專利名稱：一種抗人NT-proBNP多肽的單克隆抗體及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種抗人NT-proBNP多肽的單克隆抗體及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
當(dāng)今隨著老齡化的發(fā)展以及各種心臟疾病的增多，導(dǎo)致心力衰竭病人逐年增加。心力衰竭(Heart Failure)是一種由于心臟功能障礙而產(chǎn)生的體征和癥狀的臨床綜合征。雖然現(xiàn)在的一些藥物可延緩病情惡化，但除非進(jìn)行心臟移植，否則心力衰竭是無(wú)法治愈。心力衰竭早期診斷和避免病情惡化是當(dāng)今醫(yī)療保健面臨的關(guān)鍵問題，越早開始治療，對(duì)病人就越有益。然而，心力衰竭(尤其是在心衰早期)是很難確診的。心衰的典型癥狀，如呼吸急促、踝關(guān)節(jié)腫脹、疲勞等都不具特異性，有些病情輕微的患者也沒有表現(xiàn)出典型癥狀。初級(jí)醫(yī)療機(jī)構(gòu)僅依賴臨床標(biāo)準(zhǔn)作為診斷依據(jù)，診斷心力衰竭的假陽(yáng)性率可高達(dá)50%。目前診斷心衰最常用有效的方法主要有超聲心動(dòng)圖、放射核素顯像和心核磁共振檢查；但是日常實(shí)際診斷左心室功能衰竭時(shí)，上述檢查手段沒有一項(xiàng)是可以完全信賴，并具有良好的重現(xiàn)性的。因此，臨床上急需一種客觀、簡(jiǎn)單、科學(xué)的快速診斷方法，提高心衰患者的診斷率。研究表明腦鈉肽(Brain natriuretic peptide, BNP)和氨基末端腦鈉肽前體(N-terminalpro-brain natriuretic peptide, NT-proBNP)濃度的升高對(duì)于心衰的診斷具有很高敏感性，并能評(píng)估心功能損害嚴(yán)重程度，是診斷和鑒別診斷心力衰竭非常有效的生物標(biāo)記物。BNP是主要由心室分泌的一種多肽類激素，具有利鈉、擴(kuò)張血管、抑制腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)的作用。BNP屬于一類具有17氨基酸環(huán)狀結(jié)構(gòu)的多肽激素家族，這其中還包括心鈉妝(trial natriuretic peptide, ANP)、C 型鈉妝(C-type natriureticpeptide, CNP)等。研究表明,這類物質(zhì)對(duì)于慢性心力衰竭及心臟功能不全的診斷具有較強(qiáng)的指導(dǎo)意義。BNP是前腦鈉肽元(preproBNP)通過蛋白酶解過程形成的。proproBNP是在心肌細(xì)胞中合成的包含134個(gè)氨基酸殘基的多肽鏈，當(dāng)切掉1-26位信號(hào)肽后就形成包含108個(gè)氨基酸殘基的腦鈉肽元(proBNP)。心室受刺激時(shí)腦鈉肽元(pro-BNP)裂解成有活性的BNP (32個(gè)氨基酸)和沒有活性的NT-proBNP (76個(gè)氨基酸)。NT-proBNP和含有C末端32個(gè)氨基酸的具有生物活性的BNP是等比例釋放，因此二者在心血管系統(tǒng)疾病的診斷、治療、監(jiān)測(cè)和預(yù)后方面有著相似的臨床應(yīng)用。NT-proBNP的生物半衰期是60-120分`鐘，相比BNP20分鐘的生物半衰期要長(zhǎng)的多。同時(shí)，心衰時(shí)NT-proBNP的升高幅度要明顯大于BNP，更利于檢測(cè)。此外，NT-proBNP在血清和血漿中非常穩(wěn)定，可以采用常規(guī)血液樣本的傳送及處理方法，無(wú)需對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理。一般情況下ΝΤ-ρι.οΒΝΡ含量幾乎沒有日間變異，這意味著隨時(shí)可以取樣檢測(cè)；而且還不受患者體位及運(yùn)動(dòng)狀況的影響，在抽取血液樣品時(shí)，患者無(wú)需休息或平躺。通過與紐約心臟學(xué)會(huì)(New York heart association, NYHA)心功能分級(jí)比較，NT-proBNP更能真實(shí)反映心功能的變化。