專利名稱：重組人促卵泡激素的純化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及蛋白的純化方法。具體而言，本發(fā)明公開了重組人促卵泡激素的純化新工藝。
背景技術(shù)：
促卵泡激素(FSH)是由垂體前葉分泌的能促進(jìn)并增強(qiáng)卵巢中的卵泡發(fā)育和成熟的最重要的內(nèi)分泌激素，可用于誘發(fā)排卵或超排卵，在男子可以促進(jìn)精子的發(fā)育。FSH同LH和絨毛膜促性腺激素(hCG) —樣都是一種異源二聚體糖蛋白，由非共價(jià)結(jié)合的α和β亞基組成，分別含有92個(gè)和111個(gè)氨基酸。糖基是以N-糖苷鍵的方式連接在α和β兩個(gè)亞基各自的區(qū)域。糖在糖蛋白激素分子中占15% 30%，主要包括甘露糖、巖藻糖和半乳糖， N —乙酰葡萄糖胺。糖鏈末端含唾液酸，與蛋白以共價(jià)鍵的方式結(jié)合，通常連接在天冬酰胺上，形成所謂的N-連糖鏈。FSH每個(gè)亞基上有2個(gè)糖基位點(diǎn)(α-亞基的分別位于第52位和第78位氨基酸殘基上，β -亞基的分別位于第7位和第24位氨基酸殘基上)，這2個(gè)位點(diǎn)還會(huì)有一些糖鏈分枝。糖鏈的組成直接影響著激素的生物學(xué)活性，采用化學(xué)或酶解的方法解離除去糖鏈，F(xiàn)SH的生物學(xué)活性降低，直到消失，且α鏈上糖鏈的解離對(duì)激素的影響比 β鏈更大。
FSH的應(yīng)用價(jià)值
由于FSH合成和分泌的不足所致的FSH濃度的不同，是男性和女性不育的主要原因。在女性中，這一狀態(tài)的特征表現(xiàn)為不排卵或排卵異常。在男性中，可能會(huì)由于沒有足夠量的有活力的精子的產(chǎn)生而導(dǎo)致不育。單獨(dú)注射FSH或者與LH合用，已被成功用于治療不育癥。以前商業(yè)化的用于治療的FSH是由尿源提取的(來自絕經(jīng)婦女的uFSH)。然而,應(yīng)用重組DNA技術(shù)生產(chǎn)的人重組FSH(rhFSH)在臨床上體現(xiàn)了更好的質(zhì)量和有效性。目前國(guó)內(nèi)該類產(chǎn)品有瑞士雪蘭諾公司生產(chǎn)的Gonal-F (果納芬)和荷蘭歐加農(nóng)公司生產(chǎn)的Puregon (普利康)。
糖蛋白激素是一類重要的生物大分子，它的分離純化，不但對(duì)研究其結(jié)構(gòu)與功能具有重要的學(xué)術(shù)意義，而且作為特殊應(yīng)用的醫(yī)藥，分離純化出大量的高活性純品，更有巨大的經(jīng)濟(jì)效益與實(shí)用價(jià)值。但是，糖蛋白激素在糖鏈上的不均一性為其色譜分離增加了難度， 概括起來包括三個(gè)方面的問題低含量、不穩(wěn)定性及不均一性。
糖蛋白激素在生物體內(nèi)的含量一般都是很低的，這就要求首先采用一定的方法進(jìn)行濃縮與富集。在酸性、熱、有機(jī)溶劑的作用下糖蛋白激素中唾液酸易于解離，亞基易于解離，這就要求必須采用中性pH、溫和及低溫的分離技術(shù)與環(huán)境。甚至冷凍干燥也會(huì)引起糖蛋白激素的失活，一般不適于在分離純化中采用這種方法進(jìn)行濃縮，而采用超濾的方法。這對(duì)于粗制原料的制備是很難能全部達(dá)到要求的。傳統(tǒng)的分離純化方法，由于太長(zhǎng)的分離時(shí)間顯然對(duì)保持生物學(xué)活性也是不利的。
