專利名稱：一種蟲草菌粉蘇氨酸含量快速檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及蟲草菌粉氨基酸含量檢測領(lǐng)域，尤其涉及一種蟲草菌粉蘇氨酸含量快速檢測方法。
背景技術(shù)：
冬蟲夏草屬于子囊菌綱、麥角科、蟲草屬，是我國特有的名貴強壯滋補中藥材。由于天然冬蟲夏草產(chǎn)區(qū)具有局限性，產(chǎn)量稀少，加上長期以來亂采濫挖造成生態(tài)破壞嚴重，野生蟲草遠遠不能滿足日益增長的市場需求。因此大量替代品被開發(fā)，其中最有效的是人工發(fā)酵蟲草菌粉，即將分離的天然冬蟲夏草真菌菌株進行發(fā)酵，得到菌絲體，再經(jīng)純化加工后得到干燥的真菌粉末。蟲草菌粉中含有多種不同類型的化合物，營養(yǎng)豐富，具有增強身體免疫力，抗疲勞，抗腫瘤，保肝護肝，改善心血管功能，治療腎臟衰竭等多種藥理活性和功能。氨基酸作為主要功能性成分之一，在蟲草菌粉中的含量可達20 40%，且包含所有人體必需氨基酸。其含有的蘇氨酸(a-氨基-￠-羥丁基)，是八種人體必需氨基酸中僅次于蛋氨酸、賴氨酸和色氨酸的第四種氨基酸，在醫(yī)藥工業(yè)方面應(yīng)用十分廣泛。臨床上蘇氨酸是氨基酸大輸液的主要成分之一，具有恢復(fù)人體疲勞、促進生長發(fā)育、抗脂肪肝的效果?？捎糜谥委熑辫F性貧血，增強體質(zhì)，提高免疫力等。在天然蟲草中，蘇氨酸的含量在
I.8g/100g左右，而市場上所銷售的發(fā)酵蟲草菌粉中蘇氨酸含量和比例差異卻很大，因此， 對發(fā)酵蟲草菌粉中蘇氨酸含量進行定量檢測，可以作為發(fā)酵蟲草菌粉質(zhì)量的評價標準之一，對控制產(chǎn)品質(zhì)量有重要意義。傳統(tǒng)的氨基酸檢測方法多是使用以離子交換色譜分離各種氨基酸為基礎(chǔ)的氨基酸自動分析儀。根據(jù)GB T5009. 124-2003，該方法分析步驟為先稱取一定量的樣品于水解管內(nèi)，再加入6mol/L的鹽酸，新蒸餾的苯酚，將水解管冷凍，再抽真空充氮氣，重復(fù)三次后， 將已封口的水解管放在110 ± I °C的恒溫干燥箱內(nèi)水解22h ；再將水解液全部轉(zhuǎn)移到50mL容量瓶內(nèi)用去離子水定容；最后準確吸取0. 200mL混合氨基酸標準溶液，用pH2. 2緩沖液稀釋到5mL，此標準稀釋液濃度為5. 00nmol/50 u L，作為測定用的氨基酸標準液；用氨基酸自動分析儀外標法測定樣品待測液的氨基酸含量。該方法樣本預(yù)處理耗時耗力、操作復(fù)雜，并且需使用多種化學(xué)試劑，不僅會對環(huán)境造成一定污染，有的還會對人體造成一定傷害。因此， 急需研究一種簡單、快速、無損的氨基酸檢測方法和技術(shù)。電磁波波長800 2500nm范圍內(nèi)為物質(zhì)分子振動光譜的倍頻和組合頻譜帶，含氫基團C-H，0-H, N-H, S-H對光波有很強的吸收，因而包含了絕大多數(shù)類型有機物組分和分子結(jié)構(gòu)的豐富信息，可用于物質(zhì)有機物質(zhì)含量的定量測定。近紅外光譜由于其可實現(xiàn)快速、無破壞、無污染、低消耗地分析樣品組分，已廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、制藥、食品和化工等領(lǐng)域，在快速檢測、產(chǎn)品質(zhì)量研究中具有很大的應(yīng)用潛力。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種蟲草菌粉蘇氨酸含量快速檢測方法，用于蟲草菌粉中蘇氨酸含量的快速、無損、準確檢測，解決了現(xiàn)有檢測方法操作繁瑣、耗時、耗力、成本高、污染環(huán)境等問題。一種蟲草菌粉蘇氨酸含量快速檢測方法，包括(I)取蟲草菌粉，分別采集波長 1204nm、1215nm、1476nm、1537nm、1693nm、1717nm、 1738nm、1922nm、1962nm、2058nm、2099nm和2205nm光波所對應(yīng)的蟲草菌粉的反射率；(2)將各反射率轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的吸光度；(3)將各吸光度代入多元線性回歸方程y = -2. 439入「29. 211入2+41. 