專利名稱：滸苔微世代的熒光原位雜交檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及綠潮生物檢測(cè)與監(jiān)測(cè)研究，具體地說(shuō)是一種滸苔微世代的熒光原位雜 交檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
基于分子基礎(chǔ)(核酸、蛋白、糖蛋白)的檢測(cè)方法較傳統(tǒng)檢測(cè)方法有很大的優(yōu)勢(shì)， 種類鑒定更為準(zhǔn)確可靠，并能夠提供定量信息，可以檢測(cè)較低豐度的目標(biāo)微藻種類(大型 藻類的微型世代)，使之能在常規(guī)監(jiān)測(cè)中使用。由于rRNA基因ITS區(qū)的異質(zhì)性，使得其在各 類生物屬、種間表現(xiàn)出明顯的差異。國(guó)際上通常采用ITS區(qū)作為各種生物類群屬種間分類 和系統(tǒng)研究的區(qū)域，也是設(shè)計(jì)探針的首選區(qū)域。相對(duì)而言，兩者之間的轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS區(qū)， 為高變的區(qū)域，為生物各類群屬下水平的研究提供較多的信息，是國(guó)際上公認(rèn)的生物各類 群屬下種間水平研究的一個(gè)很好的比較指標(biāo)，在動(dòng)植物的分子分類中已得到廣泛的使用， 在藻類分子鑒定中也已被采用。熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization, FISH)是一種非放射性 原位雜交方法，它采用特殊熒光素標(biāo)記核酸(DNA)探針，對(duì)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)DNA或RNA的特定序 列存在與否最為有效。這一技術(shù)可以在保持細(xì)胞形態(tài)完整性的條件下，檢測(cè)到細(xì)胞內(nèi)的核 酸序列。FISH技術(shù)的基本過(guò)程是利用熒光標(biāo)記的探針在細(xì)胞內(nèi)與特異性互補(bǔ)的核酸序列 雜交。通過(guò)激發(fā)雜交探針的熒光來(lái)檢測(cè)信號(hào)，從而檢測(cè)相應(yīng)的核苷酸序列。該技術(shù)主要的 步驟包括1)樣品的固定；2)樣品的制備和預(yù)處理；3)預(yù)雜交；4)探針和樣品變性；5)用 不同的探針雜交來(lái)檢測(cè)不同的靶序列；6)漂洗去除未結(jié)合的探針；7)檢測(cè)雜交信號(hào)，進(jìn)行 結(jié)果分析。其關(guān)鍵環(huán)節(jié)在熒光染料的選擇、雜交過(guò)程和雜交后檢測(cè)(Miller et al. , 1998 ； Groben et al.，2005)。FISH技術(shù)通常采用的熒光染料是熒光素衍生物(FITC，F(xiàn)luoX)、羅 丹明衍生物(TRITC，TeXaSRed)和吲哚二羧箐(Cy3、Cy5)等，由于吲哚二羧箐具有顯著的亮 度和光熄滅穩(wěn)定性，因此具有較好的應(yīng)用前景。2007年和2008年，我國(guó)黃海中部連續(xù)兩年爆發(fā)滸苔(Enteromorphaprolifera)綠 潮。2008年6月初，黃海中南部海域出現(xiàn)歷史罕見的大規(guī)模的滸苔綠潮現(xiàn)象，并逐漸向青島 近海海域漂移，滸苔綠潮持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)、規(guī)模大，嚴(yán)重影響到奧帆賽比賽海域環(huán)境質(zhì)量和青島 市區(qū)沿海一線景觀。