目前純化重組人的FSH的文 獻(xiàn)中多數(shù)使用染料親和層析或者金屬螯合填料層析作為捕獲手段，后期通過親和層析、反相層析、離子交換層析、分子篩層析、疏水層析等多種手段、多步處理來實(shí)現(xiàn)該蛋白質(zhì)的純化。例如CN201080056651公開了反相、凝膠過濾、疏水層析等；在專利CN100554277C中提到利用陰離子交換層析和固定金屬離子層析(即金屬螯合層析)以及疏水層析對(duì)重組或天然促卵泡激素進(jìn)行純化。更多使用的捕獲手段是染料親和層析US7939296涉及陽離子交換層析、染料親和、疏水、凝膠過濾；EP1106623 A I涉及染料親和、洗滌、梯度洗脫等手段(rhFSH最終收率、生物活性等未明);CN200580037591.9涉及染料親和、疏水、反相；US2009209454層析方法包括染料親和、陰離子、疏水、強(qiáng)陰離子， CN201080022681涉及陰離子交換層析、疏水作用層析和染料親和層析且排斥弱的陰離子交換層析。另外值得注意的是，這些純化方法所涉及的陰離子交換層析采用的是吸附一洗脫模式。
反相層析需要使用有機(jī)溶劑作為蛋白質(zhì)的洗脫介質(zhì)，蛋白質(zhì)長(zhǎng)時(shí)間暴露在有機(jī)溶劑中將導(dǎo)致分子結(jié)構(gòu)不同程度的改變，嚴(yán)重的可導(dǎo)致不可逆變性，嚴(yán)重影響蛋白的生物學(xué)活性。金屬螯合層析會(huì)導(dǎo)致高濃度金屬離子引入蛋白溶液中，不同程度導(dǎo)致蛋白活性的降低，并且增加了金屬離子去除的難度。疏水層析用于促性腺激素的分離，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)活性回收率較低，具體失活機(jī)理不明，為此，開發(fā)一種減少蛋白活性喪失的FSH純化工藝具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明解決的技術(shù)問題是，提供了一種重組人促卵泡激素的純化工藝，避免了使用對(duì)蛋白活性影響較大的反相層析、金屬螯合層析或疏水層析，操作簡(jiǎn)便，蛋白活性高且收率高。
本發(fā)明的一種技術(shù)方案為
一種重組人促卵泡激素的純化方法，包括以下步驟
I)陰離子交換層析含重組人FSH的細(xì)胞培養(yǎng)物上清液，在平衡陰離子交換層析柱后上樣，收集含重組人FSH的流穿液；
2)親和層析將FSH特異的CaptureSelect親和層析柱(荷蘭BAC公司產(chǎn)品)平衡， 上樣，再用洗脫緩沖液洗脫層析柱，收集含重組人FSH的洗脫峰；
3)凝膠過濾層析平衡凝膠層析柱后上樣，收集含有重組人FSH的組分。
上述純化方法中所述陰離子交換層析柱的介質(zhì)的配基為季銨基或二乙胺乙基。優(yōu)選的陰離子交換層析柱的介質(zhì)為Q sepharose F. F或DEAE sepharose F. F。其中所述陰離子交換層析所用平衡緩沖液中含有O. 1-0. 2M NaCl, pH為7. 0-7. 5。所述陰離子交換層析所用平衡緩沖液中還可以進(jìn)一步含有O. 02-0. 05M Tris和O. 01-0.1M甲硫氨酸。
上述純化方法第二個(gè)步驟所述的親和層析中所用平衡緩沖液含有O. 02-0. 05M Tris, pH 為 7. 0-7. 5 ;洗脫重組人 FSH 的緩沖液含有 O. 02-0. 05MTris 和1. 5-2. OM MgCl2, pH 為 7. 0-7. 5。
上述純化方法中所述凝膠層析柱的介質(zhì)為分離范圍在3-600kD、適于重組人FSH 純化的凝膠，優(yōu)選米用 Superdex75、Superdex200、Sephadex G-50、Sephadex G-75 或 Sephadex G_100。所述凝膠層析所用平衡緩沖液含有0. 02-0.1M枸櫞酸鈉和O . 01-0.1M甲硫氨酸，pH為7. 0-7.5。
更進(jìn)一步說，上述純化方法的步驟I和/或步驟3中上樣前，將樣品在超濾系統(tǒng)中進(jìn)行濃縮和緩沖液置換。所述置換所用的緩沖液含O. 02-0. 05M Tris,O. 1-0. 2M NaCl和O.01-0.1M 甲硫氨酸，pH 為 7. 0-7. 5。
