一種檢測犬貓弓形蟲抗體的間接elisa試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種檢測犬貓弓形蟲抗體的間接ELISA試劑盒，涉及一種人獸共患傳染病的免疫學(xué)檢測技術(shù)，適用于犬貓弓形蟲抗體的定性檢測。本試劑盒包括弓形蟲重組抗原GRA7預(yù)包被酶標(biāo)板、樣品稀釋液為含有0.5％BSA和0.05％NaN3的0.01mol/L（pH7.2）的PBS；酶結(jié)合物為辣根過氧化物酶（HRP）-兔抗犬或貓IgG結(jié)合物、底物顯色液為TMB顯色液、終止液為2mol/L硫酸溶液、陽性對照、陰性對照。本發(fā)明敏感性高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好，可作為犬貓弓形蟲抗體檢測方法。
【專利說明】—種檢測犬貓弓形蟲抗體的間接ELISA試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明公開了一種犬貓弓形蟲抗體檢測的間接ELISA試劑盒，屬于基因工程技術(shù)和診斷試劑領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]弓形蟲病是弓形蟲引起的一種重要人獸共患寄生蟲病，導(dǎo)致人及動物流產(chǎn)、畸胎、死胎，嚴(yán)重危害公共衛(wèi)生安全和畜牧業(yè)生產(chǎn)。貓是弓形蟲終末宿主，犬是弓形蟲中間宿主，在弓形蟲的傳播與感染中起重要作用。目前弓形蟲尚無有效疫苗，犬貓弓形蟲感染的監(jiān)測對于疾病的防控具有重要意義。
[0003]弓形蟲感染的診斷主要包括病原學(xué)、分子生物學(xué)及免疫學(xué)等方法。病原學(xué)方法費(fèi)時、費(fèi)力、敏感性低。分子生物學(xué)方法包括PCR、DNA探針及基因芯片等技術(shù)具有較高的敏感性和特異性，但需要昂貴的儀器設(shè)備，操作過程較復(fù)雜。免疫學(xué)檢測方法包括染色試驗(DT)、間接熒光抗體試驗(IFAT)、間接血凝試驗(IHA)、直接凝集試驗(DAT)、改良凝集實驗(MAT)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)，其中DT需要用活的蟲體，存在生物安全風(fēng)險；IFAT具有較高的敏感性和特異性，但需要專門的儀器設(shè)備，不適合臨床使用；IHA和LAT無種屬特異性，但其敏感性較低；MAT檢測結(jié)果被認(rèn)為是金標(biāo)準(zhǔn)，但對犬弓形蟲檢測出率較低。ELISA敏感性、特異性較高，適合于大樣本量檢測。
[0004]目前弓形蟲ELISA檢測所用的抗原多是蟲體可溶性抗原，其成分不確定，抗原制備批次間差別較大，不易標(biāo)準(zhǔn)化。隨著分子生物學(xué)技術(shù)不斷發(fā)展，重組抗原作為弓形蟲的診斷抗原具有無可比擬的優(yōu)勢，如抗原成分確定，易標(biāo)準(zhǔn)化，特異性強(qiáng)等。弓形蟲速殖子有3種分泌細(xì)胞器，微線體、棒狀體和致密顆粒。致密顆粒蛋白(dense granule protein, GRA)主要是在蟲體修飾納蟲泡時及細(xì)胞內(nèi)存活中起重要作用，與蟲體在細(xì)胞內(nèi)存活和復(fù)制有相關(guān)，能夠引發(fā)宿主T細(xì)胞B細(xì)胞強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答，其中GRA7分泌過程持續(xù)速殖子感染宿主的整個階段，是排泄分泌(ES)抗原的主要成分，能夠刺激干擾素及腫瘤壞死因子的大量分泌，具有良好的免疫原性，是一種潛在的疫苗、診斷侯選抗原分子。本發(fā)明公開了以重組GRA7作為犬貓弓形蟲抗體檢測的間接ELISA試劑盒，與其它方法相比，具有較強(qiáng)的敏感性和特異性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明提供了一種以重組蛋白GRA7為抗原來檢測犬貓弓形蟲抗體的間接ELISA試劑盒，其目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的特異性不強(qiáng)、假陽性率高等缺點(diǎn)和不足，用于弓形蟲抗體的定性檢測。
