專(zhuān)利名稱(chēng)：改進(jìn)的重組人促卵泡激素的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及促性腺激素領(lǐng)域。特別地，提供了改進(jìn)的重組人促卵泡激素(rhFSH)。這種改進(jìn)的rhFSH可用于不育癥的治療，特別是用于人類(lèi)患者。
背景技術(shù)：
促性腺激素是一組蛋白質(zhì)激素，其調(diào)控雄性和雌性的性腺功能，因此在人類(lèi)能育中起到重要作用。其是由脊椎動(dòng)物腦垂體的促性腺細(xì)胞在受到促性腺激素釋放激素(GnRH)刺激后分泌的。促性腺激素為異二聚體糖蛋白，包括促卵泡激素(FSH)、促黃體激素(LH)及絨毛促性腺激素(CG)。這些促性腺激素具有相同的α-亞基，但包含不同的β_亞基，后者能確保其的受體結(jié)合特異性。FSH包含一個(gè)92個(gè)氨基酸的α -亞基以及一個(gè)111個(gè)氨基酸的β-亞基，后者賦予其對(duì)FSH受體的特異性結(jié)合。所述天然蛋白質(zhì)的兩個(gè)亞基都受到糖基化修飾。α-亞基在Asn52和Asn78處而β -亞基在Asn7和Asn24處進(jìn)行天然糖基化。在細(xì)胞中兩種亞基都是以前體蛋白質(zhì)產(chǎn)生然后加工并分泌的。FSH調(diào)控身體的發(fā)育、生長(zhǎng)、青春期成熟及生殖過(guò)程。特別地，其刺激生殖細(xì)胞的成熟并因此參與精子發(fā)生及卵泡發(fā)生。卵泡發(fā)生是由FSH誘導(dǎo)的，例如通過(guò)FSH對(duì)粒層細(xì)胞表面上的FSH受體的結(jié)合。FSH受體為G蛋白偶聯(lián)受體，其在FSH結(jié)合時(shí)激活偶聯(lián)的G蛋白。然后所述G蛋白進(jìn)而激活腺苷酸環(huán)化酶，導(dǎo)致cAMP——種二級(jí)信使分子的產(chǎn)生。細(xì)胞中cAMP濃度的增加激活數(shù)種下游靶標(biāo)，特別是cAMP依賴的蛋白質(zhì)激酶，后者然后引起黃體酮和雌激素的合成。黃體酮和雌激素是由粒層細(xì)胞分泌的，誘導(dǎo)卵泡發(fā)生。在粒層細(xì)胞受到FSH刺激時(shí)，其還釋放抑制素-B，這形成了一個(gè)負(fù)反饋 環(huán)，從而抑制垂體中FSH的產(chǎn)生和分泌。已有顯示抑制素B為很好替代標(biāo)記物，提示有FSH造成的卵巢刺激。FSH在對(duì)不育癥的治療中有廣泛使用，可以單獨(dú)或與其他試劑(特別是LH)組合使用。在本領(lǐng)域中，通用已經(jīng)使用了純化自絕經(jīng)期后人尿液的FSH (尿FSH)或由中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞重組產(chǎn)生的FSH用于人類(lèi)治療。然而，由于存在不同異構(gòu)體，所以有極大的與不同F(xiàn)SH制備相關(guān)的異質(zhì)性。個(gè)體FSH異構(gòu)體顯示相同的氨基酸序列，但在其糖基化程度和本質(zhì)上有差異。具體的異構(gòu)體的特征在于碳水化合物支鏈結(jié)構(gòu)的異質(zhì)性以及不同量的唾液酸(一種帶負(fù)電的末端單糖單元)，這二者都影響了異構(gòu)體的特異生物活性。因此，F(xiàn)SH的糖基化形式對(duì)其生物學(xué)活性有顯著的影響。然而，來(lái)自不同供體和不同制備物的尿液FSH在其碳水化合物結(jié)構(gòu)上有顯著的變化，形成高度的批-批變化?？紤]到尿液制品中病毒的存在，還存在安全問(wèn)題。進(jìn)一步地，獲自CHO細(xì)胞的FSH顯示的糖基化形式特異于這些倉(cāng)鼠細(xì)胞，這與人類(lèi)糖基化形式不相同。這些差異導(dǎo)致所獲得的FSH有變化的生物學(xué)活性及副作用，因此要施用于患者的藥用制備物也具有這些性質(zhì)。鑒于此，本發(fā)明的一個(gè)目標(biāo)就是提供改進(jìn)的FSH制備物。進(jìn)一步地，本發(fā)明的一個(gè)目標(biāo)是提供具有新型治療或藥用特征的FSH制備物。進(jìn)一步地，本發(fā)明的一個(gè)目標(biāo)是提供具有改進(jìn)的糖基化形式的FSH制備物。
發(fā)明概述本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)獲自人類(lèi)細(xì)胞的改進(jìn)的FSH制備物(優(yōu)選地，是以優(yōu)化的糖基化水平選擇的制備物)能夠以比對(duì)應(yīng)的獲自人尿液或CHO細(xì)胞的FSH制備物更低的濃度誘導(dǎo)性類(lèi)固醇如雌激素和黃體酮的分泌。因此，根據(jù)本發(fā)明的FSH制備物具有可用于治療的驚人的特征。本發(fā)明在第一方面提供了重組的FSH制備物，其中制備物中的重組FSH具有的糖基化形式包含一種或多種以下特征(i)攜帶平分型N-乙酰葡萄糖胺(bisGlcNAc)的聚糖的相對(duì)量為至少20%;(ii)攜帶果糖的聚糖的相對(duì)量為至少30%;和/或(iii) 2，6-偶聯(lián)唾液酸的相對(duì)量為至少30% ;和/或(iv)其為多樣的糖基化形式。在第二方面，本發(fā)明提供了重組FSH制備物，其可通過(guò)在人類(lèi)細(xì)胞或人類(lèi)細(xì)胞系中生產(chǎn)而獲得，特別是細(xì)胞系GT-5s (DSM ACC3078,保藏于2010年7月28日)。據(jù)發(fā)現(xiàn)在各細(xì)胞系中產(chǎn)生的FSH產(chǎn)生了改進(jìn)的糖基化譜，如上文和下文所描述的。還提供了一種藥用組合物，其包含根據(jù)本發(fā)明的重組FSH。進(jìn)一步地，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明的重組FSH制備物或藥用組合物，用于治療不育癥。進(jìn)一步地，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明的重組FSH制備物或藥用組合物，用于不依賴于cAMP而誘導(dǎo)和/或刺激性類(lèi)固醇的分泌。一些實(shí)驗(yàn)顯示根據(jù)本發(fā)明的FSH的低濃度效應(yīng)在特定環(huán)境中不依賴于靶標(biāo)細(xì)胞中的cAMP信號(hào)傳導(dǎo)。因此，這些實(shí)驗(yàn)表明根據(jù)本發(fā)明的改進(jìn)的FSH制備物可在一定濃度下誘導(dǎo)性類(lèi)固醇如黃體酮的分泌而不增加cAMP的分泌。因此，認(rèn)為根據(jù)本發(fā)明的改進(jìn)的FSH制備物的特定實(shí)施方式能夠誘導(dǎo)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路而導(dǎo)致性類(lèi)固醇的分泌，所述通路不同于對(duì)通常使用的FSH制備物所描述的使用cAMP作為第二信使的已知信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。