本發(fā)明所用原料可取自按各種方法制得的含重組人FSH的細(xì)胞培養(yǎng)物，宿主細(xì)胞可為中國(guó)倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞。
本發(fā)明提供了一種新的純化思路，利用陰離子交換、親和、凝膠過濾的層析組合即可得到純的重組人FSH，成本低，步驟少，簡(jiǎn)便易行，質(zhì)量穩(wěn)定，不存在復(fù)雜的變復(fù)性過程，避免了使用對(duì)蛋白活性影響較大的反相層析、金屬螯合層析或疏水層析；先利用流穿模式的陰離子交換，除去大量雜蛋白、色素以及部分殘留DNA、內(nèi)毒素及宿主蛋白，既保護(hù)了后續(xù)的親和填料，又實(shí)現(xiàn)了粗純與濃縮富集；親和介質(zhì)偶聯(lián)了駱駝源的抗體，載量高，只特異性地結(jié)合FSH的完整分子，而不結(jié)合單個(gè)亞基，更好地去除了降解的單體亞基；凝膠過濾可進(jìn)一步除去殘留DNA、內(nèi)毒素及宿主蛋白，還可起到去除蛋白聚體以及糖基化不足的FSH蛋白， 使FSH的純度從親和層析后得到的90%進(jìn)一步提高到了 98%。
本發(fā)明還在超濾濃縮與置換、陰離子交換、親和、凝膠過濾時(shí)均使用近中性的緩沖液，尤其是用中性緩沖液將FSH從親和柱洗脫，不采用酸液洗脫再加堿中和的傳統(tǒng)方法，因而避免了 PH劇烈變化帶來的蛋白沉淀以及糖脫落問題，保證了洗脫得到的蛋白的純度和活性；超濾置換、陰離子交換所用緩沖液中含甲硫氨酸，凝膠過濾還一并將FSH溶液置換為含甲硫氨酸的緩沖體系，避免再次濃縮置換造成的回收率下降，并可減少FSH的氧化，利于 FSH最終的保存。
本發(fā)明所述的重組人促卵泡激素的純化新工藝，經(jīng)過對(duì)重組人促卵泡激素純度驗(yàn)證與活性驗(yàn)證，并顯示了良好的實(shí)際效果。本發(fā)明制備重組人促卵泡激素與市售的促卵泡激素Puregon (普利康)經(jīng)過對(duì)照，顯示了本發(fā)明制備產(chǎn)物具有更高的生物學(xué)活性。


圖1市售的促卵泡激素Puregon (普利康)SEC-HPLC檢測(cè)圖譜。其中，縱坐標(biāo) mAU表示A214紫外吸收值，橫坐標(biāo)為時(shí)間，目的蛋白于15. Smin左右出峰。
圖2實(shí)施例1最終制備的促卵泡激素的SEC-HPLC圖譜。其中，縱坐標(biāo)mAU表示 A214紫外吸收值，橫坐標(biāo)為時(shí)間，目的蛋白于15. Smin左右出峰。
圖3實(shí)施例2最終制備的促卵泡激素的SEC-HPLC圖譜。其中，縱坐標(biāo)mAU表示 A214紫外吸收值，橫坐標(biāo)為時(shí)間，目的蛋白于15. Smin左右出峰。
圖4實(shí)施例3最終制備的促卵泡激素的SEC-HPLC圖譜。其中，縱坐標(biāo)mAU表示 A214紫外吸收值，橫坐標(biāo)為時(shí)間，目的蛋白于15. Smin左右出峰。
圖5實(shí)施例1、2 、3最終制備的促卵泡激素的以及蛋白質(zhì)Marker的SDS-PAGE電泳圖譜。
條帶1、2、3分別為實(shí)例1、2、3最終制備的重組人促卵泡激素；
條帶4 :蛋白質(zhì)Marker ；
圖6實(shí)施例1、2、3最終制備的促卵泡激素的以及蛋白質(zhì)Marker的 WesternBloting 圖譜。
條帶1、2、3分別為實(shí)例1、2、3最終制備的重組人促卵泡激素；
條帶4 :蛋白質(zhì)Marker ；
圖7實(shí)施例2最終制備的促卵泡激素的氧化亞基檢測(cè)圖譜。其中，縱坐標(biāo)mAU表示A214紫外吸收值，橫坐標(biāo)為時(shí)間。
圖8實(shí)施例3最終制備的促卵泡激素的氧化亞基檢測(cè)圖譜。其中，縱坐標(biāo)mAU表示A214紫外吸收值，橫坐標(biāo)為時(shí)間。