由此可見，我國(guó)沿海不僅成為中國(guó)赤潮發(fā)生的重災(zāi)區(qū)，而且已經(jīng)成為以 大型綠藻滸苔(Enteromorpha prolifera)為代表的綠潮的重災(zāi)區(qū)，對(duì)赤潮、綠潮，特別是綠 潮微世代等生物的準(zhǔn)確鑒定、快速檢測(cè)和預(yù)警預(yù)報(bào)已成為當(dāng)前赤潮和綠潮研究領(lǐng)域的熱點(diǎn) 問(wèn)題，并具有重要的理論和實(shí)際意義。針對(duì)傳統(tǒng)監(jiān)測(cè)方法的困難和限制，國(guó)外科學(xué)家們已致力于發(fā)展各種特異性分子探 針來(lái)檢測(cè)各種赤潮類群，使目標(biāo)赤潮生物能通過(guò)光學(xué)或化學(xué)的手段檢測(cè)出來(lái)，實(shí)現(xiàn)快速且 準(zhǔn)確地鑒定、計(jì)數(shù)目標(biāo)綠潮種類，從而確定赤潮的生物量、分布情況，達(dá)到準(zhǔn)確檢測(cè)預(yù)報(bào)綠 潮的目的。迄今為止，分子探針技術(shù)在赤潮生物檢測(cè)與監(jiān)測(cè)研究在國(guó)際上得到了迅速發(fā)展， 而針對(duì)綠潮的相關(guān)研究卻特別少，特別是針對(duì)滸苔(Enteromorpha prolifera)微世代，即越冬種子庫(kù)(propagule bank)形式的熒光原位雜交技術(shù)還未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種快速、準(zhǔn)確的滸苔微世代的熒光原位雜交檢測(cè)方法； 它可實(shí)現(xiàn)快速且準(zhǔn)確地鑒定、計(jì)數(shù)滸苔，從而確定其生物量、分布情況，達(dá)到準(zhǔn)確檢測(cè)預(yù)報(bào) 的目的。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)為滸苔微世代的熒光原位雜交檢測(cè)方法，用于FITC標(biāo)記原位雜交檢測(cè)滸苔微世代 的寡核苷酸探針為如下4種探針之一或一種以上，1)5， -GCCCGCCGTTTACAGGAT-3，2) 5，-AGCCCTAACCCATTGAACCC-3，3) 5，-CCCTGCGATAGTAACTGAGACA-3，4) 5，-GGAGCCCTAACCCATTGAA-3，于它們的5’端采用FITC標(biāo)記的辦法。用于FITC標(biāo)記原位雜交檢測(cè)滸苔微世代的寡核苷酸探針最好為如下2種探針之 一或二種，2) 5，-AGCCCTAACCCATTGAACCC-3，，3) 5，-CCCTGCGATAGTAACTGAGACA-3，。原位雜交的具體過(guò)程為1)樣品的制備和預(yù)處理將現(xiàn)場(chǎng)海水水體樣品進(jìn)行濃縮后，對(duì)藻的自發(fā)熒光進(jìn)行固定、脫色用離心管于 5000g/min離心樣品5min，加入乙醇至終體積濃度1 %固定，靜置1_2小時(shí)，得濃縮脫色后的 樣品，上帶有聚碳酸酯膜的過(guò)濾器上過(guò)濾，使細(xì)胞留在聚碳酸酯膜上；分別采用1XPBS和 雜交緩沖液過(guò)濾清洗濾膜；2)雜交將濾膜置于載玻片上，直接加入雜交緩沖液和熒光探針，使探針終濃度 達(dá)到5-lOng/ii L ；將玻片置于溫濕的暗處46-50°C雜交2_3h ；3)漂洗去除未結(jié)合的探針用預(yù)熱至50°C的1XSET的雜交清洗液浸泡洗滌濾膜 來(lái)終止雜交反應(yīng)，洗滌后用干凈濾紙吸干濾膜；4)檢測(cè)雜交信號(hào)，進(jìn)行結(jié)果分析加入封片劑和終濃度為1 P g/mL DNA標(biāo)記物DAPI的混合液，復(fù)染并防止熒光淬 滅。蓋上蓋玻片并封片，儲(chǔ)存于暗處以備檢測(cè)。雜交后的藻細(xì)胞以熒光顯微鏡觀察雜交 效果，并記錄陽(yáng)性標(biāo)記率；觀察FITC熒光標(biāo)記的藻細(xì)胞時(shí)應(yīng)用450-490nm的激發(fā)光波長(zhǎng)、 510-520nm發(fā)射光波長(zhǎng)的濾光片組合觀察，觀察確認(rèn)水樣中存在的滸苔微世代。