本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)免疫診斷領(lǐng)域，具體地指一種C-反應(yīng)蛋白免疫膠乳微球制備方法及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：C反應(yīng)蛋白(C-reactiveprotein,CRP)是一種在白介素-6的介導(dǎo)下主要由肝臟產(chǎn)生的急性期反應(yīng)蛋白，急性期濃度可升高上千倍。CRP無(wú)論在人或動(dòng)物體內(nèi)均是急性時(shí)相反應(yīng)蛋白中重要的蛋白之一，是一種敏感的炎癥標(biāo)志物，在急性創(chuàng)傷和感染時(shí)其血濃度急劇升高。正常動(dòng)物血清CRP含量很低，但在感染、炎性、手術(shù)及腫瘤等情況下，幾個(gè)小時(shí)迅速升高，在狗體內(nèi)24～48小時(shí)可達(dá)高峰。病變消退后，CRP可迅速下降至正常，所以可作為動(dòng)物細(xì)菌和病毒感染的一個(gè)首選指標(biāo)，防止抗生素濫用和減少食品帶來(lái)的健康問(wèn)題。1977年Sternberg創(chuàng)建了速率散射比濁法，是以測(cè)定的溶液對(duì)光的散射程度來(lái)判斷樣品中抗原的含量。一定波長(zhǎng)的光沿水平軸照射，碰到小顆粒的免疫復(fù)合物可導(dǎo)致光散射，散射強(qiáng)度與抗原抗體免疫復(fù)合物的含量成正比。但免疫比濁法由于檢測(cè)靈敏度達(dá)不到臨床的要求，于是出現(xiàn)了膠乳增強(qiáng)免疫比濁法。其基本原理是首先將抗體吸附在一種膠乳顆粒上，當(dāng)遇到相應(yīng)的抗原時(shí)，抗原抗體結(jié)合而出現(xiàn)膠乳凝集。單個(gè)膠乳顆粒的大小在入射光波長(zhǎng)之內(nèi)，光線可透過(guò)。當(dāng)兩個(gè)以上膠乳顆粒凝集可阻礙光線透過(guò)，使透射光減少，其減少程度與膠乳凝集的程度成正比，亦與抗原成反比?，F(xiàn)有技術(shù)中常采用聚苯乙烯微球偶聯(lián)抗體，得到用于檢測(cè)的膠乳試劑，但偶聯(lián)效率普遍偏低，只有60～80％，且偶聯(lián)時(shí)碳化二亞胺類活化劑對(duì)抗體活性破壞較大，導(dǎo)致產(chǎn)品成品率低。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的就是要克服現(xiàn)有C-反應(yīng)蛋白免疫膠乳微球制備方法產(chǎn)品成品率低的缺陷，提供一種偶聯(lián)效率高、偶聯(lián)后抗體活性影響小的C-反應(yīng)蛋白免疫膠乳微球制備方法及由采用該C-反應(yīng)蛋白免疫膠乳微球的膠乳增強(qiáng)免疫比濁法C-反應(yīng)蛋白測(cè)定試劑盒。