專利名稱：：促卵泡激素時間分辨免疫熒光分析法及試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及促卵泡激素(FSH)定量檢測試劑盒，屬于時間分辨免疫熒光分析法檢測領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：促卵泡激素(Follicle-stimulating-honnone,FSH)是一種由垂體前葉分泌的糖蛋白，由兩條多肽鏈通過非共價鍵結(jié)合而成，分子量為37000。FSH可增強細胞色素P450的合成，使雄激素轉(zhuǎn)化為雌激素，而且FSH與LH共同調(diào)節(jié)著卵巢內(nèi)甾體激素的合成，在卵泡的成熟和黃體的生成中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。在女性FSH可促進卵泡成熟，促排卵，并在月經(jīng)周期中與LH同步變化，在男性FSH主要促進精子的生成和成熟。在絕經(jīng)期、卵巢切除術(shù)后及早熟性卵巢衰竭中FSH水平升高，此時給予雌激素可使FSH水平恢復正常，證明其是負反饋調(diào)節(jié)機理。目前血清FSH的檢測主要有酶聯(lián)免疫法(ELISA)、免疫放射法(IRMA)。由于受示蹤劑性狀的限制，ELISA的靈敏度不高，檢測范圍有限，IRMA試劑盒受同位素半衰期的影響，有效期短，此外還有一定的放射性污染。時間分辨免疫熒光分析(time-resolvedfluoroi畫,ssay,TRFIA)利用具有獨特熒光特性的鑭系元素，代替酶、同位素等，做為發(fā)光免疫分析中的一種重要方法，具有靈敏度高、示蹤物穩(wěn)定、不受樣品自然熒光干擾、無放射性污染等許多優(yōu)點。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種用于FSH檢測的時間分辨免疫熒光分析法及試劑盒，主要解決現(xiàn)有技術(shù)存在的靈敏度低、穩(wěn)定性差、操作煩瑣及污染環(huán)境等技術(shù)問題。本發(fā)明采用銪標記技術(shù)，提供銪標記試劑盒，以提高方法的靈敏度及穩(wěn)定性。本發(fā)明的技術(shù)方案是在進行時間分辨免疫熒光分析檢測法前需完成下列準備工作首先制備包被板，所用的包被板為特異性抗體包被的板，F(xiàn)SH包被板條的制備包括以下步驟(1)將純化的FSH單克隆抗體用碳酸鹽緩沖液稀釋，然后加入包被板條各孔內(nèi)，經(jīng)吸附、洗滌、封閉、干燥后獲得FSH單克隆抗體包被板條；(2)將FSH單克隆抗體包被板條裝入專用的鋁箔包裝袋，封口并冷藏備用。其次是FSH銪標記的制備，包括以下步驟(1)取待標記抗體加入透析袋中，放入配制好的PH9.5的碳酸鹽緩沖液中，室溫透析過夜(其間多次換透析液)；(2)次日，取出抗體，稀釋至0.2-5/mL，按質(zhì)量比為2:1的比例(DTTA-Eu:抗體)邊振蕩邊加入DTTA-Eu，室溫下在振板機上慢速振蕩l小時，然后在黑暗中靜置48小時;(3)標記好的抗體與游離DTTA-Eu通過S印hadexG50色譜柱(1.5X50cm)分離，分離過程用核酸蛋白儀監(jiān)控；(4)用小試管依次分段接受流出物，用分光光度計，在280nm處測吸光度，同時測熒光強度，計算出Eu標抗體濃度；(5)加入O.3%BSA，2-8。C保存。促卵泡激素時間分辨免疫熒光分析法，包括下列步驟①固相抗體制備將抗促卵泡激素單克隆抗體用碳酸鈉緩沖溶液稀釋至l-10ug/mL作為包被液，包被反應板，并用封閉液封閉；②鑭系元素離子標記抗體制備選用配對抗促卵泡激素單克隆抗體用常規(guī)方法進行鑭系元素離子標記；③在步驟①制得的具有固相抗體的反應板上，每孔加入促卵泡激素標準品或待測樣品，以及用反應緩沖液稀釋的標記抗體進行孵育，最后進行熒光測定。步驟①中包被液中單克隆抗體的濃度為l-10ug/mL，步驟②中標記抗體用反應緩沖液以體積比為1:20稀釋。步驟②中的鑭系元素離子優(yōu)選為Eu3+。步驟③中的反應緩沖液為PH7.8的50mmol/LTris-HCl,內(nèi)含0.9%NaCl,1%BSA，0.05%牛IgG，20uMDTPA，0.08%Tween20和0.10/扁:1;且該步驟③在時間分辨熒光免疫分析儀器上自動完成。所用增強液為熒光增強液。促卵泡激素定量檢測試劑盒，其特征是試劑盒包括:包被抗體的緩沖液、封閉液、反應緩沖液、洗液、增強液，以及作為包被抗體的抗促卵泡激素單克隆抗體，鑭系元素離子標記的抗促卵泡激素單克隆抗體和促卵泡激素標準品。所述FSH標準品的制備方法為先分別將FSH凍干抗原溶解并稀釋至所需的最高濃度，再采用倍比稀釋法稀釋至所需濃度，獲得FSH標準品。用含6。/。BSA，4%糖，0.1%麵3,50匪ol/LTris-HCl緩沖液將促卵泡激素蛋白配制成標準品。