一種用于快速檢測(cè)霉菌和酵母菌的檢測(cè)皿及制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明專利所屬的技術(shù)領(lǐng)域是微生物學(xué)檢測(cè)，具體涉及一種用于快速檢測(cè)霉菌和 酵母菌的檢測(cè)皿及制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 霉菌和酵母菌廣泛存在于空氣、水和土壤中，絕大部分對(duì)人體無害，但有些霉菌對(duì) 人體有害，霉菌可引起食物霉變，會(huì)刺激人體消化道、胃部等，嚴(yán)重的還可對(duì)肝臟造成損傷， 造成食物中毒，危及生命安全。現(xiàn)行檢測(cè)技術(shù)主要有GB 4789.15-2010食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)， 食品微生物學(xué)檢測(cè)一霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)，該方法為平板法，具有檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確、可靠的特 點(diǎn)，是經(jīng)典的微生物檢測(cè)和鑒定方法，然該方法耗時(shí)長(zhǎng)、需要現(xiàn)配置培養(yǎng)基，操作步驟繁瑣， 難以滿足快檢的實(shí)際要求。
[0003] 紙片法的出現(xiàn)，彌補(bǔ)了平板法的缺點(diǎn)，逐步成為微生物檢測(cè)和鑒定的主要方法和 標(biāo)準(zhǔn)，2007年，Petrifilm?測(cè)試片被正式列為中國(guó)出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，該方法正 逐漸被越來越多的食品生產(chǎn)加工企業(yè)及各類檢測(cè)機(jī)構(gòu)所認(rèn)可。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)微生物紙片 法的研究較多，廣州天河綠洲生物化學(xué)研究中心公開了一項(xiàng)實(shí)用新型專利《霉菌和酵母菌 的快速檢測(cè)檢驗(yàn)紙片》CN03274715.2,該專利采用底面涂布含有酶顯色劑吸水凝膠粉的上 蓋膜和吸附了培養(yǎng)基液的培養(yǎng)片組成，該產(chǎn)品的使用，需要進(jìn)行待測(cè)菌液的涂布和蓋膜操 作，存在人為操作不當(dāng)蓋膜產(chǎn)生氣泡及涂布不均影響目標(biāo)菌生長(zhǎng)和實(shí)驗(yàn)結(jié)果判讀困難的缺 陷。濟(jì)南市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所和山東大學(xué)公開了一項(xiàng)發(fā)明專利《食品包裝材料表面霉菌 的檢測(cè)方法及專用濾紙》CN200110014458.2,該發(fā)明僅適用于食品包裝材料，且只針對(duì)霉菌 檢測(cè)。湖北工業(yè)大學(xué)公開了一項(xiàng)發(fā)明專利《食品和餐具中大腸菌群快速檢測(cè)紙片的制備與 應(yīng)用》將濾紙片放入無菌的塑模袋內(nèi)，組裝測(cè)試片，存在目標(biāo)菌在組裝袋中擴(kuò)散生長(zhǎng)，菌落 邊緣模糊，影響檢測(cè)結(jié)果判讀的缺點(diǎn)。3M創(chuàng)新有限公司申請(qǐng)了一項(xiàng)發(fā)明專利《用于檢測(cè)酵母 和霉菌的方法和培養(yǎng)裝置》201480007414.5，該培養(yǎng)裝置包括含有自支承基材的主體，基材 具有第一主表面和第二主表面，該培養(yǎng)裝置需要將待測(cè)樣品進(jìn)行涂布，在不超過72小時(shí)的 培養(yǎng)時(shí)間，可判斷檢測(cè)結(jié)果，其缺點(diǎn)在于存在人工操作不當(dāng)，引起涂布和蓋膜產(chǎn)生氣泡的可 能。