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所提供的C-反應(yīng)蛋白免疫膠乳微球制備方法，步驟如下：1)準(zhǔn)備粒徑范圍50～200nm的聚苯乙烯微球，聚苯乙烯微球首先用濃度為50mmol/L的2-嗎啉乙磺酸緩沖液稀釋至終濃度0.8～1.2％w/v，得到pH為5.5～6.5的微球溶液；2)以2-嗎啉乙磺酸緩沖液溶解碳化二亞胺，得到濃度為10mg/mL的碳化二亞胺溶液；3)以微球溶液中所含聚苯乙烯微球的重量為計(jì)，按每10mg聚苯乙烯微球添加50～60μL的比例將碳化二亞胺溶液滴加至微球溶液中，2～8℃震蕩活化1h，震蕩速度為30～50r/min，得到活化聚苯乙烯微球溶液；4)將濃度≥10mg/mL的CRP多克隆抗體在pH8.5～9.5條件下溶解，溶劑是50mmol/L的硼酸鹽緩沖液，使抗體終濃度在0.5～2mg/mL之間，得到CRP多克隆抗體溶液，儲(chǔ)存于2～8℃?zhèn)溆茫?)將CRP多克隆抗體溶液滴加至活化聚苯乙烯微球溶液中，直至抗體與微球質(zhì)量比為0.05～0.2:1，整個(gè)滴加過(guò)程持續(xù)4～7min，使活化聚苯乙烯微球與抗體上的氨基耦合，兩者的混合液呈中性，之后0～4℃震蕩12～24h，震蕩速度為30～50r/min，即得C-反應(yīng)蛋白免疫膠乳微球。優(yōu)選地，所述步驟3)中震蕩活化條件為：4℃震蕩活化1h，震蕩速度為50r/min。優(yōu)選地，所述步驟5)中使活化聚苯乙烯微球與抗體上的氨基耦合時(shí)，4℃震蕩16h，震蕩速度為50r/min。本發(fā)明還提供了一種膠乳增強(qiáng)免疫比濁法C-反應(yīng)蛋白測(cè)定試劑盒，包括C-反應(yīng)蛋白檢測(cè)試劑R1和C-反應(yīng)蛋白檢測(cè)試劑R2；所述C-反應(yīng)蛋白檢測(cè)試劑R1中各組分及含量為：0.01～13％穩(wěn)定劑1、10～200mM的緩沖液1、1～6％的促凝劑1、0.02～0.1％的防腐劑1；所述C-反應(yīng)蛋白檢測(cè)試劑R2中各組分及含量為：0.01～23％穩(wěn)定劑2、1～5mg/ml的C-反應(yīng)蛋白免疫膠乳微球、10～200mM的緩沖液2、0.02～0.1％的防腐劑2；所述C-反應(yīng)蛋白檢測(cè)試劑R2的制備方法為：1)準(zhǔn)備粒徑范圍50～200nm的聚苯乙烯微球，聚苯乙烯微球首先用濃度為50mmol/L的2-嗎啉乙磺酸緩沖液稀釋至終濃度0.8～1.2％w/v，得到pH為5.5～6.5的微球溶液；2)以2-嗎啉乙磺酸緩沖液溶解碳化二亞胺，得到濃度為10mg/mL的碳化二亞胺溶液，3)以微球溶液中所含聚苯乙烯微球的重量為計(jì)，按每10mg聚苯乙烯微球添加50～60μL的比例將碳化二亞胺溶液滴加至微球溶液中，2～8℃震蕩活化1h，震蕩速度為30～50r/min，得到活化聚苯乙烯微球溶液；4)將濃度≥10mg/mL的CRP多克隆抗體在pH8.5～9.5條件下溶解，溶劑是50mmol/L的硼酸鹽緩沖液，使抗體終濃度在0.5～2mg/mL之間，得到CRP多克隆抗體溶液，儲(chǔ)存于2～8℃?zhèn)溆茫?)將CRP多克隆抗體溶液滴加至活化聚苯乙烯微球溶液中，直至抗體與微球質(zhì)量比為0.05～0.2:1，整個(gè)滴加過(guò)程持續(xù)4～7min，使活化聚苯乙烯微球與抗體上的氨基耦合，兩者的混合液呈中性，之后0～4℃震蕩12～24h，震蕩速度為30～50r/min，即得C-反應(yīng)蛋白免疫膠乳微球；6)向C-反應(yīng)蛋白免疫膠乳微球中加入含有穩(wěn)定劑2和緩沖液2的封閉液，震蕩得到膠乳溶液；7)膠乳溶液離心，去上清液，以除去其中殘留的活化劑，然后加入防腐劑2至貯存濃度，超聲分散，即得。