本發(fā)明涉及免疫檢測領(lǐng)域，特別是指一種人類血型檢測試劑盒及其制備方法。

背景技術(shù)：

血型是指血液成分(包括紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血小板及血漿蛋白)表面的抗原類型。通常所說的血型是指紅細(xì)胞膜上特異性抗原類型，而與臨床關(guān)系最密切，人們所熟知的是紅細(xì)胞ABO血型系統(tǒng)及Rh血型系統(tǒng)。

早期ABO血型及Rh血型實驗室檢測方法主要有血凝試驗、微柱凝膠試驗，上述方法已廣泛應(yīng)用于臨床血型鑒定以及輸血科交叉配血等。近年建立了如流式細(xì)胞技術(shù)、酶聯(lián)免疫吸附試驗、膠體金凝集技術(shù)等實驗室檢測方法。其中，血凝試驗是指抗體和紅細(xì)胞在液體介質(zhì)中發(fā)生肉眼可見的凝集反應(yīng)，主要分為玻片法、試管法、全自動微板法。微柱凝膠試驗采用凝膠技術(shù)進行抗球蛋白試驗，該方法可提高試驗的靈敏度及特異性。目前微柱凝膠試驗在國外輸血領(lǐng)域已逐漸作為常規(guī)應(yīng)用于ABO及Rh血型定型，未知血型抗體篩查以及直接抗球蛋白試驗。

然而，現(xiàn)有技術(shù)中血凝試驗、微柱凝膠試驗、膠體金凝集技術(shù)均為反定性產(chǎn)品，檢測結(jié)果需要進行反向推斷才能判定結(jié)果，且操作較為繁瑣，檢測過程受認(rèn)為因素干擾較多。同時，流式細(xì)胞術(shù)、酶聯(lián)免疫檢測，需要有專業(yè)人員進行操作，并且需要特殊設(shè)備進行判讀。此外，上述傳統(tǒng)方法使用的血液樣本不能出現(xiàn)溶血，溶血樣本會干擾檢測結(jié)果，導(dǎo)致錯誤判讀。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提出一種人類血型檢測試劑盒，可同時檢測ABO及Rh血型，檢測結(jié)果直觀，并可用于檢測溶血樣本，具有高靈敏性、特異性與穩(wěn)定性。

基于上述目的本發(fā)明提供的人類血型檢測試劑盒包括檢測條，所述檢測 條包括金結(jié)合物墊和反應(yīng)膜，所述金結(jié)合物墊包被有膠體金標(biāo)記的鼠抗人A抗原單克隆抗體、膠體金標(biāo)記的鼠抗人B抗原單克隆抗體和膠體金標(biāo)記的鼠抗人D抗原單克隆抗體；所述反應(yīng)膜包括包被有鼠抗人B抗原單克隆抗體的B抗原檢測線、包被有鼠抗人A抗原單克隆抗體的A抗原檢測線、包被有鼠抗人D抗原單克隆抗體的Rh檢測線和包被有羊抗鼠IgG多克隆抗體的質(zhì)控線。

可選的，所述鼠抗人B抗原單克隆抗體的濃度為1.0-5.0mg/mL，所述鼠抗人A抗原單克隆抗體的濃度為1.0-5.0mg/mL，所述鼠抗人D抗原單克隆抗體濃度為1.0-10.0mg/mL。

可選的，所述羊抗鼠IgG多克隆抗體濃度為4.0-10.0mg/mL。

可選的，還包括樣本稀釋液，該樣本稀釋液為磷酸鹽緩沖液。

較佳的，所述檢測條放置于長方形塑料盒中，構(gòu)成檢測卡，該檢測卡上設(shè)有樣品孔和檢測孔，所述樣品孔與所述檢測條的所述樣品墊位置對應(yīng)，所述檢測孔對應(yīng)所述檢測條的所述檢測線和所述質(zhì)控線。