所述海水水體樣品采集后用篩絹過(guò)濾濃縮；所述雜交緩沖液的組成為0. 9M NaCl, 20mmol/LTris-HCl, pH7. 2,0. 1% (v/v) Nonidet-P40, 20% (v/v)甲酰胺。本發(fā)明的整體思路1、探針的設(shè)計(jì)和制作將所獲得的滸苔ITS序列(參見序列的數(shù)據(jù)庫(kù)網(wǎng)站http://WWW. ncbi. nlm. nih. gov/sites/gquery,登陸序列號(hào)為FJ026732)與從GeneBank和EMBL等核酸數(shù)據(jù)庫(kù)種獲得的石莼屬所有的株系的ITS序列，應(yīng)用Clustal X(自由軟件)對(duì)序列進(jìn)行排序，并手動(dòng)精 減排列結(jié)果，確定針對(duì)目標(biāo)藻分類水平的特異性序列；然后通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)(GeneBank和EMBL) 的BLAST N接口對(duì)這些排列結(jié)果進(jìn)行篩選。篩選后得到的特異性序列用于設(shè)計(jì)合適的探針。FISH技術(shù)通常采用的熒光染料是熒光素衍生物(FITC，F(xiàn)luoX)、羅丹明衍生物 (TRITC，Texas Red)和吲哚二羧箐(Cy3、Cy5)等，由于吲哚二羧箐具有顯著的亮度和光熄 滅穩(wěn)定性，因此具有較好的應(yīng)用前景。常用的熒光標(biāo)記染料如表1所示；表1常用的FISH熒光染料 2、樣品的獲得1)水體中樣品的獲得用采水器采集5-10L海水，用10 ii m篩絹過(guò)濾濃縮，將水體積縮小為100-200mL。2)附著樣品的獲得附著樣品的采集地點(diǎn)一般為潮間帶。最常用的方法是放置載玻片或者其他載體放 置在目標(biāo)區(qū)域，定期取回實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)；另一種方法是采用刮擦目標(biāo)藻類的方式，這種方式容 易造成目標(biāo)藻類的破損，而且雜質(zhì)太多，不易檢測(cè)，一般不使用該方法。3、雜交技術(shù)流程該技術(shù)主要的步驟包括1)樣品的固定；2)樣品的制備和預(yù)處理；3)預(yù)雜交；4)探針和樣品變性；5)用不同的探針雜交來(lái)檢測(cè)不同的靶序列；6)漂洗去除未結(jié)合的探針；7)檢測(cè)雜交信號(hào)，進(jìn)行結(jié)果分析。其關(guān)鍵環(huán)節(jié)在熒光染料的選擇、雜交過(guò)程和雜交后檢測(cè)。本發(fā)明采用的滸苔(Enteromorpha prolifera)微世代的熒光原位雜交檢測(cè)方法 具有以下優(yōu)點(diǎn)1、熒光試劑和探針經(jīng)濟(jì)、安全原位雜交的探針按標(biāo)記分子類型分為放射性標(biāo)記和非放射性標(biāo)記。用同位素標(biāo)記 的放射性探針優(yōu)勢(shì)在于對(duì)制備樣品的要求不高，可以通過(guò)延長(zhǎng)曝光時(shí)間加強(qiáng)信號(hào)強(qiáng)度，故較靈敏。缺點(diǎn)是探針不穩(wěn)定、自顯影時(shí)間長(zhǎng)、放射線的散射使得空間分辨率不高、及同位素 操作較繁瑣等。項(xiàng)目采用原位熒光標(biāo)記系統(tǒng)則可克服這些不足，而且沒(méi)有放射性，而且費(fèi)用 較少，因此具有經(jīng)濟(jì)、安全的特點(diǎn)。2、探針?lè)€(wěn)定，一次標(biāo)記后可在兩年內(nèi)使用；項(xiàng)目設(shè)計(jì)的探針在合適的條件下保存，可以使有效期延長(zhǎng)至兩年。