優(yōu)選地，所述穩(wěn)定劑1選自0.5～1.8％的氯化鈉、0.1～1％的BSA、1～20mM的乙二胺四乙酸二鈉、0.01～1％的TritonX-100中的一種或兩種以上；所述緩沖液1選自4-羥乙基哌嗪乙磺酸-氫氧化鈉緩沖液(Hepes)、三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液(Tris)、3-(N-嗎啉基)-2-羥基丙磺酸-氫氧化鈉緩沖液(Mopso)、磷酸鹽緩沖液(PBS)、硼酸鹽緩沖液(BBS)、甘氨酸緩沖液(Glycine)中的一種或兩種以上；所述促凝劑1選自聚乙二醇6000、聚乙二醇8000或硫酸葡聚糖中的一種；所述防腐劑1選自疊氮鈉、Proclin300或硫柳汞中的一種；所述穩(wěn)定劑2選自0.5～1.8％的氯化鈉、0.2～3％的BSA、1～20mM乙二胺四乙酸二鈉、0.01～1％的TritonX-100、1～10％的丙三醇中的一種或兩種以上；所述緩沖液2選自4-羥乙基哌嗪乙磺酸-氫氧化鈉緩沖液、三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液、3-(N-嗎啉基)-2-羥基丙磺酸-氫氧化鈉緩沖液、磷酸鹽緩沖液、硼酸鹽緩沖液、甘氨酸緩沖液中的一種或兩種以上；所述防腐劑2選自疊氮鈉、Proclin300或硫柳汞中的一種。進(jìn)一步優(yōu)選地，所述C-反應(yīng)蛋白檢測(cè)試劑R1中各組分及含量為：0.4～0.8％的BSA、0.5～0.9％的NaCl、pH7.4的100～200mMTris、1～3％的PEG、0.05％的NaN3；所述C-反應(yīng)蛋白檢測(cè)試劑R2中各組分及含量為：0.4～0.8％的BSA、1～5mg/ml的C-反應(yīng)蛋白免疫膠乳微球、pH7.4的25-50mmol/L甘氨酸緩沖液、0.05％的NaN3；或所述C-反應(yīng)蛋白檢測(cè)試劑R1和所述C-反應(yīng)蛋白檢測(cè)試劑R2中0.05％的NaN3替換為0.1％的Proclin300。進(jìn)一步地，上述試劑盒還包括C-反應(yīng)蛋白校準(zhǔn)品，其各組分及含量為：0.01～13％的校準(zhǔn)品穩(wěn)定劑、20mg/L的C-反應(yīng)蛋白、10～200mM的校準(zhǔn)品緩沖液、0.02～0.1％的校準(zhǔn)品防腐劑。優(yōu)選地，所述校準(zhǔn)品穩(wěn)定劑選自0.5～1.8％的氯化鈉、0.1～1％的BSA、1～20mM的乙二胺四乙酸二鈉、0.01～1％的TritonX-100中的一種或兩種以上；所述校準(zhǔn)品緩沖液選自4-羥乙基哌嗪乙磺酸-氫氧化鈉緩沖液、三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液、3-(N-嗎啉基)-2-羥基丙磺酸-氫氧化鈉緩沖液、磷酸鹽緩沖液、硼酸鹽緩沖液、甘氨酸緩沖液中的一種或兩種以上；所述校準(zhǔn)品防腐劑選自疊氮鈉、Proclin300或硫柳汞中的一種。進(jìn)一步優(yōu)選地，所述C-反應(yīng)蛋白校準(zhǔn)品中各組分及含量為：0.4～0.8％的BSA、0.5～0.9％的NaCl、20mg/L的C-反應(yīng)蛋白、pH7.4的25-50mmol/L甘氨酸緩沖液、0.05％的NaN3；或所述C-反應(yīng)蛋白校準(zhǔn)品中各組分及含量為：0.4～0.8％的BSA、0.5～0.9％的NaCl、20mg/L的C-反應(yīng)蛋白、pH7.4的25-50mmol/L甘氨酸緩沖液、0.1％的Proclin300。