本發(fā)明使用雙抗體夾心法，反應步驟包括試劑準備、加樣反應、洗滌拍干、加增強液、測熒光值。本發(fā)明的有益效果是分析靈敏度高(0.2mlU/mL)，檢測時間短(65min)，特異性好，與干擾物質(zhì)的交叉反應小。圖1為本發(fā)明的反應原理圖本發(fā)明釆用雙抗體夾心一步法?？谷薋SH單抗包被于96孔熒免板，校準品或樣品中的FSH與包被單抗及銪離子(Eu3+)標記的單抗于微孔內(nèi)表面發(fā)生免疫反應，微孔表面的夾心免疫復合物與游離標記單抗通過洗滌分離。微孔表面免疫復合物中的Eu3+被熒光增強液解離后形成穩(wěn)定的熒光配合物，熒光強度與校準品或樣品中的FSH濃度呈正比例，通過劑量一反應曲線可得出樣品中FSH濃度。圖2為本發(fā)明操作流程圖第一步稀釋銪標記物，第二步加入校準品和待測樣品，第三歩加入稀釋后的銪標記，第四步孵育，第五步洗板，第六步加入增強液，第七步檢測。具體實施例方式下面參照圖1、2通過實施例對本發(fā)明作進一步說明。實施例促卵泡激素(FSH)測定1、標準品配制用含6%BSA，4%糖，0.1%NaN3，50誦ol/LTris-HCl緩沖液將FSH蛋白酉己制成0、3、10、30、100、300mlU/mL標準液，以國家FSH標準品校正。分裝，于+2+8'C保存。2、操作步驟1)試劑的準備a)洗滌液將40mL濃縮洗液和960mL去離子水在干凈的洗液瓶中混合，作為工作洗滌液備用。b)銪標記使用前一小時內(nèi)，用分析緩沖液按l:20稀釋銪標記物。c)將試劑盒分析緩沖液、待測樣品、校準品和和所需數(shù)量的微孔反應條平衡至室溫(2025°C)。2)吸取25ul的校準品或樣品，按順序加入相應微孔底部。3)在各微孔內(nèi)加入100yl己稀釋的銪標記溶液，室溫下于慢檔振動60分鐘。4)洗板6次，將板條在潔凈的吸水紙上拍干。5)在每個微孔內(nèi)加入200wl的增強液，室溫下于慢檔振動5分鐘。6)用時間分辨熒光測定儀檢測。促卵泡激素(FSH)測定流程見表1<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>表觀FSH濃度為上表所示濃度的交叉反應物質(zhì)用本試劑檢測所得到的FSH濃度。權(quán)利要求1、促卵泡激素時間分辨免疫熒光分析法，其特征是包括下列步驟①固相抗體制備將抗促卵泡激素單克隆抗體用碳酸鈉緩沖溶液稀釋至1-10ug/mL作為包被液，包被反應板，并用封閉液封閉；②鑭系元素離子標記抗體制備選用配對抗促卵泡激素單克隆抗體用常規(guī)方法進行鑭系元素離子標記；③在步驟①制得的具有固相抗體的反應板上，每孔加入促卵泡激素標準品或待測樣品，以及用反應緩沖液稀釋的標記抗體進行孵育，最后進行熒光測定。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述促卵泡激素時間分辨免疫熒光分析法，其特征是步驟②中標記抗體用反應緩沖液以體積比為1:20稀釋。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述促卵泡激素時間分辨免疫熒光分析法，其特征是歩驟②中的鑭系元素離子為Eu3+。4、根據(jù)權(quán)利要求1所述促卵泡激素時間分辨免疫熒光分析法，其特征是步驟③中的反應緩沖液為PH7.8的50mmol/LTris-HC1，內(nèi)含0.9%NaCl，1%BSA，0.05%牛IgG，200uMDTPA，0.08%Tween20和0.1%線;且該步驟③在時間分辨熒光免疫分析儀器上自動完成。5、促卵泡激素定量檢測試劑盒，其特征是試劑盒包括:包被抗體的緩沖液、封閉液、反應緩沖液、洗液、增強液，以及作為包被抗體的抗促卵泡激素單克隆抗體，鑭系元素離子標記的抗促卵泡激素單克隆抗體和促卵泡激素標準品。6、根據(jù)權(quán)利要求5所述的促卵泡激素定量檢測試劑盒，其特征是標準品為用含6%BSA，4%糖，0.1%NaN3，50腿ol/LTris-HCl緩沖液將促卵泡激素蛋白配制成標準品。全文摘要本發(fā)明公開了促卵泡激素(FSH)的時間分辨免疫熒光分析法及試劑盒，其選用抗FSH單克隆抗體作為包被抗體，用碳酸鈉緩沖溶液稀釋至1-10ug/ml作為包被液；配對抗FSH單克隆抗體用鑭系元素離子標記作為標記抗體，實驗時用反應緩沖液按1∶20稀釋使用；在包被抗體的反應板上，每孔依次加入25ul的FSH標準品或待測樣品、以及稀釋的標記抗體，孵育后進行熒光檢測。本發(fā)明還提供相應的試劑盒。本發(fā)明具有較高的靈敏度、特異性及穩(wěn)定性，且分析系統(tǒng)高度自動化，可提高臨床檢驗結(jié)果的速度，大幅度降低人為誤差和增加檢出結(jié)果的可靠性。文檔編號G01N33/74GK101614748SQ200810043548公開日2009年12月30日申請日期2008年6月25日優(yōu)先權(quán)日2008年6月25日發(fā)明者吳馮波,君沈申請人:上海新波生物技術(shù)有限公司