專利名稱：檢測人血型的電化學(xué)方法及系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及檢測人類血型的方法及系統(tǒng)，特別是涉及使用電化學(xué)手段檢測人 類ABO血型所使用的電化學(xué)檢測方法和系統(tǒng)。
背景技術(shù)：
血液分型是將人血液分成A、 B、 AB和O四種不同類型的常規(guī)方法。目前， 血液分型方法都是根據(jù)紅血細(xì)胞懸液的細(xì)胞聚集完成的。該方法是首先從病人血 清中分離紅細(xì)胞。將適量的紅細(xì)胞與引入試管中或玻片上的試驗(yàn)溶液(含有抗A 血清、抗B血清)或其稀釋液混和，可以再加入利于免疫反應(yīng)進(jìn)行的試劑并保 溫、離心和攪拌。然后在顯微鏡下肉眼觀察，確定細(xì)胞是否發(fā)生了聚集。 -
如果樣品在抗A試劑存在下發(fā)生細(xì)胞聚集，而在抗B存在下不發(fā)生集聚即 鑒定為A型血。樣品在抗B試劑存在下發(fā)生細(xì)胞聚集，但在抗A存在下不發(fā)生 聚集則鑒定為B型血。樣品與抗A和抗B試劑均有聚集，樣品為AB型血。樣 品與抗A和B血清均不發(fā)生反應(yīng)則定為O型血。
目前檢測ABO血型的技術(shù)可以分為兩類， 一類為檢測細(xì)胞膜上結(jié)合血型抗 原的技術(shù)，包括紅細(xì)胞鹽水凝集法、中和實(shí)驗(yàn)、吸收實(shí)驗(yàn)、解離實(shí)驗(yàn)和混合凝集 反應(yīng)等。另一類直接檢測游離血型抗原，包括協(xié)同凝集反應(yīng)、放射免疫反應(yīng)等。
紅細(xì)胞鹽水凝集法是通過已知的IgM型抗體結(jié)合新鮮紅細(xì)胞表面的血型抗 原，導(dǎo)致紅細(xì)胞凝集，來判斷被檢血液的血型。此方法廣泛用于臨床輸血前的血 型檢驗(yàn)(配型)，但只能用于檢測新鮮紅細(xì)胞的血型，而且試劑均需低溫保存。
其他血型檢測方法也都存在各自的缺點(diǎn)，例如中和實(shí)驗(yàn)費(fèi)時(shí)較長，而且靈 敏度比較低。解離實(shí)驗(yàn)和混合凝集反應(yīng)操作要求高，每次實(shí)驗(yàn)需要反復(fù)摸索條件， 其靈敏度也不高；協(xié)同凝結(jié)反應(yīng)是用IgG型抗體致敏SPA蛋白，通過葡萄球菌 的凝集是否判斷血型，但對試劑保存要求較高，使其應(yīng)用受到一定限制；放射免 疫和酶聯(lián)免疫方法雖然靈敏度高，但是不適合單人份檢測，也無法實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場檢測。
上述這些血型分析和判斷方法需要由有經(jīng)驗(yàn)的技術(shù)人員手工完成的，所以常常受到技術(shù)人員經(jīng)驗(yàn)和工作疲勞程度等囚素影響，導(dǎo)致結(jié)果判斷錯(cuò)誤。另外，傳 統(tǒng)方法需要使用載玻片、蓋玻片和吸管等物件及抗人球蛋白抗體。如果使用不慎， 在實(shí)驗(yàn)過程中很可能對人員或環(huán)境造成嚴(yán)重污染。可見，目前常用的臨床血型鑒 定方法存在檢定時(shí)間長、手工勞動(dòng)強(qiáng)度大，以及結(jié)果受主觀偏差影響較大和存在 污染的可能等問題。因此，有必要對傳統(tǒng)的血型檢測方法做出實(shí)質(zhì)性的改進(jìn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了利用電化學(xué)阻抗分析技術(shù)檢測人ABO血型的檢測系統(tǒng)，該系 統(tǒng)是以化學(xué)交聯(lián)法在電極表面固定的紅細(xì)胞ABO血型抗體，與待檢紅細(xì)胞發(fā)生 免疫結(jié)合反應(yīng)，引起工作電極的交流阻抗的改變來達(dá)到對血型的鑒定，所說的檢
