本發(fā)明涉及酶聯(lián)免疫檢測技術，具體涉及一種用于檢測毒死蜱的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特別適于蔬菜、水果和茶葉中毒死蜱含量的檢測。

背景技術：

毒死蜱(Chlorpyrifos)，化學名稱O,O-二乙基-O-(3,5,6-三氯-2-吡啶基)硫代磷酸酯，商品名為毒死蜱、樂斯本、白蟻清等，是甲胺磷和甲基對硫磷等高效農藥的新型高效、低毒替代品種，屬于廣譜型有機磷酸酯類殺蟲劑，可用于糧食、蔬菜、水果及經濟作物的害蟲防治。毒死蜱是農產品與食品中農藥殘留監(jiān)測的重要目標物之一，不僅在農作物中的殘留日益嚴重，而且可以通過代謝等途徑向環(huán)境中轉移，對人類健康構成潛在威脅，它會影響大腦發(fā)育，對甲狀腺系統(tǒng)產生作用，導致血液甲狀腺素濃度降低，過量攝取可能會引起痙攣以及眩暈，尤其對兒童健康危害較大。

有鑒于此，發(fā)達國家對毒死蜱的使用進行了嚴格的規(guī)定，并不斷提高毒死蜱在農產品中的殘留限量。歐盟對菠菜中毒死蜱的最高限量為0.05mg/kg；日本對毒死蜱的國家標準最為嚴格，其2002年4月公布的農殘限量標準表中，其菠菜的毒死蜱限量為0.01mg/kg；國際食品法典委員會(CAC)對菠菜中毒死蜱殘留限量為0.05mg/kg。我國最高殘留限量國家標準為：糧食0.1mg/kg；梨果、葉菜1mg/kg；棉籽油0.05mg/kg。

因此，為了預防和應對毒死蜱殘留引起的環(huán)境和食品污染問題，有必要建立一種靈敏、簡便、快速的毒死蜱檢測方法。目前毒死蜱的殘留檢測主要有高效液相色譜法(HPLC)、氣-質聯(lián)用法(GC-MS)。采用這些分析方法需要昂貴的儀器和專門的技術人員，樣品前處理過程復雜且花費高、費時長，難以滿足大量樣品和現(xiàn)場樣品快速檢測的需要。酶聯(lián)免疫吸附分析法(ELISA)具有簡便快速、特異靈敏、樣品容量大、分析成本低的特點，可以簡化甚至省去樣品凈化步驟，在大量樣本和現(xiàn)場樣本快速篩選檢測中顯示出獨特優(yōu)勢，能夠更好地滿足我國食品企業(yè)、政府職能監(jiān)管部門等開展檢測工作，極具發(fā)展?jié)摿Α?/p>

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種結構簡單、使用方便、價格便宜、便于攜帶的用于毒死蜱檢測的酶聯(lián)免疫試劑盒，并提供一種高效、準確、簡便、適于大批量樣本篩選的定性、定量檢測方法。

本發(fā)明試劑盒，它包括：包被有毒死蜱偶聯(lián)抗原的酶標板、毒死蜱單克隆抗體、酶標記抗抗體、毒死蜱標準品溶液、底物顯色液、終止液、洗滌液、復溶液；所述毒死蜱偶聯(lián)抗原是由毒死蜱半抗原與載體蛋白偶聯(lián)得到，所述載體蛋白為鼠血清蛋白、甲狀腺蛋白、牛血清白蛋白、兔血清蛋白、人血清蛋白、卵清蛋白、血藍蛋白或纖維蛋白原，所述毒死蜱半抗原是由毒死蜱原藥在堿性條件下與氨基丁酸在吡啶環(huán)上與鄰近氮原子的氯進行親核取代反應得到，分子結構式為：