進(jìn)一步地，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明的重組FSH制備物或藥用組合物用于通過(guò)不依賴于cAMP信號(hào)的生物學(xué)過(guò)程刺激或共刺激生殖細(xì)胞的成熟。進(jìn)一步地，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明的重組FSH制備物或藥用組合物用于誘導(dǎo)和/或刺激性類(lèi)固醇的分泌的用途，在這些FSH濃度下不會(huì)誘導(dǎo)顯著的cAMP釋放。本發(fā)明的其他目標(biāo)、特征、優(yōu)勢(shì)及方面通過(guò)以下描述及附隨的權(quán)利要求對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員變得明顯。然而，要理解的是以下描述、附隨的權(quán)利要求及指出本應(yīng)用優(yōu)選的實(shí)施方式的特異實(shí)施例都只是以示例說(shuō)明的方式給出。在閱讀下文后，本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)容易理解在所公開(kāi)的發(fā)明的精神和范圍內(nèi)的多種變化和修飾。發(fā)明詳述定義如本文所使用的，以下詞語(yǔ)通常優(yōu)選地具有下文提出的意義，除非其使用的上下文中另有指出。如本文所使用的，詞語(yǔ)“包含”除了其常規(guī)意義外還包括并特異性指代詞語(yǔ)“基本上由……組成”及“由…… 組成”。因此，詞語(yǔ)“包含”指的是這樣的實(shí)施方式，其中“包含”特異性列出的元素的主題物質(zhì)不包含其他元素，還包括這樣的實(shí)施方式，其中“包含”特異性列出的元素的主體物質(zhì)可能和/或確實(shí)包含其他元素。術(shù)語(yǔ)“FSH”指的是促卵泡激素，一種促性腺激素。FSH為一種糖蛋白，其包含兩個(gè)亞基的糖蛋白，標(biāo)記為α和β亞基。優(yōu)選地，F(xiàn)SH為人類(lèi)FSH，特別是由具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的α亞基和具有SEQ ID NO :2的氨基酸序列的β亞基組成的人類(lèi)FSH。然而，在其中一個(gè)或兩個(gè)亞基中可能存在一個(gè)或多個(gè)，如I個(gè)、I或2個(gè)、多至3個(gè)、多至5個(gè)、多至10個(gè)或多至20個(gè)氨基酸的置換、添加和/或刪除。優(yōu)選地，α亞基的氨基酸序列與根據(jù)SEQ ID NO:1的氨基酸序列共有的整體同源性或同一性為至少80%、更優(yōu)選地至少85%、至少90%、至少95%或至少98%。進(jìn)一步地，β亞基的氨基酸序列與根據(jù)SEQ ID NO: 2的氨基酸序列共有的整體同源性或相同性優(yōu)選為至少80%、更優(yōu)選地至少85%、至少90%、至少95%或至少98%。所述FSH的亞基優(yōu)選地為兩條分離的多肽鏈，然而，如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“FSH”還包括這樣的實(shí)施方式，其中這兩個(gè)亞基共價(jià)地彼此相連，例如通過(guò)交聯(lián)試劑或連接多肽鏈，還包括這樣的實(shí)施方式，其中一個(gè)或兩個(gè)亞基被進(jìn)一步劃分為數(shù)條多肽鏈。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的FSH能夠結(jié)合及/或激活FSH受體，優(yōu)選地為人類(lèi)FSH受體。如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“FSH”具體指代制備物中的所有FSH蛋白質(zhì)。因此，術(shù)語(yǔ)“FSH”具體指代FSH制備物或組合物中所有FSH蛋白質(zhì)的全體。
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優(yōu)選地，所述FSH蛋白質(zhì)的兩個(gè)亞基都包含一個(gè)或多個(gè)連接于多肽鏈的碳水化合物結(jié)構(gòu)。更優(yōu)選地，這些碳水化合物結(jié)構(gòu)是連接于這些亞基的天冬氨酸殘基上的。在尤其優(yōu)選的實(shí)施方式中，ct亞基包含兩個(gè)碳水化合物結(jié)構(gòu),分別連接于Asn52和Asn78,而/或β亞基含兩個(gè)碳水化合物結(jié)構(gòu)，分別連接于Asn7和Asn24。攜帶這些碳水化合物結(jié)構(gòu)的氨基酸殘基以相對(duì)于根據(jù)SEQ ID N0:1和2的相應(yīng)α和β亞基的人類(lèi)氨基酸序列的方式進(jìn)行標(biāo)注。人類(lèi)FSH的糖部分優(yōu)選地由果糖、半乳糖、甘露糖、半乳糖胺、葡萄糖胺和/或唾液酸構(gòu)成。根據(jù)本發(fā)明使用的FSH優(yōu)選地為重組FSH，更優(yōu)選地為重組人類(lèi)FSH。術(shù)語(yǔ)“重組FSH”指的是FSH并非由活的人類(lèi)或動(dòng)物體天然產(chǎn)生并因此獲自來(lái)源于其的樣品，如尿液、血液或其他體液、排泄物或人類(lèi)或動(dòng)物體的組織。優(yōu)選地，重組FSH獲自經(jīng)過(guò)生物技術(shù)工程改造的細(xì)胞，特別是以編碼FSH或者FSH的α或β亞基的核酸轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方式，重組FSH獲自包含編碼FSH的外源核酸的人類(lèi)細(xì)胞。相應(yīng)的外源核酸可例如通過(guò)使用一種或多種表達(dá)載體而引入，其可例如經(jīng)由轉(zhuǎn)染而引入宿主細(xì)胞。用于重組產(chǎn)生蛋白質(zhì)和FSH的相應(yīng)方法在在先技術(shù)中已熟知，無(wú)需其他描述。根據(jù)本發(fā)明的FSH優(yōu)選地為FSH，更優(yōu)選地為人類(lèi)FSH，可通過(guò)在人類(lèi)細(xì)胞，優(yōu)選地為人類(lèi)細(xì)胞系中產(chǎn)生而獲得。所述人類(lèi)細(xì)胞系優(yōu)選地來(lái)源于人類(lèi)血細(xì)胞，特別是髓細(xì)胞系，優(yōu)選地為髓性白血病細(xì)胞系。所述細(xì)胞系優(yōu)選地是永生化的。