NT-proBNP水平與心衰的嚴(yán)重程度相關(guān)，水平越高病變?cè)絿?yán)重，預(yù)后也越差。同時(shí)，NT-proBNP有利于在早期階段或病變輕微階段發(fā)現(xiàn)心衰。對(duì)于NT-proBNP的鑒定已經(jīng)進(jìn)行過相關(guān)研究及報(bào)道，W093/24531 (US5, 786，163)公開了能夠結(jié)合ΝΤ-ρι.οΒΝΡ47-64位氨基酸的多克隆抗體及檢測(cè)方法，Hunt，P.J.等公布了針對(duì)1-13位氨基酸的測(cè)定法。此外還有針對(duì)其它不同氨基酸區(qū)段的測(cè)定法，但這些方法都存在重復(fù)性較差，樣品預(yù)處理方法復(fù)雜，表征或/和臨床相關(guān)性較差等問題。因此，需要更有效的抗體和特異性檢測(cè)方法解決上述問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種抗人NT-proBNP多肽的單克隆抗體。本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種抗人NT-proBNP多肽的單克隆抗體在制備檢測(cè)早期心力衰竭的診斷試劑盒的用途。本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下:一種抗人NT-proBNP多肽的單克隆抗體，是用下述方法制成:(I)將多肽片段aal與aa2，利用蛋白偶聯(lián)技術(shù)與KLH載體蛋白進(jìn)行連接，得到偶聯(lián)蛋白aal-KLH_aa2 ;(其中KLH載體蛋白又稱鑰孔蟲戚孔血藍(lán)蛋白，KLH是分子量十分巨大的蛋白，有幾百萬(wàn)Da，所以在KLH分子表面有大量的活性基團(tuán)，常用于蛋白偶聯(lián)的載體蛋白)。(2)用偶聯(lián)蛋白aal-KLH_aa2免疫Balb/c小鼠，將免疫后的小鼠脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞融合，制備得到抗人NT-proBNP多肽的單克隆抗體，所述aal是SEQ ID N0.1所示的序列；aa2是SEQ ID N0.2所示的序列。—種抗人NT-proBNP多肽的單克隆抗體在制備檢測(cè)早期心力衰竭的診斷試劑盒的用途。本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明所涉及的偶聯(lián)蛋白具有很好的蛋白表面活性及抗原性。能更容易的篩選出特異性好的單克隆抗體。本發(fā)明的偶聯(lián)蛋白有益于增加抗原決定簇的數(shù)量，進(jìn)而增加單克隆抗體產(chǎn)生的種類，以及提高后期單克隆抗體配對(duì)的可能性。使用本發(fā)明制備的抗體具有實(shí)驗(yàn)簡(jiǎn)單，抗體親和力高。用本發(fā)明的抗體制備的試劑盒具有特異性強(qiáng)，靈敏度高，穩(wěn)定性好等特點(diǎn)。


圖1為試劑盒繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
具體實(shí)施例方式實(shí)驗(yàn)材料:HMP resin (P-羥甲基苯氧甲基多聚乙烯樹脂)，F(xiàn)mocAA (9_芴基甲氧羰?；Ｗo(hù)的氨基酸)，MeoH (甲醇)，DCM (二氯甲烷)，DMAP (二甲基氨基吡啶)，上述材料購(gòu)于Themo公司；Piperid ine (哌啶)，DCC (二環(huán)己基碳二亞胺)，HOBT (羥基苯并三唑)，NMP (氮甲基吡咯烷酮)，EDT (1,2-乙二硫醇)，TFA (三氟乙酸)，Thioanisole (硫代苯甲醚)，Phenol, Crystalline (結(jié)晶苯酹)，Acetonitrile (乙腈),石臘,KLH載體蛋白，EDC,上述材料購(gòu)于sigma公司；NT-proBNP 標(biāo)準(zhǔn)品，購(gòu)于 Ieebio 公司。