優(yōu)選地，上述試劑盒的技術(shù)方案中，所述步驟3)中震蕩活化條件為：4℃震蕩活化1h，震蕩速度為50r/min。優(yōu)選地，上述試劑盒的技術(shù)方案中，所述步驟5)中使活化聚苯乙烯微球與抗體上的氨基耦合時(shí)，4℃震蕩16h，震蕩速度為50r/min。優(yōu)選地，上述試劑盒的技術(shù)方案中，所述步驟6)中震蕩條件為：25℃震蕩2h，然后轉(zhuǎn)入4℃震蕩24h，震蕩速度為50r/min。本發(fā)明的有益效果：(1)本發(fā)明在制備的C-反應(yīng)蛋白免疫膠乳微球時(shí)優(yōu)化化學(xué)交聯(lián)方法，將聚苯乙烯微球的羧基在低pH條件下活化，與高pH條件溶解的抗體上的氨基耦合，兩者的混合液呈中性，在低溫下偶聯(lián)12～24h，既保證了抗體的偶聯(lián)效率，同時(shí)極大程度的降低了活化劑對(duì)抗體活性的破壞。(2)本發(fā)明的膠乳增強(qiáng)免疫比濁法C-反應(yīng)蛋白測(cè)定試劑盒具有靈敏度高、定量準(zhǔn)確、重復(fù)性好、性質(zhì)穩(wěn)定的特點(diǎn)，其定量的線性范圍在0.1～20mg/L。(3)可應(yīng)用于全自動(dòng)生化分析儀或凝血分析儀，操作快速、簡(jiǎn)單，從檢測(cè)至采集結(jié)果只需5～10分鐘，具有較好的臨床應(yīng)用前景。具體實(shí)施方式以下結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)描述。實(shí)施例1本發(fā)明所提供的C-反應(yīng)蛋白免疫膠乳微球制備方法如下：1、準(zhǔn)備粒徑120nm的聚苯乙烯微球，濃度為10％，取用5ml；聚苯乙烯微球首先用濃度為50mmol/L的2-嗎啉乙磺酸緩沖液稀釋至終濃度1％w/v，得到pH為5.5～6.5的微球溶液，溶液的體積是50mL；2、以2-嗎啉乙磺酸緩沖液溶解碳化二亞胺，得到濃度為10mg/mL的碳化二亞胺溶液；3、以微球溶液中所含聚苯乙烯微球的重量為計(jì)，按每10mg聚苯乙烯微球添加50～60μL的比例將碳化二亞胺溶液滴加至微球溶液中，共滴加250μL，4℃震蕩活化1h，震蕩速度為50r/min，得到活化聚苯乙烯微球溶液；4、將CRP多克隆抗體(市售，濃度≥10mg/mL)在pH8.5～9.5條件下溶解，溶劑是50mmol/L的硼酸鹽緩沖液，使抗體終濃度在1.2mg/mL，得到CRP多克隆抗體溶液，溶液的體積是50mL，儲(chǔ)存于4℃?zhèn)溆茫?、將CRP多克隆抗體溶液滴加至活化聚苯乙烯微球溶液中，直至抗體與微球質(zhì)量比為0.05～0.2:1，整個(gè)滴加過(guò)程持續(xù)4min，兩者的混合液呈中性，之后4℃震蕩16h，震蕩速度為50r/min，即得C-反應(yīng)蛋白免疫膠乳微球1。