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，用于產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明的FSH的細(xì)胞系為細(xì)胞系GT-5s (其根據(jù)布達(dá)佩斯協(xié)議于2010年7月28日以登記號(hào)DSM ACC3078保藏于德意志微生物保藏中心(Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ), Inhoffenstraβ e7B, 38124Braunschweig(DE)),保藏人為 Glycotope GmbH, Robcrt-Rosslc-Str.10, 13125Berlin(DE))或來(lái)源于此的細(xì)胞系，或同源細(xì)胞系。GT-5s為一種永生化人類(lèi)髓性白血病細(xì)胞系，能夠提供如本文所描述的特異糖基化形式。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語(yǔ)“GT-5s”和“GT-5s細(xì)胞系”還包括來(lái)源于GT-5s的細(xì)胞或細(xì)胞系。來(lái)源于GT-5s的細(xì)胞系可例如通過(guò)隨機(jī)或特異性地從GT-5s培養(yǎng)物中選擇單一克隆或一組細(xì)胞而獲得，任選地在之前已經(jīng)對(duì)GT-5s細(xì)胞進(jìn)行了增強(qiáng)突變率的處理，或通過(guò)遺傳改變GT-5s細(xì)胞系而獲得。所選擇的克隆或一組細(xì)胞可進(jìn)一步如上文所述的方法進(jìn)行處理和/或可進(jìn)行其他的篩選輪。同源于GT-5s的細(xì)胞系特別是永生化人類(lèi)髓細(xì)胞系。優(yōu)選地，來(lái)源于或同源于GT-5s的細(xì)胞系能夠提供的FSH具有的糖基化形式類(lèi)似于獲自GT-5s的形式。優(yōu)選地，由來(lái)源于或同源于GT-5s的細(xì)胞系產(chǎn)生的FSH具有一種或多種本文所描述的糖基化特征，特別是攜帶N-平分型乙酰葡萄糖胺(bisGlcNAc)的聚糖的相對(duì)量為至少20% ;和/或攜帶果糖的聚糖的相對(duì)量為至少30%;和/或2，6-偶聯(lián)唾液酸的相對(duì)量為至少30% ;及/或多樣的糖基化形式。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方式，來(lái)源于或同源于GT-5s的細(xì)胞系能夠表達(dá)具有如本文描述的優(yōu)選糖基化形式的FSH，特別是選自表I的糖基化形式。由來(lái)源于或同源于GT-5s的細(xì)胞系產(chǎn)生的FSH的類(lèi)似的糖基化形式優(yōu)選地與獲自GT-5s的FSH的糖基化形式在一種或多種，優(yōu)選地為所有糖基化特性上的差異為20%或更少、更優(yōu)選地為15%或更少、10%或更少或5%或更少，所述糖基化特性選自bisGlcNAc的相對(duì)量、唾液酸化聚糖的相對(duì)量、硫酸化聚糖的相對(duì)量、2，6-偶聯(lián)唾液酸的相對(duì)量、果糖相對(duì)量、四天線型聚糖的相對(duì)量、攜帶半乳糖的聚糖支鏈相對(duì)量及Z數(shù)。進(jìn)一步地，根據(jù)本發(fā)明的FSH優(yōu)選地為FSH，更優(yōu)選地為人類(lèi)FSH，其具有一種或多種本文公開(kāi)的特異性糖基化特征，優(yōu)選地具有選自表I的糖基化形式。細(xì)胞系GT-5s以及由其來(lái)源的細(xì)胞系及與其同源的細(xì)胞系尤其有優(yōu)勢(shì)，因?yàn)槠涮峁┝朔浅７€(wěn)定和均一的蛋白質(zhì)生產(chǎn)，尤其是就FSH蛋白質(zhì)而言。其具有很好的批次一致性，即，從不同生產(chǎn)運(yùn)行中獲得的或以不同規(guī)模和/或用不同培養(yǎng)步驟所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)及其糖基化形式是類(lèi)似的。特別地，如本文所描述的多樣的糖基化形式在使用這些細(xì)胞系表達(dá)FSH的不同生產(chǎn)運(yùn)行中是高度可復(fù)制的。根據(jù)本發(fā)明的FSH是糖基化的，S卩，其是由一個(gè)或多個(gè)，優(yōu)選地為四個(gè)連接于多肽鏈的寡糖修飾的。這些寡糖，即聚糖或碳水化合物可以為線性或分支的糖鏈，并且優(yōu)選地為復(fù)合型N-連接寡糖鏈。根據(jù)寡糖的分支數(shù)，稱(chēng)為單_、二 _、三-或四天線型(或甚至五天線型)。單天線型寡糖是不分支的，而二 _、三-或四天線型寡糖分別具有一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)分支。因此具有更多天線的糖蛋白具有更多的寡糖終點(diǎn)并可攜帶更多的功能性末端糖單元，如唾液酸。如本文所使用的，“至少三天線型”指的是具有至少3個(gè)天線的寡糖，包括三天線型、四天線型和五天線型寡 糖。如本文所使用的，“至少四天線型”指的是具有至少4個(gè)天線的寡糖，包括四天線型和五天線型寡糖。對(duì)于復(fù)合型N-聚糖，優(yōu)選地認(rèn)為平分型GIcNAc殘基不是分支或天線，因此不加到FSH的天線之內(nèi)。本文所指代的FSH的糖基化形式特別指的是根據(jù)本發(fā)明的FSH制備物中所有FSH蛋白質(zhì)的整體糖基化形式。特別地，在糖基化形式中考慮到并反映了 FSH制備物中在FSH蛋白質(zhì)中包含并由此連接于FSH多肽鏈的任何聚糖結(jié)構(gòu)。術(shù)語(yǔ)“唾液酸”特別指代任何神經(jīng)氨酸的N-或O-置換衍生物。其可指代5-N-乙酰神經(jīng)氨酸或5-N-羥乙酰神經(jīng)氨酸，但優(yōu)選地僅僅指代5-N-乙酰神經(jīng)氨酸。唾液酸，特別是5-N-乙酰神經(jīng)氨酸，優(yōu)選地通過(guò)2，3-或2，6-連接與碳水化合物鏈相連。優(yōu)選地，本文描述的FSH制備物中存在有2，3-及2，6-偶聯(lián)唾液酸二者。FSH的唾液酸化程度通常以Z數(shù)表示。Z數(shù)表示糖蛋白的聚糖結(jié)構(gòu)上的相對(duì)負(fù)電荷。Z數(shù)是通過(guò)以下公式計(jì)算的Z=A1%*I+A2%*2+A3%*3+A4%*4