主要實(shí)驗(yàn)儀器:多肽自動(dòng)合成儀(美國(guó)ABI431A型)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海于華)，高效液相色譜儀(上海天普分析儀器)，冷凍干燥機(jī)，protein G親和層(Themo);低溫離心機(jī)(德國(guó)eppendorf)；二氧化碳培養(yǎng)箱(美國(guó)Themo3100);加樣器,恒溫水浴鍋，(德國(guó)eppendorf);倒置顯微鏡(上海，H0508);生物安全柜(TECH，B2);酶標(biāo)儀，Sephadex G-25層析柱，PH儀，(美國(guó)biorad)；分析天平(Satorius BS110S);超低溫冰箱(FORMA);液氮罐(成都液氮容器廠，YS-30-125)；普通離心機(jī)(北京醫(yī)用離心機(jī)廠，LD5-2A),色譜儀Waters 600 (美國(guó)Waters公司)，人NT-proBNP酶聯(lián)免疫試劑盒(德國(guó)IBL公司)以下結(jié)合實(shí)施例旨在進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，而非限制本發(fā)明。實(shí)施例1首先利用DNAstar軟件對(duì)人NT-proBNP全長(zhǎng)氨基酸序列進(jìn)行前期的蛋白結(jié)構(gòu)及抗原表位分析，根據(jù)最優(yōu)條件，選取兩個(gè)多肽片段，即(aal) Y-N-H-L-Q-G-K和(aa2)Y-L-Q-V-E-Q-T-S-L, aal 是 SEQ ID N0.1 所不的序列；aa2 是 SEQ ID N0.2 所不的序列。NT-proBNP抗原決定簇多肽片段aal與aa2的制備:稱取HMP樹脂lOOmg，于美國(guó)ABI431A型多肽自動(dòng)合成儀的反應(yīng)腔內(nèi)，由合成儀自動(dòng)將特定的氨基酸按不同的順序聯(lián)接起來(lái)，偶聯(lián)率達(dá)99%。反應(yīng)步驟如下:(I)氨基酸的活化(HOBt/DCC法)(2)聯(lián)接氨基酸到樹脂上(3)脫去氨基酸的Fomc保護(hù)基
(4)氨基酸活化(HOBt/DCC 法)(5)偶聯(lián)(6)重復(fù)(3)- (5)直至合成結(jié)束。(7)裂解肽樹脂用TFA (三氟乙酸)切割肽鏈，用EDT，硫代苯甲醚，H2O作為清除劑，在室溫反應(yīng)3小時(shí)，去除切割試劑，用乙醚萃取，得到NT-proBNP多肽的粗品。(8)多肽純化采用高效液相色譜分離純化條件:色譜柱C8IO X IOOmm色譜儀Waters600美國(guó)Waters公司流動(dòng)相A-0.1%TFA (三氟乙酸)H20B-0.1%TFA (三氟乙酸)于60%乙腈檢測(cè)波長(zhǎng)214nm流速4ml/min
洗脫梯度20%-60%B 于 30minHPLC (高效液相色譜)分析色譜柱C184.6X 150mm流動(dòng)相A-0.1%TFA (三氟乙酸)H20
B-0.1%TFA (三氟乙酸)于60%乙腈檢測(cè)波長(zhǎng)214nm流速lml/min洗脫梯度 0%-60%B 于 30min兩種多肽片段分析結(jié)果顯示純度95%以上。實(shí)施例2將實(shí)施例1所得的ΝΤ-ρι.οΒΝΡ抗原決定簇多肽片段(aal與aa2)與KLH載體蛋白連接，形成偶聯(lián)蛋白aal-KLH_aa2 (簡(jiǎn)稱偶聯(lián)蛋白)。蛋白偶聯(lián)步驟如下:1.稱取與所需連接多肽同等質(zhì)量的KLH，溶于PH7.2PBS緩沖液中，終濃度4 一10mg/ml2.將溶液在PH7.2PBS緩沖液中2 — 8°C透析過夜，中間換一次緩沖液。3.再將溶液在連接緩沖液中室溫下透析2小時(shí)，然后轉(zhuǎn)到干凈的容器中。4.將待連接NT-proBNP抗原決定簇多肽片段(aal與aa2)用蒸懼水溶解至IOmg/ml ο5.按質(zhì)量比1:1將NT-proBNP抗原決定簇多肽片段(aal與aa2)與KLH溶液混合，形成混合液。6.每Iml混合液中加入1.0mgEDC,室溫反應(yīng)2 — 4小時(shí)。7.將混合物在PH7.2PBS緩沖液中2 — 8°C透析過夜，其間至少換兩次緩沖液。8.將溶液取出，計(jì)算濃度，分裝凍存。實(shí)施例3用實(shí)施例2制備的偶聯(lián)蛋白作為抗原免疫動(dòng)物制備特異性單克隆抗體。