實(shí)施例2本發(fā)明所提供的C-反應(yīng)蛋白免疫膠乳微球制備方法如下：1、準(zhǔn)備粒徑50nm的聚苯乙烯微球，濃度為10％，取用5ml；聚苯乙烯微球首先用濃度為50mmol/L的2-嗎啉乙磺酸緩沖液稀釋至終濃度0.8％w/v，得到pH為5.5～6.5的微球溶液，溶液的體積是50mL；2、以2-嗎啉乙磺酸緩沖液溶解碳化二亞胺，得到濃度為10mg/mL的碳化二亞胺溶液；3、以微球溶液中所含聚苯乙烯微球的重量為計(jì)，按每10mg聚苯乙烯微球添加50～60μL的比例將碳化二亞胺溶液滴加至微球溶液中，共滴加240μL，8℃震蕩活化1h，震蕩速度為30r/min，得到活化聚苯乙烯微球溶液；4、將CRP多克隆抗體(市售，濃度≥10mg/mL)在pH8.5～9.5條件下溶解，溶劑是50mmol/L的硼酸鹽緩沖液，使抗體終濃度在0.5mg/mL，得到CRP多克隆抗體溶液，溶液的體積是50mL，儲(chǔ)存于8℃?zhèn)溆茫?、將CRP多克隆抗體溶液滴加至活化聚苯乙烯微球溶液中，直至抗體與微球質(zhì)量比為0.05～0.2:1，整個(gè)滴加過(guò)程持續(xù)5min，兩者的混合液呈中性，之后2℃震蕩24h，震蕩速度為50r/min，即得C-反應(yīng)蛋白免疫膠乳微球2。實(shí)施例3本發(fā)明所提供的C-反應(yīng)蛋白免疫膠乳微球制備方法如下：1、準(zhǔn)備粒徑200nm的聚苯乙烯微球，濃度為10％，取用5ml；聚苯乙烯微球首先用濃度為50mmol/L的2-嗎啉乙磺酸緩沖液稀釋至終濃度1.2％w/v，得到pH為5.5～6.5的微球溶液，溶液的體積是50mL；2、以2-嗎啉乙磺酸緩沖液溶解碳化二亞胺，得到濃度為10mg/mL的碳化二亞胺溶液；3、以微球溶液中所含聚苯乙烯微球的重量為計(jì)，按每10mg聚苯乙烯微球添加50～60μL的比例將碳化二亞胺溶液滴加至微球溶液中，共滴加300μL，2℃震蕩活化1h，震蕩速度為50r/min，得到活化聚苯乙烯微球溶液；4、將CRP多克隆抗體(市售，濃度≥10mg/mL)在pH8.5～9.5條件下溶解，溶劑是50mmol/L的硼酸鹽緩沖液，使抗體終濃度在2mg/mL，得到CRP多克隆抗體溶液，溶液的體積是50mL，儲(chǔ)存于2℃?zhèn)溆茫?、將CRP多克隆抗體溶液滴加至活化聚苯乙烯微球溶液中，直至抗體與微球質(zhì)量比為0.05～0.2:1，整個(gè)滴加過(guò)程持續(xù)7min，兩者的混合液呈中性，之后0℃震蕩12h，震蕩速度為30r/min，即得C-反應(yīng)蛋白免疫膠乳微球3。實(shí)施例4以實(shí)施例1制備的C-反應(yīng)蛋白免疫膠乳微球1為原料，制備膠乳增強(qiáng)免疫比濁法測(cè)定C-反應(yīng)蛋白的試劑盒。其各組分如下：C-反應(yīng)蛋白檢測(cè)試劑R1中各組分及含量為：0.8％BSA、0.5％NaCl、200mMTris(pH＝7.4)、3％PEG6000、0.05％NaN3；C-反應(yīng)蛋白檢測(cè)試劑R2中各組分的及含量為：0.4％BSA、2mg/ml的C-反應(yīng)蛋白免疫膠乳微球、25mmol/L的甘氨酸緩沖液(pH＝7.4)、0.05％NaN3；C-反應(yīng)蛋白校準(zhǔn)品中各組分及含量為：0.4％BSA、0.5％NaCl、20mg/L的C-反應(yīng)蛋白、25mmol/L的甘氨酸緩沖液、0.05％NaN3。其中，C-反應(yīng)蛋白檢測(cè)試劑R2的制備步驟如下：1、向100mL的C-反應(yīng)蛋白免疫膠乳微球1的溶液中加入50mL封閉液，25℃震蕩2h，然后轉(zhuǎn)入4℃震蕩24h，震蕩速度為50r/min，得到膠乳溶液；封閉液組分為：3％w/v的BSA、100mmol/L的甘氨酸緩沖液(pH＝8.5不含防腐劑)。