圖9含有氧化產(chǎn)物的rhFSH樣品的氧化亞基檢測(cè)圖譜，其中，縱坐標(biāo)mAU表示A214 紫外吸收值，橫坐標(biāo)為時(shí)間。
具體實(shí)施方式
儀器與材料
Pellicon2超濾膜(截流分子量10K，0. 5M2，Millipore公司產(chǎn)品)，Pellicon超濾系統(tǒng)(Millipore公司產(chǎn)品)，Amicon超濾離心管(Millipore公司產(chǎn)品)，AKTA Purifier層析系統(tǒng)(GE healthcare 公司產(chǎn)品)；TSK gelG_2000wxl 柱(Tosoh 公司產(chǎn)品)；Vydac Protein and Peptide C4柱(美國(guó)格雷斯公司產(chǎn)品)；高壓液相色譜儀(美國(guó)安捷倫Agilent公司產(chǎn)品);
具FSH 特異性的 CaptureSelect 填料(荷蘭 BAC 公司產(chǎn)品)，Superdex75prep grade 填料、Superdex75prep grade 填料以及 Sephadex G-75 (GEhealthcare 公司產(chǎn)品), Q sepharose F. F 填料、DEAE sepharose FF 填料(GEhealthcare 公司產(chǎn)品)?！?br> 一、重組人FSH的純化
實(shí)施例1重組人促卵泡激素蛋白的純化途徑一
I)含重組人FSH的細(xì)胞培養(yǎng)物上清液的預(yù)處理
清潔超濾系統(tǒng)，并作去熱原處理，濃縮上清液，用(O. 02MTris+0. 2MNaCl + O.1M甲硫氨酸)緩沖液(PH7. O)置換濃縮液。
2) Q sepharose F. F陰離子交換層析
清潔Q sepharose F. F柱層析系統(tǒng),并作去熱原處理,依次按以下步驟進(jìn)行
用A相(O. 02MTris+0. 2MNaCl + O.1M甲硫氨酸)緩沖液(pH7. O)平衡層析柱，上樣，在此條件下，雜質(zhì)結(jié)合在陰離子交換柱上，而重組人促卵泡激素蛋白不結(jié)合在陰離子交換柱上，收集流穿組分。
3)親和層析
清潔親和層析系統(tǒng)，依次進(jìn)行以下操作用(O. 02M Tris)緩沖液(pH7. O)平衡層析柱；上樣后用(O. 02M Tris)緩沖液(pH7.0)平衡層析柱；用(O. 02MTris+l. 5M MgCl2 · 6H20)緩沖液(pH7. O)洗脫層析柱上的重組人FSH，收集該洗脫峰。
清潔超濾系統(tǒng)，并作去熱原處理，用0. 02M Tris (pH7. 0)循環(huán)清洗超濾系統(tǒng)后，超濾濃縮前述層析柱洗脫峰收集液，并用0. 02M Tris (pH7. 0)充分置換。
4) Superdex75prep grade 層析
清潔Superdex75prep grade柱層析系統(tǒng),并作去熱原處理,依次按以下步驟進(jìn)行 用0. 02M枸櫞酸鈉+ 0.1M甲硫氨酸緩沖液(pH7. 5)平衡層析柱；將上步收集的濃縮蛋白溶液，上樣，收集含重組人FSH的組分。
實(shí)施例2重組人促卵泡激素蛋白的純化途徑二
I)含重組人FSH的細(xì)胞培養(yǎng)物上清液的預(yù)處理
清潔超濾系統(tǒng)，并作去熱原處理，濃縮上清液，用(O. 02MTris+0.1MNaCl + O. OlM 甲硫氨酸)緩沖液(PH7. 2)置換濃縮液。
2) DEAE sepharose F. F 陰離子交換層析
清潔DEAE sepharose F. F柱層析系統(tǒng),并作去熱原處理,依次按以下步驟進(jìn)行
用A相(O. 02MTris+0.1MNaCl + O. OlM甲硫氨酸)緩沖液(pH7. 2)平衡層析柱，上樣，在此條件下，雜質(zhì)結(jié)合在陰離子交換柱上，而重組人促卵泡激素蛋白不結(jié)合在陰離子交換柱上，收集流穿組分。