1、動(dòng)物免疫:將偶聯(lián)蛋白與弗氏佐劑等量混合充分乳化后注射3只Balb/c小鼠，每只小鼠25 μ g,共免疫3次，間隔時(shí)間15天。2、細(xì)胞融合、選擇性培養(yǎng)、篩選:融合前3天，小鼠腹腔注射無(wú)佐劑偶聯(lián)蛋白25 μ g，取出免疫小鼠的脾臟細(xì)胞，將2.0 X IO7個(gè)SP2/0骨髓瘤細(xì)胞與2.0 X IO8個(gè)經(jīng)步驟Cl)免疫的Balb/c小鼠的脾細(xì)胞混勻，離心，棄上清，輕微振蕩混勻，于37°C水浴中，在90秒內(nèi)滴加Iml體積濃度為50%的PEG-1500水溶液，然后滴加20mlDMEM培養(yǎng)基，離心，棄上清，再洗一次，離心，棄上清，得到雜交瘤細(xì)胞。使用HAT選擇培養(yǎng)基在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上選擇雜交瘤細(xì)胞，鏡下檢測(cè)總?cè)诤下?gt; 95%。鏡下選擇單克隆細(xì)胞孔的上清進(jìn)行檢測(cè)，挑取OD450 >0.8的孔內(nèi)細(xì)胞進(jìn)行亞克隆，最終獲得對(duì)NT-proBNP反應(yīng)陽(yáng)性率> 99%的細(xì)胞克隆，作為分泌抗人NT-proBNP單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。3、細(xì)胞克隆:對(duì)獲得的陽(yáng)性細(xì)胞株進(jìn)行克隆，使用有限稀釋法，克隆3次，最后得到產(chǎn)生高效價(jià)的抗人ΝΤ-ρι.οΒΝΡ單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞系7株，擴(kuò)大培養(yǎng)，凍存。4、腹水制備:6-8周齡雌性Balb/c小鼠用石蠟處理10天后，取雜交瘤細(xì)胞以2X IO6個(gè)細(xì)胞/只進(jìn)行腹腔注射。10天后從小鼠腹腔中獲取富含抗體的腹水，測(cè)定腹水效價(jià)> IO505、純化鑒定:采用protein G親和層析法。首先制備protein G親和層析柱,用PBS平衡柱子后，取腹水過柱， 然后用PBS清洗柱子，至OD值接近于零，以50nmol/L的甘氨酸鹽酸鹽溶液洗脫，收集洗脫液，測(cè)定各收集管的OD值，保留峰值區(qū)的洗脫液，洗脫液經(jīng)透析后收集。經(jīng)SDS-PAGE電泳鑒定為純化的單克隆抗體，純度為98%以上。實(shí)施例4檢測(cè)早期心力衰竭的診斷試劑盒的制備本實(shí)施例中將實(shí)施例2中獲得的7株抗人NT-proBNP單克隆抗體中通過ELISA抗體夾心法挑得一對(duì)單克隆抗體作為試劑盒中的標(biāo)記抗體和包被抗體,試劑盒包含如下。DELISA96孔檢測(cè)板一塊:以pH7.2的磷酸鹽緩沖液作為包被稀釋液，在微孔板中加入包被液(將人NT-proBNP單克隆抗體加入包被稀釋液中，使所述抗體的濃度為5-10 μ g/ml)，每孔100 μ 1，在4-8°C過夜，PBST洗板3次，用含有質(zhì)量濃度為4%的蔗糖的PH7.2磷酸鹽緩沖液溶液封閉37°C，2小時(shí)。將微孔內(nèi)液體拍干，置于零下20°C保存。2)配制人 NT-proBNP 標(biāo)準(zhǔn)品 6 瓶(各 1ml):S00pg/ml, S1150pg/ml, S2340pg/ml,S3890pg/ml, S41850pg/ml, S53500pg/ml,本系列標(biāo)準(zhǔn)品是用胎牛血清稀釋。3) HRP 標(biāo)記抗體 I 瓶(IOml):6.15g Tris、7.92g 氯化鈉、1.15g 氯化鈣、3.75g 蔗糖、IOg牛血清白蛋白、0.12g柳硫萊鈉、0.05g慶大霉素、0.5ml吐溫200mg苯酹加雙蒸水定溶至IL ;加入ImgHRP標(biāo)記抗體混勻。(HRP標(biāo)記抗體步驟:稱取HRP25mg溶于1.25%戊二醛溶液中，于室溫靜置過夜。反應(yīng)后的酶溶液經(jīng)S^hadex G-25層析柱，用生理鹽水洗脫。收集棕色流出液。將待標(biāo)記的抗體12.5mg用生理鹽水稀釋至5ml，攪拌下逐滴加入酶溶液中。