基于相同的發(fā)明構(gòu)思，本發(fā)明還提供了上述人類血型檢測試劑盒的制備方法，包括以下步驟：

(1)反應(yīng)膜的制備：

稀釋所述鼠抗人B抗原單克隆抗體、鼠抗人A抗原單克隆抗體、鼠抗人D抗原單克隆抗體和所述羊抗鼠IgG多克隆抗體，并噴涂至所述反應(yīng)膜上，分別形成所述B抗原檢測線、A抗原檢測線、Rh檢測線與質(zhì)控線，干燥備用；

(2)金結(jié)合物墊的制備：

將所述鼠抗人B抗原單克隆抗體、鼠抗人A抗原單克隆抗體、鼠抗人D抗原單克隆抗體分別與膠體金進行偶聯(lián)制得膠體金標(biāo)記的鼠抗人B抗原單克隆抗體溶液、膠體金標(biāo)記的鼠抗人A抗原單克隆抗體溶液、膠體金標(biāo)記的鼠抗人D抗原單克隆抗體溶液，均調(diào)整濃度，并混合為混合液，該混合液浸泡所述金結(jié)合物墊，鋪金，干燥備用；

(3)切割裝配：將所述反應(yīng)膜、金結(jié)合物墊、粗纖維濾紙、樣品墊裝配至所述反應(yīng)板，切割后形成所述檢測條。

可選的，所述鼠抗人A抗原單克隆抗體和鼠抗人B抗原單克隆抗體分別通過以下步驟制備獲得：

(1)取正常人的紅細(xì)胞，洗滌、離心后取上清；

(2)懸液免疫BALB/C小鼠，取脾臟，獲得脾淋巴細(xì)胞懸液備用；

(3)骨髓瘤細(xì)胞與脾淋巴細(xì)胞通過聚乙二醇融合；

(4)選擇培養(yǎng)基初步篩選、抗原特異性篩選及有限稀釋、克隆化。

可選的，所述膠體金標(biāo)記的鼠抗人A抗原單克隆抗體、膠體金標(biāo)記的鼠抗人B抗原單克隆抗體、膠體金標(biāo)記的鼠抗人B抗原單克隆抗體的制備包括以下步驟：

(1)使用碳酸鉀溶液調(diào)節(jié)膠體金pH值至8.0-9.0；

(2)加入單克隆抗體，攪拌；

(3)加入10％牛血清白蛋白溶液，攪拌；

(4)離心，棄去上清液；

(5)加入膠體金結(jié)合物稀釋液，即得。

較佳的，使用碳酸鉀溶液調(diào)節(jié)膠體金pH值至8.5。

可選的，所述膠體金標(biāo)記的鼠抗人B抗原單克隆抗體溶液、膠體金標(biāo)記的鼠抗人A抗原單克隆抗體溶液、膠體金標(biāo)記的鼠抗人D抗原單克隆抗體溶液，均調(diào)整濃度至6-10μg/mL，混合為混合液。

從上面所述可以看出，本發(fā)明提供的人類血型檢測試劑盒具有快速、簡便、不需特殊設(shè)備，適用廣泛，特異性好，靈敏度高?？赏瑫r檢測ABO和Rh血型。整個操作時間僅需3-5分鐘，檢測結(jié)果直觀，適用于臨床檢測、現(xiàn)場調(diào)查等。并且，本發(fā)明可對溶血樣本進行檢測，溶血樣本與未溶血樣本檢測結(jié)果無明顯差異，有效控制臨床應(yīng)用過程中因溶血造成的錯誤判讀，避免患者后期診療過程中輸入錯誤血型的高危風(fēng)險。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實施例人類血型檢測試劑盒中檢測條的結(jié)構(gòu)示意圖；

圖2為本發(fā)明實施例人類血型檢測試劑盒中檢測卡的結(jié)構(gòu)示意圖。

具體實施方式

為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點更加清楚明白，以下結(jié)合具體實施例，并參照附圖，對本發(fā)明進一步詳細(xì)說明。