366入3_29 424 A 4+0. 907 A 5+19. 425 A 6+9. 201 A r9. 569 A 8+24. 492 A 9-23. 382 A 1(l-7. 417 A n+5. 594 入12+1. 914，計算得到蟲草菌粉中蘇氨酸的含量；方程中，y為蟲草菌粉中蘇氨酸的含量，單位為g/lOOg;^ X12分別為波長 1204nm、1215nm、1476nm、1537nm、1693nm、1717nm、1738nm、1922nm、1962nm、2058nm、2099nm 和2205nm光波所對應(yīng)的蟲草菌粉的吸光度。由于蟲草菌粉樣本是非透明介質(zhì)，當光波照射在其表面時，除部分被吸收外，其余均發(fā)生反射，而光波吸收的多少(或者反射率)是跟蟲草菌粉內(nèi)部化學(xué)物質(zhì)含量相關(guān)的。但對其中的蘇氨酸來說，這類物質(zhì)的含量僅跟少數(shù)特征波長下的反射率有關(guān)。步驟(I)中，所述蟲草菌粉的粒徑優(yōu)選為80-100目。所述的蟲草菌粉可以為天然蟲草經(jīng)干燥、粉碎后得到的粉末；也可以為人工發(fā)酵蟲草經(jīng)干燥、粉碎后得到的粉末。采用人工發(fā)酵蟲草時，所述的蟲草菌粉可以為市售產(chǎn)品，包括發(fā)酵蟲草菌絲體粉原料、膠囊制劑內(nèi)容物、蛹蟲草菌絲體粉等。所述的蟲草菌粉還可以通過如下方法制備將經(jīng)活化的蟲草菌株接種到液體培養(yǎng)基中進行發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵培養(yǎng)后分離得到菌絲體；菌絲體經(jīng)烘干、粉碎后，得到蟲草菌粉。優(yōu)選地，所述的分離為離心分離，離心的轉(zhuǎn)速為1200轉(zhuǎn)/分鐘，離心的時間為20 分鐘，這樣可以將培養(yǎng)基和菌絲有效分離。優(yōu)選地，所述的烘干溫度為95_105°C。該烘干條件下能減少對蟲草菌粉中有益成分(特別是蘇氨酸)的破壞。步驟⑵中，反射率轉(zhuǎn)化為吸光度采用如下公式A = log(l/R)；式中，R為反射率，A為吸光度。步驟(3)中，對所述的吸光度進行平滑處理，將平滑處理得到的數(shù)值代入所述多元線性回歸方程；方程中，X I X 12分別為波長1204nm、1215nm、1476nm、1537nm、1693nm、 1717nm、1738nm、1922nm、1962nm、2058nm、2099nm 和 2205nm 光波所對應(yīng)的蟲草菌粉的吸光
度經(jīng)平滑處理后得到的數(shù)值。所述的平滑處理優(yōu)選為Savitzky Golay卷積平滑處理(Savitzky Golay Smoothing)。Savitzky Golay Smoothing卷積平滑處理利用最小二乘法進行最佳擬合,是一種直接處理來自時間域內(nèi)數(shù)據(jù)平滑問題的方法。相較其它平滑處理方法能最大程度地保留原始數(shù)據(jù)相對極大值、極小值和寬度等的分布特性，通過Savitzky Golay Smoothing卷積平滑處理可以有效去除高頻噪音，提高信噪比。特征波長的選取或多元線性回歸方程的構(gòu)建會較大程度地影響待測物的檢測效果。本發(fā)明采取如下方法用傅里葉變換紅外光譜采集波長為800 2500nm光波下蟲草菌粉的反射率，以所獲得的全部樣本的全波段光譜對蟲草菌粉蘇氨酸含量進行偏最小二乘回歸分析(Partial least squares, PLS);建立模型之后,取擬合效果最好的主成分數(shù)目下計算各波長與蘇氨酸含量相關(guān)程度大小，截取相關(guān)度較大的波段，按照波長大小趣出其相關(guān)度數(shù)值變化圖，找出圖中波峰波谷位置的波長即為特征波長；將特征波長的反射率值經(jīng)轉(zhuǎn)化后作為多元線性回歸模型的輸入變量，實際測量的蘇氨酸含量作為輸出變量，通過計算可以得到相應(yīng)的多元線性回歸方程。本發(fā)明通過上述方法，選取的特征波長分別為1204nm、1215nm、1476nm、1537nm、 1693nm、1717nm、1738nm、1922nm、1962nm、2058nm、2099nm 和 2205nm,構(gòu)建得到上述的多兀