3)親和層析
清潔親和層析系統(tǒng)，依次進(jìn)行以下操作用(O. 02M Tris)緩沖液(pH7. 2)平衡層析柱；上樣后用(O. 02M Tris)緩沖液(pH7. 2)平衡層析柱；用(O. 02MTris+2. OM MgCl2 · 6H20)緩沖液(pH7. 2)洗脫層析柱上的重組人FSH，收集該洗脫峰。
清潔超濾系統(tǒng)，并作去熱原處理，用O. 02M Tris (pH7. 2)循環(huán)清洗超濾系統(tǒng)后，超濾濃縮前述層析柱洗脫峰收集液，并用O. 02M Tris (pH7. 2)充分置換。
4) Superdex200prep grade 層析
清潔Superdex200prep grade柱層析系統(tǒng),并作去熱原處理,依次按以下步驟進(jìn)行用O.1M枸櫞酸鈉+ O. OlM甲硫氨酸緩沖液(pH7. O)平衡層析柱；將上步收集的濃縮蛋白溶液，上樣，收集含重組人FSH的組分。
實(shí)施例3重組人促卵泡激素蛋白的純化途徑三
I)含重組人FSH的細(xì)胞培養(yǎng)物上清液的預(yù)處理
清潔超濾系統(tǒng)，并作去熱原處理，濃縮上清液，用(O. 05MTris+0. 2MNaCl + O.1M甲硫氨酸)緩沖液(PH7. 5)置換濃縮液。
2) Q sepharose F. F陰離子交換層析
清潔Q sepharose F. F柱層析系統(tǒng),并作去熱原處理,依次按以下步驟進(jìn)行
用A相(O. 05MTris+0. 2MNaCl + O.1M甲硫氨酸)緩沖液(pH7. 5)平衡層析柱，上樣，在此條件下，雜質(zhì)結(jié)合在陰離子交換柱上，而重組人促卵泡激素蛋白不結(jié)合在陰離子交換柱上，收集流穿組分。
3)親和層析
清潔親和層析系統(tǒng)，依次進(jìn)行以下操作用(O. 05M Tris)緩沖液(pH7. 5)平衡層析柱；上樣后用(O. 05M Tris)緩沖液(pH7. 5)平衡層析柱；用(O. 05MTris+2. OM MgCl2 · 6H20)緩沖液(pH7. 5)洗脫層析柱上的重組人FSH，收集該洗脫峰。
清潔超濾系統(tǒng)， 并作去熱原處理，用O. 05M Tris (pH7. 5)循環(huán)清洗超濾系統(tǒng)后，超濾濃縮前述層析柱洗脫峰收集液，并用O. 02M Tris (pH7. 5)充分置換。
4) Superdex75prep grade 層析
清潔Superdex75prep grade柱層析系統(tǒng),并作去熱原處理,依次按以下步驟進(jìn)行 用O. 05M枸櫞酸鈉+ O.1M甲硫氨酸緩沖液(pH7. O)平衡層析柱；將上步收集的濃縮蛋白溶液，上樣，收集含重組人FSH的組分。
實(shí)施例4目標(biāo)蛋白的檢測(cè)
I) SDS-PAGE 檢測(cè)
將分離純化的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE分析，通過實(shí)施例1、2、3最終所獲得目標(biāo)蛋白以及蛋白質(zhì)Marker的檢測(cè)結(jié)果如圖5所示，目標(biāo)蛋白表觀分子量與理論值一致，約40kD。
2) WesternB Ioting 檢測(cè)
將分離純化的蛋白樣品進(jìn)行還原型WesternBloting分析,通過實(shí)施例1、2、3最終所獲得目標(biāo)蛋白以及蛋白質(zhì)Marker的檢測(cè)結(jié)果如圖6所示，目標(biāo)蛋白表觀分子量與理論值一致，約 40kD。
3)純度與收率
A、ELISA 檢測(cè)
此方法用于FSH免疫活性分析以及定量分析，利用抗原抗體結(jié)合來檢測(cè)FSH的含量。使用促卵泡激素ELISA kit (上海西唐生物科技公司產(chǎn)品)，檢測(cè)過程按說明書進(jìn)行。