因此，探針一次 設(shè)計(jì)，可以長(zhǎng)期使用，達(dá)到節(jié)省時(shí)間的目的。3、實(shí)驗(yàn)周期短、能迅速得到結(jié)果、試驗(yàn)操作流程簡(jiǎn)單，時(shí)間短，達(dá)到迅速檢測(cè)的目的。4、可以定量檢測(cè)滸苔微世代的量項(xiàng)目設(shè)計(jì)的探針特異性好、定位準(zhǔn)確，在熒光顯微鏡下可以清楚看到每一個(gè)被雜 交的孢子/合子/配子，因此，在取樣以及濃縮量記錄的情況下，可以通過(guò)推算的辦法定量 檢測(cè)水體中滸苔微世代種子庫(kù)的量。5、多色FISH通過(guò)在同一個(gè)核中顯示不同的顏色可同時(shí)檢測(cè)多種序列該發(fā)明可以同時(shí)使用多種滸苔探針，通過(guò)不同的熒光顏色，更加正確的確認(rèn)滸苔 微世代的存在及其存在量。


圖1 (a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)為連續(xù)的23個(gè)樣品的ITS序列比對(duì)圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)驗(yàn)操作1、滸苔(Enteromorpha prolifera)微世代探針的設(shè)計(jì)和制作1)滸苔(Enteromorpha prolifera) ITS序列的獲得于整個(gè)滸苔綠潮影響海域采 集23個(gè)不同站點(diǎn)，滸苔樣品的ITS序列及5. SSrDNA序列的PCR片段總長(zhǎng)度為540bp，其中 ITS1長(zhǎng)度為189bp，5. 8S rDNA全序列長(zhǎng)度為160bp，ITS2長(zhǎng)度為181bp。從序列比對(duì)的結(jié)果 看這23個(gè)樣品的ITS序列及5. 8S rDNA序列完全相同，可以確定是屬于一個(gè)種。滸苔ITS 序列為本實(shí)驗(yàn)室測(cè)序獲得，登陸序列的數(shù)據(jù)庫(kù)網(wǎng)站http://WWW. ncbi. nlm. nih. gov/sites/ gquery，登陸序列號(hào)為FJ026732 ；序列比對(duì)如圖1所示；2)探針的篩選將所獲得的滸苔ITS序列與從GeneBank和EMBL等核酸數(shù)據(jù)庫(kù)種獲得的石純屬 所有的株系的ITS序列，應(yīng)用Clustal X(自由軟件)對(duì)序列進(jìn)行排序，并手動(dòng)精減排列結(jié) 果，確定針對(duì)目標(biāo)藻分類水平的特異性序列；然后通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)(GeneBank和EMBL)的BLAST N接口對(duì)這些排列結(jié)果進(jìn)行篩選。篩選后得到的特異性序列用于設(shè)計(jì)合適的探針，利用 0LIG06. 0軟件確定合適的探針長(zhǎng)度(大約20bp左右)，根據(jù)Tm值和探針的二級(jí)結(jié)構(gòu)等特 點(diǎn)篩除結(jié)構(gòu)上不合適的探針。3)熒光染料的使用獲得的探針委托商業(yè)公司大連寶生物合成并進(jìn)行5’端異硫氰酸熒光素FITC熒光 基團(tuán)的標(biāo)記。2、樣品的獲得
用采水器與滸苔密集海域采集5-10L海水，用10 y m篩絹過(guò)濾濃縮，將水體積縮小 為100-200mL，根據(jù)樣品研究需要分別加入1/10體積多聚甲醛(10%，終濃度)或