實施例1；人類血型檢測試劑盒

在本實施例中，所述人類血型檢測試劑盒，包括檢測條或檢測卡、樣本 稀釋液。圖1為本發(fā)明實施例人類血型檢測試劑盒中檢測條的結(jié)構(gòu)示意圖，如圖1所示，所述檢測條包括反應(yīng)板1，以及粘附于所述反應(yīng)板上1的樣品墊2、金結(jié)合物墊3、反應(yīng)膜4、粗纖維濾紙5。在本實施例中，所述金結(jié)合物墊3包被有膠體金標(biāo)記的鼠抗人A抗原單克隆抗體、膠體金標(biāo)記的鼠抗人B抗原單克隆抗體和膠體金標(biāo)記的鼠抗人D抗原單克隆抗體。

在本實施例中，所述反應(yīng)膜4為硝酸纖維素膜，包括B抗原檢測線6、A抗原檢測線7，Rh檢測線8、質(zhì)控線9。B抗原檢測線6包被有鼠抗人B抗原單克隆抗體，A抗原檢測線7包被有鼠抗人A抗原單克隆抗體，Rh檢測線8包被有鼠抗人D抗原單克隆抗體。

在本實施例中，所述鼠抗人A抗原單克隆抗體的濃度為1.0-5.0mg/mL。較佳地，所述鼠抗人A抗原單克隆抗體濃度為1.5mg/mL。該鼠抗人A抗原單克隆抗體是無色澄清透明溶液；用聚丙烯酰氨凝膠電泳(SDS-PAGE)測定，上樣量為10μL時，該鼠抗人A抗原單克隆抗體顯示為重鏈和輕鏈各一條帶。

在本實施例中，所述鼠抗人B抗原單克隆抗體的濃度為1.0-5.0mg/mL。較佳地，所述鼠抗人B抗原單克隆抗體濃度為1.5mg/mL。鼠抗人B抗原單克隆抗體是無色澄清透明溶液，用聚丙烯酰氨凝膠電泳(SDS-PAGE)測定，上樣量為10μL時，該鼠抗人B抗原單克隆抗體顯示為重鏈和輕鏈各一條帶。

在本實施例中，所述鼠抗人D抗原單克隆抗體濃度為1.0-10.0mg/mL。較佳地，所述鼠抗人D抗原單克隆抗體濃度為1.5mg/mL。該鼠抗人D抗原單克隆抗體是無色澄清透明溶液。用聚丙烯酰氨凝膠電泳(SDS-PAGE)測定，上樣量為10μL時，該抗體顯示為重鏈和輕鏈各一條帶?？蛇x地，該單克隆抗體購自北京萬域美瀾科技有限公司。

在本實施例中，所述質(zhì)控線9包被有羊抗鼠IgG多克隆抗體。作為一個較佳的實施例，所述羊抗鼠IgG多克隆抗體包被前為無色透明液體，濃度為4.0-10.0mg/mL。較佳地，所述羊抗鼠IgG多克隆抗體濃度為4mg/mL?？蛇x地，該單克隆抗體購自北京萬域美瀾科技有限公司。

在本實施例中，所述樣本稀釋液為20mM，pH值為7.4的磷酸鹽緩沖液。

圖2為本發(fā)明實施例人類血型檢測試劑盒中檢測卡的結(jié)構(gòu)示意圖，如圖 2所示，作為一個可選的實施例，所述檢測條放置于特定的長方形塑料盒中，構(gòu)成所述檢測卡，該檢測卡上設(shè)有一樣品孔10和檢測孔11。所述樣品孔10用于滴加實驗樣品，與所述檢測條的樣品墊2位置對應(yīng)；檢測孔11對應(yīng)檢測條的B抗原檢測線6、A抗原檢測線7、Rh檢測線8和質(zhì)控線9，通過檢測孔11可以觀察到所述反應(yīng)膜4上B抗原檢測線6、A抗原檢測線7、Rh檢測線8和質(zhì)控線9的變化。

實施例2：人類血型檢測試劑盒的制備方法

在反應(yīng)膜4上，利用鼠抗人B抗原單克隆抗體包被B抗原檢測線6，鼠抗人A抗原單克隆抗體包被A抗原檢測線7，鼠抗人D抗原單克隆抗體包被Rh檢測線8，重組幽門螺桿菌抗原包被作為檢測線；利用羊抗鼠IgG多克隆抗體包被質(zhì)控線9；標(biāo)記膠體金的鼠抗人B抗原單克隆抗體、標(biāo)記膠體金的鼠抗人A抗原單克隆抗體、標(biāo)記膠體金的鼠抗人D抗原單克隆抗體混合包被金結(jié)合物墊3，組裝即得檢測條。