B、SEC-HPLC 法
色譜柱TSKgel G_2000wxl 柱(30cmX 7. 8mm)
流動(dòng)相(磷酸鹽緩沖液)0. lmol/L的Na2SO4H. 2g，加950ml的水溶解，加6. 75ml 磷酸，用飽和NaOH(5-6ml)調(diào)節(jié)至pH6. 7，用水定容至1000ml，O. 45um膜過濾。
流速0.5mT ,/min,
檢測(cè)波長(zhǎng)214nm，
ST0P:30min。
通過實(shí)施例1、2、3最終所獲得目標(biāo)蛋白檢測(cè)結(jié)果如圖2、3、4所示，目標(biāo)蛋白于 15. 9min出峰。對(duì)照藥普利康檢測(cè)結(jié)果如圖1所示。
平均純度與收率
通過ELISA、SEC_HPLC檢測(cè)與計(jì)算，目標(biāo)蛋白總回收率44%，其中培養(yǎng)物上清液中目標(biāo)蛋白濃度12mg/L ;經(jīng)過超濾濃縮以及緩沖液置換，目標(biāo)蛋白回收率85% ;Q_S印harose FF層析目標(biāo)蛋白回收率90% ;親和層析目標(biāo)蛋白回收率大于80%，蛋白質(zhì)純度約90%，緊接的超濾與緩沖液置換步驟中目標(biāo)蛋白回收率80% ；Sephadex G-75凝膠過濾層析目標(biāo)蛋白回收率90%以上，目標(biāo)蛋白純度大于98%。
4)蛋白質(zhì)活性檢測(cè)
生物活性檢測(cè)根據(jù)熒光素酶(Luciferase)化學(xué)發(fā)光法。其原理為穩(wěn)定表達(dá)FSHR 的細(xì)胞系在與FSH共同孵育時(shí)，將在FSH的誘導(dǎo)下啟動(dòng)與FSHR偶聯(lián)的熒光素酶基因(報(bào)告基因)的表達(dá)，這種受體-報(bào)告基因的緊密關(guān)系構(gòu)成本檢測(cè)方法的理論基礎(chǔ)。通過熒光素酶定量試劑盒測(cè)定報(bào)告基因的表達(dá)水平，來間接反應(yīng)上游誘導(dǎo)物FSH的相對(duì)生物活性。在同步檢測(cè)多濃度FSH國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品，并繪制出精確濃度相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)曲線后，即可通過比對(duì)檢測(cè)讀數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到未知FSH樣品的準(zhǔn)確活度。普利康比活性值為90833IU/mg，通過實(shí)施例1、2、3最終所獲得目標(biāo)蛋白的活性檢測(cè)結(jié)果見表I。
表I本發(fā)明純化的重組`人促卵泡激素與原研藥普利康的活性比較
實(shí)施例1實(shí)施例2實(shí)施例3活性含量11916IU/mg98333IU/mg11583IU/mg與普利康之比131. 1%108.2%127. 5%
5)RP_HPLC測(cè)氧化亞基的含量rhFSH的一級(jí)結(jié)構(gòu)中含有甲硫氨酸殘基，所以容易受到空氣中氧氣的氧化。根據(jù)質(zhì) 量標(biāo)準(zhǔn)要求氧化亞基含量與a亞基的含量比不大于5%。1. RP-HPLC 色譜條件色譜柱VydacProtein and Peptide C4 柱(25cmX4. 6mm, 5um)流動(dòng)相A(0. lmol/1 TEAP緩沖液):85%磷酸6. 75ml，加水9500ml，用三乙胺調(diào)pH 至6. 00 + 0. 05，用水定容至1000ml，用0. 45um膜過濾后，放置24小時(shí)后使用。流動(dòng)相B:乙腈流動(dòng)相C:水乙腈三氟乙酸=20:82:0. 1%流速1.OmL/min ；檢測(cè)波長(zhǎng)214nm;柱溫4(TC;表2 RP-HPLC洗脫梯度表