3M創(chuàng)新有限公司還申請(qǐng)了 一項(xiàng)發(fā)明專利《快速檢測(cè)微生物的裝置》201180032280.9，該 裝置的使用依賴于待測(cè)樣品的涂布和蓋膜操作，引入了因人為操作不當(dāng)，導(dǎo)致判讀結(jié)果有 誤的可能。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明要解決的問題是提供一種霉菌和酵母菌快速培養(yǎng)和檢測(cè)的檢測(cè)皿及其制 備方法，以簡(jiǎn)化和加快霉菌和酵母菌的檢測(cè)鑒定，簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)操作步驟，提高對(duì)微生物的檢測(cè) 效率，獲得可靠的檢測(cè)結(jié)果。
[0005] 本發(fā)明就是為了彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不足及滿足實(shí)際檢測(cè)的需要，在現(xiàn)有紙片檢測(cè)法 的基礎(chǔ)上，利用微生物生化反應(yīng)的特性，將微生物胞內(nèi)酶的種類及反應(yīng)條件作為微生物分 類鑒定的主要依據(jù)，通過在分離培養(yǎng)基或選擇性培養(yǎng)基中，加入微生物特異性酶顯色底物， 當(dāng)目的菌在培養(yǎng)基上生長(zhǎng)時(shí)，其特異性酶就能降解顯色底物，并產(chǎn)生帶有特殊顏色的代謝 物，使菌落形成特定的顏色或形態(tài)，從而進(jìn)行樣品中微生物的培養(yǎng)和檢測(cè)。本發(fā)明采用培養(yǎng) 皿和濾紙為載體，開發(fā)霉菌和酵母菌培養(yǎng)、檢測(cè)，該檢測(cè)皿將培養(yǎng)時(shí)間縮短到48h，菌落或 菌斑呈現(xiàn)立體生長(zhǎng)，易于判讀和分析，可同時(shí)實(shí)現(xiàn)霉菌和酵母菌的檢測(cè)，且準(zhǔn)確度達(dá)國(guó)標(biāo) 90%以上，能夠滿足實(shí)際檢測(cè)需求。
[0006] 本發(fā)明的目的及解決其主要技術(shù)問題是采用以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的：一種用于快 速檢測(cè)霉菌和酵母菌的檢測(cè)皿，包括無菌培養(yǎng)皿和測(cè)試片，測(cè)試片平鋪于無菌培養(yǎng)皿底部， 測(cè)試片上附著有霉菌和酵母菌特征顯色液體培養(yǎng)基； 其中所述的培養(yǎng)基的組成，每l〇〇g蒸餾水中含有:胰蛋白胨〇. 8g-2.0g、酵母粉0.4g-0.88、葡萄糖]^-48、磷酸氫二鉀0.058-0.]^、氯化鈉0.058-0.28、磷酸二氫鉀0.28-0.48、硫 酸鎂0.2g-0.4g、孟加拉紅0.04g-0.1 g、氯霉素0.1 g-0.3g、N，N-二甲基甲酰胺2g-4g、酶解底 物混合劑0.015g-0.04g。
[0007] 所述的酶解底物混合劑由5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸鹽與NBT按2:1-1:1比例溶解 于N，N-二甲基甲酰胺得到。
[0008] 所述的測(cè)試片是直徑為70mm的白色中速濾紙，每片濾紙使用0.05 Mol/L Triton-Tris緩沖生理鹽水處理液進(jìn)行處理，處理液用量為1.0-1.5mL。所述的無菌培養(yǎng)皿是單次使 用的培養(yǎng)皿。