所述毒死蜱單克隆抗體是以毒死蜱偶聯(lián)抗原作為免疫原制備獲得。

所述抗抗體為羊抗鼠抗抗體。

所述酶標記抗抗體的標記酶為辣根過氧化物酶；酶標記的抗抗體是采用戊二醛法或過碘酸鈉法將標記酶與抗抗體進行偶聯(lián)得到的。

為了更方便現(xiàn)場監(jiān)控和大量樣本篩查，所述試劑盒還包括毒死蜱標準品溶液、底物顯色液、終止液、洗滌液、復溶液。

所述毒死蜱標準品溶液6瓶，濃度分別為0μg/L、0.6μg/L、1.8μg/L、5.4μg/L、16.2μg/L和48.6μg/L。

所述底物顯色液由底物液A液和底物液B液組成，A液為過氧化氫或過氧化脲，B液為鄰苯二胺或四甲基聯(lián)苯胺，所述終止液為1～2mol/L的硫酸溶液。

所述洗滌液優(yōu)選為pH值為7.4，含有0.5％～1.0％吐溫-20、0.01‰～0.03‰疊氮化鈉的0.1～0.3mol/L磷酸鹽緩沖液。

所述復溶液優(yōu)選為pH值為7.0的0.1mol/L磷酸鹽緩沖液。

其中在酶標板制備過程中所用到的包被緩沖液為pH值為9.6的0.05mol/L碳酸鹽緩沖液，封閉液為pH值為7.1～7.5，含有1％～3％酪蛋白的0.1～0.3mol/L磷酸鹽緩沖液。

本發(fā)明中酶標板的制備過程為：用包被緩沖液將包被原稀釋成20μg/mL，每孔加入100μL，37℃避光孵育2h或4℃過夜，傾去孔中液體，用洗滌液洗滌2次，每次30s，拍干，然后在每孔中加入150～200μL封閉液，37℃避光孵育1～2h，傾去孔內液體拍干，干燥后用鋁膜真空密封保存。

本發(fā)明的檢測原理為：

在微孔條上預包被毒死蜱偶聯(lián)抗原，加入樣本溶液或標準品溶液后，再加入毒死蜱單克隆抗體溶液，樣本中的毒死蜱與酶標板上包被的毒死蜱偶聯(lián)抗原競爭毒死蜱單克隆抗體，加入酶標記抗抗體進行放大作用，用顯色液顯色，樣本吸光度值與毒死蜱的含量呈負相關，與標準曲線比較即可得到樣本中毒死蜱的殘留量；同時根據(jù)酶標板上顏色的深淺，與系列濃度的標準品溶液顏色的比較可粗略判斷樣本中毒死蜱殘留量的濃度范圍。

本發(fā)明還提供了一種應用上述酶聯(lián)免疫試劑盒檢測毒死蜱的方法，它包括步驟：

(1)樣本前處理；

(2)用試劑盒進行檢測；

(3)分析檢測結果。

本發(fā)明檢測毒死蜱的酶聯(lián)免疫試劑盒主要采用間接競爭ELISA方法定性或定量檢測樣本中毒死蜱的含量；對樣本的前處理要求低，樣本前處理過程簡單，能同時快速檢測大批量樣本；主要試劑以工作液的形式提供，檢驗方法方便易行，具有特異性高、靈敏度高、精確度高、準確度高等特點。本發(fā)明的酶聯(lián)免疫試劑盒，結構簡單、使用方便、價格便宜、攜帶便利、檢測方法高效、準確、簡便、適于大批量樣本篩選的定性、定量檢測。

附圖說明

圖1：毒死蜱半抗原合成路線圖

圖2：毒死蜱半抗原核磁共振氫譜圖

圖3：試劑盒標準曲線圖

具體實施方式

下面結合具體的實施例來進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明，而不用來限制本發(fā)明的范圍。

實施例1試劑盒組分的制備

1、毒死蜱半抗原的合成(合成路線見附圖1)及鑒定

1.0g毒死蜱原藥用30mL乙醇溶解，加氫氧化鈉0.41g，加氨基丁酸0.35g，回流反應3h，檢測，原料全部反應完成。蒸干乙醇，加水-乙酸乙酯萃取，水相，調節(jié)pH值到3，乙酸乙酯萃取，有機相蒸干，用二氯甲烷和正己烷重結晶，即得到毒死蜱半抗原產物。