(1)反應(yīng)膜的制備：

用包被稀釋液分別將鼠抗人B抗原單克隆抗體、鼠抗人A抗原單克隆抗體、鼠抗人D抗原單克隆抗體稀釋至最佳包被濃度0.5-1.5mg/mL；用包被稀釋液將羊抗鼠IgG多克隆抗體稀釋至最佳包被濃度1-3mg/mL；用點膜機將4種包被液分別噴到反應(yīng)膜4上，噴點量為0.1μL/mm，分別形成所述B抗原檢測線6、A抗原檢測線7、Rh檢測線8和質(zhì)控線9；將已包被的反應(yīng)膜4于37℃干燥3小時，并于室溫保存。

較佳地，用包被稀釋液分別將鼠抗人B抗原單克隆抗體、鼠抗人A抗原單克隆抗體、鼠抗人D抗原單克隆抗體稀釋至最佳包被濃度1mg/mL；用包被稀釋液將羊抗鼠IgG多克隆抗體稀釋至最佳包被濃度2mg/mL。在該濃度時，反應(yīng)膜質(zhì)控線和檢測線顯色效果較好，且靈敏度，特異性較好。

所述包被稀釋液為0.05M的磷酸鹽緩沖液。所述包被稀釋液為無色、澄清、透明液體且無懸浮物。將該緩沖液用純化水兩倍稀釋，用PH計測定PH值為7.3-7.5。將該緩沖液用純化水兩倍稀釋，用電導(dǎo)率儀測定電導(dǎo)率為9000-14000μs/cm。

鼠抗人A抗原單克隆抗體和鼠抗人B抗原單克隆抗體通過以下步驟制備獲得：

1)取正常人的紅細(xì)胞，洗滌、離心后取上清；

2)懸液免疫BALB/C小鼠，取脾臟，獲得脾淋巴細(xì)胞懸液備用；

3)骨髓瘤細(xì)胞與脾淋巴細(xì)胞通過聚乙二醇融合；

4)選擇培養(yǎng)基初步篩選、抗原特異性篩選及有限稀釋、克隆化。

具體地，所述鼠抗人A抗原單克隆抗體通過以下方法制備獲得：

取正常人的A型紅細(xì)胞，用生理鹽水洗滌3次，每次1000r/min離心10min取上清。將上清(懸液)用生理鹽水稀釋至10％的懸液免疫BALB/C小鼠(腹腔注射0.5ml/只)共3次，每次間隔10天，最后一次注射3天后小鼠拉頸處死，無菌取脾臟，培養(yǎng)液洗一次，脾臟研碎，過不銹鋼篩網(wǎng)。離心，細(xì)胞用培養(yǎng)液洗2次。脾淋巴細(xì)胞懸液備用。

取對數(shù)生長SP2/0骨髓瘤細(xì)胞離心，用無血清培養(yǎng)液洗滌2次后用于融合。按1：5的比例混合脾淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞，用無血清不完全培養(yǎng)液洗1次，離心1000rpm，10min；棄上清，吸凈殘留液體。在90s內(nèi)于37℃水浴中加入0.2ml 50％聚乙二醇4000(PEG4000)，37℃繼續(xù)溫育90s，然后1000r/min離心6min，用無血清RPMI1640培養(yǎng)基終止其反映，然后離心10min(1000r/min)，去上清，加入20％1640-HAT培養(yǎng)基40ml，混勻后加入4塊96孔組織培養(yǎng)板中，置于37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，10-15天后，用A、B、O三型紅細(xì)胞檢測培養(yǎng)孔上清的凝集情況，篩選出對A型細(xì)胞凝集、對B、O型細(xì)胞不凝集的陽性孔，然后用有限稀釋法克隆化。