線性回歸方程，對蟲草菌粉中的蘇基酸含量預(yù)測效果最好。本發(fā)明通過少數(shù)特征波長進行多元線性回歸分析，實現(xiàn)了蟲草菌粉中蘇氨酸含量的快速、無損、準確檢測，大大減少了操作步驟，縮短了檢測時間，減少了環(huán)境污染，降低了檢測成本。


圖I為本發(fā)明實施例中基于PLS全波段建模在最優(yōu)主成分數(shù)目下的各波長與蘇氨酸含量相關(guān)度變化圖；圖2為本發(fā)明實施例中建模集樣本預(yù)測結(jié)果散點分布圖；圖3為本發(fā)明實施例中預(yù)測集樣本預(yù)測結(jié)果散點分布圖。
具體實施例方式實施例發(fā)酵蟲草菌粉中蘇氨酸含量檢測隨機收集189份杭州中美華東制藥有限公司生產(chǎn)的發(fā)酵蟲草菌粉，為使采集的樣本更具代表性和多樣性，樣本包括保質(zhì)期內(nèi)不同年月的批號?？墒箻颖局械奶K氨酸含量具有更大的范圍，使所建模型具有更好的適應(yīng)性和魯棒性。(I)將189個發(fā)酵蟲草菌粉樣本烘干至恒重，然后使用布魯克傅里葉變換光譜儀 MPA測定發(fā)酵蟲草菌粉樣本全波段光譜的反射率值，同時利用背景技術(shù)所提及的傳統(tǒng)方法用全自動氨基酸分析儀Biochrom 30+測量所有樣本中蘇氨酸的含量，色譜柱為Na+陽離子交換柱。(2)隨機選取126個樣本作為建模集樣本，其余63個作為預(yù)測集樣本。(3)將所得所有樣本的反射率轉(zhuǎn)化為吸光度值,并做Savitzky Golay Smoothing 卷積平滑處理。(4)用傅里葉變換光譜儀獲得的建模集的全光譜對蘇氨酸含量進行偏最小二乘回歸分析，建立模型之后，取擬合效果最好的主成分數(shù)目下(此樣本中為9個主成分)計算各波長與蘇氨酸含量相關(guān)程度大小，截取相關(guān)度較大的波段，按照波長大小趣出其相關(guān)度數(shù)值變化圖(圖I)，找出該圖中波峰波谷位置的波長作為特征波長，分別為1204nm、1215nm、 1476nm、1537nm、1693nm、1717nm、1738nm、1922nm、1962nm、2058nm、2099nm 和 2205nm。(5)然后將建模集的各特征波長所對應(yīng)的值作為自變量，相應(yīng)的實際測量得到的發(fā)酵蟲草菌粉中蘇氨酸含量作為因變量，利用多元線性回歸方法(Multiple linear regression, MLR)得到如下多元線性回歸方程
y = -2. 439 A 廠29. 211 A 2+41. 366 A 3~29. 424 A 4+0. 907 A 5+19. 425 A 6+9. 201 A 廠9 .569 A 8+24. 492 A g-23. 382 A 1(l-7. 417 A n+5. 594 A 12+1. 914方程中，y為發(fā)酵蟲草菌粉中蘇氨酸的含量，單位為g/100g DW ;入丨 A12分別為波長 1204nm、1215nm、1476nm、1537nm、1693nm、1717nm、1738nm、1922nm、1962nm、2058nm、 2099nm和2205nm所對應(yīng)的發(fā)酵蟲草菌粉樣品吸光度經(jīng)過Savitzky Golay Smoothing卷積平滑處理后的數(shù)值。利用上述多元線性回歸方程對建模集和預(yù)測集發(fā)酵蟲草菌粉的蘇氨酸含量進行預(yù)測，并對預(yù)測結(jié)果進行評價。評價指標中相關(guān)系數(shù)越接近于1，均方根誤差、偏差的絕對值和截距的絕對值越小，說明模型預(yù)測性能越好。結(jié)果如下表I
數(shù)據(jù)集樣本個數(shù)相關(guān)系數(shù)均方根誤差偏差斜率截距建模集1260.92070.046985.828><10_70.84661.8787預(yù)測集630.90260.058150.0540.92270.141 對建模集和預(yù)測集預(yù)測結(jié)果表明，發(fā)酵蟲草菌粉中蘇氨酸含量的測量值和預(yù)測值之間的相關(guān)系數(shù)達到0.9以上，均方根誤差較小，達到了理想的預(yù)測精度。預(yù)測結(jié)果的散點圖如圖2和圖3所示，圖中散點均勻地分布在回歸直線兩側(cè)。上述結(jié)果說明，本發(fā)明能夠?qū)崿F(xiàn)快速、無損、準確地檢測蟲草菌粉中蘇氨酸的含量。
