雌激素代謝檢測(cè)試劑盒的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種檢測(cè)女性雌激素代謝是否正常的試劑盒，包括檢測(cè)CYP1A1基因上rs4646903位點(diǎn)、CYP1B1基因上Leu432Val位點(diǎn)、COMT基因上Val158Met位點(diǎn)和GSTT1基因上Present/Null位點(diǎn)多態(tài)性的特異性引物對(duì)及特異性熒光探針對(duì)，Taq酶，dNTP混合液，MgCl2溶液，反應(yīng)緩沖液和去離子水。
【專(zhuān)利說(shuō)明】雌激素代謝檢測(cè)試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，更具體的，本發(fā)明涉及一種檢測(cè)女性雌激素代謝是否正常的試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]雌激素是一組化學(xué)結(jié)構(gòu)非常相近的類(lèi)固醇激素，由18個(gè)碳原子組成，包括一個(gè)芳香環(huán)(A環(huán))，一個(gè)位于C-3處的羥基和一個(gè)位于C-17的羥基或酮基，以及在其他一些基團(tuán)。最常見(jiàn)的天然雌激素是雌酮(El)、雌二醇(E2)和雌三醇(E3)，其中以E2的雌激素作用最強(qiáng)。通常情況下主要由女性或者雌性哺乳動(dòng)物的卵泡顆粒細(xì)胞分泌，此外兩性的腎上腺皮質(zhì)、大腦和脂肪細(xì)胞，以及雄性睪丸間質(zhì)細(xì)胞也能分泌少量雌激素。無(wú)論雄性和雌性動(dòng)物體內(nèi)都存在一定比例的雌、雄激素。
[0003]雌激素的代謝由I相代謝酶和II相代謝酶共同完成。雌二醇被CYPlAl和CYPlBl羥基化為兒茶酚雌激素，即2-0HE2和4-0HE2。兒茶酚雌激素要么經(jīng)COMT發(fā)生氧位甲基化生成 2-Me0E2、2-0H-3-Me0E2 或 4_Me0E2，要么進(jìn)一步由 CYP450 酶系氧化為半醌(E2_2，3-SQ、E2-3，4-SQ)和醌(E2-2，3_Q、E2_3，4-Q)。這些雌激素醌類(lèi)物質(zhì)經(jīng)GSTs催化，與GSH結(jié)合形成2-0HE2-l-SG、2-0HE2-4-SG或4-0HE2-2-SG。若未能經(jīng)GSTs代謝，則形成醌-DNA加合物(比如4-0HE2-N7-鳥(niǎo)嘌呤、2-0HE2-N2-脫氧鳥(niǎo)嘌呤)或者通過(guò)活性氧在半醌和醌上發(fā)生多重氧化生成氧化加合物(比如8-0H-脫氧鳥(niǎo)嘌呤)。此外，UGTs和SULTs分別向雌激素的中間代謝產(chǎn)物轉(zhuǎn)移葡萄糖醛酸基和磺基，形成水溶性化合物，被機(jī)體排出體內(nèi)
[0004]進(jìn)入圍絕經(jīng)期 是女性的一個(gè)特殊階段，受到生物、心理和社會(huì)因素的影響，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究認(rèn)為，卵巢功能衰退、性激素分泌減少、促性腺激素升高以及不適應(yīng)機(jī)體內(nèi)分泌的重新調(diào)整而引起植物神經(jīng)功能紊亂是導(dǎo)致絕經(jīng)期綜合征發(fā)病的主要原因?？茖W(xué)研究發(fā)現(xiàn)，雌激素受體廣泛分布在女性全身組織和器官的細(xì)胞膜上，當(dāng)雌激素減少時(shí)，這些組織和器官就會(huì)發(fā)生退行性變或代謝上的變化，進(jìn)而出現(xiàn)一系列神經(jīng)、內(nèi)分泌、代謝和心理的失衡，弓丨起各系統(tǒng)改變的綜合征候群。目前認(rèn)為卵巢功能衰退、雌激素分泌減少、促性腺激素升高及內(nèi)分泌平衡狀況改變是引起絕經(jīng)期綜合征的主要原因，并發(fā)現(xiàn)雌激素降低的水平與絕經(jīng)期綜合征的嚴(yán)重度基本呈正相關(guān)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明提供一種檢測(cè)女性雌激素代謝是否正常的試劑盒。
