引物1.0nL， 20pmol'L"反向引物1.0jiL，基因組DNAl.O j^L， ddH20 16.3 kiL;(2) PCR擴增反應(yīng)在PCR儀上進行，反應(yīng)條件為94。C預(yù)變性5min; 94 。C變性1 min， 58 'C退火1 min， 72 'C延伸1 min，進行35個循環(huán)；最后 72'C延伸10min，隨后于4'C保存?zhèn)溆谩?br> 全文摘要
本發(fā)明公開了一種鑒別辣椒抗疫病性狀的分子標記方法，包括辣椒基因組DNA的提取、PCR擴增及特異酶切產(chǎn)物多態(tài)性分析，其特征在于根據(jù)植物抗病基因序列人工合成一對由一定數(shù)量的堿基組成特定序列的核苷酸分子，以此對核苷酸分子為引物，通過PCR反應(yīng)得到分子標記，利用此標記中的特異酶切產(chǎn)物的大小能鑒別出辣椒抗疫病材料和感疫病材料。這一方法用于辣椒苗期或成株期抗疫病性篩選，能極大地加速辣椒抗疫病育種進程。
文檔編號C12Q1/68GK101487048SQ20091002096
公開日2009年7月22日 申請日期2009年1月19日 優(yōu)先權(quán)日2009年1月19日
發(fā)明者鞏振輝, 李大偉, 賈慶利, 逯明輝, 陳儒鋼, 煒 黃 申請人:西北農(nóng)林科技大學(xué)