2、膠乳溶液以15000r/min離心30～45min，去掉上清液，然后加入含有NaN3成分的貯存液至貯存濃度，超聲分散即得。實(shí)施例5以實(shí)施例1制備的C-反應(yīng)蛋白免疫膠乳微球1為原料，制備膠乳增強(qiáng)免疫比濁法測(cè)定C-反應(yīng)蛋白的試劑盒。其各組分如下：C-反應(yīng)蛋白檢測(cè)試劑R1中各組分及含量為：0.8％BSA、0.9％NaCl、100mMTris(pH＝7.4)、1％PEG8000、0.1％Proclin300；C-反應(yīng)蛋白檢測(cè)試劑R2中各組分的及含量為：0.8％BSA、2mg/ml的C-反應(yīng)蛋白免疫膠乳微球、50mmol/L的甘氨酸緩沖液(pH＝7.4)、0.1％Proclin300；C-反應(yīng)蛋白校準(zhǔn)品中各組分及含量為：0.8％BSA、0.9％NaCl、20mg/L的C-反應(yīng)蛋白、50mmol/L的甘氨酸緩沖液、0.1％Proclin300。其中，C-反應(yīng)蛋白檢測(cè)試劑R2的制備步驟如下：1、向100mL的C-反應(yīng)蛋白免疫膠乳微球1的溶液中加入50mL封閉液，25℃震蕩2h，然后轉(zhuǎn)入4℃震蕩24h，震蕩速度為50r/min，得到膠乳溶液；封閉液組分為：3％w/v的BSA、100mmol/L的甘氨酸緩沖液(pH＝8.5不含防腐劑)。2、膠乳溶液以15000r/min離心30～45min，去掉上清液，然后加入含有Proclin300成分的貯存液至貯存濃度，超聲分散即得。實(shí)施例6以實(shí)施例1制備的C-反應(yīng)蛋白免疫膠乳微球1為原料，制備膠乳增強(qiáng)免疫比濁法測(cè)定C-反應(yīng)蛋白的試劑盒。其各組分如下：C-反應(yīng)蛋白檢測(cè)試劑R1中各組分及含量為：1％BSA、20mM乙二胺四乙酸二鈉、1.8％的NaCl、1％的TritonX-100、10mM的磷酸鹽緩沖液(PBS)、100mM的4-羥乙基哌嗪乙磺酸-氫氧化鈉緩沖液(Hepes)、1％的PEG6000、0.02％的硫柳汞；C-反應(yīng)蛋白檢測(cè)試劑R2中各組分的含量為：5％的丙三醇、1mg/ml的C-反應(yīng)蛋白免疫膠乳微球、10mM的3-(N-嗎啉基)-2-羥基丙磺酸-氫氧化鈉緩沖液(Mopso)、0.04％的硫柳汞；C-反應(yīng)蛋白校準(zhǔn)品中各組分的含量為：1％的TritonX-100、20mg/L的C-反應(yīng)蛋白、200mM的硼酸鹽緩沖液(BBS)、0.04％的硫柳汞；其中，C-反應(yīng)蛋白檢測(cè)試劑R2的制備步驟如下：1、向100mL的C-反應(yīng)蛋白免疫膠乳微球1的溶液中加入50mL封閉液，25℃震蕩2h，然后轉(zhuǎn)入4℃震蕩24h，震蕩速度為50r/min，得到膠乳溶液；封閉液中含丙三醇和3-(N-嗎啉基)-2-羥基丙磺酸-氫氧化鈉緩沖液(Mopso)。2、膠乳溶液以15000r/min離心30～45min，去掉上清液，然后加入含有硫柳汞成分的貯存液至貯存濃度1mg/mL，超聲分散即得。實(shí)施例7以實(shí)施例1制備的C-反應(yīng)蛋白免疫膠乳微球1為原料，制備膠乳增強(qiáng)免疫比濁法測(cè)定C-反應(yīng)蛋白的試劑盒。