的魯格氏碘液、4%福爾馬林、2. 5%戊二醛進(jìn)行固定。3、雜交技術(shù)流程將現(xiàn)場(chǎng)樣品進(jìn)行濃縮及顯微鏡計(jì)數(shù)后，對(duì)藻的自發(fā)熒光進(jìn)行脫色采用乙醇、丙酮 或者甲醇梯度脫色(此步驟脫色效果和時(shí)間根據(jù)具體情況而定)，過(guò)濾。用針筒吸取l_2ml 左右濃縮脫色后的樣品，在13mm針筒過(guò)濾器上低壓過(guò)濾，細(xì)胞則留在濾膜(聚碳酸酯膜或 核孔膜)上。用針筒吸取1XPBS lmL清洗一次5min，濾掉，用針筒吸取預(yù)熱的雜交緩沖液 (0. 9MNaCl,20mM Tris-HCl, pH7. 2,0. 1% (v/v)Nonidet_P40，20% 甲酰胺)lmL 清洗一次， 5min，濾掉。濾膜可以室溫空氣干燥，可在室溫下儲(chǔ)存一個(gè)月左右，也可以直接用于熒光原 位雜交(FISH)，大的濾膜如25mm可以剪成若干小塊，用作多樣本分析。將濾膜置于載玻 片上，直接加入預(yù)熱的雜交緩沖液55 y L與熒光探針5 u L (66ng/ u L)，使探針終濃度達(dá)到 5ng/uL0將玻片置于溫濕雜交盒(自制)于暗處46-50°C雜交2-3h。溫濕暗雜交盒中的 濕紙用雜交緩沖液潤(rùn)濕，并確保含探針的雜交緩沖液完全覆蓋濾膜(根據(jù)濾膜大小，用量 可以減少)。用預(yù)熱的(50°C ) lXSET(lmM EDTA, 20mM Tris/HCl,0. 15MNaCl,pH7. 8) 100 u L 的雜交清洗液洗滌濾膜來(lái)終止雜交反應(yīng)，共清洗二次，每次溫育5分鐘，洗滌后用干凈濾紙 吸干濾膜。加入10-60 u L封片劑Citifluor/DAPI-Mix (含1 u g/mL DAPI)復(fù)染并防止熒 光淬滅。每張玻片可以并排放兩張25mm的濾膜，蓋上蓋玻片并封片，儲(chǔ)存于暗處以備檢測(cè)。 玻片可以在冷凍條件下保存數(shù)月而熒光不會(huì)衰減。4、實(shí)驗(yàn)結(jié)果經(jīng)過(guò)NIKON 80i熒光顯微鏡檢測(cè)(激發(fā)492nm，發(fā)射528nm)后發(fā)現(xiàn)片中有數(shù)量不 等的發(fā)射綠色熒光的滸苔孢子/配子/合子。
實(shí)施例1、樣品的獲得本次實(shí)驗(yàn)從2008年6月開始，到2008年7月止。水體樣品于2008年6月15號(hào)采自 青島第二海水浴場(chǎng)潮間帶漂浮滸苔密集區(qū)域(35. 35° N，119. 30° E，水面以下10-35cm)。 采集樣品后的操作過(guò)程同上述實(shí)驗(yàn)操作。共采集水體樣品55個(gè)，每個(gè)5L。實(shí)驗(yàn)室內(nèi)用10 ym 篩絹過(guò)濾濃縮，將水體積縮小為100mL。2、探針的設(shè)計(jì)滸苔中用于FITC標(biāo)記原位雜交的寡核苷酸探針(根據(jù)ITS序列設(shè)計(jì))設(shè)計(jì)同上 述方法，5’端采用FITC標(biāo)記的辦法，一共設(shè)計(jì)4種探針1)5， -GCCCGCCGTTTACAGGAT-3，2) 5，-AGCCCTAACCCATTGAACCC-3，3) 5 ’ -CCCTGCGATAGTAACTGAGACA-3’4) 5，-GGAGCCCTAACCCATTGAA-3，3、雜交流程1)樣品的制備和預(yù)處理將現(xiàn)場(chǎng)樣品進(jìn)行濃縮及顯微鏡計(jì)數(shù)后，對(duì)藻的自發(fā)熒光進(jìn)行固定、脫色用15mL離心管于5000g/min 5min離心15mL樣品，棄上清，加入乙醇固定劑(體積濃度)3mL， 靜置1-2小時(shí)。用針筒吸取l_2ml左右濃縮脫色后的樣品，用13mm針筒在帶有聚碳酸酯膜的過(guò)濾 器上過(guò)濾，使細(xì)胞留在聚碳酸酯膜上。用針筒吸取1XPBS lmL過(guò)濾清洗一次，清洗時(shí)間5min。用針筒吸取預(yù)熱的(50°C) 雜交緩沖液(0. 9M NaCl,20mmol/LTris-HCl, pH7. 2,0. 1% (v/v)Nonidet-P40, 20% (v/v) 甲酰胺)lmL過(guò)濾清洗一次，清洗時(shí)間5min。