腹腔注射0.5ml液體石蠟于BALB/C鼠，1-2周后腹腔注射雜交瘤細(xì)胞，接種細(xì)胞7-10天后(小鼠頻于死亡之前)處死小鼠，用無菌注射器抽提腹水。1000r/min 10min離心后取上清進行凍存包藏。

具體地，所述鼠抗人B抗原單克隆抗體通過以下方法制備獲得：

取正常人的B型紅細(xì)胞，用生理鹽水洗滌3次，每次1000r/min離心10min取上清。將上清(懸液)用生理鹽水稀釋至10％的懸液免疫BALB/C小鼠(腹腔注射0.5ml/只)共3次，每次間隔10天，最后一次注射3天后小鼠拉頸處死，無菌取脾臟，培養(yǎng)液洗一次，脾臟研碎，過不銹鋼篩網(wǎng)。離心，細(xì)胞用培養(yǎng)液洗2次。脾淋巴細(xì)胞懸液備用。

取對數(shù)生長SP2/0細(xì)胞離心，用無血清培養(yǎng)液洗滌2次后用于融合。按1：5的比例混合脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞，用無血清不完全培養(yǎng)液洗1次，離心1000rpm，10min；棄上清，吸凈殘留液體。在90s內(nèi)于37℃水浴中加入0.2ml 50％PEG4000，37℃繼續(xù)溫育90s，然后1000r/min離心6min，用無血 清RPMI1640培養(yǎng)基終止其反映，然后離心10min(1000r/min)，去上清，加入20％1640-HAT培養(yǎng)基40ml，混勻后加入4塊96孔組織培養(yǎng)板中，置于37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，10-15天后，用A、B、O三型紅細(xì)胞檢測培養(yǎng)孔上清的凝集情況，篩選出對B型細(xì)胞凝集、對A、O型細(xì)胞不凝集的陽性孔，然后用有限稀釋法克隆化。

腔注射0.5ml液體石蠟于BALB/C鼠，1-2周后腹腔注射雜交瘤細(xì)胞，接種細(xì)胞7-10天后(小鼠頻于死亡之前)處死小鼠，用無菌注射器抽提腹水。1000r/min 10min離心后取上清進行凍存包藏。

(2)金結(jié)合物墊的制備：

分別將鼠抗人B抗原單克隆抗體、鼠抗人A抗原單克隆抗體、鼠抗人D抗原單克隆抗體與膠體金進行偶聯(lián)制得膠體金標(biāo)記的鼠抗人B抗原單克隆抗體溶液、膠體金標(biāo)記的鼠抗人A抗原單克隆抗體溶液、膠體金標(biāo)記的鼠抗人D抗原單克隆抗體溶液。將上述3種膠體金標(biāo)記的單克隆抗體溶液分別按混合后最佳濃度6-10μg/mL調(diào)整并混合，以1-3mL/條，浸泡所述金結(jié)合物墊，鋪金，37℃干燥3小時，并于室溫保存。

較佳地，所述3種膠體金標(biāo)記的單克隆抗體溶液分別按混合后最佳濃度8μg/mL調(diào)整并混合，以1.5mL/條，浸泡所述金結(jié)合物墊，鋪金。該濃度時試紙條的特異性和敏感性較好，靈敏度較高。

在本實施例中，膠體金標(biāo)記的鼠抗人B抗原單克隆抗體的制備步驟如下：

1)用0.1M碳酸鉀溶液調(diào)節(jié)膠體金PH值至8.0-9.0；

2)加入6-20μg/mL鼠抗人B抗原單克隆抗體，攪拌40分鐘；

3)再加入10％的牛血清白蛋白至終濃度為1％，攪拌15分鐘；

4)12000rpm/min，4℃離心15分鐘，小心棄去上清液；

5)加入原體積(原體積以膠體金體積計算)的1/2體積的膠體金結(jié)合物稀釋液。

較佳地，步驟1)中用0.1M碳酸鉀溶液調(diào)節(jié)膠體金PH值至8.5。該PH值試紙條效果較好，穩(wěn)定性好。

較佳地，步驟2)中，加入10μg/mL鼠抗人B抗原單克隆抗體。該濃度時膠體金與鼠抗人B抗原單克隆抗體結(jié)合充分，且穩(wěn)定，原料利用率高，制備出的試紙條穩(wěn)定、效果佳。