其中Al%為帶-1電荷的聚糖的百分比，A2%為帶_2電荷的聚糖的百分比，A3%為帶-3電荷的聚糖的百分比，而A4%為帶-4電荷的聚糖的百分比。這些百分比是相對(duì)連接于FSH的所有聚糖計(jì)算的，包括帶電及不帶電的聚糖。聚糖的的電荷可由聚糖中包含的任何帶電的單糖單元或置換物提供，尤其是由唾液酸殘基和/或硫酸基團(tuán)和/或磷酸基團(tuán)提供。由于FSH的聚糖的電荷通常只是通過(guò)其的唾液酸殘基確定而FSH通常具有四個(gè)聚糖結(jié)構(gòu)，所以Z數(shù)指示了 FSH上的唾液酸的量或FSH的酸性。然而，當(dāng)FSH還包括顯著量的硫酸聚糖時(shí)，Z數(shù)指示了唾液酸和硫酸基團(tuán)的組合量。根據(jù)本發(fā)明，“聚糖的相對(duì)量”指代連接于FSH制備物或包含F(xiàn)SH的組合物中FSH糖蛋白的聚糖的特定百分比或百分比范圍。特別地，聚糖的相對(duì)量指的是FSH蛋白質(zhì)中包含并因此連接于FSH制備物或包含F(xiàn)SH的組合物的FSH多肽鏈的所有聚糖的特定百分比或百分比范圍。100%的聚糖指的是分別連接于FSH制備物或包含F(xiàn)SH的組合物中的FSH糖蛋白的所有聚糖。例如，攜帶平分型GIcNAc的聚糖的相對(duì)量為60%指的是這樣的FSH制備物，其中FSH蛋白質(zhì)中包含并因此連接于所述FSH制備物中FSH多肽鏈的所有聚糖中的60%包含平分型GIcNAc殘基，而FSH蛋白質(zhì)中包含并因此連接于所述FSH制備物中FSH多肽鏈的所有聚糖中的40%不包含平分型GlcNAc殘基。本文給出的數(shù)值，特別是特異糖基化特性的相對(duì)量?jī)?yōu)選地理解為近似數(shù)值。特別地，這些數(shù)值優(yōu)選地可高出或低于多至10%，特別是高出或低于多至9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2% 或 1%?！癋SH制備物”可為任何包含或由FSH構(gòu)成的組合物或物質(zhì)。其可為固態(tài)或液態(tài)形式，可包含F(xiàn)SH之外的其他成分。特別地，F(xiàn)SH制備物可為溶液，包含F(xiàn)SH及合適溶劑如水和/或乙醇，或?yàn)槔绾蠪SH的溶液凍干后獲得的粉末。FSH制備物的合適實(shí)例為在細(xì)胞中表達(dá)FSH后獲得的組合物，特別是在FSH的純化之后，或包含F(xiàn)SH的藥用組合物。FSH制備物可在FSH之外含有例如溶劑、稀釋劑、輔料、穩(wěn)定劑、防腐劑、鹽、佐劑和/或表面活性劑。術(shù)語(yǔ)“FSH制備物”在本文使用的意義特別是“包含F(xiàn)SH的組合物”。這些術(shù)語(yǔ)優(yōu)選地在本文以同義詞使用?！?，6-偶聯(lián)唾液酸的相對(duì)量”指代為2，6-偶聯(lián)唾液酸的唾液酸的總量的特定百分比或百分比范圍。因此2，6-偶聯(lián)唾液酸的相對(duì)量為100%意味著所有唾液酸為2，6-偶聯(lián)唾液酸。例如，2，6-偶聯(lián)唾液酸的相對(duì)量為60%指的是這樣的FSH制備物，其中FSH蛋白質(zhì)中包含并因此連接于所述FSH制備物中FSH蛋白質(zhì)的寡糖鏈的所有唾液酸中的60%是以2，6-連接而連接，而FSH蛋白質(zhì)中包含并因此連接于所述FSH制備物中FSH蛋白質(zhì)的寡糖鏈的所有唾液酸中的40%不是以2，6-連接而連接，而是經(jīng)由2，3-連接或2，8-連接而連接·術(shù)語(yǔ)“多樣糖基化形式”特別指的是制備物或組合物中FSH蛋白質(zhì)的糖基化形式，這些糖基化形式包含多種不同的聚糖結(jié)構(gòu)。不同的聚糖結(jié)構(gòu)為寡糖結(jié)構(gòu)在至少一個(gè)寡糖單元的存在/不存在、量和/或位置及/或至少一種化學(xué)修飾例如硫酸殘基、乙酰殘基等等上有差異。特定的“不同聚糖結(jié)構(gòu)”優(yōu)選地在其相對(duì)量為糖基化形式中聚糖結(jié)構(gòu)總量的至少
O.02%、更優(yōu)選地至少O. 03%、至少O. 05%、至少O. 07%、至少O. 1%、至少O. 15%、至少O. 2%、至少O. 25%、至少O. 3%或者至少O. 5%時(shí)只以這方面考慮。多樣糖基化形式特別是包含至少5種不同聚糖結(jié)構(gòu)的糖基化形式。優(yōu)選地，多樣糖基化形式包含至少7、更優(yōu)選地至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少55且最優(yōu)選地至少60種不同的聚糖結(jié)構(gòu)。多樣糖基化形式特別還指代制備物或組合物中FSH的糖基化形式，所述糖基化形式包含比在相應(yīng)制備物或組合物中獲自CHO細(xì)胞的的FSH更多的不同聚糖結(jié)構(gòu)。特別地，糖基化形式比獲自CHO細(xì)胞的FSH包含的不同聚糖結(jié)構(gòu)多至少10%、優(yōu)選地至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%且最優(yōu)選地至少100%。術(shù)語(yǔ)“核酸”包括單鏈和雙鏈核酸及核糖核酸，以及脫氧核糖核酸。其可包含天然發(fā)生的及合成的核苷酸，也可天然或人工修飾，例如有甲基化、5’ -和/或3’ -帽化。術(shù)語(yǔ)“載體”在本文使用的是其最通用的意義，包含核酸的任何中間媒介物，其能使得所述核酸例如引入原核及/或真核宿主細(xì)胞，并在恰當(dāng)?shù)臅r(shí)候整合入宿主細(xì)胞的基因組中。此種類(lèi)型的載體優(yōu)選地在宿主細(xì)胞中復(fù)制和/或表達(dá)。載體優(yōu)選地包含一種或多種選擇標(biāo)記物以選擇包含所述載體的宿主細(xì)胞。合適的選擇標(biāo)記物為抗性基因，其為宿主細(xì)胞提供例如針對(duì)特異抗生素的抗性。其他合適的選擇標(biāo)記物為例如酶類(lèi)基因如DHFR或GS。使得重組蛋白質(zhì)(包括FSH)能夠表達(dá)的載體以及能夠使得重組蛋白質(zhì)在宿主中以高產(chǎn)量表達(dá)的合適的表達(dá)盒及表達(dá)元件在在線技術(shù)中已熟知，也是商業(yè)可得的，因此無(wú)需在本文進(jìn)行詳細(xì)描述。術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞”和“多個(gè)細(xì)胞”以及“細(xì)胞系”可交換使用，優(yōu)選地指代一種或多種哺乳動(dòng)物細(xì)胞，特別是人類(lèi)細(xì)胞。該術(shù)語(yǔ)包括細(xì)胞的子代或細(xì)胞群體。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到“多個(gè)細(xì)胞”包括單一細(xì)胞的子代，而由于天然、偶然、或認(rèn)為突變和/或改變的原因，子代不必(在形態(tài)或總DNA互補(bǔ)物上)完全相同于起始親本細(xì)胞?！凹?xì)胞”優(yōu)選地指代分離的細(xì)胞核/或培養(yǎng)的細(xì)胞，其沒(méi)有并入活的人類(lèi)或動(dòng)物體。術(shù)語(yǔ)“患者”根據(jù)本發(fā)明指的是人類(lèi)、非人靈長(zhǎng)動(dòng)物或其他動(dòng)物，特別是哺乳動(dòng)物如奶牛、馬、豬、綿羊、山 羊、狗、貓或嚙齒動(dòng)物如小鼠和大鼠。在一個(gè)具體優(yōu)選的實(shí)施方式中，患者為人類(lèi)。在人類(lèi)患者的情況下，F(xiàn)SH優(yōu)選地為人類(lèi)FSH?；颊呖梢詾樾坌曰虼菩?，優(yōu)選地為雌性。術(shù)語(yǔ)“藥用組合物”特別指代適合施用于人類(lèi)或動(dòng)物的組合物，即含有藥用可接受組分的組合物。優(yōu)選地，藥用組合物包含活性化合物或鹽或其原藥，以及載體、稀釋劑或藥用輔料如緩沖液、防腐劑及張力調(diào)節(jié)劑。