其各組分如下：C-反應(yīng)蛋白檢測(cè)試劑R1中各組分的含量為：10mM乙二胺四乙酸二鈉、50mmol/L的甘氨酸緩沖液、6％的硫酸葡聚糖、0.08％的NaN3；C-反應(yīng)蛋白檢測(cè)試劑R2中各組分的含量為：1.8％的NaCl、3％BSA、20mM乙二胺四乙酸二鈉、1％的TritonX-100、10％的丙三醇、5mg/ml的C-反應(yīng)蛋白免疫膠乳微球、110mM的Tris、0.05％的Proclin300；C-反應(yīng)蛋白校準(zhǔn)品中各組分的含量為：1％的NaCl、20mg/L的C-反應(yīng)蛋白、50mM的磷酸鹽緩沖液(PBS)、0.02％的NaN3；其中，C-反應(yīng)蛋白檢測(cè)試劑R2的制備步驟如下：1、向100mL的C-反應(yīng)蛋白免疫膠乳微球1的溶液中加入50mL封閉液，25℃震蕩2h，然后轉(zhuǎn)入4℃震蕩24h，震蕩速度為50r/min，得到膠乳溶液；封閉液中含NaCl、BSA、乙二胺四乙酸二鈉、TritonX-100、丙三醇及Tris。2、膠乳溶液以15000r/min離心30～45min，去掉上清液，然后加入含有Proclin300成分的貯存液至貯存濃度5mg/mL，超聲分散即得。試驗(yàn)例一、C-反應(yīng)蛋白免疫膠乳微球偶聯(lián)效率及活性檢測(cè)(1)準(zhǔn)備4份50mg的CRP多克隆抗體及4份粒徑120nm的聚苯乙烯膠乳顆粒，三份采用實(shí)施例1～3所提供的制備方法，制得C-反應(yīng)蛋白免疫膠乳微球1～3；(2)另一份采用現(xiàn)有C-反應(yīng)蛋白免疫膠乳微球的制備方法，制得對(duì)照C-反應(yīng)蛋白免疫膠乳微球；對(duì)照C-反應(yīng)蛋白免疫膠乳微球的制備方法步驟如下：1)取5ml的表面帶有羧基基團(tuán)的聚苯乙烯膠乳顆粒(顆粒直徑120nm)用50mM的pH＝6.0的2-嗎啉乙磺酸緩沖液稀釋至50ml，終濃度為1％w/v。2)再加入0.5％w/v的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽和0.5％w/v的硫代N羥基琥珀酰胺進(jìn)行活化膠乳，37℃水浴1小時(shí)。3)離心，去上清液(含殘留活化交聯(lián)劑)，用2-嗎啉乙磺酸緩沖液清洗一遍，再加入50mg的CRP多克隆抗體進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)，37℃水浴4小時(shí)，即得。(3)對(duì)C-反應(yīng)蛋白免疫膠乳微球1～3和對(duì)照C-反應(yīng)蛋白免疫膠乳微球分別離心分離，以收集上清中未偶聯(lián)的抗體，然后再對(duì)上述微球分別加入封閉液，封閉膠乳表面殘留活化位點(diǎn)。針對(duì)上述免疫乳膠微球的檢測(cè)試驗(yàn)如下：1、通過(guò)在封閉前離心分離未偶聯(lián)的抗體，采用BCA蛋白濃度測(cè)定法得到未偶聯(lián)抗體的質(zhì)量，即可求出偶聯(lián)效率，得到實(shí)施例1～3的制備方法偶聯(lián)效率分別為93％、88％、90％，而現(xiàn)有制備方法的偶聯(lián)效率為78.4％。2、通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)上述已封閉的免疫膠乳微球的抗體效價(jià)，計(jì)算得出C-反應(yīng)蛋白免疫膠乳微球1～3的活性分別為1：3200、1:1600和1:3200，對(duì)照C-反應(yīng)蛋白免疫膠乳微球的活性為1:400。