在本實施例中，膠體金標(biāo)記的鼠抗人A抗原單克隆抗體的制備步驟如下：

1)用0.1M碳酸鉀溶液調(diào)節(jié)膠體金PH值至8.0-9.0；

2)加入6-20μg/mL鼠抗人A抗原單克隆抗體，攪拌40分鐘；

3)再加入10％的牛血清白蛋白至終濃度為1％，攪拌15分鐘；

4)12000rpm/min，4℃離心15分鐘，小心棄去上清液；

5)加入原體積(原體積以膠體金體積計算)的1/2體積的膠體金結(jié)合物稀釋液。

較佳地，步驟1)中用0.1M碳酸鉀溶液調(diào)節(jié)膠體金PH值至8.5。該PH值試紙條效果較好，穩(wěn)定性好。

較佳地，步驟2)中，加入10μg/mL鼠抗人A抗原單克隆抗體。該濃度時膠體金與鼠抗人A抗原單克隆抗體結(jié)合充分，且穩(wěn)定，原料利用率高，制備出的試紙條穩(wěn)定、效果佳。

在本實施例中，膠體金標(biāo)記的鼠抗人D抗原單克隆抗體的制備步驟如下：

1)用0.1M碳酸鉀溶液調(diào)節(jié)膠體金PH值至8.0-9.0；

2)加入6-20μg/mL鼠抗人D抗原單克隆抗體，攪拌40分鐘；

3)再加入10％的牛血清白蛋白至終濃度為1％，攪拌15分鐘；

4)12000rpm/min，4℃離心15分鐘，小心棄去上清液；

5)加入原體積(原體積以膠體金體積計算)的1/2體積的膠體金結(jié)合物稀釋液。

較佳地，步驟1)中用0.1M碳酸鉀溶液調(diào)節(jié)膠體金PH值至8.5。該PH值試紙條效果較好，穩(wěn)定性好。

較佳地，步驟2)中，加入10μg/mL鼠抗人D抗原單克隆抗體。該濃度時膠體金與鼠抗人D抗原單克隆抗體結(jié)合充分，且穩(wěn)定，原料利用率高，制備出的試紙條穩(wěn)定、效果佳。

以上所述膠體金結(jié)合物稀釋液是將磷酸氫二鈉5.372g、磷酸二氫鈉0.78g、牛血清白蛋白5g、氯化鈉8.5g、酪蛋白0.5g溶于1L去離子水中，混勻制備而成。

(3)切割裝配：在內(nèi)包間內(nèi)將反應(yīng)膜、金結(jié)合物墊、粗纖維濾紙、樣品墊裝配成反應(yīng)板，再用切割機切成4mm寬的檢測條組裝成成品。