FSH的國(guó)際單位(IU)指的是人尿液FSH和LH的第四套國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)(the fourthInternational Standard for Human Urinary FSH and LH) (Storring, P. L. &GainesDas, R. E. (2001) Journal of Endocrinology 171, 119-129)，是根據(jù)增廣卵巢增重法(aaugmented ovarian weight gain method)石角定的(Steelman, S. L. &Pohley, F. M. (1953)Endocrinology53, 604-616)。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語(yǔ)“不育癥治療”指的是對(duì)人類(lèi)或動(dòng)物受試者生殖或能育性相關(guān)的功能不良或疾病的治療。特別地，不育癥治療包括輔助生殖技術(shù)、排卵誘導(dǎo)、體外受精、宮腔內(nèi)人工受精以及生殖細(xì)胞成熟如卵泡發(fā)生或精子發(fā)生的實(shí)現(xiàn)或改進(jìn)。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語(yǔ)“其中未釋放顯著量的cAMP”或類(lèi)似的詞語(yǔ)特別指的是細(xì)胞或組織釋放的cAMP的量占由以導(dǎo)致最大cAMP釋放的濃度的FSH刺激后的細(xì)胞或組織獲得的cAMP釋放量的少于25%、優(yōu)選地為少于20%、更優(yōu)選地為少于15%、少于10%、少于7. 5%、少于5%或少于2. 5%。這些細(xì)胞或組織易感或敏感于FSH的刺激,如粒層細(xì)胞或睪丸支持細(xì)胞(Sertoli cell)。不依賴于FSH的cAMP釋放，即在FSH不存在時(shí)也會(huì)發(fā)生的cAMP釋放不應(yīng)當(dāng)在這一方面考慮。優(yōu)選地，“釋放顯著量的cAMP”或“cAMP的顯著釋放”是高于FSH不存在時(shí)cAMP釋放的任何cAMP釋放，特別是在測(cè)量的不精確度之上的任何可檢測(cè)的cAMP釋放。用于測(cè)量cAMP釋放的標(biāo)準(zhǔn)步驟在實(shí)施例中有所描述，可用于確定顯著或不顯著的cAMP釋放?！癱AMP的釋放”指的是cAMP的細(xì)胞內(nèi)釋放及/或cAMP的細(xì)胞外釋放或分泌，優(yōu)選地只指代cAMP的分泌。cAMP指代環(huán)磷酸腺苷，其在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起第二信使分子的作用。cAMP是由腺苷環(huán)化酶從ATP合成的?！安灰蕾嘽AMP信號(hào)傳導(dǎo)”的生物學(xué)過(guò)程或信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑優(yōu)選地不涉及腺苷環(huán)化酶的活化?！靶灶?lèi)固醇”，也稱(chēng)為性腺類(lèi)固醇或性激素，特別指代與脊椎動(dòng)物的雄激素和雌激素受體相互作用的類(lèi)固醇激素。術(shù)語(yǔ)“性類(lèi)固醇”包括雄性激素如合成代謝類(lèi)固醇、雄烯二酮、脫氫表雄酮、二氫睪丸酮和睪丸酮；雌激素如雌二醇、雌三醇和雌素酮；以及黃體酮。優(yōu)選地，性類(lèi)固醇指代天然發(fā)生的性類(lèi)固醇，更優(yōu)選地指代天然人類(lèi)性類(lèi)固醇。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選的性類(lèi)固醇為雌二醇和黃體酮，尤其是黃體酮。本發(fā)明根據(jù)一個(gè)方面基于的是一項(xiàng)發(fā)現(xiàn)，具有優(yōu)化糖基化形式的改進(jìn)的重組FSH制備物能夠在低的不誘導(dǎo)顯著cAMP釋放的FSH濃度下誘導(dǎo)性類(lèi)固醇如黃體酮的分泌。特別地，在此特定方面，根據(jù)本發(fā)明的改進(jìn)的FSH在比通常所用的尿液FSH或獲自CHO細(xì)胞的重組FSH低很多的濃度下誘導(dǎo)性類(lèi)固醇分泌。因此，改進(jìn)的FSH可以低很多的劑量施用，這減少了副作用的風(fēng)險(xiǎn)，并進(jìn)一步降低了生產(chǎn)成本。進(jìn)一步地，如果以可比的劑量施用，在此實(shí)施方式中改進(jìn)的FSH比通常使用的FSH在患者體內(nèi)提供更長(zhǎng)久的活性，因?yàn)樵谑┯靡欢魏荛L(zhǎng)的時(shí)間后只有很低濃度的FSH留存在循環(huán)系統(tǒng)中，但是根據(jù)本發(fā)明的這個(gè)實(shí)施方式的FSH仍然發(fā)揮其生物學(xué)活性并優(yōu)選地刺激或共刺激生殖細(xì)胞成熟和/或釋放性類(lèi)固醇。此夕卜，在高濃度下，根據(jù)本發(fā)明的改進(jìn)的FSH以及通常使用的尿液或來(lái)源于CHO的FSH顯示出可比的效應(yīng)。因此，相比于通常使用的FSH，劑量過(guò)大沒(méi)有其他風(fēng)險(xiǎn)。進(jìn)一步地，本發(fā)明者已經(jīng)在獼猴中證明根據(jù)本發(fā)明的改進(jìn)FSH與通常使用的尿液或來(lái)源于CHO的FSH相比具有類(lèi)似甚至 較高的藥學(xué)效應(yīng)。這一點(diǎn)尤其意外，因?yàn)楦鶕?jù)本發(fā)明的FSH在大鼠和猴中顯示了比獲自尿液或CHO細(xì)胞的常用FSH制備物更低的最大血清濃度(Cmax)及循環(huán)半衰期。雖然改進(jìn)的FSH的生物可及性較低，但卻具有類(lèi)似或更高的藥學(xué)效應(yīng)，因此可以推論根據(jù)本發(fā)明的改進(jìn)的FSH具有比尿液或CHO來(lái)源的FSH更高的特異性治療活性。根據(jù)所獲得的臨床數(shù)據(jù)，根據(jù)本發(fā)明的改進(jìn)的FSH在人類(lèi)中比常用FSH制備物有顯著更高的Cmax ;然而，改進(jìn)的FSH的循環(huán)半衰期稍低卻也是可比的。最意外的是，根據(jù)本發(fā)明的改進(jìn)FSH制備物甚至在只施用了單次劑量之后都在人類(lèi)中顯示出治療效應(yīng)，特別是卵泡生長(zhǎng)的效應(yīng)。相反，以單次劑量施用常用FSH制備物后未觀察到任何效應(yīng)。因此，預(yù)期的是以所述改進(jìn)的FSH可對(duì)患者進(jìn)行更精確的治療。特別地，有可能使用確切定時(shí)、定量的劑量治療并改進(jìn)患者的不育癥，也可能不需要長(zhǎng)期的連續(xù)治療。因此，也減少了多胎妊娠的風(fēng)險(xiǎn)。總之，根據(jù)本發(fā)明的改進(jìn)的FSH制備物更加有效。因此，可對(duì)患者施用較小的劑量，這引起更少的副作用，對(duì)患者更加方便也花費(fèi)更少。