測系統(tǒng)包括(l)檢測電極為絲網(wǎng)印刷的三電極，其中包括石墨工作電極、石 墨對電極和銀/氯化銀參比電極，其中工作電極表面固定有ABO血型抗體；(2) 交流阻抗分析裝置為能夠檢測由于紅細(xì)胞與其抗體的結(jié)合所導(dǎo)致的工作電極交 流阻抗的變化，從而借以判斷紅細(xì)胞表面抗原的類型。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中所說的交流阻抗法血型檢測系統(tǒng)是利 用電極表面固定的紅細(xì)胞ABO血型抗體與紅細(xì)胞發(fā)生免疫結(jié)合反應(yīng)，引起電極
之間交流阻抗的改變來達(dá)到對血型的鑒定。
本發(fā)明的交流阻抗法血型檢測系統(tǒng)包括(l)檢測電極為絲網(wǎng)印刷的三電 極。三電極包括石墨工作電極、石墨對電極和銀/氯化銀參比電極，其中工作電 極表面固定有ABO血型抗體；(2)檢測裝置為具有檢測交流阻抗功能的電化 學(xué)分析裝置，在紅細(xì)胞與相應(yīng)抗體反應(yīng)后，其能夠檢測出由于特定血型紅細(xì)胞的 存在所導(dǎo)致的工作電極交流阻抗的改變，從而可借以判斷紅細(xì)胞表面血型抗原的 類型。
本發(fā)明是利用紅細(xì)胞與紅細(xì)胞ABO血型抗體發(fā)生免疫反應(yīng)前后電極表面顯
著變化，導(dǎo)致的工作電極的交流阻抗發(fā)生變化的這一特性，達(dá)到對血型的指示。 根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，其特征在于所說的檢測電極是絲網(wǎng)印刷的三電 極，其中包括石墨工作電極，銀/氯化銀參比電極以及石墨對電極。檢測時(shí)，該 檢測電極被插入在檢測裝置前端的凹槽內(nèi)。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，特征是采用化學(xué)交聯(lián)法將抗A抗體或抗B抗
體固定在工作電極表面，并使所說的抗體直接在電極表面上與待檢紅細(xì)胞發(fā)生免
疫反應(yīng)。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，其特征是利用交流阻抗的電化學(xué)分析裝置直接 測量絲網(wǎng)印刷電極的交流阻抗變化，并分析所說變化的幅度。
可以將經(jīng)過稀釋的待檢血液樣品加至電極表面并覆蓋整個(gè)電極的工作區(qū)域，
靜置一段時(shí)間(5分鐘左右)，待發(fā)生免疫結(jié)合反應(yīng)后，用5mM磷酸鹽緩沖液 (PBS)進(jìn)行沖洗，然后利用具有交流阻抗檢測功能的電化學(xué)分析裝置檢測電極 的交流阻抗。由于紅細(xì)胞的存在而顯著地改變了工作電極的交流阻抗，所以可根 據(jù)工作電極的交流阻抗的改變判斷紅細(xì)胞表面抗原的類型。
本發(fā)明電化學(xué)免疫分析檢測ABO血型，是用已知特異性抗體與血型抗原反 應(yīng)，利用血型物質(zhì)在電極表面發(fā)生免疫反應(yīng)前后的電化學(xué)信號改變來判斷血型類 型，故具有較高的靈敏度。同時(shí)，本發(fā)明的方法操作簡單方便、可避免現(xiàn)有普通 交叉配血實(shí)驗(yàn)的各種缺陷。傳統(tǒng)的凝集法則通常需要加入抗人球蛋白抗體使紅細(xì) 胞凝集以便用肉眼觀察。本發(fā)明方法的檢測原理利用的是免疫結(jié)合反應(yīng)，即利用 紅細(xì)胞的電化學(xué)特性，而無需使其凝集，所以不需要加入抗人球蛋白抗體。儀器 操作軟件具有數(shù)據(jù)處理及識別分析功能，可以避免人為的主觀干擾。特別適合采 血現(xiàn)場ABO血型的快速檢測以及血型的家庭自檢，也適用于血站系統(tǒng)對批量血 液樣品的ABO血型快速鑒定。