實施例3：人類血型檢測試劑盒的檢測方法

1.檢測前準(zhǔn)備：檢驗前將試劑盒和樣本恢復(fù)至室溫。實驗濕度應(yīng)小于60％，實驗溫度為18-30℃。

2.樣本準(zhǔn)備：全血為指尖采血或者采用靜脈采血。全血樣本采集后不做保存，即采即用。

3.檢測條檢測方法

(1)從原包裝鋁箔袋中取出檢測條，平置于臺面上；

(2)取20μL全血，加到檢測條樣品墊2處，再加樣本稀釋液100μL(約2-3滴)；

(3)3-5分鐘內(nèi)判讀結(jié)果，10分鐘后檢驗結(jié)果無效。

(4)檢測結(jié)果判定：

ABO血型系統(tǒng)判定(B抗原檢測線6、A抗原檢測線7、質(zhì)控線9有參照意義)：

A型血：質(zhì)控線9和A抗原檢測線7位置各出現(xiàn)一條紅色條帶。

B型血：質(zhì)控線9和B抗原檢測線6位置各出現(xiàn)一條紅色條帶。

AB型血：質(zhì)控線9、A抗原檢測線7和B抗原檢測線6位置各出現(xiàn)一條紅色條帶。

O型血：只在質(zhì)控線9位置出現(xiàn)一條紅色條帶。

無效：質(zhì)控線9位置沒有出現(xiàn)紅色條帶。

RhD血型系統(tǒng)判定(Rh檢測線8、質(zhì)控線9有參照意義)：

RhD陽性血：質(zhì)控線9和Rh檢測線8位置各出現(xiàn)一條紅色條帶。

RhD陰性血：只在質(zhì)控線9位置出現(xiàn)一條紅色條帶。

無效：質(zhì)控線9位置沒有出現(xiàn)紅色條帶

4.檢測卡檢測方法

(1)從鋁箔袋中取出檢測卡，放在水平工作臺面上平置，并做好樣本標(biāo)記；

(2)取20μL全血樣本，直接加入到加樣孔10中，再加樣本稀釋液100μL(約2-3滴)；

(3)3-5分鐘內(nèi)判讀結(jié)果，10分鐘后檢驗結(jié)果無效。

(4)檢測結(jié)果判定：

ABO血型系統(tǒng)判定(B抗原檢測線6、A抗原檢測線7、質(zhì)控線9有參 照意義)：

A型血：質(zhì)控線9和A抗原檢測線7位置各出現(xiàn)一條紅色條帶。

B型血：質(zhì)控線9和B抗原檢測線6位置各出現(xiàn)一條紅色條帶。

AB型血：質(zhì)控線9、A抗原檢測線7和B抗原檢測線6位置各出現(xiàn)一條紅色條帶。

O型血：只在質(zhì)控線9位置出現(xiàn)一條紅色條帶。

無效：質(zhì)控線9位置沒有出現(xiàn)紅色條帶。

RhD血型系統(tǒng)判定(Rh檢測線8、質(zhì)控線9有參照意義)：

RhD陽性血：質(zhì)控線9和Rh檢測線8位置各出現(xiàn)一條紅色條帶。

RhD陰性血：只在質(zhì)控線9位置出現(xiàn)一條紅色條帶。

無效：質(zhì)控線9位置沒有出現(xiàn)紅色條帶

實施例4：人類血型檢測試劑盒有效性驗證

1.陰性、陽性符合率檢測：

(1)檢測10份A型血液質(zhì)控樣本(Rh型陽性)，A型及Rh型結(jié)果檢測結(jié)果均為陽性，B型為陰性。

(2)檢測10份B型血液質(zhì)控樣本(Rh型陽性)，B型及Rh型結(jié)果檢測結(jié)果均為陽性，A型為陰性。

(3)檢測10份AB型血液質(zhì)控樣本(Rh型陽性)，A型、B型及Rh型結(jié)果檢測結(jié)果均為陽性。

(4)檢測10份O型血液質(zhì)控樣本(Rh型陽性)，A型、B型及Rh型結(jié)果均為陰性。

(5)檢測4份Rh型陰性血液質(zhì)控樣本(A、B、AB、O型各一支)，Rh型結(jié)果均為陰性。其中A型Rh型陰性血液質(zhì)控樣本A型檢測結(jié)果為陽性，B型為陰性；B型Rh型陰性血液質(zhì)控樣本B型檢測結(jié)果為陽性，A型為陰性；AB型Rh型陰性血液質(zhì)控樣本A型、B型檢測結(jié)果均為陽性；O型Rh型陰性血液質(zhì)控樣本A型、B型檢測結(jié)果均為陰性。

2.靈敏度檢測：

(1)A型最低檢出限質(zhì)控樣本檢測，最低檢出限樣本原液，按1：4稀釋后檢測，A型檢測結(jié)果為陽性。

(2)B型最低檢出限質(zhì)控樣本檢測，最低檢出限樣本原液，按1：4稀釋后檢測，B型檢測結(jié)果為陽性。

(3)Rh型最低檢出限質(zhì)控樣本檢測，最低檢出限樣本原液，按1：4稀釋后檢測，Rh型檢測結(jié)果為陽性。

3.精密性檢測：

選擇AB型及Rh型陽性的樣本作為精密性質(zhì)控樣本檢測，采用10個檢測卡平行測定精密性質(zhì)控樣本，各檢測卡相同血型檢測線顯色速度及強度一致，均一性無差別。