濾膜可以室溫空氣干燥，可在室溫下儲(chǔ)存一個(gè) 月左右，也可以直接用于熒光原位雜交。2)雜交將濾膜置于載玻片上，直接加入預(yù)熱的(50°C )雜交緩沖液(0. 9M NaCl,20mmol/ LTris-HCl, pH7. 2,0. 1 % (v/v) Nonidet-P40, 20 % (v/v)甲酰胺)55 ii L 與熒光探針 5 uL(50ng/ u L)，使探針終濃度達(dá)到5ng/ u L。將玻片置于溫濕雜交盒于暗處46_50°C雜交 2-3h。溫濕暗雜交盒中的濕紙用雜交緩沖液潤(rùn)濕，并確保含探針的雜交緩沖液完全覆蓋濾膜。3)漂洗去除未結(jié)合的探針用預(yù)熱的(50°C) lXSET(lmMEDTA,20mMTris/HCl,0. 15MNaCl，pH7. 8) 100 ii L 的雜
交清洗液浸泡洗滌濾膜來(lái)終止雜交反應(yīng)，共清洗二次，每次溫育5分鐘，洗滌后用干凈濾紙 吸干濾膜。4、檢測(cè)雜交信號(hào)，進(jìn)行結(jié)果分析加入10-60 u L封片劑Citif luor和DNA標(biāo)記物DAPI (終濃度為1 y g/mL)的混合 液，復(fù)染并防止熒光淬滅。每張玻片可以并排放兩張25X25mm的濾膜，蓋上蓋玻片并封片， 儲(chǔ)存于暗處以備檢測(cè)。玻片可以在冷凍條件下保存數(shù)月而熒光不會(huì)衰減。雜交后的藻細(xì)胞 以熒光顯微鏡(Leica，型號(hào)為DMIRB)觀察雜交效果，并記錄陽(yáng)性標(biāo)記率。觀察FITC熒光 標(biāo)記的藻細(xì)胞時(shí)應(yīng)用450-490nm的激發(fā)光波長(zhǎng)、510-520nm發(fā)射光波長(zhǎng)的濾光片組合觀察。 觀察結(jié)果發(fā)現(xiàn)55個(gè)水樣中有24個(gè)觀察到了發(fā)綠色熒光的滸苔微世代，存在率為43. 64% ； 其中探針 2)5，-AGCCCTAACCCATTGAACCC-3，和 3)5，-CCCTGCGATAGTAACTGAGACA-3，的標(biāo)記 效果較好。滸苔微世代SEQUENCE LISTING<110>中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所<120>滸苔微世代的熒光原位雜交檢測(cè)方法<130><160>4<170>PatentIn version 3. 1<210>1<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>gene<222>(1). . (18)<223><400>1gcccgccgtt tacaggat18<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><221>gene<222>(1). . (20)<223><400>2agccctaacc cattgaaccc 20<210>3<211>22滸苔微世代<212>DNA<213>人工序列<220><221>gene<222>(1). . (22)<223><400>3ccctgcgata gtaactgaga ca 22<210>4<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><221>gene<222>(1). . (19)<223><400>4ggagccctaa cccattgaa19
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權(quán)利要求
滸苔微世代的熒光原位雜交檢測(cè)方法，其特征在于用于FITC標(biāo)記原位雜交檢測(cè)滸苔微世代的寡核苷酸探針為如下4種探針之一或一種以上，1)5’-GCCCGCCGTTTACAGGAT-3’2)5’-AGCCCTAACCCATTGAACCC-3’3)5’-CCCTGCGATAGTAACTGAGACA-3’4)5’-GGAGCCCTAACCCATTGAA-3’于它們的5’端采用FITC標(biāo)記的辦法。