進(jìn)一步地，用改進(jìn)的FSH可設(shè)計(jì)更特異和詳細(xì)的劑量方案。進(jìn)一步地，減少的半衰期可減少不期望的副作用并進(jìn)一步使得治療終止后FSH能更快從人體移除。不受此理論的約束，本發(fā)明的發(fā)明人推論根據(jù)本發(fā)明的FSH制備物的更高的特異性治療活性是基于改進(jìn)的糖基化形式。特別地，高量的平分型GIcNAc殘基和/或高量的2，6-偶聯(lián)唾液酸以及高量的硫酸化聚糖可產(chǎn)生高的活性。進(jìn)一步地，根據(jù)本發(fā)明的FSH制備物還顯示了更多樣復(fù)雜的糖基化形式，意味著相比于例如來(lái)源于CHO細(xì)胞的常規(guī)FSH制備物，所述制備物中存在更多不同的聚糖結(jié)構(gòu)。據(jù)相信，CHO來(lái)源的FSH只能在靶標(biāo)細(xì)胞中激活單一的通路，而根據(jù)本發(fā)明的改進(jìn)的FSH由于其由獨(dú)特的糖基化形式，顯然是經(jīng)由多種不同通路發(fā)揮其生物學(xué)活性，產(chǎn)生增加的生物學(xué)應(yīng)答。如本文實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)所示，這些途徑中有一些涉及cAMP信號(hào)傳導(dǎo)，而其他的新型通路是不依賴于cAMP的。鑒于這些發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明在第一個(gè)方面提供了 FSH制備物，其中制備物中的FSH具有的糖基化形式包含一種或多種以下特征⑴攜帶平分型N-乙酰葡萄糖胺(bisGlcNAc)的聚糖的相對(duì)量為至少20%;(ii)攜帶果糖的聚糖的相對(duì)量為至少30%;和/或(iii) 2，6-偶聯(lián)唾液酸的相對(duì)量為至少30% ;和/或(iv)其為多樣的糖基化形式。在特定實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了 FSH制備物，其中制備物中的FSH具有的糖基化形式包含一種或多種以下特征(i)攜帶平分型N-乙酰葡萄糖胺(bisGlcNAc)的聚糖的相對(duì)量為至少35%;(ii)攜帶果糖的聚 糖的相對(duì)量為至少60%;和/或(iii) 2，6-偶聯(lián)唾液酸的相對(duì)量為至少30% ；優(yōu)選地，所述FSH為重組FSH，因此其可通過(guò)宿主細(xì)胞中的重組生產(chǎn)而獲得，后者優(yōu)選地為人類(lèi)宿主細(xì)胞。合適的提供相應(yīng)糖基化形式的人宿主細(xì)胞隨后有描述。優(yōu)選地，所述糖基化形式包含特征(i)、(ii)和(iii)的至少兩種(特別是特征
(i)和(ii)、(i)和(iii)、或(ii)和(iii))，更優(yōu)選地包含全部特征(i)、(ii)和(iii)。進(jìn)一步地，所述糖基化形式可進(jìn)一步包含至少四天線型的聚糖，其相對(duì)量為至少15%，和/或攜帶一個(gè)或多個(gè)唾液酸殘基的聚糖，其相對(duì)量為至少80%，和/或攜帶半乳糖的聚糖，其相對(duì)量為至少95%，和/或攜帶末端半乳糖單元的聚糖分支，其相對(duì)量為至少60%，和/或攜帶硫酸基團(tuán)聚糖，其相對(duì)量為至少1%，優(yōu)選地為至少2. 5%。所述末端半乳糖單元任選地進(jìn)一步攜帶唾液酸殘基。所述組合物中的重組FSH優(yōu)選地具有Z數(shù)為至少200。攜帶bisGlcNAc的聚糖的相對(duì)量?jī)?yōu)選地為至少25%、至少27%、至少30%、至少35%、至少38%或至少40%。更優(yōu)選地，其的范圍為大約25%-大約60%，特別是大約35%-大約60%的范圍或大約38%-大約50%的范圍，或大約40%-大約45%的范圍。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方式，為大約42%。攜帶一個(gè)或多個(gè)唾液酸殘基的聚糖的相對(duì)量?jī)?yōu)選地為至少83%、至少85%或至少88%，更優(yōu)選地為大約85%-大約98%的范圍或大約88%-大約95%的范圍，最優(yōu)選地為大約90%。Z數(shù)優(yōu)選地為至少210、更優(yōu)選地至少215、至少220、至少230或至少240。較高的Z數(shù)可例如通過(guò)在FSH制備物中富集酸性和/或負(fù)電FSH蛋白質(zhì)而獲得。優(yōu)選地，至少四天線型聚糖的相對(duì)量為至少16%、至少17%、至少18%或至少19%、更優(yōu)選地至少20%或至少21%。至少三天線型聚糖，特別是三-和四天線型聚糖的相對(duì)量?jī)?yōu)選地為至少25%、至少30%、至少35%或至少40%、更優(yōu)選地至少45%、至少50%或至少55%。優(yōu)選地，攜帶果糖的聚糖的相對(duì)量為至少35%、至少40%、至少50%、至少60%或至少70%、更優(yōu)選地至少75%或至少78%。其可為大約70%-大約90%的范圍，特別是大約75%-大約85%的范圍。優(yōu)選地，2，6-偶聯(lián)的唾液酸的相對(duì)量為至少40%、至少45%、至少50%、至少53%、至少55%、至少60%或至少65%，特別是大約40%-大約99%的范圍，優(yōu)選地為大約40%-大約80%、大約50%-大約60%或大約53%-大約70%的范圍。優(yōu)選地，2，3-偶聯(lián)唾液酸對(duì)2，6-偶聯(lián)唾液酸的比率范圍為大約1:10-大約7:3，更優(yōu)選地為大約1:5_大約3:2或大約1:2_大約1:1，最優(yōu)選地為大約2:3-大約1:1。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，2，6-偶聯(lián)唾液酸的相對(duì)量超過(guò)2，3-偶聯(lián)唾液酸的量。攜帶半乳糖的聚糖的相對(duì)量?jī)?yōu)選地為至少97%，最優(yōu)選地為大約98%。優(yōu)選地，攜帶半乳糖單元(任選地由唾液酸殘基修飾)的聚糖分支的相對(duì)量為至少65%、更優(yōu)選地至少70%或至少73%。其優(yōu)選地范圍為大約60%-大約95%，更優(yōu)選地范圍為大約70%-大約80%。優(yōu)選地，攜帶硫酸基團(tuán)的聚糖(硫酸聚糖)的相對(duì)量為至少1%、至少1. 5%、至少2%、至少2. 5%、至少3%或至少5%、更優(yōu)選地至少7%、至少10%或至少12%。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方式，攜帶硫酸基團(tuán)的聚糖的相對(duì)量不超過(guò)50%，優(yōu)選地不超過(guò)40%、35%、30%、25%或20%。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，制備物中的FSH具有多樣糖基化形式，其中制備物中FSH包含至少45或優(yōu)選地至少50種不同的聚糖結(jié)構(gòu)，其中每種不同的聚糖結(jié)構(gòu)具有制備物中FSH的聚糖結(jié)構(gòu)總量的相對(duì)量為至少O. 05%。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方式，制備物中FSH包含至少35或優(yōu)選地至少40種不同的聚糖結(jié)構(gòu)，其中每種不同的聚糖結(jié)構(gòu)具有制備物中FSH的聚糖結(jié)構(gòu)總量的相對(duì)量為至少O. 1% ;和/或制備物中FSH包含至少20或優(yōu)選地至少25中不同的聚糖結(jié)構(gòu)，其中每種不同的聚糖結(jié)構(gòu)具有制備物中FSH的聚糖結(jié)構(gòu)總量的相對(duì)量為至少