[0009]這種快速檢測(cè)霉菌和酵母菌的檢測(cè)皿的制備方法，按下列步驟制備： A.配制霉菌和酵母菌特征顯色液體培養(yǎng)基：取100g蒸餾水，按照配方加入:胰蛋白胨 0 · 8g-2 · 0g、酵母粉0 · 4g-0 · 8g、葡萄糖lg-4g、磷酸氫二鉀0 · 05g-0 · lg、氯化鈉0 · 05g-0 · 2g、 磷酸二氫鉀〇. 2g-0.4g、硫酸鎂0.2g-0.4g、孟加拉紅0.04g-0. lg、加熱溶解后，采用高壓滅 菌鍋在121°C滅菌15min，冷卻至室溫后依次加入經(jīng)過濾滅菌的氯霉素及酶解底物混合劑， 得到液體培養(yǎng)基，在〇_4°C下冷藏備用。
[0010] B.制備測(cè)試片： 濾紙片前處理：將吸附濾紙切成直徑為70mm的測(cè)試片，加入1.0-1.5mL 0.05 Mol/L Triton-Tris緩沖生理鹽水處理后，放入37°C恒溫箱或干燥箱中干燥4h，放入含有干燥劑的 自封袋中，室溫保存?zhèn)溆谩?br>[0011] 培養(yǎng)液吸附：取上述處理濾紙，121°C滅菌15min，將滅菌后的測(cè)試片浸入到步驟A 所配好的霉菌酵母菌特征顯色液體培養(yǎng)基中，浸泡5-10min后，將測(cè)試片用鑷子夾出，平放 在干凈的超凈工作臺(tái)上，無菌條件下烘干后，在〇_4°C的無菌冷藏箱內(nèi)，保存?zhèn)溆茫?C.組裝測(cè)試片:將步驟B中所制備的測(cè)試片，裝入到無菌培養(yǎng)皿內(nèi)，蓋好培養(yǎng)皿蓋后，將 培養(yǎng)皿置于鋁箱包裝袋中，抽真空包裝，即可得到產(chǎn)品。
[0012] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有明顯的優(yōu)點(diǎn)和有益效果。由以上技術(shù)方案可知，具體 的與現(xiàn)有技術(shù)相比突出的實(shí)質(zhì)性進(jìn)步有以下三點(diǎn)： 第一、通過培養(yǎng)基優(yōu)化，獲得一種同時(shí)適用于霉菌和酵母菌生長(zhǎng)的培養(yǎng)基；以透氣性 好、吸附性強(qiáng)、大小合適的濾紙材料作為培養(yǎng)基的載體，通過濾紙的前處理，培養(yǎng)基的吸附 及烘干，將培養(yǎng)基附著在濾紙片上;通過將待測(cè)樣品直接接種于濾紙片上，實(shí)現(xiàn)對(duì)待測(cè)樣品 中霉菌和酵母菌的快速培養(yǎng)和檢測(cè)。
[0013] 第二、本發(fā)明所述的快速檢測(cè)霉菌和酵母菌的檢測(cè)皿，與現(xiàn)有3M Petrifilm測(cè)試 片相比，避免了由于涂布不均及蓋膜不當(dāng)產(chǎn)生氣泡的現(xiàn)象，氣泡的產(chǎn)生和存在，對(duì)于檢測(cè)樣 品的計(jì)數(shù)結(jié)果將產(chǎn)生較大影響，避免了人為操作不當(dāng)引起的誤差。同時(shí)，采取培養(yǎng)皿為載 體，利用特有的培養(yǎng)基配方，可實(shí)現(xiàn)霉菌和酵母菌立體生長(zhǎng)，使其便于觀察和區(qū)分。
[0014] 第三、本發(fā)明所述的快速檢測(cè)霉菌和酵母菌的檢測(cè)皿，使用簡(jiǎn)便，可以長(zhǎng)期存放， 應(yīng)用靈活的特點(diǎn)，可大大節(jié)省培養(yǎng)基配置、培養(yǎng)皿滅菌、清洗等處理的時(shí)間，降低了勞動(dòng)強(qiáng) 度，縮短了檢測(cè)時(shí)間。同時(shí)，本發(fā)明檢測(cè)皿制備方法簡(jiǎn)單、易行，能夠?qū)崿F(xiàn)自動(dòng)化生產(chǎn)，成本 低廉，使用方便。
【附圖說明】
[0015] 圖1不同的檢測(cè)方法檢測(cè)結(jié)果比對(duì)表1。
[0016] 圖2國(guó)標(biāo)法與本檢測(cè)皿測(cè)試結(jié)果比對(duì)表2。
[0017] 圖3濾紙?zhí)幚韺?duì)試驗(yàn)結(jié)果影響比對(duì)表3。
[00