權(quán)利要求
1.一種重組人促卵泡激素的純化方法，包括以下步驟1)陰離子交換層析含重組人FSH的細(xì)胞培養(yǎng)物上清液，在平衡陰離子交換層析柱后上樣，收集含重組人FSH的流穿液；2)親和層析將FSH特異的CaptureSelect親和層析柱平衡,上樣,再用洗脫緩沖液洗脫層析柱，收集含重組人FSH的洗脫峰；3)凝膠過濾層析平衡凝膠層析柱后上樣，收集含有重組人FSH的組分。
2.如權(quán)利要求1所述的純化方法，其特征是所述陰離子交換層析柱的介質(zhì)的配基為季銨基或二乙胺乙基。
3.如權(quán)利要求2所述的純化方法，其特征是所述陰離子交換層析柱的介質(zhì)為Q sepharose F. F 或 DEAE sepharose F. F。
4.如權(quán)利要求1所述的純化方法，其特征是陰離子交換層析所用平衡緩沖液中含有0.1-0. 2M NaCl，pH 為 7. 0-7. 5。
5.如權(quán)利要求4所述的純化方法，其特征是陰離子交換層析所用平衡緩沖液中還含有 O. 02-0. 05M Tris 和 O. 01-0.1M 甲硫氨酸。
6.如權(quán)利要求1所述的純化方法，其特征是，所述親和層析中所用平衡緩沖液含有O. 02-0. 05M Tris, pH為7. 0-7. 5 ;洗脫重組人FSH的緩沖液含有O. 02-0. 05M Tris和1.5-2. OM MgCl2, pH 為 7. 0-7. 5。
7.如權(quán)利要求1所述的純化方法，其特征是所述凝膠層析柱的介質(zhì)為分離范圍在 3_600kD、適于重組人 FSH 純化的凝膠，優(yōu)選 Superdex75、Superdex200> Sephadex G-50、 Sephadex G-75 或 Sephadex G-1OO0
8.如權(quán)利要求7所述的純化方法，其特征是凝膠層析所用平衡緩沖液含有O.02-0.1M 枸櫞酸鈉和O. 01-0.1M甲硫氨酸，pH為7. 0-7. 5。
9.如權(quán)利要求1所述的純化方法，其特征是，所述步驟I和/或步驟3中上樣前，將樣品在超濾系統(tǒng)中進(jìn)行濃縮和緩沖液置換。
10.如權(quán)利要求9所述的純化方法，其特征是置換所用的緩沖液含O.02-0. 05MTris、 O. 1-0. 2M NaCl 和 O. ·01-0.1M 甲硫氨酸，pH 為 7. 0-7. 5。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種重組人促卵泡激素的純化方法，包括陰離子交換層析、親和層析、凝膠過濾層析。本發(fā)明成本低，步驟少，簡(jiǎn)便易行，質(zhì)量穩(wěn)定，不存在復(fù)雜的變復(fù)性過程，避免了使用對(duì)蛋白活性影響較大的反相層析、金屬螯合層析或疏水層析；先利用流穿模式的陰離子交換，除去大量雜蛋白、色素以及部分殘留DNA、內(nèi)毒素及宿主蛋白，既保護(hù)了后續(xù)的親和填料，又實(shí)現(xiàn)了粗純與濃縮富集；親和介質(zhì)偶聯(lián)了駱駝源的抗體，載量高，只特異性地結(jié)合FSH的完整分子，而不結(jié)合單個(gè)亞基，更好地去除了降解的單體亞基；凝膠過濾可進(jìn)一步除去殘留DNA、內(nèi)毒素及宿主蛋白，還可起到去除蛋白聚體以及糖基化不足的FSH蛋白。
文檔編號(hào)C07K14/59GK103059125SQ20121057937
公開日2013年4月24日 申請(qǐng)日期2012年12月27日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月27日
發(fā)明者海崗, 王海彬, 應(yīng)躍斌, 江海燕, 郭婷婷, 繆世偉, 白驊 申請(qǐng)人:浙江海正藥業(yè)股份有限公司