取上述半抗原經核磁共振氫譜鑒定，結果見附圖2。圖譜中化學位移在11.0ppm處的羧基信號峰，2.30ppm、1.89ppm及3.35ppm處的亞甲基信號峰，證明毒死蜱半抗原結構正確。

2、毒死蜱偶聯(lián)抗原的合成及鑒定

免疫原制備——毒死蜱半抗原與牛血清白蛋白(BSA)偶聯(lián)得到免疫原。

取9mg半抗原，溶解于1mL N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中；取30mg碳化二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)用0.2mL水充分溶解后加入半抗原溶液中，室溫下攪拌24h，即可得到反應液A；稱取BSA 50mg，使之充分溶解在3.8mL CB(pH9.0)中，將反應液A逐滴緩慢加入到蛋白溶液中，并于室溫下攪拌24h；用0.01mol/L PBS 4℃透析3d，每天換3次透析液；分裝，于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

包被原制備——毒死蜱半抗原與卵清蛋白(OVA)偶聯(lián)得到免疫原。

取9mg半抗原，溶解于1mL DMF中；取30mg EDC和NHS用0.2mL水充分溶解后加入半抗原溶液中，室溫下攪拌24h，即可得到反應液A；稱取OVA 50mg，使之充分溶解在3.8mL CB(pH9.0)中，將反應液A逐滴緩慢加入到蛋白溶液中，并于室溫下攪拌24h；用0.01mol/L PBS 4℃透析3d，每天換3次透析液；分裝，于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

按合成毒死蜱偶聯(lián)抗原反應所用半抗原、載體蛋白與偶聯(lián)產物的比例，進行紫外(200nm～400nm)掃描測定，通過比較三者分別在260nm和280nm的吸光值計算其結合比。偶聯(lián)物毒死蜱半抗原-載體蛋白的最大吸收峰與毒死蜱半抗原、載體蛋白的最大吸收峰相比發(fā)生了明顯的變化，表明毒死蜱半抗原-載體蛋白的合成是成功的。

3、毒死蜱單克隆抗體的制備

(1)雜交瘤細胞的獲得

1)首次免疫：將毒死蜱半抗原-BSA偶聯(lián)物(免疫原)與等量的弗氏完全佐劑充分乳化，皮下注射6周齡的Balb/c小鼠，每只0.2mL；

2)加強免疫兩次：從首次免疫開始，每兩周加強免疫一次，用弗式不完全佐劑代替弗氏完全佐劑，方法和劑量同首次免疫；

3)最后一次加強免疫一周后眼底靜脈采血測效價和抑制，有抑制且效價達到1:10000以上時進行如下末次免疫：腹腔注射不加任何佐劑的免疫原溶液0.1mL，三天后處死小鼠，取其脾臟與骨髓瘤細胞融合；

4)采用間接競爭酶聯(lián)免疫分析方法測定細胞上清液，篩選陽性孔。利用有限稀釋法對陽性孔進行克隆化，得到并建立穩(wěn)定分泌毒死蜱單克隆抗體的雜交瘤細胞株，取處于對數(shù)生長期的雜交瘤細胞用凍存液制成細胞懸液，分裝于凍存管，在液氮中長期保存。

(2)單克隆抗體的制備

1)細胞復蘇：取出毒死蜱單克隆抗體雜交瘤細胞株凍存管，立即放入37℃水浴中速融，離心去除凍存液后，移入培養(yǎng)瓶內培養(yǎng)；

2)制備腹水與抗體純化：采用體內誘生法，將Balb/c小鼠(8周齡)腹腔注入滅菌石蠟油0.5mL/只，7天后腹腔注射雜交瘤細胞5×10⁵個/只，7天后采集腹水。用辛酸-飽和硫酸銨法進行純化，得到毒死蜱單克隆抗體溶液(-20℃保存)。