0.5%。在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方式中，制備物中的FSH比相應(yīng)制備物中獲自CHO細(xì)胞的FSH包含的不同聚糖結(jié)構(gòu)多至少40%，優(yōu)選地至少50%，其中每種不同的聚糖結(jié)構(gòu)具有相應(yīng)制備物中FSH的聚糖結(jié)構(gòu)總量的相對(duì)量為至少O. 05%,O. 1%或O. 5%。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明的重組FSH制備物不包含N-羥乙酰神經(jīng)氨酸(NeuGc)或可檢測(cè)量的Neu Gc。進(jìn)一步地，根據(jù)本發(fā)明的重組FSH制備物優(yōu)選地還不含有Galili表位(Gal α I, 3-Gal結(jié)構(gòu))或可檢測(cè)量的Galili表位。本發(fā)明特別提供了具有人類(lèi)糖基化形式的FSH。由于這些糖基化特性，不存在誘導(dǎo)副作用的外源免疫原性非人結(jié)構(gòu)，這意味著避免了已知由特定外源糖結(jié)構(gòu)如免疫原性非人唾液酸(NeuGc)或Galili表位(Gal-Gal結(jié)構(gòu))(所述二者對(duì)于嚙齒動(dòng)物生產(chǎn)系統(tǒng)也是已知的)或其他結(jié)構(gòu)如已知來(lái)自酵母系統(tǒng)的免疫原性高甘露糖結(jié)構(gòu)引起的不期望的副作用或不利之處。在特定實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明的制備物中重組FSH的糖基化形式包含一種或多種，優(yōu)選地包括全部的以下特征⑴攜帶平分型N-乙酰葡萄糖胺(bisGlcNAc)的聚糖的相對(duì)量范圍為大約25%-大約 50%;(ii)攜帶果糖的聚糖的相對(duì)量為至少35%;(iii) 2，6-偶聯(lián)唾液酸的相對(duì)量為至少53%;(iv)攜帶一個(gè)或多個(gè)唾液酸的聚糖的相對(duì)量為至少88%;以及(V)至少四天線型聚糖的相對(duì)量為至少16%.在特定的優(yōu)選實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明的重組FSH制備物具有下文表I中列出的糖基化形式之一表1:特異糖基化參數(shù)
權(quán)利要求
1.重組FSH制備物，其中制備物中的重組FSH具有的糖基化形式包含一種或多種以下特征 (i)攜帶平分型N-乙酰葡萄糖胺(bisGlcNAc)的聚糖的相對(duì)量為至少20%;和/或 ( )攜帶果糖的聚糖的相對(duì)量為至少30%;和/或 (iii)2，6-偶聯(lián)唾液酸的相對(duì)量為至少30% ;和/或 (iv)其為多樣的糖基化形式。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的重組FSH制備物，其中糖基化形式包括特征(i)、(ii)和(iii)中至少兩項(xiàng)，優(yōu)選地包括全部特征(i)、(ii)和(iii)。
3.重組FSH制備物，其可通過(guò)在人細(xì)胞系GT-5s或來(lái)源于其的細(xì)胞系或同源于其的細(xì)胞系中生產(chǎn)而獲得。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任何一項(xiàng)的重組FSH制備物，其包含一種或多種以下特征 (a)糖基化形式包含攜帶一種或多種唾液酸殘基的聚糖的相對(duì)量為至少85%; (b)糖基化形式包含至少四天線型聚糖的相對(duì)量為至少18%； (c)Z數(shù)為至少200; (d)其為人重組FSH;和/或 (e)其由人細(xì)胞系或人類(lèi)細(xì)胞產(chǎn)生。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任何一項(xiàng)的重組FSH制備物，其中糖基化形式包含一種或多種以下特征 (i)攜帶平分型N-乙酰葡萄糖胺(bisGlcNAc)的聚糖的相對(duì)量范圍為大約25%-大約50%; (ii)至少四天線型聚糖的相對(duì)量為至少16%； (iii)攜帶果糖的聚糖的相對(duì)量為至少35%； (iv)2，6-偶聯(lián)唾液酸相對(duì)量為至少53%; (v)攜帶一種或多種唾液酸殘基的聚糖的相對(duì)量為至少88%； (vi)Z數(shù)為至少220; (vii)攜帶半乳糖的聚糖的相對(duì)量為至少95%; (viii)攜帶任選地由唾液酸殘基修飾的末端半乳糖單位的聚糖分支的相對(duì)量為至少60% ； (ix)攜帶硫酸基團(tuán)的聚糖的相對(duì)量為至少3%; (x)其包含至少45種不同的聚糖結(jié)構(gòu)，其中每種不同的聚糖結(jié)構(gòu)具有的相對(duì)量為制備物中FSH的聚糖結(jié)構(gòu)總量的至少O. 05% ； (xi)其包含至少35種不同的聚糖結(jié)構(gòu)，其中每種不同的聚糖結(jié)構(gòu)具有的相對(duì)量為制備物中FSH的聚糖結(jié)構(gòu)總量的至少O. 1% ； (xiii)其包含至少20種不同的聚糖結(jié)構(gòu)，其中每種不同的聚糖結(jié)構(gòu)具有的相對(duì)量為制備物中FSH的聚糖結(jié)構(gòu)總量的至少O. 5% ;和/或 (xiv)其包含相比于對(duì)應(yīng)制備物中獲自CHO細(xì)胞的FSH多出至少40%的不同聚糖結(jié)構(gòu)，其中每種不同的聚糖結(jié)構(gòu)具有的相對(duì)量為相應(yīng)制備物中FSH的聚糖結(jié)構(gòu)總量的至少O.05%。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任何一項(xiàng)的重組FSH制備物，其中糖基化形式包含以下特征(i)攜帶平分型N-乙酰葡萄糖胺(bisGlcNAc)的聚糖的相對(duì)量范圍為大約25%-大約50%; (ii)至少四天線型聚糖的相對(duì)量為至少16%; (iii)攜帶果糖的聚糖的相對(duì)量為至少35%; (iv)2，6-偶聯(lián)唾液酸的相對(duì)量范圍為大約53%-大約99%;且 (v)攜帶一種或多種唾液酸殘基的聚糖的相對(duì)量為至少88%。