[0006]該試劑盒包括:檢測(cè)CYPlAl基因上rs4646903位點(diǎn)、CYPlBl基因上Leu432Val位點(diǎn)、COMT基因上Vall58Met位點(diǎn)和GSTTl基因上Present/Null位點(diǎn)多態(tài)性的特異性引物對(duì)及特異性熒光探針對(duì)，Taq酶，dNTP混合液，MgCl2溶液，反應(yīng)緩沖液，去離子水。
[0007]本試劑盒中所述的特異性引物和熒光探針對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是能夠輕易完成設(shè)計(jì)的，特異性引物和熒光探針對(duì)可用常規(guī)的DNA合成技術(shù)進(jìn)行合成。【具體實(shí)施方式】
[0008]下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，或按照廠商所建議的條件。
[0009]實(shí)施例檢測(cè)試劑盒的使用
[0010]步驟1:DNA模板的抽取
[0011]用硅膠吸附法抽提口腔上皮細(xì)胞的基因組DNA。
[0012]步驟2:熒光定量PCR反應(yīng)
[0013]使用檢測(cè)試劑盒中的熒光定量PCR套裝，進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，反應(yīng)的體系為總體積10 u 1，包含濃 度為20ng/ Ul的DNA模板2u、1ul IOX熒光定量PCR反應(yīng)緩沖液、
0.1 u l 25mM dNTP 混合液、0.6 u I 25mMMgCl2 溶液、0.025 u l (5units/ u I) Taq DNA 聚合酶、20 u M的有義引物和反義引物各0.225 ul、10 u M的帶VIC熒光探針和帶FAM熒光探針各0.25 yl,去尚子水5.325 ul o
[0014]在PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)條件為50°C、2分鐘，95°C、10分鐘，進(jìn)行60個(gè)循環(huán)的95°C、30秒，60°C、1分鐘。反應(yīng)結(jié)束后在熒光定量PCR儀上讀取樣品熒光量。
[0015]步驟4:基因型分析
[0016]根據(jù)試劑盒使用說(shuō)明書(shū)標(biāo)示的基因分型圖示對(duì)SNP位點(diǎn)進(jìn)行基因型分析。
[0017]熟悉熒光定量PCR技術(shù)的本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠通過(guò)辨識(shí)熒光定量PCR儀上顯示的最終樣品熒光量，根據(jù)不同序列探針熒光信號(hào)的強(qiáng)弱即可確定所檢測(cè)的SNP位點(diǎn)的基因型。
【權(quán)利要求】
1.一種檢測(cè)女性雌激素代謝是否正常的試劑盒，包括特異性引物對(duì)及特異性熒光探針對(duì)，Taq酶，dNTP混合液，MgCl2溶液，熒光定量PCR反應(yīng)緩沖液和去離子水，其特征在于:所述的特異性引物對(duì)及特異性熒光探針對(duì)是針對(duì)CYPlAl基因上rs4646903位點(diǎn)、CYPlBl基因上Leu432Val位點(diǎn)、COMT基因上Vall58Met位點(diǎn)和GSTTl基因上Present/Null位點(diǎn)多態(tài)性設(shè)計(jì)的。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103757090SQ200910200485
【公開(kāi)日】2014年4月30日 申請(qǐng)日期:2009年12月23日 優(yōu)先權(quán)日:2009年12月23日
【發(fā)明者】馮哲民, 鄒祖燁, 賀憲民 申請(qǐng)人:新靶向(上海)分子醫(yī)療技術(shù)有限公司