圖1顯示本發(fā)明血型檢測方法中使用的整體反應(yīng)檢測系統(tǒng)模式圖。其中1 為檢測裝置，2為固定了血型抗體的電極系統(tǒng)。電極系統(tǒng)2被插入在檢測裝置1 上顯示的凹槽3內(nèi)。
圖2顯示本發(fā)明血型檢測方法中使用的三電極工作電極區(qū)域免疫反應(yīng)后的 模式圖。其中1為免疫反應(yīng)的紅細(xì)胞；2為電極上固定的ABO血型抗體；3為 工作電極。
圖3顯示本發(fā)明血型檢測方法中最后的結(jié)果判讀原理圖。其中1為B型血 樣和固定有抗B抗體的電極反應(yīng)的檢測結(jié)果阻抗圖;2為A型血樣和固定有抗A抗體的電極反應(yīng)的檢測結(jié)果阻抗圖；3為B型血樣和固定有抗A抗體的電極反 應(yīng)的檢測結(jié)果阻抗圖；4為A型血樣與固定有抗B抗體的電極反應(yīng)的檢測阻抗 圖。即曲線1和曲線2為未凝集的結(jié)果，曲線3和曲線4為發(fā)生凝集的結(jié)果。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例l:交流阻抗法檢測血型 (1)在電極上固定血型抗體(抗A和抗B抗體)
稱取殼聚糖固體0.01g ，以0.2M醋酸溶液稀釋到lml，終濃度為1% 。以 微量移液器吸取lnl上述殼聚糖溶液，滴加在4.5mn^的石墨工作電極上，室溫
自然晾干。
在處理好的工作電極表面滴加0.05%的戊二醛溶液過夜，5 mM磷酸鹽緩沖 液(PBS)沖洗后泡入濃度為5mg/ml的血型抗體(抗A、抗B抗體)溶液中， 交聯(lián)24小時(shí)。取出，用5mMPBS洗去游離的血型抗體(抗A、抗B抗體)，最 后用濃度為5%的牛血清白蛋白(BSA)封閉2小時(shí)。最后干燥后密封保存。
(2) 加入紅細(xì)胞待檢樣品進(jìn)行免疫反應(yīng) 血樣用生理鹽水或其它等張稀釋液稀釋到2%—5%濃度，移取20fil至電極
表面，室溫反應(yīng)5分鐘左右，用lOmMPBS沖洗除去未結(jié)合在電極表面的紅細(xì) 胞。
(3) 檢測電極交流阻抗信號 在滴加待檢血樣之前先在電極表面加入20^1生理鹽水，將電極插入檢測儀
器前端電極插槽內(nèi)檢測電極表面溶液的交流阻抗值；滴加待檢血樣免疫反應(yīng)后， 用生理鹽水沖洗除去未結(jié)合在電極表面的紅細(xì)胞，在電極表面加入20jxl生理鹽 水，相同參數(shù)下檢測電極表面溶液的交流阻抗值。根據(jù)反應(yīng)前后交流阻抗大小的 差值，判斷是否有紅細(xì)胞結(jié)合到電極表面。
結(jié)果如圖3所示。其中橫坐標(biāo)表示交流阻抗檢測時(shí)的溶液電阻，縱坐標(biāo)表示 交流阻抗檢測時(shí)的電容電阻。簡而言之，交流阻抗的大小可以根據(jù)阻抗弧度的大 小來直觀表示。結(jié)合本檢測結(jié)果，阻抗弧半徑小的表示紅細(xì)胞和相應(yīng)的血型抗體 沒有發(fā)生免疫結(jié)合反應(yīng)，弧半徑大的表示紅細(xì)胞和相應(yīng)的血型抗體發(fā)生了免疫結(jié) 合反應(yīng)。圖3中，曲線1為A型血液樣本與固定有抗B抗體的電極反應(yīng)的檢測曲線；曲線2為B型血液樣本和固定有抗A抗體的電極反應(yīng)的檢測曲線；曲線 3為A型血液樣本和固定有抗A抗體的電極反應(yīng)的檢測曲線；曲線4為B型血 液樣本和固定有抗B抗體的電極反應(yīng)的檢測曲線。通過多個(gè)樣品檢測，目前可 以判定溶液阻抗不大于250歐的即可以確定為沒有發(fā)生免疫結(jié)合反應(yīng)。