[0006]本發(fā)明提供的犬貓弓形蟲抗體的間接ELISA試劑盒包括重組抗原GRA7預(yù)包被酶標(biāo)板、樣品稀釋液、陽性對照、陰性對照、酶結(jié)合物、洗滌液、底物顯色液和終止液。
[0007]本發(fā)明所述的試劑盒制備方法包括以下步驟:
1、弓形蟲重組GRA7蛋白的表達(dá)與純化:運(yùn)用PCR技術(shù)擴(kuò)增弓形蟲GRA7基因，將其克隆入原核表達(dá)載體pET-28a(+)，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-GRA7，經(jīng)酶切鑒定分析和序列測定。將重組質(zhì)粒PET-GRA7轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，IPTG誘導(dǎo)后，表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE分析，在約29kDa處出現(xiàn)特異性表達(dá)帶，與預(yù)期一致。重組菌裂解后,9000 rpm離心6 min,分別取上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE，結(jié)果顯示目的蛋白主要以不可溶性形式表達(dá)(圖1)。Westernblotting分析,表達(dá)產(chǎn)物能與弓形蟲陽性血清反應(yīng)(圖2)。重組蛋白經(jīng)N1-NTA純化后，純度達(dá)90%以上(圖3)。
[0008]2、抗原包被:將純化的重組蛋白GRA7用pH 9.6的碳酸鹽緩沖液稀釋至5 μ g/mL,包被96孔酶標(biāo)板，每孔50 μ L，4°C過夜，用洗滌液洗5遍，每遍5min ;加入5%脫脂奶粉配制成的封閉液，每孔100 μ L，溫箱37°C，Ih ;隨后用洗滌液洗滌5遍，每遍5min，4°C保存?zhèn)溆谩?br> [0009]3、兔抗犬或貓IgG的制備和辣根過氧化物(HRP)標(biāo)記:按常規(guī)方法提取純化犬或貓IgG，免疫家兔，當(dāng)兔抗血清ELISA效價達(dá)1:32以上時取血清；硫酸銨沉淀純化；用改良的過碘酸氧化法進(jìn)行標(biāo)記；最后酶標(biāo)記物加入5%牛血清白蛋白、1%酪蛋白和50%的中性甘油，測定工作濃度后，-20°C保存?zhèn)溆谩0010]4、上述各種溶液的配制:①樣品稀釋液:5% BSA, 0.05% NaN3的0.01 mol/L, pH7.2的磷酸鹽緩沖液(PBS) ?’②洗滌液:在1000 ml的0.01 M PBS溶液(3.58g Na2HPO4, 0.27g KH2PO4, 8 g NaCl, 0.2 g KCl)中加 0.5 ml 吐溫-20 (Tween-20) ； I 封閉液:100 ml 液滌液中加入5g脫脂奶粉，即5%脫脂奶粉封閉液；答終止液:取54.3ml濃度為95-98%濃硫酸加蒸餾水至1000ml即可。
[0011]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比其積極效果在于具有特異性好、靈敏度高、重復(fù)性好，可以作為犬貓弓形蟲抗體常規(guī)檢測方法。
[0012]附圖表說明
圖1:弓形蟲重組蛋白GRA7表達(dá)的SDS-PAGE分析結(jié)果.1.蛋白Marker ； 2-4.重組蛋白GRA7 ；5.空白對照.圖2:弓形蟲重組蛋白GRA7表達(dá)的Western blotting分析.1.蛋白Marker ;2.重組蛋白GRA7;3.陰性對照.圖3:弓形蟲重組蛋白GRA7純化結(jié)果.1.蛋白Marker ;2，3.純化的重組蛋白GRA7.表1.犬弓形蟲抗體間接ELSIA試劑盒檢測結(jié)果 表2.貓弓形蟲抗體間接ELSIA試劑盒檢測結(jié)果
【具體實施方式】
[0013]實施例1:犬弓形蟲抗體間接ELSIA試劑盒操作步驟