4.特異性檢測：

紅細(xì)胞A型抗原、B型抗原與D型抗原間無干擾。

檢測含內(nèi)源性干擾物質(zhì)和潛在交叉反應(yīng)物質(zhì)的樣本，結(jié)果如下：

高甘油三酯(<10mmol/L)的樣本、高膽紅素(<200μmol/L)的樣本、以及溶血樣本不會對本發(fā)明造成干擾。

抗核抗體、抗線粒體抗體，抗雙鏈DNA抗體、乙型肝炎病毒表面抗原、丙型肝炎病毒、梅毒螺旋體、艾滋病毒、戊型肝炎病毒為陽性的樣本不會對本發(fā)明造成干擾。

5.穩(wěn)定性檢測：

在長期穩(wěn)定性實驗過程中，4～30℃干燥避光保存14月依然可以滿足產(chǎn)品性能指標(biāo)要求；加速穩(wěn)定性實驗過程中，37℃條件下，16天后檢測結(jié)果依然可以滿足產(chǎn)品性能指標(biāo)要求。

6.溶血樣本檢測：采用溶血樣本進行上述實驗，依然符合上述結(jié)果。

本發(fā)明提供的人類血型檢測試劑盒具有以下優(yōu)勢，

(1)同時檢測ABO和Rh血型

本發(fā)明提供的人類血型檢測試劑盒的反應(yīng)膜具有包被有鼠抗人B抗原單克隆抗體的B抗原檢測線、包被有鼠抗人A抗原單克隆抗體的A抗原檢測線和包被有鼠抗人D抗原單克隆抗體的Rh檢測線，可同時對ABO和Rh血型定型。

(2)檢測結(jié)果直觀

本發(fā)明提供的人類血型檢測試劑盒通過“雙抗體夾心法”直接檢測細(xì)胞表面A抗原、B抗原、D抗原，檢測線變色即表明存在相應(yīng)抗原，代表為該血型。避免了傳統(tǒng)方法檢測結(jié)果需要進行反向推斷才能判定結(jié)果，且操作較為繁瑣，檢測過程受認(rèn)為因素干擾較多等問題。

(3)操作簡便、快捷

本發(fā)明提供的人類血型檢測試劑盒操作快速、簡便、不需特殊設(shè)備，準(zhǔn)確和靈敏度高等特點，整個操作時間僅需3-5分鐘。

(4)可用于溶血樣本的檢測

由于本發(fā)明提供的人類血型檢測試劑盒直接檢測細(xì)胞表面抗原，進而可進行溶血樣本的檢測，溶血樣本與未溶血樣本檢測結(jié)果無明顯差異，有效控制臨床應(yīng)用過程中因溶血造成的錯誤判讀，避免患者后期診療過程中輸入錯誤血型的高危風(fēng)險。

可見，本發(fā)明提供的人類血型檢測試劑盒具有快速、簡便、不需特殊設(shè)備，適用廣泛，特異性好，靈敏度高?？赏瑫r檢測ABO和Rh血型。整個操作時間僅需3-5分鐘，檢測結(jié)果直觀，適用于臨床檢測、現(xiàn)場調(diào)查等。并且，本發(fā)明可對溶血樣本進行檢測，溶血樣本與未溶血樣本檢測結(jié)果無明顯差異，有效控制臨床應(yīng)用過程中因溶血造成的錯誤判讀，避免患者后期診療過程中輸入錯誤血型的高危風(fēng)險。

所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解：以上任何實施例的討論僅為示例性的，并非旨在暗示本公開的范圍(包括權(quán)利要求)被限于這些例子；在本發(fā)明的思路下，以上實施例或者不同實施例中的技術(shù)特征之間也可以進行組合，步驟可以以任意順序?qū)崿F(xiàn)，并存在如上所述的本發(fā)明的不同方面的許多其它變化，為了簡明它們沒有在細(xì)節(jié)中提供。因此，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所做的任何省略、修改、等同替換、改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。