權(quán)利要求
1.一種蟲草菌粉蘇氨酸含量快速檢測方法，包括(1)取蟲草菌粉，分別采集波長1204nm、1215nm、1476nm、1537nm、1693nm、1717nm、 1738nm、1922nm、1962nm、2058nm、2099nm和2205nm光波所對應(yīng)的蟲草菌粉的反射率；(2)將各反射率轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的吸光度；(3)將各吸光度代入多元線性回歸方程y= -2. 439 A r29. 211 A 2+41. 366 A 3-29. 4 24 入 4+0. 907 入 5+19. 425 入 6+9. 201 入 7_9. 569 入 8+24. 492 入 9_23. 382 入 1(l-7. 417 入 n+5. 594 入12+1. 914，計算得到蟲草菌粉中蘇氨酸的含量；方程中，y為蟲草菌粉中蘇氨酸的含量，單位為g/100g ; X i X 12分別為波長1204nm、 1215nm、1476nm、1537nm、1693nm、1717nm、1738nm、1922nm、1962nm> 2058nm> 2099nm 和 2205nm光波所對應(yīng)的蟲草菌粉的吸光度。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的蟲草菌粉蘇氨酸含量快速檢測方法，其特征在于，步驟(I) 中，所述蟲草菌粉的粒徑為80-100目。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的蟲草菌粉蘇氨酸含量快速檢測方法，其特征在于，步驟(I) 中，所述的蟲草菌粉通過如下方法制備將經(jīng)活化的蟲草菌株接種到液體培養(yǎng)基中進行發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵培養(yǎng)后分離得到菌絲體；菌絲體經(jīng)烘干、粉碎后，得到蟲草菌粉。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的蟲草菌粉蘇氨酸含量快速檢測方法，其特征在于，所述的烘干溫度為95-105°C。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的蟲草菌粉蘇氨酸含量快速檢測方法，其特征在于，步驟(3) 中，對所述的吸光度進行平滑處理，將平滑處理得到的數(shù)值代入所述多元線性回歸方程； 方程中，X 丨 X12 分別為波長 1204nm、1215nm、1476nm、1537nm、1693nm、1717nm、1738nm、 1922nm、1962nm、2058nm、2099nm和2205nm光波所對應(yīng)的蟲草菌粉的吸光度經(jīng)平滑處理后得到的數(shù)值。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的蟲草菌粉蘇氨酸含量快速檢測方法，其特征在于，所述的平滑處理為Savitzky Golay卷積平滑處理。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種蟲草菌粉蘇氨酸含量快速檢測方法，包括取蟲草菌粉，分別采集波長1204nm、1215nm、1476nm、1537nm、1693nm、1717nm、1738nm、1922nm、1962nm、2058nm、2099nm和2205nm光波所對應(yīng)的蟲草菌粉的反射率；將各反射率轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的吸光度；將各吸光度代入多元線性回歸方程，計算得到蟲草菌粉中蘇氨酸的含量。本發(fā)明通過少數(shù)特征波長進行多元線性回歸分析，實現(xiàn)了蟲草菌粉中蘇氨酸含量的快速、無損、準確檢測，大大減少了操作步驟，縮短了檢測時間，減少了環(huán)境污染，降低了檢測成本。
文檔編號G01N21/35GK102608058SQ20121005177
公開日2012年7月25日 申請日期2012年3月1日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月1日
發(fā)明者何勇, 徐寧, 魏萱 申請人:浙江大學(xué)