(3)單克隆抗體效價的測定

用間接競爭ELISA法測定抗體的效價為1:(100000～150000)。

間接競爭ELISA方法：用毒死蜱半抗原-OVA偶聯(lián)物包被酶標板，加入毒死蜱標準品溶液、毒死蜱單克隆抗體溶液和辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠抗抗體溶液，25℃反應30min，倒出孔內液體，用洗滌液洗滌3～5次，用吸水紙拍干；加入底物顯色液，25℃反應15min后，加入終止液終止反應；設定酶標儀于波長450nm處測定每孔吸光度值。

(4)單克隆抗體特異性的測定

抗體特異性是指它同特異性抗原結合的能力與同該類抗原類似物結合能力的比較，常用交叉反應率作為評價標準。交叉反應越小，抗體的特異性則越高。

本實驗將毒死蜱、甲基毒死蜱、二嗪農、甲基對硫磷、殺螟硫磷、馬拉硫磷、對硫磷做系列稀釋，分別與單克隆抗體進行間接競爭ELISA，制作標準曲線，分析得到IC₅₀，然后按下式計算交叉反應率：

結果顯示各類似物的交叉反應率為：毒死蜱100％、甲基毒死蜱7.08％、二嗪農＜1％、甲基對硫磷＜1％、殺螟硫磷＜1％、馬拉硫磷＜1％、對硫磷＜1％。本發(fā)明抗體對甲基毒死蜱、二嗪農、甲基對硫磷、殺螟硫磷、馬拉硫磷、對硫磷等其他農藥無交叉反應，只針對毒死蜱有特異性結合。

4、羊抗鼠抗抗體的制備

以羊為免疫動物，以鼠源抗體為免疫原免疫無病原體羊，得到羊抗鼠抗抗體。

5、酶標記抗抗體的制備

將羊抗鼠抗抗體與辣根過氧化物酶(HRP)采用改良后的過碘酸鈉法進行偶聯(lián)。傳統(tǒng)的過碘酸鈉法要求反應體系中酶與抗體的摩爾濃度比為4:1，由于辣根過氧化物酶在強氧化作用下產生許多與抗體結合的位點，這樣活化的辣根過氧化物酶分子充當了連接各分子的橋梁，降低了酶標記物的酶活性，使制備的偶聯(lián)物中混有許多聚合體。為了解決這個問題，我們將傳統(tǒng)的方法進行了改良，即：

(1)省去了氨基的封閉過程，因為能產生自身氨基連接的氨基實際很少；

(2)降低辣根過氧化物酶與抗體的摩爾濃度比率至2:1，改良后的方法比傳統(tǒng)的方法簡便，對酶活性的損失減少。

6、酶標板的制備

用包被緩沖液將包被原(毒死蜱半抗原-OVA偶聯(lián)物)稀釋成20μg/mL，每孔加入100μL，37℃避光孵育2h，傾去孔中液體，用洗滌液洗滌2次，每次30s，拍干，然后在每孔中加入200μL封閉液，37℃避光孵育2h，傾去孔內液體拍干，干燥后用鋁膜真空密封保存。

實施例2檢測毒死蜱的酶聯(lián)免疫試劑盒的組建

組建檢測毒死蜱的酶聯(lián)免疫試劑盒，使其包含下述組分：

(1)包被毒死蜱偶聯(lián)抗原的酶標板；

(2)毒死蜱標準品溶液6瓶，濃度分別為0μg/L、0.6μg/L、1.8μg/L、5.4μg/L、16.2μg/L和48.6μg/L；

(3)毒死蜱單克隆抗體工作液；

(4)用辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠抗抗體；

(5)底物顯色液由A液和B液組成，A液為過氧化脲，B液為四甲基聯(lián)苯胺；

(6)終止液為2mol/L硫酸；

(7)洗滌液為pH值為7.4，含有0.5％～1.0％吐溫-20、0.01‰～0.03‰疊氮化鈉的0.1～0.3mol/L磷酸鹽緩沖液；

(8)復溶液為pH值為7.0的0.1mol/L磷酸鹽緩沖液。

實施例3蔬菜、水果和茶葉樣本中毒死蜱的檢測

1、樣本前處理

稱取1.0g±0.05g樣本至10mL聚苯乙烯離心管中，加入5mL甲醇，用渦旋混合儀渦動2min，混勻；3000g室溫(20～25℃)離心5min，取50μL上層清液至2mL聚苯乙烯離心管中，加入950μL復溶液，渦動20s；取50μL用于分析。