上述試驗(yàn)證明本發(fā)明方法既保證了抗體的偶聯(lián)效率，同時(shí)極大程度的降低了活化劑對(duì)抗體活性的破壞。二、試劑盒在蛋白分析儀上的應(yīng)用1、將實(shí)施例4中的C-反應(yīng)蛋白校準(zhǔn)品配置成5個(gè)濃度梯度和一個(gè)空白對(duì)照，采用透射比濁蛋白分析儀進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)步驟為：將10ul的各校準(zhǔn)品分別加入到裝有400ul的C-反應(yīng)蛋白檢測(cè)試劑R1試劑和攪拌子的比色杯中，將比色杯放入檢測(cè)口，儀器自動(dòng)檢測(cè)到比色杯，再加入80ulC-反應(yīng)蛋白檢測(cè)試劑R2試劑加入到比色杯中，儀器自動(dòng)攪拌混勻10s，測(cè)定吸光度OD1，反應(yīng)1min后，測(cè)定吸光度OD2，儀器自動(dòng)計(jì)算吸光度的差值：△OD＝OD2-OD1。每個(gè)濃度檢測(cè)5次，測(cè)得的各濃度校準(zhǔn)品的△OD的平均值作縱坐標(biāo)，相應(yīng)的濃度作橫坐標(biāo)，制作濃度-吸光度差值校準(zhǔn)曲線，通過(guò)excel計(jì)算得到曲線方程為Y＝0.0331X+0.0032。2、然后放入待測(cè)品1人的血漿，測(cè)定得到其吸光度差值△OD，然后根據(jù)上述濃度-吸光度差值校準(zhǔn)曲線，計(jì)算得到待測(cè)品1中C-反應(yīng)蛋白的濃度。3、同一份人血待測(cè)品1稀釋100倍，然后采用實(shí)施例4的試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)定得到其吸光度差值，然后根據(jù)上述濃度-吸光度差值校準(zhǔn)曲線，計(jì)算得到人血待測(cè)品1稀釋100倍后，其中C-反應(yīng)蛋白的濃度。重復(fù)上述人血待測(cè)品1檢測(cè)5次，所得的結(jié)果見(jiàn)下表1表1人血待測(cè)品中CRP濃度檢測(cè)重復(fù)試驗(yàn)4、同一份人血待測(cè)品1再采用實(shí)施例5～7的試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)定得到其吸光度差值，然后根據(jù)各個(gè)試劑盒的濃度-吸光度差值校準(zhǔn)曲線，計(jì)算得到待測(cè)品1中C-反應(yīng)蛋白的濃度，重復(fù)5次取平均值，并計(jì)算Cv％，所得的結(jié)果見(jiàn)下表2。表1不同試劑盒針對(duì)同一人血待測(cè)品檢測(cè)試驗(yàn)試劑盒實(shí)施例編號(hào)實(shí)施例4實(shí)施例5實(shí)施例6實(shí)施例7人血待測(cè)品中CRP濃度17.27mg/L17.25mg/L17.40mg/L17.18mg/LCv％0.57％0.61％3.04％3.56％上述試驗(yàn)表明，本發(fā)明的試劑盒線性范圍在0.1～20mg/L，靈敏度高、定量準(zhǔn)確、重復(fù)性好、性質(zhì)穩(wěn)定。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3