IM PH9.5的碳酸緩沖液0.25ml，繼續(xù)攪拌3小時(shí)。加0.2M賴氨酸0.25ml，混勻后，置室溫2小時(shí)。在攪拌下逐滴加入等體積飽和硫酸銨，置4°C I小時(shí)。3000轉(zhuǎn)/分鐘離心半小時(shí)，棄上清。沉淀物用半飽和硫酸銨洗二`次，最后沉淀物溶于少量0.15M PH7.4的PBS中。將上述溶液裝入透析袋中，在0.15MPH7.4的PBS緩沖液中透析后，10，000轉(zhuǎn)/分鐘離心30分鐘去除沉淀，上清液即為酶結(jié)合物，分裝后，冰凍保存。)4)酶底物溶液I瓶(15ml):為含有0.25g/L TMB,3.19g/L尿酸過氧化氫、lg/L乙酸鈉、2.5lg/L檸檬酸的水溶液。5)終止液 I 瓶(15ml):lmol/L HCl 水溶液。6)洗滌液I瓶(120ml):0.01mol/L pH7.2磷酸鹽緩沖液，該緩沖液含0.05%的吐溫20。實(shí)施例5使用方法制定標(biāo)準(zhǔn)曲線:將6種人NT-proBNP標(biāo)準(zhǔn)品，加入ELISA96孔檢測(cè)板的孔中，每孔100 μ 1，待檢血清，每孔IOOy 1，37°C溫育I小時(shí)，洗滌液洗板4次，甩干，加入HRP標(biāo)記抗體，每孔100μ 1，37°C溫育I小時(shí)，洗滌液洗板5次，甩干，加入酶底物溶液，每孔100 μ 1，室溫避光顯色15分鐘，加入終止液，每孔100 μ 1，使用酶標(biāo)儀在450nm測(cè)定吸光值(Α450)，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，450nm吸收值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，將待測(cè)血清450nm吸收值帶入曲線計(jì)算血清中NT-proBNP含量。(圖1)回歸方程:y=0.0009x+0.1454Correl=0.9919
權(quán)利要求
1.一種抗人NT-proBNP多肽的單克隆抗體,其特征是用下述方法制成: (1)將多肽片段aal與aa2，利用蛋白偶聯(lián)技術(shù)與KLH載體蛋白進(jìn)行連接，得到偶聯(lián)蛋白 aal_KLH_aa2 ； (2)用偶聯(lián)蛋白aal-KLH_aa2免疫Balb/c小鼠，將免疫后的小鼠脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞融合，制備得到抗人NT-proBNP多肽的單克隆抗體,所述aal是SEQ ID N0.1所示的序列；aa2是SEQ ID N0 .2所示的序列。
2.一種抗人NT-proBNP多肽的單克隆抗體在制備檢測(cè)早期心力衰竭的診斷試劑盒的用途。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種抗人NT-proBNP多肽的單克隆抗體及其應(yīng)用，所述抗體制備為將多肽片段aa1與aa2,與KLH載體蛋白進(jìn)行連接，得到偶聯(lián)蛋白aa1-KLH-aa2；(2)用偶聯(lián)蛋白免疫Balb/c小鼠，將免疫后的小鼠脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞融合，制備得到抗人NT-proBNP多肽的單克隆抗體，本發(fā)明所涉及的偶聯(lián)蛋白具有很好的蛋白表面活性及抗原性。能更容易的篩選出特異性好的單克隆抗體。有益于增加抗原決定簇的數(shù)量，進(jìn)而增加單克隆抗體產(chǎn)生的種類，以及提高后期單克隆抗體配對(duì)的可能性。使用本發(fā)明制備的抗體具有實(shí)驗(yàn)簡(jiǎn)單，抗體親和力高。用本發(fā)明的抗體制備的試劑盒具有特異性強(qiáng)，靈敏度高，穩(wěn)定性好等特點(diǎn)。
文檔編號(hào)C07K16/26GK103087191SQ201210576560
公開日2013年5月8日 申請(qǐng)日期2012年12月26日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月26日
發(fā)明者魏丙卓 申請(qǐng)人:天健生物制藥(天津)有限公司