2、用試劑盒檢測

向包被有毒死蜱偶聯(lián)抗原的酶標板微孔中加入毒死蜱標準品溶液或經前處理的樣本溶液50μL/孔，然后加入毒死蜱單克隆抗體工作液50μL/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置25℃避光反應30min；倒出孔內液體，每孔加入250μL洗滌液充分洗滌4～5次，每次間隔10s，用吸水紙拍干；再加入辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠抗抗體100μL/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置25℃避光反應30min，取出重復洗板步驟；每孔加入底物顯色液A液過氧化脲50μL，底物顯色液B液四甲基聯(lián)苯胺(TMB)50μL，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置25℃避光顯色15min，每孔加入終止液2mol/L硫酸50μL，輕輕振蕩混勻，用酶標儀波長設定在450nm處，測定每孔吸光度值(OD值)。

3、檢測結果分析

用所獲得的每個濃度的標準品溶液的吸光度平均值(B)除以第一個標準品溶液(0標準)的吸光度值(B₀)再乘以100％，得到百分吸光度值。以毒死蜱標準品濃度(μg/L)的對數(shù)值為X軸，百分吸光度值為Y軸，繪制標準曲線，如圖3所示。用同樣的辦法計算樣本溶液的百分吸光度值，相對應每一個樣本的毒死蜱含量則可從標準曲線上讀出。

實施例4毒死蜱酶聯(lián)免疫試劑盒技術參數(shù)的確定試驗

1、試劑盒靈敏度和檢測限

按照常規(guī)方法測定試劑盒靈敏度，試劑盒標準曲線最低點為0.6μg/L，標準曲線的范圍為0.6～48.6μg/L，IC₅₀(50％抑制濃度)浮動范圍為1.0～2.0μg/L；對空白白菜、蘋果、茶葉樣本各20份進行檢測，從標準曲線上查出對應于各百分吸光度值的濃度，以20份樣本濃度的平均值加上3倍標準差表示檢測限，結果得該方法對蔬菜、水果、茶葉樣本的檢測限為100μg/kg。2、樣本精密度和準確度試驗

以回收率作為準確度評價指標，以重復測定某一濃度樣本的檢測結果相對標準偏差(RSD％)作為精密度評價指標。計算公式為：回收率(％)＝實際測定值/理論值×100％，其中理論值為樣本的添加濃度；相對標準偏差RSD％＝SD/X×100％，其中SD為標準偏差，X為測定數(shù)據(jù)的平均值。

按100μg/kg、200μg/kg、400μg/kg三個濃度毒死蜱對空白白菜、蘋果、茶葉樣本進行添加回收測定，每個樣本做4個平行，用三批不同試劑盒進行測定，計算樣本的平均回收率及精密度結果見下表。

表1精密度及準確度試驗

以100、200、400μg/kg三個濃度的毒死蜱對空白白菜、蘋果、茶葉樣本進行添加，平均回收率在70％～110％之間；批內、批間相對標準偏差均小于15％。

3、試劑盒穩(wěn)定性試驗

試劑盒保存條件為2～8℃，經過12個月的測定，試劑盒的最大吸光度值(零標準)、50％抑制濃度、毒死蜱添加實際測定值均在正常范圍之內?？紤]在運輸和使用過程中，會有非正常保存條件出現(xiàn)，將試劑盒在37℃保存條件下放置7天，進行加速老化實驗，結果表明該試劑盒各項指標完全符合要求?？紤]到試劑盒冷凍情況發(fā)生，將試劑盒放入-20℃冰箱冷凍7天，測定結果也表明試劑盒各項指標完全正常。從以上結果可得出試劑盒可以在2～8℃至少保存12個月以上。