(1)將樣品稀釋液將犬血清按1:50稀釋后，加入GRA7預(yù)包被酶標(biāo)板的孔內(nèi)，每孔50 μ L，溫箱 37°C，Ih ；
(2)洗漆液洗漆5遍,每遍5min；
(3)加入HRP標(biāo)記兔抗犬IgG(工作濃度)，每孔50 μ L，溫箱37°C，Ih ；
(4)洗漆液洗漆5遍,每遍5min；
(5)加入TMB底物顯色液，每孔50μL，溫箱37°C避光顯色20min ；
(6)加入終止液,每孔50μL ;
(7)利用酶標(biāo)儀在450nm測定光吸收(OD)值；
(8)結(jié)果判定:以空白對照孔調(diào)零后測各孔OD值，若大于規(guī)定的陰性對照OD值的2.1倍，即為陽性。
[0014]實施例2:貓弓形蟲抗體間接ELSIA試劑盒操作步驟
(1)將樣品稀釋液將貓血清按1:64稀釋后，加入GRA7預(yù)包被酶標(biāo)板的孔內(nèi)，每孔50 μ L，溫箱 37°C，Ih ；
(2)洗漆液洗漆5遍,每遍5min；
(3)加入HRP標(biāo)記兔抗貓IgG(工作濃度)，每孔50 μ L，溫箱37°C，Ih ；
(4)洗漆液洗漆5遍,每遍5min；
(5)加入TMB底物顯色液，每孔50μ L，溫箱37°C避光顯色20min ；
(6)加入終止液,每孔50μL ;
(7)利用酶標(biāo)儀在450nm測定光吸收(OD)值；
(8)結(jié)果判定:以空白對照孔調(diào)零后測各孔OD值，若大于規(guī)定的陰性對照OD值的2.1倍，即為陽性。
[0015]實施例3:犬弓形蟲抗體間接ELSIA試劑盒檢測結(jié)果評價
將通過MAT法及IFAT法確定為犬弓形蟲抗體陽性、陰性血清259份，用該試劑盒檢測。檢測結(jié)果如表1。統(tǒng)計學(xué)分析表明，ELISA檢測結(jié)果與實際結(jié)果無顯著差異(P > 0.05 ；Kappa=0.8631,95% Cl: 0.7803, 0.9459),結(jié)果一致率為 96.1%。犬弓形蟲抗體間接 ELSIA試劑盒檢測結(jié)果敏感性為88.6%，特異性為97.7%。
[0016]實施例4:貓弓形蟲抗體間接ELSIA試劑盒檢測結(jié)果評價
將通過MAT法及IFAT法確定為貓弓形蟲抗體陽性、陰性血清185份，用該試劑盒檢測。檢測結(jié)果如表2。統(tǒng)計學(xué)分析表明，ELISA檢測結(jié)果與實際結(jié)果無顯著差異(P >0.05;Kappa=0.9195，95% 眼 Cl: 0.8500,0.9890)，結(jié)果一致率為 97.3%。貓弓形蟲抗體間接 ELSIA試劑盒檢測結(jié)果敏感性為92.5%，特異性為98.6%。
表1.犬弓形蟲抗體間接ELSIA試劑盒檢測結(jié)果
【權(quán)利要求】
1.一種檢測犬貓弓形蟲抗體的間接ELISA試劑盒，所述檢測試劑盒包含:弓形蟲重組抗原GRA7預(yù)包被酶標(biāo)板，包被量為0.25 μ g ;樣品稀釋液為含0.5% BSA和0.05% NaN3的0.01mol/L (pH 7.2)的PBS ;酶結(jié)合物為辣根過氧化物酶-兔抗犬或貓IgG結(jié)合物；底物顯色液為TMB顯色液；終止液為2 mol/L硫酸溶液，陽性對照、陰性對照。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的犬貓弓形蟲抗體間接ELISA試劑盒，其特征在于包被抗原的制備是通過PCR技術(shù)擴(kuò)增弓形蟲致密顆粒蛋白GRA7基因，將其克隆至原核表達(dá)載體pET-28a中，構(gòu)建PET-GRA7，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)N1-NTA純化后作為弓形蟲檢測抗原。
【文檔編號】G01N33/531GK103837688SQ201410118911
【公開日】2014年6月4日 申請日期:2014年3月27日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月27日
【發(fā)明者】劉全, 王澤東, 蔡玉峰, 魏峰 申請人:吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)