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任何一項(xiàng)的重組FSH制備物，其中制備物中的重組FSH具有根據(jù)表I中列出的任何一個(gè)實(shí)施方式的糖基化形式。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任何一項(xiàng)的重組FSH制備物，其中所述FSH能夠 (a)以不釋放顯著量的cAMP的濃度；及/或 (b)通過(guò)誘導(dǎo)不依賴于cAMP信號(hào)傳導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路 刺激粒層細(xì)胞中黃體酮的釋放。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8中任何一項(xiàng)的重組FSH制備物，其中所述FSH能夠通過(guò)不依賴cAMP信號(hào)傳導(dǎo)的生物學(xué)過(guò)程刺激或共刺激生殖細(xì)胞成熟。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-9中任何一項(xiàng)的重組FSH制備物，其中FSH具有一種或多種以下可在粒層細(xì)胞測(cè)定中確定的特征 (a)其能夠以低于誘導(dǎo)粒層細(xì)胞釋放cAMP所需的最小濃度的濃度刺激粒層細(xì)胞中黃體酮的釋放； (b)其能夠以不誘導(dǎo)cAMP釋放或誘導(dǎo)cAMP的釋放低于10pmol/ml的FSH濃度刺激大約5*104-大約1*105粒層細(xì)胞/ml中釋放至少200ng/ml的黃體酮； (c)其能夠以低于人尿液FSH或產(chǎn)生于CHO細(xì)胞中的重組FSH(Gonal F)所需濃度的濃度刺激大約5*104-大約1*105粒層細(xì)胞/ml中釋放至少100ng/ml的黃體酮；及/或 (d)其能夠以人尿液FSH或產(chǎn)生于CHO細(xì)胞中的重組FSH(Gonal F)不產(chǎn)生相應(yīng)的黃體酮釋放的濃度刺激大約5*104-大約1*105粒層細(xì)胞/ml中釋放至少100ng/ml的黃體酮。
11.根據(jù)權(quán)利要求1-9中任何一項(xiàng)的重組FSH制備物，其中FSH能夠在單次劑量施用后誘導(dǎo)雌性人類(lèi)中的卵泡生長(zhǎng)，其中所述單次劑量?jī)?yōu)選地包含25-500IU FSH且優(yōu)選地是腸道外施用的，特別是通過(guò)皮下注射而施用。
12.藥用組合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求1-11的重組FSH制備物。
13.根據(jù)權(quán)利要求1-11中任何一項(xiàng)的重組FSH制備物或根據(jù)權(quán)利要求12的藥用組合物用于不育癥治療。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的重組FSH制備物或藥用組合物，其中要施用于患者的劑量使得患者循環(huán)系統(tǒng)中FSH濃度范圍為大約O. 05-大約2IU/L，優(yōu)選地為大約O.1-大約1IU/L。
15.根據(jù)權(quán)利要求1-11中任何一項(xiàng)的重組FSH制備物或根據(jù)權(quán)利要求12的藥用組合物用于也不依賴cAMP而誘導(dǎo)和/或刺激性類(lèi)固醇的分泌。
16.根據(jù)權(quán)利要求1-11中任何一項(xiàng)的重組FSH制備物或根據(jù)權(quán)利要求12的藥用組合物用于通過(guò)不依賴cAMP信號(hào)傳導(dǎo)的生物學(xué)過(guò)程刺激或共刺激生殖細(xì)胞成熟。
17.根據(jù)權(quán)利要求1-11的重組FSH制備物或根據(jù)權(quán)利要求12的藥用組合物用于以不誘導(dǎo)顯著cAMP釋放的FSH濃度誘導(dǎo)和/或刺激性類(lèi)固醇的分泌。
18.根據(jù)權(quán)利要求13-16中任何一項(xiàng)的重組FSH制備物或藥用組合物用于不育癥治療，其中不育癥的治療包括輔助生殖技術(shù)、排卵誘導(dǎo)、體外受精例如通過(guò)胞漿內(nèi)單精子注射的體外受精、配子輸卵管內(nèi)轉(zhuǎn)移、宮腔內(nèi)人工受精，對(duì)女性無(wú)卵障礙的治療、對(duì)女性卵子成熟的嚴(yán)重激素缺陷障礙的治療、對(duì)男性精子產(chǎn)生缺陷的治療和/或?qū)ι臣?xì)胞成熟如卵泡發(fā)生或精子發(fā)生的實(shí)現(xiàn)或改進(jìn)，尤其是例如在體外受精刺激操作流程中和/或進(jìn)行無(wú)卵障礙治療時(shí)實(shí)現(xiàn)或改進(jìn)女性卵泡成熟。
19.根據(jù)權(quán)利要求13-18中任何一項(xiàng)的重組FSH制備物或藥用組合物，其中重組FSH制備物或藥用組合物具有一種或多種以下特征 (i)其能夠在僅施用單次劑量后誘導(dǎo)卵泡生長(zhǎng)和/或卵子成熟'及/或 (ii)其在人、食蟹猴、大鼠和/或小鼠中的一種或多種中比獲自人尿液及/或表達(dá)于CHO細(xì)胞中的FSH制備物具有更低的循環(huán)半衰期；及/或 (iii)其在人、食蟹猴、大鼠和/或小鼠中的一種或多種中比獲自人尿液及/或表達(dá)于CHO細(xì)胞中的FSH制備物具有更低的生物利用率；及/或 (iv)其在人、食蟹猴、大鼠和/或小鼠中的一種或多種中具有的治療效力與獲自人尿液及/或表達(dá)于CHO細(xì)胞中的FSH制備物類(lèi)似或比其更高。
20.根據(jù)權(quán)利要求1-11中任何一項(xiàng)的重組FSH制備物或根據(jù)權(quán)利要求12的藥用組合物用于誘導(dǎo)卵泡生長(zhǎng)和/或卵子成熟的用途，及/或如權(quán)利要求13-19中任何一項(xiàng)限定的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及改進(jìn)的FSH制備物，其能夠以比通常使用的尿液FSH或獲自CHO細(xì)胞的重組FSH低得多的濃度刺激性類(lèi)固醇的釋放，且其不依賴cAMP信號(hào)傳導(dǎo)而起作用。這些改進(jìn)的FSH制備物可用于不育癥的治療。
文檔編號(hào)A61K38/24GK103068839SQ201180037096
公開(kāi)日2013年4月24日 申請(qǐng)日期2011年8月4日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月4日
發(fā)明者S·戈勒茲, L·施特克爾 申請(qǐng)人:葛萊高托普有限公司