2.按照權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于用于FITC標(biāo)記原位雜交檢測(cè)滸苔微 世代的寡核苷酸探針為如下2種探針之一或二種，2)5，-AGCCCTAACCCATTGAACCC-3，，3)5，-CCCTGCGATAGTAACTGAGACA-3，。
3.按照權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于原位雜交的具體過(guò)程為，1)樣品的制備和預(yù)處理將現(xiàn)場(chǎng)海水水體樣品進(jìn)行濃縮后，對(duì)藻的自發(fā)熒光進(jìn)行固定、脫色用離心管于 5000g/min離心樣品5min，加入乙醇至終體積濃度1 %固定，靜置1_2小時(shí)，得濃縮脫色后的 樣品，上帶有聚碳酸酯膜的過(guò)濾器上過(guò)濾，使細(xì)胞留在聚碳酸酯膜上；分別采用IXPBS和 雜交緩沖液過(guò)濾清洗濾膜；2)雜交將濾膜置于載玻片上，直接加入雜交緩沖液和熒光探針，使探針終濃度達(dá)到 5-10ng/yL ；將玻片置于溫濕的暗處46_50°C雜交2_3h ；3)漂洗去除未結(jié)合的探針用預(yù)熱至50°C的IXSET的雜交清洗液浸泡洗滌濾膜來(lái)終 止雜交反應(yīng)，洗滌后用干凈濾紙吸干濾膜；4)檢測(cè)雜交信號(hào)，進(jìn)行結(jié)果分析加入封片劑和終濃度為1 μ g/mL DNA標(biāo)記物DAPI的混合液，復(fù)染并防止熒光淬滅。蓋 上蓋玻片并封片，儲(chǔ)存于暗處以備檢測(cè)。雜交后的藻細(xì)胞以熒光顯微鏡觀察雜交效果，并記 錄陽(yáng)性標(biāo)記率；觀察FITC熒光標(biāo)記的藻細(xì)胞時(shí)應(yīng)用450-490nm的激發(fā)光波長(zhǎng)、510-520nm 發(fā)射光波長(zhǎng)的濾光片組合觀察，觀察確認(rèn)水樣中存在的滸苔微世代。
4.按照權(quán)利要求3所述的檢測(cè)方法，其特征在于所述海水水體樣品采集后用篩絹過(guò) 濾濃縮。
5.按照權(quán)利要求3所述的檢測(cè)方法，其特征在于所述雜交緩沖液的組成為0.9M NaCl, 20mmol/LTris-HCl, pH7. 2,0. 1% (v/v)Nonidet-P40, 20% (v/v)甲酰胺。
全文摘要
本發(fā)明涉及綠潮生物檢測(cè)與監(jiān)測(cè)研究，具體地說(shuō)是一種滸苔微世代的熒光原位雜交檢測(cè)方法，用于FITC標(biāo)記原位雜交檢測(cè)滸苔微世代的寡核苷酸探針為如下4種探針之一或一種以上，1)5’-GCCCGCCGTTTACAGGAT-3’，2)5’-AGCCCTAACCCATTGAACCC-3’，3)5’-CCCTGCGATAGTAACTGAGACA-3’，4)5’-GGAGCCCTAACCCATTGAA-3’，它們的5’端采用FITC標(biāo)記的辦法。本發(fā)明可實(shí)現(xiàn)快速且準(zhǔn)確地鑒定、計(jì)數(shù)滸苔微世代，從而確定其生物量、分布情況，達(dá)到準(zhǔn)確檢測(cè)預(yù)報(bào)的目的。
文檔編號(hào)C12N15/11GK101851666SQ20091002028
公開日2010年10月6日 申請(qǐng)日期2009年4月4日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月4日
發(fā)明者葉乃好, 莊志猛, 張曉雯, 毛玉澤, 王清印 申請(qǐng)人:中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所