溶液阻抗大于250歐則發(fā)生了免疫結(jié)合，反之則未發(fā)生免疫結(jié)合。和固定有 抗A抗體以及抗B抗體都發(fā)生結(jié)合的為AB型血；和抗A抗體以及抗B抗體都 未發(fā)生結(jié)合的為O型血；和抗A抗體發(fā)生結(jié)合但是和抗B抗體未結(jié)合的為A血 型；和抗A抗體未結(jié)合但是和抗B抗體結(jié)合的為B血型。
實(shí)施例2:本發(fā)明血型檢測方法的實(shí)際應(yīng)用
三電極交流阻抗法檢測血型檢測系統(tǒng)適合街頭采血以及家庭ABO血型自檢 等。通過預(yù)先修飾的電極，達(dá)到對血型快速簡單的鑒定。該方法操作簡單快速， 不需要額外添加抗人球蛋白等試劑，全部檢測過程不超過10分鐘即可完成，而 且易于普及。我們使用傳統(tǒng)的血型檢測方法和本發(fā)明的電化學(xué)血型檢測方法，對 普通人群100例個(gè)體(獻(xiàn)血員)同時(shí)進(jìn)行血型檢測。結(jié)果顯示，本方法的檢測結(jié) 果和與已知的血球凝集方法相比較，符合率達(dá)到100%。同時(shí)本發(fā)明的電化學(xué)檢 測方法避免了目前常用的臨床血型鑒定方法存在檢定時(shí)間長、手工勞動(dòng)強(qiáng)度大， 以及結(jié)果受操作者主觀偏差影響較大和存在污染的可能等各種問題。
權(quán)利要求
1、一種利用電化學(xué)阻抗分析技術(shù)檢測人ABO血型的檢測系統(tǒng)，該系統(tǒng)是以化學(xué)交聯(lián)法在電極表面固定的紅細(xì)胞ABO血型抗體，與待檢紅細(xì)胞發(fā)生免疫結(jié)合反應(yīng)，引起工作電極的交流阻抗的改變來達(dá)到對血型的鑒定，所說的檢測系統(tǒng)包括(1)檢測電極為絲網(wǎng)印刷的三電極，其中包括石墨工作電極、石墨對電極和銀/氯化銀參比電極，其中工作電極表面固定有ABO血型抗體；(2)交流阻抗分析裝置為能夠檢測由于紅細(xì)胞與其抗體的結(jié)合所導(dǎo)致的工作電極交流阻抗的變化，從而借以判斷紅細(xì)胞表面抗原的類型。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1的系統(tǒng)，其中檢測電極被插入到檢測裝置前端的電極插槽內(nèi)。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1的系統(tǒng)，其特征是利用化學(xué)交聯(lián)法在絲網(wǎng)印刷電極的工 作電極表面固定紅細(xì)胞ABO血型抗體。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1的系統(tǒng)，其中所說的檢測裝置是交流阻抗分析裝置，利 用具有檢測交流阻抗功能的交流阻抗分析裝置檢測絲網(wǎng)印刷電極發(fā)生免疫結(jié)合反應(yīng)前后的交流阻抗變化。
全文摘要
本發(fā)明涉及檢測人類血型的方法，特別是涉及使用電化學(xué)手段檢測人類ABO血型的方法及所使用的檢測系統(tǒng)。該系統(tǒng)由電極系統(tǒng)、電流阻抗檢測系統(tǒng)組成。將待測血樣滴加在預(yù)先修飾好的電極上后，根據(jù)血樣中紅細(xì)胞與固定在電極表面的血型抗體反應(yīng)后所帶來的交流阻抗的改變達(dá)到對血型的判斷。本方法操作簡單，結(jié)果明了，可以有效避免操作者的主觀影響等。
文檔編號G01N33/80GK101470120SQ20071030536
公開日2009年7月1日 申請日期2007年12月28日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月28日
發(fā)明者文 楊, 汪大明, 王保丹, 肖江群 申請人:英科新創(chuàng)(廈門)科技有限公司